EP1185629A1 - Nukleinsäurefragment und vektor, enthaltend eine halogenase, sowie ein verfahren zur halogenierung chemischer verbindungen - Google Patents

Nukleinsäurefragment und vektor, enthaltend eine halogenase, sowie ein verfahren zur halogenierung chemischer verbindungen

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Publication number
EP1185629A1
EP1185629A1 EP00929542A EP00929542A EP1185629A1 EP 1185629 A1 EP1185629 A1 EP 1185629A1 EP 00929542 A EP00929542 A EP 00929542A EP 00929542 A EP00929542 A EP 00929542A EP 1185629 A1 EP1185629 A1 EP 1185629A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
methyl
cιo
butenyl
dimethyl
ethyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00929542A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Pelzer
Petra Huber
Roderich Suessmuth
Juergen Recktenwald
Dorothée HECKMANN
Wolfgang Wohlleben
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1185629A1 publication Critical patent/EP1185629A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • the invention relates to a method for the enzymatic halogenation of chemical compounds.
  • the invention further relates to a nucleic acid fragment, a vector and organisms 10 containing a halogenase or a halogenase gene.
  • Halogenation reactions have long been known in chemical synthesis. They are used to manufacture a large number of halogenated organic compounds. A disadvantage of these
  • haloperoxidases enzymes 30 are known from the literature which halogenate organic compounds in the presence of a halogen ion and hydrogen peroxide.
  • examples of such enzymes are the haloperoxidase from Streptomyces aureofaciens (Kren et al., Liebigs Ann. / Red., 1997, 11: 2379-83), from Rhodococcus erythropolis (Schrijver et al., Appl. Environ. Micro-35 biol., 1997, 63, 5: 1911-1916), from Amycolatopsis orientalis (van Wageningen et al., Chem.
  • halogenation reaction is the actual enzyme reaction of these haloperoxidases or whether it is only a side reaction.
  • the 45 enzymes very often show a low substrate and cosubstrate affinity and a low specificity for enzymes.
  • other halogenating enzymes are known from the literature. For example, Kirner et al. (J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, No. 7, p. 1939-1943) and Hohaus et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, No. 18, 2012-2013) a halogenase which introduces a chloro atom in the 7-position of the tryptophan.
  • GenBank (Y 16952) has a 9.9 kb Amycolatopsis mediterranei DNA fragment. Pelzer et al. describe two functions of this DNA in the GenBank entry. It codes for oxygenases and glycosyltransferases. No other functions are mentioned.
  • halogenation process which is characterized in that a chemical compound is halogenated in the presence of a halogenase, the halogenase being derived from the
  • the enzyme can also advantageously be isolated from organisms of the genus Streptomyces, especially of the genus and species Streptomyces mediterranei.
  • Electroduction 10 may also be mentioned as an advantageous variant of electroporation. It enables fast, direct DNA transfer from E. coli to Actinomycetes by electroporation using shuttle vectors (Muth, G., Brolle, DF, Wohlleben, W., 1999).
  • the functional fragments are shortened by 5 to 30% against sequence 30 (a), preferably by 10 to 20%.
  • sequences that are longer than sequence (a) are also conceivable.
  • Sequences which hybridize under standard conditions with the sequences mentioned under (a) 35 and (b) are understood to mean sequences which, for example, at temperatures between 42 and 58 ° C. in an aqueous buffer solution with a concentration between 0.1 and 5xSSC ( IxSSC 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate; pH 7.2) or additionally hybridize in the presence of 50% formamide such as 40 42 ° C. in 5xSSC and 50% formamide.
  • nucleic acids are understood to mean, for example, DNA, cDNA, RNA or mRNA. Furthermore, the homologues of these nucleic acid sequences are also to be understood.
  • R 4 and R 5 independently of one another are hydrogen, hydroxyl, halogen, nitro, cyano, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl, C ⁇ -C ⁇ o alkoxy, C 2 -C ⁇ o alkenyl, C 2 -C ⁇ o-alkenyloxy, substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl, aryl, hetaryl, R 6 R 7 N and where two radicals R 4 and R 5 together on adjacent carbon atoms together a further substituted or can form unsubstituted aromatic, saturated or partially saturated ring with 5 to 6 atoms in the ring, which may contain one or more heteroatoms such as 0, N or S;
  • R 8 substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl, C 2 -C ⁇ o-alkenyl, substituted or unsubstituted aryl;
  • halogen-containing organic or inorganic compounds can be used as the halogen donor.
  • inorganic compounds are preferred.
  • Halogens are advantageously added to the reaction solution in the form of their salts.
  • the alkali and / or alkaline earth metal salts of the halogens may be mentioned as examples.
  • Substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C ⁇ alkenyl chains such as, for example, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3 -Pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-1-butenyl, 2-methyl-1-butenyl, 3-methyl-1-butenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl -2-butenyl, l-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1, 1-dimethyl-2-propenyl, 1, 2-dimethyl-l-propenyl, 1 , 2-Dirnethyl-2-propenyl, 1-ethyl-1-propenyl, 1-ethyl-2-propenyl,
  • alkenyloxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C ⁇ alkenyloxy chains, such as ethenyloxy, propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy, 3-butenyloxy, 2-methylpropenyloxy, 1-pentenyloxy, 2-pentenyloxy, 3-pentenyloxy , 4-pentenyloxy, 1-methyl-1-butenyloxy, 2-methyl-1-butenyloxy, 3-methyl-1-butenyloxy, 1-methyl-2-butenyloxy, 2-methyl-2-butenyloxy, 3-methyl-2 - Butenyloxy, l-methyl-3-butenyloxy, 2-methyl-3-butenyloxy, 3-methyl-3-butenyloxy, 1, 1-dimethyl-2-propenyloxy, 1, 2-dimethyl-1-propenyloxy, 1, 2-dimethyl-2-propenyloxy, 1-ethyl-l-prop
  • substituents of the said radicals of R 1 are in principle all possible substituents in question, do not hinder the Halogenaseretician, for example one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, Hydroxy, alkyl, cycloalkyl, aryl, alkoxy, benzyloxy, phenyl or benzyl.
  • substituents of the said radicals of R 1 are in principle all possible substituents in question, do not hinder the Halogenaseretician, for example one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, Hydroxy, alkyl, cycloalkyl, aryl, alkoxy, benzyloxy, phenyl or benzyl.
  • R 2 in the compounds of the formula I and II denotes hydrogen, hydroxyl, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 1 -alkyl, C 1 -C 1 -alkoxy, C 2 -C ⁇ o-alkenyl, C 2 -C ⁇ 0 -alkenoxy-, R 6 RN-;
  • alkenyloxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C ⁇ o alkenyloxy chains, such as ethenyloxy, propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy, 3-butenyloxy, 2-methylpropenyloxy, 1-pentenyloxy, 2-pentenyloxy, 3-pentenyloxy , 4-pentenyloxy, 1-methyl-1-butenyloxy, 2-methyl-1-butenyloxy, 3-methyl-1-butenyloxy, 1-methyl-2-butenyloxy, 2-methyl-2-butenyloxy, 3-methyl-2 - Butenyloxy, 1-methyl-3-butenyloxy, 2-methyl-3-butenyloxy, 3-methyl-3-butenyloxy, 1, l-dimethyl-2-propenyloxy, 1, 2-dimethyl-1-propenyloxy, 1, 2 -Dimethyl-2-propenyloxy, 1-ethyl-l
  • R 3 in the compounds of the formula I and II denotes hydrogen, hydroxyl, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 1 -alkyl, C 1 -C 1 -alkoxy, C 2 -C ⁇ o-alkenyl, C 2 -C ⁇ o- Alkenyloxy, C ⁇ -C ⁇ o-alkylcarbonyl, C 2 -C ⁇ o-alkenylcarbonyl, aryl, hetaryl,
  • alkoxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 10 alkoxy chains such as methoxy, ethoxy, propoxy, 1-methylethoxy, butoxy, 1-methylpropoxy, 2-methylpropoxy, 1, 1-dimethylethoxy, pentoxy, 1st -Methylbutoxy, 2-methylbutoxy, 3-methylbutoxy, 1, 1-dimethylpropoxy, 1, 2-dimethylpropoxy, 2, 2-dimethylpropoxy, 1-ethylpropoxy, hexoxy, 1-methylpentoxy, 2-methylpentoxy, 3-methylpentoxy, 4 -Methylpentoxy, 1, 1-dimethylbutoxy, 1, 2-dimethylbutoxy, 1, 3-dimethylbutoxy, 2, 2-dimethylbutoxy, 2, 3-dimethylbutoxy, 3, 3-dimethylbutoxy, 1-ethylbutoxy, 2-ethylbutoxy, 1 , 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-trimethylpropoxy, 1-ethyl
  • alkylcarbonyl radicals are branched or unbranched -CC-alkylcarbonyl chains, such as, for example, methylcarbonyl, ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, 1-methylethylcarbonyl, n-butylcarbonyl, 1-methylpropylcarbonyl, 2-methylpropylcarbonyl, 1,1-dimethylethylcarbonyl, n- Pentylcarbonyl, 1-methylbutylcarbonyl, 2-methylbutylcarbonyl, 3-methylbutylcarbonyl, 2, 2-dimethylpropylcarbonyl, 1-ethylpropylcarbonyl, n-hexylcarbonyl, 1, 1-dimethylpropyicarbonyl, 1, 2-dimethylpropylcarbonyl, 1-methylpentylcarbonyl, 2-methylpentylcarbonyl, 3-methylpentylcarbonyl, 4-methylpentylcarbonyl, 1, 1-dimethylbut
  • Alkenylcarbonyl radicals are branched or unbranched C 2 -C 10 alkenyl chains, such as, for example, ethenylcarbonyl, propenylcarbonyl, 1-butenylcarbonyl, 2-butenylcarbonyl, 3-butenylcarbonyl, 2-methylpropenylcarbonyl, 1-pentenylcarbonyl, 2-pentenylcarbonyl, 3-pentenylcarbonyl, 4-pentenylcarbonyl Pentenylcarbonyl, 1-methyl-1-butenylcarbonyl, 2-methyl-1-butenylcarbonyl, 3-methyl-1-butenylcarbonyl, 1-methyl-2-butenylcarbonyl, 2-methyl-2-butenylcarbonyl, 3-methyl-2-butenylcarbonyl, l-methyl-3-butenylcarbonyl, 2-methyl-3-butenylcarbonyl, 3-methyl-3-butenylcarbonyl, 1, l-dimethyl-2-propen
  • substituents of the said radicals of R 3 are in principle all possible substituents in question, do not hinder the Halogenaseretician, for example one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, Hydroxy, alkyl, cycloalkyl, aryl, alkoxy, benzyloxy, phenyi or benzyl.
  • substituents of the said radicals of R 3 are in principle all possible substituents in question, do not hinder the Halogenaseretician, for example one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, Hydroxy, alkyl, cycloalkyl, aryl, alkoxy, benzyloxy, phenyi or benzyl.
  • aryl radicals are phenyl, methoxyphenyl or naphthyl or aromatic rings or ring systems with 6 to 18 carbon atoms in the ring system and up to 24 further C atoms which can form further non-aromatic rings or ring systems with 3 to 8 C atoms in the ring understand, which may be substituted with one or more radicals such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, alkyl, alkoxy, or other radicals.
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • cyano cyano
  • nitro, amino, hydroxy, alkyl, alkoxy, or other radicals optionally substituted phenyl, methoxyphenyl and naphthyl are preferred.
  • Hetaryl radicals are simple or condensed aromatic ring systems with one or more heteroaromatic 3- to 7-membered rings, which can contain one or more heteroatoms such as N, 0 or S, and optionally with one or more radicals such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine , Cyano, nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy or other aromatic or further saturated or unsaturated non-aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • Cyano nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy or other aromatic or further saturated or unsaturated non-aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • R 4 and R 5 in the compounds of the formulas I and II independently of one another denote hydrogen, hydroxyl, halogen, nitro, cyano, substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl, C ⁇ -C ⁇ o-alkoxy- , C 2 ⁇ C ⁇ o-alkenyl, C 2 -C ⁇ o-alkenyloxy, substituted or unsubstituted C -C ⁇ o-cycloalkyl-, aryl, hetaryl, R ⁇ R 7 N- and where two radicals R 4 and R 5 on adjacent carbon atoms together can form a further substituted or unsubstituted aromatic, saturated or partially saturated ring with 5 to 6 atoms in the ring, which may contain one or more heteroatoms such as 0, N or S.
  • Halogen means fluorine, bromine or chlorine, preferably chlorine.
  • Substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C 10 alkenyl chains such as, for example, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl may be used as alkenyl radicals , 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-1-butenyl, 2-methyl-1-butenyl, 3-methyl-1-butenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3 -Methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl,
  • alkoxy radicals are substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkoxy chains such as methoxy, ethoxy, propoxy, 1-methylethoxy, butoxy, 1-methylpropoxy, 2-methylpropoxy, 1, 1-dimethylethoxy, pentoxy, 1-methyl - butoxy, 2-methylbutoxy, 3-methylbutoxy, 1, 1-dimethylpropoxy,
  • Substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C ⁇ alkenyloxy chains such as, for example, ethenyloxy, propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy, 3-butenyloxy, 2-methylpropenyloxy, 1-pentenyloxy, 2-pentenyloxy, 3-pentenyloxy, may be used as alkenyloxy radicals , 4-pentenyloxy, 1-methyl-1-butenyloxy, 2-methyl-1-butenyloxy, 3-methyl-1-butenyloxy, 1-methyl-2-butenyloxy, 2-methyl-2-butenyloxy, 3-methyl-2 - Butenyloxy, l-methyl-3-butenyloxy, 2-methyl-3-butenyloxy, 3-methyl-3-butenyloxy, 1, l-dimethyl-2-propenyloxy, 1, 2-dimethyl-1-propenyloxy, 1, 2 -Dimethyl-2-prop
  • Examples of substituted or unsubstituted branched or unbranched C 1 -C 8 cycloalkyl chains with 3 to 7 carbon atoms in the ring or ring system such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, 1-methylcyclopropyl, 1-ethylcyclopropyl, 1-propylcyclopropyl, 1-butylcyclopropyl, are examples of cycloalkyl radicals , 1-pentylcyclopropyl, 1-methyl-l-butylcyclo- propyl, 1, 2-dimethylcyclypropyl, l-methyl-2-ethylcyclopropyl, cyclooctyl, cyclononyl or cyclodecyl.
  • the cycloalkyl radicals can also contain heteroatoms such as S, N and 0 in the ring.
  • Aryl includes, for example, simple or condensed aromatic ring systems, which may not contain one or more radicals such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • cyano nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • phenyl, methoxyphenyl and naphthyl are preferred.
  • substituents are suitable as substituents for the radicals mentioned of R 4 and R 5 , for example one or more substituents such as halogen such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, alkyl, cycloalkyl, aryl, alkoxy, benzyloxy, Phenyi or benzyl.
  • R 5 and R 7 in the substituent R 6 R 7 N - independently of one another are hydrogen or substituted or unsubstituted, branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl.
  • Methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, i-propyl or i-butyl are preferred.
  • substituents which do not impede the halogenase reaction for example one or more substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, are suitable as substituents for the radicals mentioned of R 6 and R 7 .
  • R 8 in the substituent 0 denotes n
  • R 8 C 0 - substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 1 -C 8 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, substituted or unsubstituted aryl.
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched C ⁇ -C ⁇ o-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl , 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethy
  • Aryl includes, for example, simple or condensed aromatic ring systems, which may not contain one or more radicals such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • cyano nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • phenyl, methoxyphenyl and naphthyl are preferred.
  • alkyl radicals are substituted or unsubstituted branched or unbranched -CC-alkyl chains such as methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, n-pentyl , 1-methylbutyl,
  • Methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, i-propyl or i-butyl are preferred.
  • Substituted or unsubstituted, branched or unbranched C 2 -C ⁇ alkenyl chains such as, for example, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3 -Pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-1-butenyl, 2-methyl-1-butenyl, 3-methyl-1-butenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl -2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1, l-dimethyl-2-propenyl, 1, 2-dimethyl-l-propenyl
  • Aryl includes, for example, simple or condensed aromatic ring systems, which may not contain one or more radicals such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • cyano nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy, aryl, hetaryl or other saturated or unsaturated aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • phenyl, methoxyphenyl and naphthyl are preferred.
  • Hetaryl includes, for example, simple or fused aromatic ring systems with one or more heteroaromatic 3- to 7-membered rings, which can contain one or more heteroatoms such as N, 0 or S, and which may contain one or more radicals such as halogen, such as fluorine, chlorine or Bromine, cyano, nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy or further aromatic or further saturated or unsaturated saturated non-aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • halogen such as fluorine, chlorine or Bromine
  • cyano nitro, amino, hydroxy, thio, alkyl, alkoxy or further aromatic or further saturated or unsaturated saturated non-aromatic rings or ring systems may be substituted.
  • substituents which do not impede the halogenase reaction, for example one or more substituents such as halogen, such as fluorine, chlorine or bromine, cyano, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, are suitable as substituents for the radicals mentioned of R 8 and R 9 .
  • halogen such as fluorine, chlorine or bromine
  • cyano nitro, amino, hydroxyl, alkyl
  • substituents for the radicals mentioned of R 8 and R 9 are suitable as substituents for the radicals mentioned of R 8 and R 9 .
  • An organism which contains at least one gene for the halogenase described above can be used for the process according to the invention.
  • a microorganism is preferably used.
  • Halogenase containing organism or with a purified or purified enzyme Halogenase containing organism or with a purified or purified enzyme.
  • halogen donor is advantageously added to the reaction.
  • Halogen is preferably chlorine or bromine.
  • Fluorine and iodine are less preferred because they can have a toxic effect, so that the activity of the organisms is hindered or even killed.
  • the reaction is also possible with fluorine and iodine.
  • the method according to the invention can grow or rest
  • the organisms used for the halogenation are grown in a medium which enables the growth of these organisms, preferably microorganisms.
  • This medium can be a synthetic or a natural, complex medium.
  • media known to the person skilled in the art are used.
  • the media used generally contain a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and possibly small amounts of vitamins and trace elements.
  • Advantageous nitrogen sources are organic or inorganic nitrogen compounds or materials that contain these compounds.
  • ammonium salts such as NHC1 or (NH) 2 S0 4 , nitrates, urea, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, beer yeast autolysate, soybean meal, wheat gluten, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, yeast or potato protein, which can often also serve as a carbon source at the same time.
  • inorganic salts are the salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, manganese, potassium, zinc, copper and iron.
  • the chloride, sulfate and phosphate ions are particularly worth mentioning as the anion of these salts.
  • growth factors are added to the nutrient medium, such as vitamins or growth promoters such as biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, pantothenate or pyridoxine, amino acids such as alanine, cysteine, proline, aspartic acid, glutamine, serine, phenylalanine, ornithine or
  • carboxylic acids such as citric acid, formic acid, pimelic acid or lactic acid, or substances such as dithiothreitol.
  • the mixing ratio of the nutrients mentioned depends on the organism and the type of fermentation and is determined in each individual case.
  • the medium components can all be introduced at the beginning of the fermentation, after they have been sterilized separately if necessary or sterilized together, or else they can be added continuously or discontinuously during the fermentation as required.
  • the breeding conditions are determined in such a way that the organisms grow optimally and that the best possible yields are achieved.
  • Preferred cultivation temperatures are 15 ° C to 40 ° C. Temperatures between 25 ° C and 37 ° C are particularly advantageous.
  • the pH is preferably held in a range from 3 to 9. PH values between 5 and 8 are particularly advantageous.
  • an incubation period of a few hours to a few days, preferably from 8 hours to 21 days, particularly preferably from 4 hours to 14 days, is sufficient.
  • the maximum amount of product in the medium accumulates within this time.
  • the person skilled in the art can learn, for example, how media can be optimized advantageously from the textbook Applied Microbial Physiology, "A Practical Approach (Eds.
  • the process according to the invention can be carried out continuously or batchwise in a batch or fed-batch manner.
  • the pH can be regulated or not regulated during the fermentation.
  • the fermentation takes place at a pH between 5 and 9, preferably 6 and 9.
  • glycopeptide antibiotics An analysis method for glycopeptide antibiotics is Nadkarni et al. (J. Antibiotics 1994: 334-341).
  • the process according to the invention is carried out with free enzymes (crude extract or purified enzyme), it is advantageously possible to work in a further temperature range.
  • This temperature range is determined on the one hand by the reaction rate, that is, very low temperatures lead to a slow reaction rate, on the other hand it is determined by the temperature resistance of the enzyme, that is, high temperatures lead to denaturation of the enzyme.
  • a temperature range between 5 and 80 ° C, preferably from 10 to 60 ° C, particularly preferably from 20 to 40 ° C is advantageous.
  • Dormant cells are also suitable for the process, and if appropriate, like the enzymes, can also be advantageously immobilized.
  • the cell membranes are destabilized so that the educts and the product can reach the reaction site (enzyme) more easily.
  • the destabilization can take place, for example, using various alkali or alkaline earth metal salts such as lithium, rubidium or calcium salts or by treatment with solvents.
  • the halogenases or halogenase genes used in the process according to the invention belong to the NADH-dependent halogenases, which differ from the haloperoxidases due to their regio- and / or stereoselectivity.
  • the preferred halogenase from Amycolatopsis mediterranei has 491 amino acids (SEQ ID NO: 2).
  • Her gene was named bhaA.
  • the enzyme has a NADH / FAD binding site.
  • ß & ß-fold sequence motif which is probably involved in the ADP binding of FAD and NAD-dependent enzymes.
  • An Asp residue is conserved at position 304 of the protein, which may enable FAD binding.
  • bhaA may also bind FAD.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lad 1 --- T7, T5, Contain T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -P R - or in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lad 1 --- T7, T5, Contain T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -P R - or in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • the substrate specificity can be increased and / or changed in the desired direction by means of various mutagenesis methods, for example site directed mutagenesis, error prone PCR and / or gene shuffling.
  • balhimycin biosynthetic gene cluster Different gene inactivation experiments clearly showed that different genes of the cluster on 16.1, such as genes for glycosyltransferases and cytochrome P450-dependent mono-oxygenases, are involved in balhimycin biosynthesis. This was proof of the identification of the balhimycin biosynthetic gene cluster.
  • the gene has an ATG start codon and a TGA stop codon.
  • a streptomycete-typical promoter could not be found in this sequence.
  • the gene is defined by the start and stop codons highlighted in bold).
  • the gene replacement mutant PH3 (see FIG. 5, generation of the gene replacement mutant PH3) was generated, which was used exclusively for the production of the in-frame deletion mutant PH4 (see FIG. 6, generation of the in-frame deletion mutant PH4) (see 3, construction of plasmids for gene exchange and "in frame” deletion of the balhimycin halogenase gene bhaA, + FIG. 4, construction of plasmids for gene exchange and "in frame” deletion of the balhimycin halogenase gene bhaA).
  • the starting plasmid for the necessary vector constructions was a pVC18 derivative (pVC18B3.0), which carries the 3088 bp BamHI fragment on which, inter alia, the bhaA gene is localized (see FIG. 3, construction of plasmids for gene exchange and "in frame" deletion of the balhimycin halogenase gene bhaA). All DNA isolations, restriction cleavages and cloning were, unless otherwise described, as described by Sambrook, J., Fritsch, ⁇ .F. and Maniatis, F., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
  • the primers had the following sequence:
  • both inserts were cloned as EcoRI / Sphl fragment in the vector pSPl (Pelzer et al., 1997), which is non-replicative and can be used for gene inactivation in the balhimycin producer, so that the plasmids pPH4 (deletion construct) and pPH3 ( Gene replacement construct) arose (Fig. 4).
  • the gene replacement mutant PH3 was created.
  • the balhimycin producer was transformed with the plasmid pPH3 using the "direct transformation" (Pelzer et al., 1997).
  • the gene replacement mutant PH3 could be identified by suitable selection (chloramphenicol resistance and erythro mycin sensitivity, FIG. 5) and verified by Southern hybridizations (Sambrook, see above).
  • This gene replacement mutant PH3 was then transformed with the deletion plasmid pPH4.
  • the primary selection was initially based on an integration of the entire vector via homologous recombination (chloramphenicol resistance and erythromycin resistance, FIG. 6).
  • the selection pressure for vector elimination was then removed by homologous recombination. Chloramphenicol-sensitive and erythromycin-sensitive colonies were found. Southern hybridizations verified the mutant PH4 as the correct in-frame deletion mutant in the bhaA gene.
  • the product range of the clone pH4 corresponded to that of the wild type.
  • unglycosylated compounds (Verb. 7 ⁇ , 8 ⁇ , 9 ⁇ ) were detected in the culture filtrates of this mutant and were not detected in the wild-type product range. 7 shows the structure of the balhimycin.
  • Table 1 Product spectrum of the wild-type and mutant compounds identified with KPLC-ES-MS. The non-chlorinated biosynthesis products are labeled " ⁇ ".
  • Fig. 8 ES mass spectra of dechlorobalhimycin (mutant PH4) and balhimycin (wild type).
  • the characteristic isotope patterns prove the inactivation of the halogenase BhaA.
  • Line spectra correspond to the theoretically expected isotope distributions. Optimized purification
  • the filtered culture supernatants were shaken out three times with the volume of the culture filtrate with ethyl acetate. Before application to the XADl ⁇ column, the culture supernatants were again filtered through a porcelain frit (filter G3) and eluted with the step gradient shown in Table 2. The fractions were examined for the content of crude peptide with HPLC-MS, the solvent was removed in vacuo and freeze-dried.
  • the ES-MS spectra were recorded on an API-III triple quadrupole mass spectrometer (Sciex, Thornhill, Canada). Unless otherwise noted, the samples were dissolved in ACN / H 2 0 (1: 1, 0.1% formic acid) and the spectra recorded in positive ion mode. The sample was fed using a microbore pump (140A Solvent Delivery System, ABI, Rothstadt) with a flow rate after split of 5 ⁇ l / min. A UV detector (Linear UWIS 204, Linear Instruments, Reno, Nevada) was used for detection. 0.1% trifluoroacetic acid (solvent A) and acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid (solvent B) served as the mobile phase. The separations were carried out on an analytical column (Nucleosil RP-C18, 5 ⁇ m, 2 x 100 mm, Grom,dorfberg). Dechlorobalhimycin

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Halogenierung, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei die Halogenase von der (a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von (b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder (c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert wird oder von einer (d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30 %ige Identität oder über 60 %ige Ähnlichkeit aufweist.

Description

Nukleinsäurefragment und Vektor, enthaltend eine Halogenase, sowie ein Verfahren zur Halogenierung chemischer Verbindungen
5 Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Halogenierung chemischer Verbindungen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurefragment, einen Vektor und Organismen 10 enthaltend eine Halogenase bzw. ein Halogenasegen.
In der chemischen Synthese sind Halogenierungsreaktionen seit langem bekannt. Sie dienen der Herstellung einer Vielzahl von halogenierten organischen Verbindungen. Von Nachteil bei diesen
15 Synthesereaktionen ist, daß für die Synthese spezielle Anlagen benötigt werden. Diese Anlagen müssen besonders gegen Korrosion geschützt werden, da die Reaktionsprodukte häufig sehr korrosiv sind. Häufig bilden sich während der Synthese neben dem gewünschten Produkt Nebenprodukte, die zu Produktverunreinigungen
20 führen. Diese Nebenprodukte müssen, falls sie im Endprodukt nicht tolerierbar sind, aufwendig abgereinigt werden. Viele der Nebenprodukte sind darüber hinaus toxisch. In einer Reihe von Reaktionen kann es zur Dioxinbildung kommen.
25 Eine Alternative zur chemischen Halogenierung stellt die enzymatische Synthese dar. Sie ist in der Regel sehr selektiv, das heißt es werden in der Regel keine Nebenprodukte gebildet.
Aus der Literatur sind mit den sogenannten Haloperoxidasen Enzyme 30 bekannt, die in Gegenwart eines Halogenions und Wasserstoffperoxid organische Verbindungen halogenieren. Beispiele für derartige Enzyme sind die Haloperoxidase aus Streptomyces aureo- faciens (Kren et al., Liebigs Ann. /Red., 1997, 11: 2379-83), aus Rhodococcus erythropolis (Schrijver et al . , Appl. Environ. Micro- 35 biol.,1997, 63, 5: 1911-1916), aus Amycolatopsis orientalis (van Wageningen et al., Chem. Biol., 1998, 5: 155-162), aus Caldario- myces fumago (Hohaus et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl . , 1997, 36, No. 18: 2012-2013), aus Streptomyces lividans oder Serratia marcescens (von Pee, K.H., Ann. Rev. Microbiol., 1996, 50: 40 375-99) .
Es ist nicht absolut klar, ob die Halogenierungsreaktion die eigentliche Enzymreaktion dieser Haloperoxidasen darstellt oder aber ob es nur eine Nebenreaktion ist. Sehr häufig zeigen die 45 Enzyme eine geringe Substrat- und Cosubstrataffinität und eine für Enzyme geringe Spezifitat. Neben den Haloperoxidasen sind weitere halogenierende Enzyme aus der Literatur bekannt. So beschreiben Kirner et al. (J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, No . 7, p. 1939-1943) bzw. Hohaus et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, No. 18, 2012-2013) eine Halogenase, die ein Chloroatom in 7-Position des Tryptophans einführ .
Weitere Enzyme werden in Hammer et al . (Appl. Environ. Micro- biol., 1997, Vol. 63, No. 6, 2147-2154), de Schrijver et al. (Appl. Environ. Microbiol . , 1997, Vol. 63, No . 5, 1911-1916), Nowak-Thompson et al. (J. Bacteriol., 1999, 181: 2166-2174), Solenberg et al. (Chem. Biol., 4, 1997: 195-202) und Dairi et al. (Biosci., Biotechnol. Biochem. 59, 1995, 1099-1106) beschrieben.
GenBank (Y 16952) ist ein 9,9 kb langes Amycolatopsis mediterranei DNA-Fragment zu entnehmen. Pelzer et al. beschreiben im GenBank-Eintrag zwei Funktionen dieser DNA. Sie codiert für Oxygenasen und Glycosyltransferasen. Weitere Funktionen werden nicht genannt.
Keines der Enzyme wird bisher zur technischen Herstellung von halogenierten organischen Verbindungen verwendet. Es bestand daher die Aufgabe, ein Enzym für die technische Synthese halo- genierter organischer Verbindungen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Halogenierung gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei die Halogenase von der
(a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
(c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert wird oder von einer
(d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit auf- weist.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Halogenase läßt sich in dem Fachmann bekannter Weise aus Organismen isolieren. Bevorzugt läßt sie sich aus Organismen isolieren, die haloge- nierte Verbindungen, beispielsweise Glykopeptid-Antibiotika, synthetisieren. Beispiele für derartige Organismen finden sich bei den Bacteria und Eucarya wie Algen wie Ascophyllum oder Synechocystis, Flechten, Pilze wie Caldariomyces, Hefen und Bakterien wie gram-positive Bakterien wie die Actinomycetales, die Bacillales oder gram-negative Bacterien wie Pseudomonas. Die Halogenase läßt sich vorteilhaft auch aus nocardioformen Actinomyceten oder Streptomyceten isolieren.
Besonders bevorzugt läßt sich die Halogenase oder die Halogenasen (im folgenden bzw. für die Anmeldung soll singular und plural als synonym gelten) aus Glykopeptid-Antibiotika produzierenden Mitgliedern der Familie der Pseudonocardiaceae und verwandten Bakterien isolieren, wie aus den Gattungen Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora. Amycolatopsis, Thermo- crispum, Pseudoamycolata, Kibdelosporangium, Amycolata, Actino- polyspora, Actinokineospora oder Actinobispora, beispielhaft seien die Gattungen und Arten Nocardia mediterranei, Amycolatopsis mediterranei, Streptomyces mediterranei, Nocardia spec, Amycolatopsis spec, Streptomyces spec, Nocardia orientalis, Amycolatopsis orientalis, Streptomyces orientalis, Streptomyces toyocaensis oder Streptomyces viridochromogenes . Ganz besonders bevorzugt seien Amycolatopsis orientalis C329.4, A82846 und
ATCC19795 und Amycolatopsis mediterranei DSM 5908 genannt. Auch aus Organismen der Gattung Streptomyces, speziell der Gattung und Art Streptomyces mediterranei, läßt sich das Enzym vorteilhaft isolieren.
Weiterhin läßt sich die Halogenase bzw. die Nukleinsäure, die für die Halogenase codiert, aus den Gattungen Rhodococcus, Thermo- monospora, Bacillus, Serratia, Actinosporangium, Actinomadura, Actinoplanes oder Micromonospora isolieren.
Das Gen für die Halogenase läßt sich aus einer Genbank dieser Organismen über verschiedene dem Fachmann bekannte Techniken isolieren. Eine dieser Techniken ist beispielsweise das "Fischen" des Gens über die Hybridisierung mit der in SEQ ID NO: 1 genann- ten Sequenz oder Teilen dieser Sequenz aus der Genbank.
Ein entsprechendes Versuchsprotokoll ist beispielsweise den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, oder von D.M. Glover et al., DNA Cloning, Vol. 1 (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) zu entnehmen. Als weitere Methode sei die PCR-Klonierungstechnik genannt (siehe Beispiele) . In Pelzer et al. (J. Biotechnol., 56 [1997], 115-128) wird unter Punkt 2.4 die Herstellung einer Gen- (DNA)bibliothek für Amycolatopsis mediterranei beschrieben. Weitere Methoden für andere Organismen sind dem Fachmann bekannt und können Lehr- büchern wie Sambrook et al . (1989) entnommen werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell alle Organismen verwendet werden die mindestens eine Genkopie der Halogenase enthalten.
Dies können Organismen sein, die das Gen natürlicherweise enthalten, oder die das Gen in klonierter Form enthalten. Dabei kann das Gen in den natürlichen Wirtsorganismus oder aber in einen anderen Organismus eingebracht worden sein.
Bevorzugt werden Wirtsorganismen verwendet, die eine vorteilhafte gute bzw. hohe Verträglichkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln, gegenüber den umzusetzenden Substanzen, gegenüber erhöhten Temperaturen und veränderten Drücken aufweisen. Vor- teilhaft werden Organismen verwendet, in die mindestens ein Halogenasegen eingebracht wurde.
Wirte, die diese neben anderen vorteilhaften Bedingungen erfüllen, lassen sich in fast allen Bereichen des Tier-, Pflanzen- und Bakterienreiches finden.
Vorteilhafte Mikroorganismen, die als WirtsOrganismen fungieren können, lassen sich unter den Pilzen, Hefen und Bakterien finden.
Als prokaryontische Wirtsorganismen im erfindungsgemäßen Verfahren kommen prinzipiell alle gram-negativen oder gram-positiven Bakterien in Frage. Als gram-negative Bakterien seien beispielhaft die Enterobacteriaceae wie die Gattungen Escherichia, Aerobacter, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Serratia, Erwinia oder Salmonella oder die Pseudomonadaceae wie die Gattungen Pseudomonas, Xanthomonas, Burkholderia, Gluconobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Methanomonas , Comamo- nas, Cellulomonas oder Acetobacter genannt.
Als gram-positive Bakterien seien beispielhaft die Endosporen- bildenden gram-positiven aeroben oder anaeroben Bakterien wie die Gattungen Bacillus, Sporolactobacillus oder Clostridium, die coryneformen Bakterien wie die Gattungen Arthrobacter, Cellulomonas, Curtobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Micro- bacterium oder Kurthia oder die Actinomycetales wie die Familien Pseudonocardiaceae, Streptomycineae oder Nocardiaceae mit den Gattungen wie Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Nocardia, Amycolatopsis, Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharo- polyspora oder Thermocrispum genannt. Bevorzugt werden Bakterien der Gattungen Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Brevibacterium, Strepto- myces, Actinomyces, Mycobacterium, Gordona, Micrococcus, Rhodococcus, Nocardia oder Amycolatopsis verwendet.
Besonders bevorzugt werden Gattungen und Arten wie Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mutabilis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniforrnis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Streptomyces sp., Streptomyces lividans, Amycolatopsis mediterranei, Amycolatopsis orientalis, Nocardia mediterranei oder Nocardia orientalis verwendet.
Vorteilhaft werden Organismen verwendet, für die die zum Ein- bringen genetischer Information erforderlichen Methoden schon vorhanden sind, wie beispielsweise für Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia oder Amycolatopsis.
Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert werden. Aufgrund dieser in der Vergangenheit häufig erforderlichen taxonomischen Umgruppierungen der genannten Gattungen innerhalb der bakteriellen Systematik sind auch andere als die oben genannten Familien, Gattungen und Arten für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, sowohl als AusgangsOrganismus zur Isolierung der Halogenase bzw. des Halogenasegens als auch zum Einbringen der DNA.
Als eukaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Verfahrens kommen prinzipiell alle Organismen in Frage wie Pilze, Hefen, Pflanzen, pflanzliche Zellen oder tierische Zellen. Als Hefen seien die Gattungen Rhodotorula, Yarrowia, Sporobolomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Saccharomyces oder Schizosaccharo- myces bevorzugt genannt . Besonders bevorzugt sind die Gattungen und Arten Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolytica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus, Saccharomyces cerevisiae, Candida boidinii, Candida bombicola, Candida cylindracea, Candida para- psilosis, Candida rugosa, Candida tropicalis, Pichia methanolica oder Pichia pastoris. Als Pilze seien Aspergillus, Canninghamella, Beauveria, Mucor, Neurospora, Penicillium oder Rhizoctonia beispielhaft genannt. Vorteilhaft werden als Pilze folgende Gattung und Art im erfindungsgemäßen Verfahren verwandt: Aspergillus awamori, Aspergillus candidus, Aspergillus ficuu , Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Beauveria densa, Beauveria nivea, Mucor miehei, Mucor rouxii, Mucor sp., Neurospora crassa, Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Rhizoctonia repens oder Rhizoc- tonia solani.
Auch Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Lavendula vera sind geeignet. Besonders bevorzugt werden pflanzliche Zellkulturen, Protoplasten aus Pflanzen oder Kalluskulturen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine chemische Verbindung wie oben beschrieben in Gegenwart einer Halogenase zur entsprechenden halogenierten Verbindung umgesetzt.
Die Halogenase wird dabei (a) von der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert oder (b) von einer Nuklein- säuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von [a] oder (c) einer mit [a] oder [b] unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert oder (d) von einer Sequenz, die mit der unter [a] genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist.
Diese unter (a) bis (d) genannten Sequenzen lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vorteilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektroporation, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinj ektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al . (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird ebenfalls als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten 5 oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektro- poration, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium ver-
10 mittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Molec.Biol. 42 (1991)
15 205-225 beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaci ens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird bei-
20 spielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende 5 Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Die in die Organismen eingebrachte Nukleinsäure kann dabei in den Organismen als extrachromosomales Element oder integriert in das 0 Genom vorliegen.
Die Integration in das Genom kann beispielsweise über heterologe oder homologe Rekombination erfolgen.
5 Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in die Organismen eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische 0 Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Hydrola- segene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidase- gene, Peroxidasegen oder Gene wie das Luciferasegen, ß-Galactosi- dasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidasegen, ß-Lacta- masegen, Acetyl-, Phospho- oder Adenyltransferasegen genannt. 5 Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizier- barkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene.
Anstelle der Reportergene oder des Reportergens kann aber auch vorteilhaft ein Antibiotika- oder sonstiges Resistenzgen oder ein Biosynthesegen verwendet werden.
In Pelzer et al. wird ein spezielles Genklonierungssystem für den Glycopeptidantibiotika-Produzenten Amycolatopsis mediterranei beschrieben, speziell für den Stamm DSM5908.
Pelzer et al. beschreiben ein modifiziertes direktes Transformationsverfahren zum Einbringen von DNA. Die Effizienz der DNA-Aufnahme hängt vom Alter der Kultur ab. Die besten Ergebnisse lassen sich mit Myzel aus der frühen stationären Phase (52 bis 55 Stunden) erzielen. Auf die Arbeit von Pelzer et al . (J. Bio- technol. 56 [1997], 115-128) wird an dieser Stelle ausdrücklich bezug genommen.
Als weitere vorteilhafte Methoden zum Einbringen von Nukleinsäuren in beispielsweise Actinomyceten wie Streptomyceten seien beispielhaft die Konjugation (Muth, G. , Brolle, D.F., Wohlleben, W. , 1999, Genetics of Streptomyces, in "Manual of Industrial Microbioiogy and Biotechnology" , Eds. Demain, A.L. and Davies, J.E., ASM Press, Washington, D.C.), und die PEG- induzierte Protoplastentransformation (Hopwood, D.A. et al . , 1985, Genetic manipulation of Streptomyces; a laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, U.K. und W. Wohlleben und G. Muth, 1993, Streptomyces plasmid vectors, p. 147-175, In K.G. Harley, ed., Plasmids: A practical approach, Oxford University Press, Oxford und Muth, G., Brolle, D.F., Wohlleben, W. , 1999, s.o.) genannt. Beide Methoden können, wie dem Fachmann bekannt ist, leicht auf andere Actinomycetales-Stämme übertragen werden .
Vorteilhaft wird zur Umgehung des bei Actinomyceten häufig vorhandenen starken Restriktionssystems die zu transformierende Nukleinsäure vor der eigentlichen Transformation durch Hitze- denaturierung in Anwesenheit oder Abwesenheit des Phagen fl-origins (Hillemann et al., 1991, Nucleic Acids Res. 194, 727-731) oder durch alkalische Denaturierung/Renaturierung (Oh und Chater, 1997, J. Bacteriol., 179, 122-127) in Einzelstrang-DNA überführt .
Zur Umgehung der Restriktion durch den Wirtsorganismus kann die DNA gerade bei Actinomyceten vorteilhaft durch interspezifische Konjugation von beispielsweise Escherichia coli auf Actinomyceten übertragen werden. Auch seltene Actinomyceten-Stämme sind so zugänglich (Baltz, R.H., 1998, Trends in Microbiology, 6, 76,83, Flett et al., 1997, FEMS Microbiol. Lett., 155, 223-229). Auch mit Hilfe der Elektroporation können Nukleinsäuren vorteilhaft in 5 Actinomyceten-Stämme eingebracht werden (Muth, G., Brolle, D.F., Wohlleben, W. , 1999, s.o.; English et al., 1998, J. Ind. Microbiology and Biotechnology, 21, 219-224; Lal , R. et al . , 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 665-671). Weiterhin sei als vorteilhafte Variante der Elektroporation auch die Electroduction 10 erwähnt. Sie ermöglicht einen schnellen direkten DNA-Transfer von E. coli nach Actinomyceten durch Elektroporation mit Hilfe von Shuttle-Vektoren (Muth, G., Brolle, D.F., Wohlleben, W. , 1999).
Neben einzelnen Zellen kann auch Myzel bei Amycolatopsis und 15 Nocardia unter Zugabe von CsCl2, Kalbsthy us-DNA und PEG vorteilhaft transformiert werden (Pelzer et al . , 1997; Madon J. und R. Hütter, 1991, J. Bacteriol., 173, 6325-6331, Vrijbloed, J.W. et al., 1995, Plasmid 34, 96-104; Kumar, C.V. et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 60, 4086-4093). 20
Unter einer Nukleinsäuresequenz , die für ein funktionelles Fragment von (a) codiert, sind Sequenzen zu verstehen, die gegenüber (a) verkürzt sind, aber noch die enzymatische Aktivität aufweisen. Diese Sequenzen können am 3 ' - oder 5 '-Ende der Sequenz ver- 25 kürzt worden sein. Es ist auch möglich, daß Teile innerhalb der codierenden Sequenz im Leseraster entfernt wurden, ohne daß die enzymatische Aktivität verloren gegangen ist.
In der Regel sind die funktioneilen Fragmente gegen der Sequenz 30 (a) um 5 bis 30 % verkürzt, bevorzugt um 10 bis 20 %. Theoretisch sind auch gegenüber der Sequenz (a) verlängerte Sequenzen denkbar.
Unter Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit den unter (a) 35 und (b) genannten Sequenzen hybridisieren, sind Sequenzen zu verstehen, die beispielsweise bei Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 5xSSC (lxSSC 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat; pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 40 42°C in 5xSSC und 50 % Formamid hybridisieren.
Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 45 zu entnehmen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze spezifische Oligo- nukleotide mit einer Länge von mindestens 20 bis 25 Nukleotiden verwendet. Bevorzugt werden Oligonukleotide von mindestens 25 Nukleotiden verwendet. Aber auch längere Oligonukleotide 50 bis 200 Nukleotide oder noch längere Teile bis zur gesamten Nukleinsäuresequenz [siehe (a) und (b)] können vorteilhaft verwendet werden .
Unter Nukleinsäuren sind im erfindungsgemäßen Verfahren bei- spielsweise DNA, cDNA, RNA oder mRNA zu verstehen. Weiterhin sind darunter auch die Homologen dieser Nukleinsäuresequenzen zu verstehen.
Unter Homologen sind beispielsweise die eukaryontischen oder prokaryontischen Homologen, verkürzte Sequenzen oder Einzelstrang-DNA zu verstehen. Diese können zur codierenden oder nicht codierenden Sequenz homolog sein.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können auch vorteilhaft Halogenasen verwendet werden, die von einer Sequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz eine über 30%ige, bevorzugt 50%ige, besonders bevorzugt 60%ige, ganz besonders bevorzugt über eine 95%ige Identität oder über eine 60%ige, bevorzugt 70%ige, besonders bevorzugt 80%ige, ganz besonders bevorzugt 97%ige Ähnlichkeit über die gesamte Länge auf der von der Sequenz abgeleiteten Aminosäureebene aufweisen (Blast-Programm, W. Gish und D.J. States, Nat. Genet., 3, 1993: 266-272) .
Diese Sequenzen sind vorteilhaft aus SEQ ID NO: 1 über Deletion, Insertion und/oder Substitution von Nukleotiden erhältlich, wobei auch hier wie in allen anderen Fällen die enzymatische Aktivität aus den Sequenzen abgeleiteten Halogenaseproteinen erhalten bleibt.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren chemische Verbindungen der folgenden allgemeinen Struktur I mit der oben genannten Halogenase umgesetzt:
wobei die Variablen und Substituenten in Formel I folgende Bedeutung haben:
R1 = Wasserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubsti- tuiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-,
C2-Cι0-Alkenyl-, Cχ-Cι0-Alkoxy-, C2-Cι0-Alkenyloxy- , R6R7N-,
0
B R8— c— 0—- ; R2 = Wasserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cι0-Alkenyl-, C2-Cι0-Alkenyloxy-, R6R7N-;
R3 = asserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, Cχ-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl-, C2-Cιo-Alkenyloxy-, Cι-Cιo-Alkylcarbonyi-, C2-Cχo-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,
0 R9 y c_ .
R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-, Halogen-, Nitro-, Cyano-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cχo-Alkenyl-, C2-Cιo-Alkenyloxy-, substituiertes oder unsubstituiertes C3-C10-Cycloalkyl-, Aryl-, Hetaryl-, R6R7N- und wobei zwei Reste R4 und R5 an benachbarten Kohlenstoff tomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie 0, N oder S enthalten kann;
R6 und R7 unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-;
R8 = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cχo-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-;
R9 = substituiertes oder unsubstituiertes , verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyi - , C2-Cιo~Alkenyl- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl - , Hetaryl- ; X = -CH- oder N; Y = 0 oder N; m = 0 oder 1 ; n = 0 , 1 , 2 oder 3 ; p = 0 oder 1.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden in Gegenwart der Halogenase zu den halogenierten Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel II umgesetzt:
wobei die Variablen und Substituenten in Formel II die unter Formel I genannte Bedeutung haben und Hai Chlor, Fluor, Brom oder Iod, bevorzugt Chlor oder Brom, bedeutet.
In der Regel sind für die Reaktion genügend Halogenatome in der Reaktionslösung vorhanden. Vorteilhaft wird jedoch ein Halogen- donor zur Reaktionslösung gegeben.
Als Halogendonor können prinzipiell alle Halogen-haltigen organischen oder anorganischen Verbindungen dienen. Der Einfachheit halber und aus Kostengründen werden anorganische Verbindungen bevorzugt. Vorteilhafterweise werden Halogene in Form ihrer Salze der Reaktionslösung zugegeben. Beispielhaft seien die Alkali- und/oder Erdalkalisalze der Halogene genannt.
R1 bezeichnet in den Verbindungen der Formel (= Struktur) I und II Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Ci-Cio-Alkyl-, C2-Cι0-Alkenyl-, Cι-Cι0-Alkoxy-, C2-Cι0-Alkenyloxy-, R6R7N- ,
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo~Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dirne hylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dirnethylpropyl, 1, 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1 , 3-Dimethylbutyl , 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1, 2-Trimethylpropyl, 1,2, 2-Trimethylpropyl , 1-Ethyl-1-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl. Besonders bevorzugt sind Methyl und Ethyl.
Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo~Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl- propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-l-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3 -Methyl-1-butenyl, l-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl , 3-Methyl-2-butenyl, l-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1, 1-Dirnethyl-2 -propenyl, 1, 2-Dimethyl-l-propenyl , 1, 2-Dirnethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2 -Methyl-1-pentenyl, 3 -Methyl-1-pentenyl , 4-Methyl-l-pentenyl, 1-Methyl-2 -pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3 -pentenyl, 2-Methyl-3 -pentenyl, 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl , l-Methyl-4-pentenyl, 2 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl , 4-Methyl-4-pentenyl, 1, 1-Dirnethyl-2 -butenyl, 1, 1-Dirnethyl-3 -butenyl, 1, 2-Dirnethyl- 1-butenyl, 1, 2 -Dimethyl-2-butenyl, 1, 2 -Dirnethyl-3 -butenyl,
1, 3 -Dirnethyl-1-butenyl, 1, 3 -Dimethyl-2 -butenyl, 1, 3-Dirnethyl- 3-butenyl, 2 , 2-Dimethyl-3-butenyl, 2, 3-Dimethyl-l-butenyl,
2, 3 -Dirnethyl-2 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-3 -butenyl, 3 , 3-Dimethyl-
1-butenyl, 3 , 3-Dimethy1-2-butenyl, 1 -Ethyl-1-butenyl , l-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3 -butenyl , 2-Ethyl-l-butenyl, 2-Ethyl-2 -butenyl, 2 -Ethyl-3 -butenyl, 1, 1 , 2-Trimethyl-2 -propenyl, 1-Ethyl-l-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2 -methyl-1-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-2- propenyl , 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver- zweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl- propoxy, 2-Methylpropoxy, 1, 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1 , 1-Dimethylpropoxy, 1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, i-Dimethylbutoxy, 1 , 2-Dimethylbutoxy, 1 , 3-Dimethylbutoxy, 2 , 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy, 1-Ξthylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- methylpropoxy, 1-Ethyl-l-methylpropoxy, l-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo~Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2 -Pentenyloxy, 3-Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-l- butenyloxy, 2-Methyl-l-butenyloxy, 3-Methyl-1-butenyloxy, l-Methyl-2-butenyloxy, 2-Methyl-2-butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, l-Methyl-3-butenyloxy, 2-Methyl-3-butenyloxy, 3 -Me hyl-3 -butenyloxy, 1 , 1-Dimethyl-2 -propenyloxy, 1, 2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1 , 2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-l-propenyloxy, l-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-l-pentenyloxy, 2-Methyl-l- pentenyloxy, 3-Methyl-l-pentenyioxy, 4-Methyl-l-pentenyloxy, l-Methyl-2-pentenyloxy, 2-Methyl-2-pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, l-Methyl-3-pentenyloxy, 2-Methyl-3-pentenyloxy, 3 -Methyl-3 -pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, l-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3 -Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1, 1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1, l-Dimethyl-3-butenyloxy, 1, 2-Dimethyl-l-butenyl- oxy, 1, 2 -Dimethyl-2-butenyloxy, 1, 2-Dimethyl-3-butenyloxy,
1, 3-Di-methyl-l-butenyloxy, 1, 3 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 1,3-Di- methyl-3 -butenyloxy, 2 , 2-Dimethyl-3-butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2 , 3 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 2 , 3 -Dimethyl-3-butenyloxy, 3 , 3-Dimethyl-l-butenyloxy, 3 , 3-Dimethy1-2-butenyloxy, 1-Ethyl-l-butenyloxy, l-Ethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-3 -butenyloxy, 2-Ethyl-l-butenyloxy, 2-Ethy1-2-butenyloxy, 2 -Ethyl-3 -butenyloxy, 1,1, 2-Trimethyl-2-propenyloxy, l-Ethyl-l-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyloxy, l-Ethyl-2-methyl-2 -propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt .
Als Substituenten der genannten Reste von R1 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl .
R2 bezeichnet in den Verbindungen der Formel I und II Wasser- stoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl-, C2-Cι0-Alkenyloxy-, R6RN-;
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver- zweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 1, 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1 , 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1, 1,2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2 -Butenyl, 3-Butenyl, 2 -Methyl- propenyl, 1-Pentenyl, 2 -Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-l-butenyl , 3-Methyl-l-butenyl, 1-Methyl-2 -butenyl, 2 -Methyl-2 -butenyl , 3 -Methyl-2 -butenyl, 1-Methyl-3 -butenyl, 2-Methyl-3 -butenyl, 3 -Methyl-3 -butenyl, 1, l-Dimethyl-2 -propenyl, 1 , 2-Dimethyl-l-propenyI , 1 , 2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl , l-Ethyl-2-propenyl , 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-l-pentenyl , 2 -Methyl-1-pentenyl, 3 -Methyl-1-pentenyl , 4-Methyl-l-pentenyl, 1-Methyl-2 -pentenyl, 2 -Methyl-2-pentenyl , 3 -Methyl-2 -pentenyl, 4-Methyl-2 -pentenyl, 1-Methyl-3 -pentenyl , 2-Methyl-3 -pentenyl , 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl , 1-Methyl-4-pentenyl, 2 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl , 4-Methyl-4-pentenyl, 1, l-Dimethyl-2 -butenyl , 1, 1-Dirnethyl-3 -butenyl , 1, 2-Dimethyl- 1-butenyl, 1 , 2-Dimethyl-2-butenyl, 1, 2 -Dimethyl-3 -butenyl , 1, 3-Dimethyl-l-butenyl, 1, 3 -Dirnethyl-2 -butenyl , 1, 3-Dimethyl- 3 -butenyl, 2 , 2-Dimethyl-3 -butenyl, 2, 3 -Dirnethyl-1-butenyl, 2, 3 -Dimethyl-2 -butenyl, 2 , 3 -Dirnethyl-3 -butenyl , 3 , 3 -Dirnethyl- 1-butenyl, 3 , 3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-l-butenyl , l-Ethyl-2- butenyl, l-Ethyl-3 -butenyl , 2-Ethyl-l-butenyl, 2 -Ethyl-2 -butenyl, 2-Ethyl-3 -butenyl, 1 , 1 , 2 -Trimethyl -2 -propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-l-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl- propoxy, 2-Methylpropoxy, 1, 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy, 1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, 1-Dimethylbutoxy, 1 , 2-Dimethylbutoxy, 1 , 3-Dimethylbutoxy, 2 , 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- methylpropoxy, 1-Ethyl-1-methylpropoxy, l-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo-Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2-Pentenyloxy, 3 -Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-l- butenyloxy, 2-Methyl-l-butenyloxy, 3-Methyl-l-butenyloxy, 1-Methyl-2 -butenyloxy, 2 -Methyl-2 -butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, 1-Methyl-3 -butenyloxy, 2 -Methyl-3 -butenyloxy, 3 -Methyl-3 -butenyloxy, 1 , l-Dimethyl-2-propenyloxy, 1 , 2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1, 2 -Dimethyl-2 -propenyloxy, 1-Ethyl-l-propenyloxy, l-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-l-pentenyloxy, 2-Methyl-l- pentenyloxy, 3-Methyl-l-pentenyloxy, 4-Methyl-1-pentenyloxy, l-Methyl-2 -pentenyloxy, 2 -Methyl-2 -pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, l-Methyl-3-pentenyloxy, 2-Methyl-3 -pentenyloxy, 3 -Methyl-3 -pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, l-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1, 1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1, l-Dimethyl-3 -butenyloxy, 1 , 2 -Dirnethyl-1-butenyl- oxy, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 1 , 2-Dimethyl-3 -butenyloxy, 1, 3-Di-methyl-l-butenyloxy, 1 , 3 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 1,3-Di- methyl-3 -butenyloxy, 2 , 2 -Dimethyl-3 -butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl-2 -butenyloxy, 2 , 3 -Dimethyl-3 -butenyl- oxy, 3 , 3-Dimethyl-l-butenyloxy, 3 , 3-Dimethyl-2-butenyloxy,
1-Ethyl-l-butenyloxy, l-Ethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-3 -butenyloxy, 2-Ethyl-1-butenyloxy, 2-Ethyl-2 -butenyloxy, 2 -Ethyl-3 -butenyloxy, 1, 1, 2-Trimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-l-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2 -methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-2 -propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyioxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Substituenten der genannten Reste von R2 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyi oder Benzyl .
R3 bezeichnet in den Verbindungen der Formel I und II Wasserstoff, Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl-, C2-Cιo-Alkenyloxy-, Cι-Cιo-Alkylcarbonyl- , C2-Cιo-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,
R9 y c .
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo~Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl , 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3 -Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 1 , 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl, 1, 1-Dimethyl- butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1 , 2 , 2-Trimethylpropyl , 1-Ethyl-l-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver- zweigte oder unverzweigte C2-Cιo~AlkenyIketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2 -Butenyl, 3 -Butenyl, 2-Methyl - propenyl, 1-Pentenyl, 2 -Pentenyl, 3 -Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-l-butenyl, 2 -Methyl-1-butenyl , 3-Methyl-l-butenyl, 1-Methyl-2 -butenyl, 2 -Methyl-2 -butenyl , 3 -Methyl-2 -butenyl, l-Methyl-3 -butenyl, 2 -Methyl-3 -butenyl , 3 -Methyl-3 -butenyl, 1, l-Dimethyl-2 -propenyl, 1 , 2-Dimethyl-l-propenyl, 1, 2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl , l-Ethyl-2-propenyl , 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyi, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2 -Methyl-1-pentenyl, 3 -Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-l-pentenyl, l-Methyl-2 -pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl , 3 -Methyl-2 -pentenyl, 4-Methyl-2 -pentenyl, 1-Methyl-3 -pentenyl, 2 -Methyl-3 -pentenyl, 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, l-Methyl-4-pentenyl, 2 -Methyl-4-pentenyl, 3 -Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1, l-Dimethyl-2-butenyl, 1, 1-Dirnethyl-3 -butenyl, 1 , 2-Dimethyl- 1-butenyl, 1 , 2-Dimethyl-2-butenyl, 1, 2-Dirnethyl-3 -butenyl , 1, 3-Dimethyl-l-butenyl , 1, 3-Dirnethyl-2 -butenyl , 1 , 3-Dimethyl- 3-butenyl, 2 , 2-Dimethyl-3-butenyl, 2 , 3 -Dimethyl-1 -butenyl ,
2 , 3-Dimethyl-2 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-3 -butenyl , 3 , 3-Dimethyl- 1-butenyl, 3 , 3-Dimethy1-2 -butenyl, 1-Ethyl-l-butenyl, l-Ethyl-2- butenyl, l-Ethyl-3 -butenyl , 2-Ethyl-l-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2 -Ethyl-3 -butenyl, 1,1, 2 -Trimethyl-2 -propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-2 -methyl-1-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver- zweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl- propoxy, 2-Methylpropoxy, 1, 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy, 1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, 1-Dimethylbutoxy, 1, 2-Dimethylbutoxy, 1, 3-Dimethylbutoxy, 2 , 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- methylpropoxy, 1-Ethyl-1-methylpropoxy, l-Ethyl-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo~Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy,
2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2-Pentenyloxy, 3 -Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-l- butenyloxy, 2 -Methyl-1-butenyloxy, 3-Methyl-l-butenyloxy, 1-Methyl-2 -butenyloxy, 2-Methyl-2 -butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, l-Methyl-3 -butenyloxy, 2 -Methyl-3 -butenyloxy, 3-Methyl-3 -butenyloxy, 1, l-Dimethyl-2-propenyloxy, 1, 2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1, 2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-l-propenyloxy, l-Ethyl-2-propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2-Hexenyloxy, 3-Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-l-pentenyloxy, 2-Methyl-l- pentenyloxy, 3-Methyl-l-pentenyloxy, 4-Methyl-l-pentenyloxy, l-Methyl-2 -pentenyloxy, 2 -Methyl-2 -pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, l-Methyl-3 -pentenyloxy, 2-Methyl-3 -pentenyloxy, 3-Methyl-3 -pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, l-Methyl-4-pentenyloxy, 2 -Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1, 1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1, l-Dimethyl-3-butenyloxy, 1 , 2-Dimethyl-l-butenyl- oxy, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 1 , 2 -Dimethyl-3 -butenyloxy,
1, 3-Di-methyl-l-butenyloxy, 1, 3 -Dirnethyl-2 -butenyloxy, 1,3-Di- methyl-3 -butenyloxy, 2 , 2 -Dimethyl-3 -butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2 , 3 -Dimethyl-2 -butenyloxy, 2 , 3 -Dimethyl-3-butenyloxy, 3 , 3-Dimethyl-l-butenyloxy, 3 , 3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-l-butenyloxy, l-Ethyl-2-butenyloxy, l-Ethyl-3-butenyloxy, 2-Ethyl-1-butenyloxy, 2 -Ethyl-2 -butenyloxy, 2 -Ethyl-3 -butenyloxy, 1, 1, 2-Trimethyl-2 -propenyloxy, 1-Ethyl-l-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2-methyl-2 -propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkylcarbonylreste seien verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylcarbonylketten, wie beispielsweise Methylcarbonyl, Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, 1-Methylethylcarbonyl , n-Butyl- carbonyl, 1-Methylpropylcarbonyl , 2-Methylpropylcarbonyl , 1,1-Di- methylethylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, 1-Methylbutylcarbonyl , 2-Methylbutylcarbonyl, 3-Methylbutylcarbonyl , 2, 2-Dimethylpropyl- carbonyl, 1-Ethylpropylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, 1, 1-Dimethyl- propyicarbonyl, 1, 2-Dimethylpropylcarbonyl, 1-Methylpentyl- carbonyl, 2-Methylpentylcarbonyl, 3-Methylpentylcarbonyl, 4-Methylpentylcarbonyl , 1, 1-Dimethylbutylcarbonyl, 1 , 2-Dimethyl- butylcarbonyl, 1, 3-Dimethylbutylcarbonyl, 2 , 2-Dimethylbutyl- carbonyl, 2, 3-Dimethylbutylcarbonyl, 3 , 3-Dimethylbuty1carbonyl , 1-Ethylbutylcarbonyl, 2 -Ethylbuty1carbonyl, 1 , 1 , 2-Trimethyl- propylcarbonyl , 1,2, 2-Trimethylpropylcarbonyl, 1-Ethyl-1-methyl- propylcarbonyl, l-Ethyl-2-methylpropylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl oder n-Decylcarbonyl genannt.
Als Alkenylcarbonylreste seien verzweigte oder unverzweigte C2-C10-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenylcarbonyl, Propenylcarbonyl, 1-Butenylcarbonyl, 2-Butenylcarbonyl, 3 -Butenylcarbonyl , 2 -Methylpropenylcarbonyl , 1-Pentenylcarbonyl , 2-Pentenylcarbonyl, 3-Pentenylcarbonyl, 4-Pentenylcarbonyl, 1-Methyl-l-butenylcarbonyl, 2-Methyl-1-butenylcarbonyl, 3-Methyl- 1-butenylcarbonyl, l-Methyl-2 -butenylcarbonyl, 2-Methyl-2- butenylcarbonyl, 3 -Methyl-2-butenylcarbonyl, l-Methyl-3-butenylcarbonyl , 2 -Methyl-3 -butenylcarbonyl, 3 -Methyl-3 -butenylcarbonyl, 1, l-Dimethyl-2 -propenylcarbonyl, 1, 2-Dimethyl-l-propenylcarbonyl, 1, 2 -Dimethyl-2 -propenylcarbonyl, 1-Ethyl-1-propenylcarbonyl, l-Ethyl-2 -propenylcarbonyl, 1-Hexenylcarbonyl , 2-Hexenylcarbonyl, 3-Hexenylcarbonyl, 4-Hexenylcarbonyl, 5-Hexenylcarbonyl, 1-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 2 -Methyl-1-pentenylcarbonyl, 3 -Methyl-1-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-1-pentenylcarbonyl, l-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-2-pentenylcarbonyl, l-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 3 -Methyl-3 -pentenylcarbonyl , 4-Methyl-3 -pentenylcarbonyl , 1-Methyl-4-pentenylcarbony1 , 2-Methyl-4-pentenylcarbonyl , 3 -Methyl-4-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 1, l-Dimethyl-2-butenylcarbonyl , 1, l-Dimethyl-3 -butenylcarbonyl , 1, 2-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenylcarbonyl, 1, 2 -Dimethyl-3 -butenylcarbonyl , 1, 3 -Dimethyl-1-butenylcarbonyl , 1, 3 -Dimethyl-2 -butenylcarbonyl, 1, 3 -Dimethyl-3 -butenylcarbonyl, 2 , 2-Dimethyl-3 -butenylcarbonyl, 2 , 3 -Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 2 , 3 -Dimethyl-2 -butenylcarbonyl, 2 , 3 -Dimethyl-3 -butenylcarbonyl , 3 , 3 -Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 3 , 3-Dimethyl-2 -butenylcarbonyl , 1-Ethyl-l-butenylcarbonyl, 1-Ethyl-2 -butenylcarbonyl , 1-Ethyl- 3 -butenylcarbonyl, 2-Ethyl-l-butenylcarbonyl , 2-Ethyl-2-butenylcarbonyl, 2 -Ethyl-3-butenylcarbonyl, 1,1, 2 -Trimethyl-2 -propenyl- carbonyl, l-Ethyl-l-methyl-2 -propenylcarbonyl, l-Ethyl-2-methyl- 1-propenylcarbonyl, l-Ethyl-2-methyl-2-propenylcarbonyl , 1-Heptenylcarbonyl, 2-Heptenylcarbonyl , 3-Heptenylcarbonyl, 4-Heptenylcarbonyl, 5-Heptenylcarbonyl, 6-Heptenylcarbonyl, 1-Octenylcarbonyl, 2-Octenylcarbonyl, 3-Octenylcarbonyl , 4-Octenylcarbonyl, 5-Octenylcarbonyl, 6-Octenylcarbonyl , 7-Octenylcarbonyl, Nonenylcarbonyl oder Dekenylcarbonyl , genannt.
Als Substituenten der genannten Reste von R3 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyi oder Benzyl .
Als Arylreste seien beispielsweise Phenyi, Methoxyphenyl oder Naphthyl oder aromatische Ringe oder Ringsysteme mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen im Ringsystem sowie bis zu 24 weiteren C-Atomen, die weitere nicht aromatische Ringe oder Ringsysteme mit 3 bis 8 C-Atomen im Ring bilden können, zu verstehen, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, oder anderen Resten substituiert sein können, genannt. Bevorzugt sind ggf. substituiertes Phenyi, Methoxyphenyl und Naphthyl.
Als Hetarylreste seien einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können, und die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy oder weiteren aromatischen oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, genannt.
R4 und R5 bezeichnen in den Verbindungen der Formel I und II unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-, Halogen-, Nitro-, Cyano-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, Cι-Cχo-Alkoxy-, c 2~Cιo-Alkenyl-, C2-Cιo-Alkenyloxy-, substituiertes oder unsubstituiertes C -Cιo-Cycloalkyl-, Aryl, Hetaryl-, RδR7N- und wobei zwei Reste R4 und R5 an benachbarten Kohlenstoffatomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie 0, N oder S enthalten kann.
Halogen bedeutet Fluor, Brom oder Chlor, bevorzugt Chlor.
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylρropyl-, 2-Methylpropyl , 1, 1-Dirnethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl,
2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1 , 1-Dimethylpropyl, 1 , 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl , 1, 1-Dirne hyl- butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl, 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1, 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl , n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, ver- zweigte oder unverzweigte C2-Cιo-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2 -Butenyl, 3 -Butenyl, 2-Methyl- propenyl, 1 -Pentenyl, 2 -Pentenyl, 3 -Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-l-butenyl, 2-Methyl-l-butenyl, 3 -Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2 -butenyl, 2 -Methyl-2 -butenyl, 3 -Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3 -butenyl, 2 -Methyl-3 -butenyl, 3 -Methyl-3 -butenyl,
1, l-Dimethyl-2 -propenyl, 1 , 2-Dimethyl-l-propenyl , 1, 2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl, l-Ethyl-2-propenyl , 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3 -Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-l-pentenyl, 1-Me hyl-2 -pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl , 3 -Methyl-2 -pentenyl, 4-Methyl-2 -pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3 -pentenyl, 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3 -pentenyl, l-Methyl-4-pentenyl, 2 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1, l-Dimethyl-2 -butenyl, 1, 1-Dimethyl-3 -butenyl , 1, 2-Dimethyl- 1-butenyl, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenyl, 1, 2-Dirnethyl-3 -butenyl , 1, 3 -Dimethyl-1-butenyl, 1 , 3-Dimethyl-2 -butenyl , 1, 3 -Dirnethyl- 3 -butenyl, 2 , 2-Dimethy1-3 -butenyl, 2, 3-Dimethyl-1-butenyl, 2, 3 -Dirnethyl-2 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-3 -butenyl , 3 , 3-Dimethyl- 1-butenyl, 3 , 3-Dimethy1-2-butenyl, 1-Ethyl-l-butenyl , l-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3 -butenyl, 2-Ethyl-l-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3 -butenyl, 1, 1 , 2 -Trimethyl-2 -propenyl, 1-Ethyl-1-methy1- 2-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-l-propenyl, l-Ethyl-2-methyi-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, l-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkoxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte Cχ-Cιo-Alkoxyketten wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1-Methyl- propoxy, 2-Methylpropoxy, 1 , 1-Dimethylethoxy, Pentoxy, 1-Methyl- butoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy, 1, 1-Dimethylpropoxy,
1, 2-Dimethylpropoxy, 2 , 2-Dimethylpropoxy, 1-Ethylpropoxy, Hexoxy, 1-Methylpentoxy, 2-Methyipentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpent- oxy, 1, 1-Dimethylbutoxy, 1 , 2-Dimethylbutoxy, 1 , 3-Dimethylbutoxy, 2, 2-Dimethylbutoxy, 2 , 3-Dimethylbutoxy, 3 , 3-Dimethylbutoxy, 1-Ethyibutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1, 1, 2-Trimethylpropoxy, 1,2,2-Tri- methylpropoxy, 1-Ethy1-1-methylpropoxy, 1-Ethy1-2-methylpropoxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy oder Decyloxy und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Alkenyloxyreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo~Alkenyloxyketten, wie beispielsweise Ethenyloxy, Propenyloxy, 1-Butenyloxy, 2-Butenyloxy, 3-Butenyloxy, 2-Methylpropenyloxy, 1-Pentenyloxy, 2 -Pentenyloxy, 3 -Pentenyloxy, 4-Pentenyloxy, 1-Methyl-1- butenyloxy, 2 -Methyl-1-butenyloxy, 3-Methyl-l-butenyloxy, l-Methyl-2 -butenyloxy, 2 -Methyl-2 -butenyloxy, 3-Methyl-2- butenyloxy, l-Methyl-3 -butenyloxy, 2-Methyl-3 -butenyloxy, 3 -Methyl-3 -butenyloxy, 1, l-Dimethyl-2-propenyloxy, 1, 2-Dimethyl- 1-propenyloxy, 1 , 2-Dimethyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-l-propenyloxy, 1-Ethyl-2 -propenyloxy, 1-Hexenyloxy, 2 -Hexenyloxy, 3 -Hexenyloxy, 4-Hexenyloxy, 5-Hexenyloxy, 1-Methyl-1-pentenyloxy, 2-Methyl-l- pentenyloxy, 3-Methyl-l-pentenyloxy, 4-Methyl-l-pentenyloxy, l-Methyl-2 -pentenyloxy, 2-Methyl-2 -pentenyloxy, 3-Methyl-2- pentenyloxy, 4-Methyl-2-pentenyloxy, l-Methyl-3 -pentenyloxy, 2-Methyl-3 -pentenyloxy, 3 -Methyl-3 -pentenyloxy, 4-Methyl-3- pentenyloxy, l-Methyl-4-pentenyloxy, 2-Methyl-4-pentenyloxy, 3-Methyl-4-pentenyloxy, 4-Methyl-4-pentenyloxy, 1, 1-Dimethyl- 2-butenyloxy, 1, l-Dimethyl-3 -butenyloxy, 1 , 2-Dimethyl-l-butenyl- oxy, 1, 2 -Dimethyl-2-butenyloxy, 1 , 2 -Dimethyl-3 -butenyloxy, 1, 3 -Di-methyl-1-butenyloxy, 1, 3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1,3-Di- methyl-3 -butenyloxy, 2 , 2 -Dimethyl-3 -butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl- 1-butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl-2 -butenyloxy, 2 , 3-Dimethyl-3-butenyl- oxy, 3 , 3-Dimethyl-l-butenyloxy, 3 , 3-Dimethyl-2-butenyloxy, 1-Ethyl-l-butenyloxy, l-Ethyl-2-butenyloxy, l-Ethyl-3 -butenyloxy, 2-Ethyl-l-butenyloxy, 2-Ethyl-2 -butenyloxy, 2 -Ethyl-3 -butenyloxy, 1, 1, 2-Trimethyl-2-propenyloxy, l-Ethyl-l-methyl-2-propenyloxy, 1-Ethyl-2 -methyl-1-propenyloxy, 1-Ethyl-2 -methy1-2 -propenyloxy, 1-Heptenyloxy, 2-Heptenyloxy, 3-Heptenyloxy, 4-Heptenyloxy, 5-Heptenyloxy, 6-Heptenyloxy, 1-Octenyloxy, 2-Octenyloxy, 3-Octenyloxy, 4-Octenyloxy, 5-Octenyloxy, 6-Octenyloxy, 7-Octenyloxy, 1-Nonenyloxy, 2-Nonenyloxy, 3-Nonenyloxy, 4-Nonenyloxy, 5-Nonenyloxy, 6-Nonenyloxy, 7-Nonenyloxy, 8-Nonenyloxy, 1-Decenyloxy, 2-Decenyloxy, 3-Decenyloxy, 4-Decenyloxy, 5-Decenyloxy, 6-Decenyloxy, 7-Decenyloxy, 8-Decenyloxy oder 9-Decenyloxy, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Als Cycloalkylreste seien beispielhaft substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte C -Cιo-Cycloalkylketten mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im Ring oder Ringsystem wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, 1-Methylcyclopropyl , 1-Ethylcyclopropyl, 1-Propylcyclopropyl , 1-Butylcyclopropyl, 1-Pentylcyclopropyl, 1-Methyl-l-Butylcyclo- propyl, 1 , 2-Dimethylcyclypropyl, l-Methyl-2-Ethylcyclopropyl, Cyclooctyl, Cyclononyl oder Cyclodecyl genannt. Die Cycloalkyl- reste können auch Heteroatome wie S, N und 0 im Ring enthalten.
Unter Aryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Hetaryl oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen. Bevorzugt sind ggf. substituierte Phenyi, Methoxyphenyl und Naphthyl.
Unter Hetaryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren hetero- aromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können, und die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy oder weiteren aromatischen oder weiteren gesättigten oder unge- sättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen.
Als Substituenten der genannten Reste von R4 und R5 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyi oder Benzyl .
R5 und R7 bezeichnen im Substituent R6R7N- unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl .
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl , 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 1 , 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl , 3-Methylpentyl , 4-Methylpentyl , 1, 1-Dimethyl- butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl, 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2 -Trimethylpropyl, 1 , 2 , 2-Trimethylpropyl , 1-Ethyl-l-methyl- propyl, 1-Ethyl-2 -methylpropyl , n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl. Als Substituenten der genannten Reste von R6 und R7 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyi oder Benzyl.
R8 bezeichnet im Substituent 0 n
R8 C 0— substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cιo-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-.
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cχ-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl , n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl , 1, 1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3 -Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl , 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 1 , 2-Dimethylpropyl, 1-MethyIpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl, 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1 , 2 , 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.
Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cχo-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2 -Butenyl, 3 -Butenyl, 2-Methyl- propenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-l-butenyl , 3 -Methy1-1-butenyl, l-Methyl-2 -butenyl, 2 -Methyl-2 -butenyl , 3 -Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3 -butenyl, 2-Methyl-3 -butenyl , 3 -Methyl-3-butenyl, 1, l-Dimethyl-2 -propenyl, 1 , 2-Dimethyl-l-propenyl, 1, 2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl , l-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-l-pentenyl, 2 -Methyl-1-pentenyl, 3 -Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2 -pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl , 3 -Methyl-2 -pentenyl, 4-Methyl-2 -pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3 -pentenyl, 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl , l-Methyl-4-pentenyl, 2 -Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1, l-Dimethyl-2 -butenyl, 1 , 1-Dimethyl-3 -butenyl , 1, 2-Dimethyl- 1-butenyl, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenyl, 1, 2-Dirnethyl-3 -butenyl , 1, 3 -Dirnethyl-1-butenyl , 1, 3 -Dirnethyl-2 -butenyl , 1, 3-Dimethyl- 3-butenyl, 2 , 2-Dimethy1-3 -butenyl, 2, 3-Dimethyl-l-butenyl, 2, 3-Dimethyl-2 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-3 -butenyl , 3 , 3-Dimethyl- 1-butenyl, 3 , 3 -Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, l-Ethyl-2- butenyl, l-Ethyl-3 -butenyl , 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethy1-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1 , 1 , 2 -Trimethyl-2 -propenyl, 1-Ethyl-1-methyl- 2-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-l-propenyl, l-Ethyl-2-methyl-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Unter Aryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Hetaryl oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen. Bevorzugt sind ggf. substituierte Phenyi, Methoxyphenyl und Naphthyl.
R9 bezeichnet im Substituent 0
R9 Y IcI
substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cχo-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-.
Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte Cι-Cιo-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl , n-Pentyl, 1-Methylbutyl,
2-Methylbutyl, 3 -Methylbutyl , 2 , 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 1 , 2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3 -Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1, 1-Dimethyl- butyl, 1, 2-Dimethylbutyl, 1, 3-Dimethylbutyl, 2 , 2-Dimethylbutyl , 2, 3-Dimethylbutyl, 3 , 3-Dimethylbutyl , 1-Ethylbutyl , 2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl, 1 , 2 , 2-Trimethylpropyl , 1-Ethyl-1-methyl- propyl, l-Ethyl-2-methylpropyl , n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl. Als Alkenylreste seien substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C2-Cιo~Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl- propenyl, 1-Pentenyl, 2 -Pentenyl, 3 -Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-l-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl , 3-Methyl-l-butenyl, 1-Methyl-2 -butenyl, 2 -Methyl-2 -butenyl, 3 -Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3 -butenyl, 2-Methyl-3 -butenyl , 3-Methyl-3-butenyl, 1, l-Dimethyl-2 -propenyl, 1 , 2-Dimethyl-l-propenyl , 1, 2-Dimethyl- 2-propenyl, 1-Ethyl-l-propenyl, 1-Ethyl-2 -propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-l-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-l-pentenyl, 4-Methyl-l-pentenyl, 1-Methyl-2 -pentenyl, 2 -Methyl-2 -pentenyl, 3 -Methyl-2 -pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, l-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3 -pentenyl, 3 -Methyl-3 -pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl , 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl , 4-Methyl-4-pentenyl, 1, l-Dimethyl-2 -butenyl, 1, l-Dimethyl-3 -butenyl, 1, 2-Dimethyl- 1-butenyl, 1, 2 -Dimethyl-2 -butenyl, 1 , 2-Dimethyl-3 -butenyl, 1, 3 -Dimethyl-1 -butenyl, 1 , 3-Dimethyl-2 -butenyl , 1, 3-Dimethy1- 3 -butenyl, 2, 2 -Dimethyl-3 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-l-butenyl, 2, 3 -Dirnethyl-2 -butenyl, 2 , 3-Dimethyl-3 -butenyl , 3 , 3-Dimethyl- 1-butenyl, 3 , 3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl , l-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3 -butenyl , 2-Ethyl-l-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3 -butenyl, 1, 1 , 2 -Trimethyl-2 -propenyl, 1-Ethyl-l-methyl- 2 -propenyl, l-Ethyl-2-methyl-l-propenyl, 1-Ethyl-2 -methy1-2- propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, 1-Nonenyl, 2-Nonenyl, 3-Nonenyl, 4-Nonenyl, 5-Nonenyl, 6-Nonenyl, 7-Nonenyl, 8-Nonenyl, 1-Decenyl, 2-Decenyl, 3-Decenyl, 4-Decenyl, 5-Decenyl, 6-Decenyl, 7-Decenyl, 8-Decenyl oder 9-Decenyl, und deren verzweigtkettige Homologen genannt.
Unter Aryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme, die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Hetaryl oder weiteren gesättigten oder ungesättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen. Bevorzugt sind ggf. substituierte Phenyi, Methoxyphenyl und Naphthyl.
Unter Hetaryl sind beispielsweise einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, 0 oder S enthalten können, und die ggf. mit einem oder mehreren Resten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Thio, Alkyl, Alkoxy oder weiteren aromatischen oder weiteren gesättigten oder unge- sättigten nicht aromatischen Ringen oder Ringsystemen substituiert sein können, zu verstehen.
Als Substituenten der genannten Reste von R8 und R9 kommen prinzipiell alle denkbaren Substituenten in Frage, die die Halogenasereaktion nicht behindern, beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyi oder Benzyl.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Organismus verwendet werden, der mindestens ein Gen für die oben beschriebene Halogenase enthält. Bevorzugt wird ein Mikroorganismus verwendet.
Das Verfahren kann vorteilhaft mit einem Rohextrakt eines
Halogenase enthaltenden Organismus oder mit einem angereinigten oder gereinigten Enzym durchgeführt werden.
Wie oben beschrieben, wird der Reaktion vorteilhaft ein Halogen- donor zugesetzt. Unter Halogen sind bevorzugt Chlor oder Brom zu verstehen. Fluor und Iod sind weniger bevorzugt, da sie toxisch wirken können, so daß die Organismen in ihrer Aktivität behindert werden oder aber sogar abgetötet werden. Die Reaktion ist aber auch mit Fluor und Iod möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit wachsenden oder ruhenden
Zellen durchgeführt werden.
Zur Halogenierung mit wachsenden Organismen werden die für die Halogenierung verwendeten Organismen in einem Medium angezogen, das das Wachstum dieser Organismen, bevorzugt Mikroorganismen, ermöglicht.
Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches, komplexes Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien in der Regel eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.
Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker- quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1 , 6-bis- phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen- säure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren oder Amino- zucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stick- stoffquelle verwendet werden.
Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NHC1 oder (NH )2S04, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat , Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Kohlenstoffquelle dienen können.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlorid-, Sulfat- und Phosphation zu nennen.
Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder
Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol .
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt vom Organismus sowie von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.
Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, be- sonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an. Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbial Physiology, "A Practical Approach (Eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL- Press, 1997, Seiten 53 - 73, ISBN 0 19 963577 3)" entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtbedingungen sind für Amycolatopsis Nadkarni et al . (J. Antibiot, 1994, 334-341) auf Seite 336 und 337, oder DE 42 26 192 Beispiel 16 + 17 (Seiten 11 und 12), EP-A-0 468 504 Beispiel 1-4 (Seiten 4-6) und Seite 2 (Zeilen 20-40) und EP-B0 521 408 Beispiel 1 zu entnehmen. Die zu halogenierende Verbindung kann dem Medium gleich zu Beginn der Fermentation zugesetzt werden oder im Laufe der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich. Der Umsatz kann mit üblichen Analysenmethoden, beispielsweise Dünnschichtchromatographie, HPLC oder GC, verfolgt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich in baten- oder fed-batch-Weise durchgeführt werden.
Während der Fermentation kann der pH-Wert, je nach Organismus, geregelt oder nicht geregelt werden. In der Regel erfolgt die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9, bevorzugt 6 und 9.
Eine Analysenmethode für Glycopeptid-Antibiotika ist Nadkarni et al. (J. Antibiotics 1994: 334-341) beispielhaft zu entnehmen.
Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit freien Enzymen (Rohextrakt oder gereinigtes Enzym) durchgeführt, so kann vorteilhaft in einem weiteren Temperaturbereich gearbeitet werden. Dieser Temperaturbereich ist einerseits durch die Reaktionsgeschwindigkeit vorgegeben, das heißt sehr niedrige Temperaturen führen zu einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit, andererseits wird es durch die Temperaturbeständigkeit des Enzyms vorgegeben, das heißt hohe Temperaturen führen zur Denaturierung des Enzyms. Aus diesen Gründen ist ein Temperaturbereich zwischen 5 und 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C vorteilhaft. Für das Verfahren eignen sich auch ruhende Zellen, die gegebenenfalls ebenso wie die Enzyme auch vorteilhaft immobilisiert werden können. Für eine bessere Umsetzung werden die Zellmembranen destabilisiert, so daß die Edukte und das Produkt leichter an den Reaktionsort (Enzym) gelangen können. Die Destabilisierung kann beispielsweise über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calcium- salze oder über eine Behandlung mit Lösungsmitteln erfolgen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Halogenasen bzw. Halogenasegene gehören zu den NADH-abhängigen Halogenasen, die sich aufgrund ihrer Regio- und/oder Stereoselektivität von den Haloperoxidasen unterscheiden.
Sie zeigen außerdem eine breite Substratspezifität. Sie halo- genieren bevorzugt aromatische Reste.
Die bevorzugte Halogenase aus Amycolatopsis mediterranei hat 491 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2). Ihr Gen wurde mit bhaA bezeichnet. Das Enzym hat eine NADH/FAD-Bindungsstelle. Im N-Terminus des bhaA-Gens befindet sich ein Sequenzmotiv (ß&ß-Fold) , welches vermutlich an der ADP-Bindung FAD- und NAD-abhängiger Enzyme beteiligt ist. In Position 304 des Proteins ist ein Asp-Rest konserviert, der eine FAD-Bindung ermöglichen kann. bhaA kann also auch FAD möglicherweise binden. Mit wachsenden Zellen ist die für die Reaktion erforderliche Bereitstellung von NADH bzw. NAD+ kein Problem, da dies aus dem Stoffwechsel des wachsenden Organismus erfolgen kann. Auch die Bereitstellung anderer erforderlicher Faktoren stellt kein Problem dar.
Wird mit ruhenden Zellen oder Enzympräparationen im erfindungsgemäßen Verfahren gearbeitet, so ist es von Vorteil, weitere Substanzen und Cofaktoren der Reaktionslösung zuzusetzen.
Im einfachsten Fall ist dies bei ruhenden Zellen der Zusatz einer Kohlenstoffquelle, über die die Reduktionsäquivalente regeneriert werden könnten.
Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit freien oder immmobili- sierten Enzymen durchgeführt, so wird vorteilhaft mindestens ein natürlicher oder synthetischer Elektronendonator der Reaktionslösung zugesetzt wie beispielsweise NADH, Methyl- oder Benzyl- viologen.
Diese Elektronendonatoren werden vorteilhaft entweder ständig der Reaktionslösung zugesetzt oder aber in einer weiteren Reaktion regeneriert. Dies kann beispielsweise in einer elektrochemischen oder enzymatischen Reaktion erfolgen. Derartige Regenerierungsreaktionen werden beispielsweise in EP-B-0 023 346, DE 29 30 087 C2 , DE 33 07 094 AI oder DE 36 31 228 AI beschrieben.
So wird in DE 29 30 087 C2 beispielsweise die Regenerierung von NADH aus NAD mittels der Formiatdehydrogenase in Gegenwart von Formiat beschrieben. Vorteilhaft wurde das Molekulargewicht des NAD+/NADH mittels Polyethylenglykol so erhöht, daß es in einem Membranreaktor zurückgehalten werden kann und so der Reaktion auf Dauer zur Verfügung steht (siehe DE 29 30 087 C2 , Spalten 1 und 2). Gleiches wird in EP-B-0 023 346 und DE 33 07 094 AI beschrieben.
In DE 36 31 228 wird die Regenerierung von NAD+ mit Viologenen (CAV und CYV) beschrieben. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform ist die Coexpression eines Cofaktor regenerierenden Enzyms, beispielsweise der Formiatdehydrogenase mit der Halogenase oder die Cokultivierung mit Organismen, die eine Regenerierung ermöglichen.
Auf die vorgenannten Schriften zur Regenerierung wird an dieser Stelle ausdrücklich bezug genommen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft in Gegenwart eines Puffers oder unter pH kontrollierten Bedingungen durchgeführt, im Falle, daß freie oder immobilisierte Enzyme verwendet werden.
Das Verfahren wird bei einem pH-Wert zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 5 und 9, besonders bevorzugt zwischen 6 und 9, durchgeführt.
Vorteilhaft werden der Reaktionslösung Ci-Ce-Mono- oder Dicarbon- säuren wie Essigsäure, Propionsäure oder Citronensäure zugesetzt. Diese können gleichzeitig zur Herstellung des Reaktionspuffers verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nukleinsäurefragment enthaltend eine Halogenase
(a) die von der in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
(c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert oder (d) die für eine Sequenz codiert, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist, und die mit einem oder mehreren homologen oder heterologen Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression und/oder Proteinexpression funktioneil verknüpft ist und/oder dessen natürliche Regulation ausgeschaltet ist.
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment sind die genannten Halogenasesequenzen oder deren funktionelle Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch in einer weniger bevorzugten Form einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No: 1 oder deren funktioneile Äquivalente (siehe S. 32 a bis d) inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Es können ein oder mehrere Kopien des Halogenasegens im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lad1--- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-posi iven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al . , Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol .22 (1993 ) ] , SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4 , nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanol- oxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise: ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetra- zyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren
Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die Halogenase-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich bei- spielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese beispielsweise von Glykopeptid-Antibiotika oder der Synthese neuer Hydridantibiotika ermöglichen oder um Cofaktor regenerierende Enzyme. Bevorzugt enthält das Nucleinsäurefragment SEQ ID NO: 1.
Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben genannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einem Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög- licht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, PACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4 , pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl , λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ3θl, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2μ, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 5 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
0 Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur
Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3 ' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regu- latorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Durch verschiedene Mutagenesemethoden, beispielsweise site directed mutagenesis, error prone PCR und/oder gene shuffling kann die Substratspezifität erhöht und/oder in der gewünschten Richtung verändert werden.
Es kann auch vorteilhaft die Enzymaktivität erhöht werden. Eine Erhöhung der Enzymaktivität oder der Substratspezifität kann beispielsweise durch eine Veränderung des katalytischen Zentrums erreicht werden. Eine Erhöhung kann auch erreicht werden, indem man das Enzym so verändert, daß Inhibitoren des Enzyms nicht mehr oder nur noch sehr schwach binden.
Für die Veränderung des Enzyms vorteilhafte Methoden sind wie oben erwähnt beispielsweise die site directed mutagenesis (siehe D.M. Glover et al . , DNA Cloning, Vol. 1, 1995, IRL Press, Kapitel 6, Seite 193ff, ISBN 019-963476-9), die zufällige Mutagenese mit PCR unter Verwendung von dITP (Spee et al., Nucleic Acids Res., Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) oder die "in vitro" Rekombinationstechnik (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751).
5 In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus 10 einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.
Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2μ Plasmids
15 aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen; bevorzugt, wie erwähnt, jedoch über homologe Rekombination
20 (Steiner et al . , Genetics, Vol. 140, 1995: 973 - 987).
Weitere für die Gattungen Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia oder Amycolatopsis geeignete vorteilhafte Vektoren werden beispielsweise in Matsushima et al . (J. Bacteriol., Vol. 169, No. 5, 25 1987: 2298-2300, Tabelle 1), de Schrijver et al. (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, No. 5, 1997: 1911-1916, Tabelle 1) oder Bierman et al . (Gene 116, 1992: 43-49, Tabelle 1) beschrieben.
Für eine optimale Expression der heterologen Halogenasegene in
30 Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
35
Eine Erhöhung der Genexpression der Halogenasegene kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, wie durch Erhöhung der Genkopienzahl oder der Verstärkung der Genexpression durch Veränderung der regulatorischen Elemente. So kann eine Verstärkung der 0 regulatorischen Elemente vorzugsweise auf der Transcrptionsebene (z.B. Verwendung stärkerer Promotoren und/oder Enhancer) oder auf Translationsebene erfolgen (z.B. Erhöhung der Stabilität des RNA) . Durch die Überexpression kann vorteilhaft eine vollständige Klonierung der Glykopeptid-Antibiotika erreicht werden. 5 Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, sowie die davon abgeleitete Proteinsequenz (SEQ ID NO: 2) .
Eine Überexpression soll hier beispielhaft für Amycolatopsis beschrieben werden. Das bhaA-Gen wird nach Amplifikation zur Erzeugung geeigneter Schnittstellen hinter den starken Eryt- hromycin-Promotor (ermE) kloniert. Dieser funktioniert gut in Amycolatopsis. Weitere geeignete Promotoren sind der konstitutive Phagenpromotor SF 14 des Phagen718 Labes et al . (Microbiology 147, 1997: 1503-1512) oder der induzierbare tipA-Promotor (Thio- strepton, Murakami et al . , 1989, J. Bacteriol. 171, 1459-66, Takano et al., 1995, Gene, 166: 133-137). Die Expression des Gens erfolgt mit replikativen Vektoren oder durch integrative Vektoren. Die Expression durch integrative Vektoren beispielsweise über die Attachment site des Phagen phiC31 (Muth, G., Brolle, G.F., Wohlleben, W., 1999) hat eine Reihe von Vorteile, so wird die Herstellung von Produkten, z.B. Antibiotika nicht negativ beeinflußt, eine Stabilisierung der Gene über Anti- biotikazusatz zum Medium ist nicht erforderlich. Ein vorteilhaftes Plasmid für die Integration ist beispielsweise pSET152 (Bierman et al., 1992, Gene 116, 43-49). Als vorteilhafte replikative Amycolatopsis-Vektoren seien pMEAlOO (Moretti, P. et. al., 1985, Plasmid, 14, 126-133), pMEA300 (Vrijbloed, J.W. et al., 1995, Plasmid, 34, 96-104) oder pA387 (Lal, R. et al . , 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 665-67) und deren Derivate genannt .
Auch eine Expression mit dem melC-Promotor (Schmitt John, T. and Engels, J.W. , 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 493-498) beispielsweise mit dem Plasmid pIJ702 (Katz, E. et al . , 1982, J. Gen. Microbiol., 192, 2703-2714) oder hinter dem ermE-Promotor (Bibb, M.J. and Janssen, G.R. Unusual features of transcription and translation of antibiotic resistance genes in antibiotic producing Streptomyces, In Proceedings of the fith International Symposium on the genetics of Industrial Microorganismus, pp. 309-318, Edited by M. Alacevic, D. Hranneli and Z. Toman, Karlovac, Yugoslavia: Ojnejin Prica Printing Works) mit Plasmid pM4 (Quiros, L.M. et al . , 1998, Mol. Microbiol., 28, 1177-1185) ist vorteilhaft möglich.
Zur Erfindung gehören auch Organismen, die SEQ ID NO: 1 oder das oben beschriebene Nukleinsäurefragment oder den beschriebenen Vektor enthalten. Beispiele
Beispiel 1 Identifizierung und Isolierung des Balhimycin- Halogenasegens bhaA
Der Balhimycin-Biosynthesegencluster wurde mit einem reversen Genetikansatz identifiziert und kloniert.
Von Glykosyltransferasen (GtfA-GtfE) , deren Gene aus den Glykopeptid-Antibiotika-Produzenten A. orientalis A82846 und A. orientalis C329.4 isoliert wurden und die an der Biosynthese der Glykopeptid-Antibiotika Chloroeremomycin (A82846B) und Van- comycin beteiligt sind (Solenberg et al . , 1997), wurden die konservierten Primer Glyl und Gly7 abgeleitet [Sequenz von Primer Glyl : 5 ' -TCCCCCCGGGIWSSCGCGGIGACGTSGA-3 ' ; Sequenz von Primer Gly7 : 5 ' -TCCCCCCGGGTGGTGGATSRCSGCSGCSACSCGICCGAA-3 ' (I: Inosin; S: C/G; W: A/T)]. Mit Hilfe der PCR-Reaktion (siehe unten) konnte ein Internes, ca. 900 bp großes Glykosyltrans- ferasegenfragment ('bgtfB') aus dem Chromosom des Balhimycin- Produzenten A. mediterranei DSM5908 amplifiziert werden.
PCR-Reaktion:
PCR-Gerät: RoboCycler Gradient 40 Thermocycler (Stratagene) Kit: Expand High Fidelity PCR-System (Boehringer)
PCR-Reaktionsansatz (100 μl ) : 50 pmol Primer Glyl 50 pmol Primer Gly7 0,1 μg genomische DNA von A. mediterranei DSM5908
200 μM dNTPs (each)
10 μl 10 X Reaktionspuffer 1, 5 mM MgCl2
3 μl MSO 3,5 U Taq DNA Polymerase
PCR-Programm:
Denaturierung: 95° 5 min
Zugabe der Polymerase: 72° 10 min Denaturierung: 94° 70 sec
Annealing: 59-63° 70 sec
Elongation: 72° 90 sec
35 Zyklen
Elongation: 72° 10 min Dieses Fragment wurde nach Konstruktion einer Cosmid-Genbank von A. mediterranei in den Cosmid-Vektor pOJ446 (Konstruktion der Genbank wie bei Gaisser, S. et al . , 1997, J. Bacteriol. 179: 6271-6278) in Southern-Hybridisierungsexperimenten (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory) zur Identifizierung des vermeintlichen Balhi- mycin-Biosynthesegenclusters eingesetzt. Auf diese Weise konnte das Cosmid 16.1, mit einem Insert von ca. 36 kb identifiziert werden. Nach Sequenzanalysen wurde festgestellt, daß der zur Gensonde homologe Bereich, für insgesamt drei Glykosyltransferase- gene (bgtfA-bgtfC) codiert, deren abgeleitete Genprodukte höchste Ähnlichkeit zu Glykosyltransferasen aufweisen (GtfA-GtfC) , die zuvor aus anderen Glykopeptid-Antibiotika-Produzenten isoliert wurden (Solenberg et al. 1997, s.o.)
Durch verschiedene Geninaktivierungsexperimente konnte eindeutig gezeigt werden, daß verschiedene Gene des Cluster auf 16.1, wie Gene für Glykosyltransferasen und Cytochrom P450-abhängige Mono- oxygenasen an der Balhimycin-Biosynthese beteiligt sind. Damit war der Nachweis für die Identifizierung des Balhimycin-Bio- synthesegenclusters erbracht.
Die Exprimente wurden wie in Pelzer et al., (Antimicrob. Agents Chemother. July 1999, Vol 43, No. 7, in press und J. Biotechnol., 56, 1977, 115-128) beschrieben durchgeführt.
Nach Identifizierung des Halogenasegens bhaA (siehe Beispiel 2) zeigte sich, daß bhaA von drei Oxygenasegenen (oxyA-C) und den drei Glykosyltransferasegenen (bgtfA-C) flankiert ist. Das Gen konnte auf einem ca. 3 kb großen BamHI-Fragment, das zuvor in den Vektor pVC19 subkloniert worden war, lokalisiert werden.
Die άoppelsträngige Sequenzierung (Sanger, F.S. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 74: 5463-5467) des Fragments ergab eine Größe von 3088 bp mit einem durchschnittlichen G/C-Gehalt von 68,8 %. Die ORF-Analyse (Staden, R. , and Mc Lachlan, A.D., 1982, Nucleic Acids Res., 10: 141-156) der Nukleotidsequenz führte zur Identifizierung von drei offenen Leserahmen (siehe Fig. 1) . Flankiert von einem Teil des Oxygenasegens oxyC und von einem Teil des Glykosyltransferasegens bgtfA befindet sich das Gen bhaA auf dem Fragment. Das Gen besitzt ein ATG-Startcodon und ein TGA-Stopcodon. Ein Streptomyceten-typischer Promotor konnte in dieser Sequenz nicht gefunden werden. Die potentielle RBS = Ribosomen-Bindungsstelle AGAGG befindet sich 11 Nukleotide vor dem Startcodon (Sequenz des bhaA-Gens siehe Fig. 2. Das Gen wird durch das jeweils fett hervorgehobene Start- und Stopcodon definiert) .
Beispiel 2 : Nachweis der Funktion des bhaA-Gens
Der Funktionsnachweis des bhaA-Gens gelang durch Erzeugung einer in frame Deletionsmutante. Die Deletion in frame erfolgte um einen eventuellen polaren Effekt auf folgende Gene durch Fremd- DNA, die bei Gendisruptions- oder Genrepiacement-Experimenten häufig zu beobachten sind, auszuschließen. Die Erzeugung der in frame Deletionsmutante erfolgte in 2 Schritten.
Zunächst wurde die Genreplacement-Mutante PH3 (siehe Fig. 5, Erzeugung der gene replacement Mutante PH3 ) erzeugt, die aus- schließlich zur Herstellung der in frame Deletionsmutante PH4 (siehe Fig. 6, Erzeugung der in frame Deletionsmutante PH4) genutzt wurde (siehe Fig. 3, Konstruktion von Plasmiden zum Genaustausch und "in frame" -Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA, + Fig. 4, Kontruktion von Plasmiden zum Genaustausch und "in frame" -Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA). Aus- gangsplasmid für die notwendigen Vektorkonstruktionen war ein pVC18-Derivat (pVC18B3.0), das das 3088bp große BamHI-Fragment trägt, auf dem u.a. das bhaA-Gen lokalisiert ist (siehe Fig. 3, Konstruktion von Plasmiden zum Genaustausch und "in frame"- Deletion des Balhimycin-Halogenasegens bhaA) . Alle DNA-Isolierungen, Restriktionsspaltungen und Klonierungen wurden, wenn nicht anders beschrieben, wie bei Sambrook, J., Fritsch, Ξ.F. und Maniatis, F., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben durchgeführt.
Dieses Plasmid wurde durch einen Mlul-Verdau linearisiert . Die Schnittstelle ist singulär und liegt etwa in der Mitte des Fragments. Die Einführung einer 969 bp in frame Deletion im bhaA-Gen erfolgte nun mit Hilfe einer PCR-Reaktion. Dazu wurden 2 Primer (Primer 2 und 3) so konzipiert, daß zum einen die in frame Deletion eingeführt wurde und daß zusätzlich durch die Primer eine singuläre Bglll-Schnittstelle entstand (s. Fig. 3).
Die Primer hatten folgende Sequenz:
Primer 2 : 5 ' -CTCACAGATCTGATACCGCGGGAAA-3 ' Primer 3 : 5 ' -CTACCAGATCTACGTGAACGAGGAG-3 ' PCR-Gerät: Thermocycler PTC100 von MJ Research
Kit: Expand High Fidelity PCR System (Boehringer)
PCR Reaktionsansatz (50 μl):
Master-Mix 1 (25 μl):
200 μM dNTP-Mix
200 nM Primer 2
200 nM Primer 3 1-10 ng Template DNA
1,5 μl DMSO
Master-Mix 2 (25 μl ) :
5 μl 10 X PCR-Puffer 2
0,75 μl Enzym-Mix
Master-Mix 1 und 2 zusammenpipettieren
PCR-Programm:
Denaturierung : 94° 3 min
Annealing: 65° 30 sec
Elongation: 68° 4 min
Denaturierung : 94° 45 sec
10 Zyklen
Annealing: 65° 30 sec
Elongation: 68° 4 4 mmiinn + 20 sec pro Zyklus
Denaturierung: 94° 45 sec
15 Zyklen
Elongation: 72° 7 min
Das PCR-Fragment wurde religiert, so daß der Vektor pUC18BΔ entstand (Fig. 4). Gleichzeitig wurde zur Erzeugung der gene replacement Mutante PH3 das Chloramphenicol-Resistenzgen cat (Gil et al., 1985, Gene 38, 1-8) als BcII-Fragment in die Bglll- Schnittstelle inseriert. Dieser Vektor bekam die Bezeichnung pUCδcat (Fig. 4). Zum Einsatz in A. mediterranei DSM5908 wurden beide Inserts als EcoRI/Sphl-Fragment in den im Balhimycin- Produzenten nichtreplikativen und zu Geninaktivierungen einsetzbaren Vektor pSPl (Pelzer et al . , 1997) kloniert, so daß die Plasmide pPH4 (Deletionskonstrukt ) und pPH3 (Gene replacement- Konstrukt) entstanden (Fig. 4). Zunächst wurde die gene replacement Mutante PH3 erzeugt. Dazu wurde der Balhimycin-Produzent mit dem Plasmid pPH3 mit Hilfe der "Direkten Transformation" (Pelzer et al., 1997) transformiert. Durch geeignete Selektion (Chloramphenicol-Resistenz und Erythro- mycin-Sensitivität, Fig. 5) konnte die gene replacement Mutante PH3 identifiziert und durch Southern-Hybridisierungen (Sambrook, s.o.) verifiziert werden.
Diese gene replacement-Mutante PH3 wurde dann mit dem Deletions- plasmid pPH4 transformiert. Die Primärselektion erfolgte zunächst auf eine Integration des gesamten Vektors über homologe Rekombination (Chloramphenicol-Resistenz und Erythromycin-Resistenz, Fig. 6). Anschließend wurde der Selektionsdruck zur Vektor- eliminierung durch homologe Rekombination entfernt. So wurden Chloramphenicol-sensitive und Erythromycin-sensitive Kolonien gefunden. Durch Southern-Hybridisierungen konnte die Mutante PH4 als korrekte in frame Deletionsmutante im bhaA-Gen verifiziert werden.
HPLC-MS Untersuchungen und Analyse des Isotopenmusters ergaben, daß PH4 nur noch unchlorierte Balhimycin-Derivate erzeugte. Damit konnte gezeigt werden, daß BhaA für beide Chlorierungen an AS- Position 2 und 6 verantwortlich ist (siehe folgende Beispiele) .
Beispiel 3
Biosynthese-Metabolite der Mutante PH4
a) Ergebnisse der Analytik mit Elektrospray-Massenspektrometrie
Mutante pH4
Das Produktspektrum des Klons pH4 entsprach abgesehen von der fehlenden Chlorierung dem des Wildtyps. Es wurden jedoch in den Kulturfiltraten dieser Mutante unglykosylierte Verbindungen (Verb. 7Δ, 8Δ, 9Δ) detektiert, die im Produktspektrum des Wild- typs nicht nachgewiesen wurden. Fig. 7 gibt die Struktur des Balhimycins wieder.
Tabelle 1: Produktspektrum der mit KPLC-ES-MS identifizierten Verbindungen des Wildtyps und der Mutanten. Die nicht-chlorierten Biosyntheseprodukte sind mit "Δ" bezeichnet.
^" = hohe Ionenintensitäten; "+" = mittlere Ionenintensitäten; "o" = geringe Ionenintensitäten
Die Ergebnisse der Untersuchung der Kulturfiltrate mit HPLC-MS zeigte, daß durch die "inframe" -Mutation die Chlorierung nicht mehr erfolgt. Der Nachweis mit Massenspektrometrie über die charakteristischen Isotopenverteilungen ist chemisch eindeutig. Alle detektierten Verbindungen der Mutante PH4 wiesen eine Massendifferenz von 68 amu = 2 Cl-Atome gegenüber den detektierten Verbindungen des Wildtyps auf.
Aus den MS-Analysen konnten nur qualitative, allenfalls halbquantitative Schlußfolgerungen über die Menge der einzelnen produzierten Metabolite gezogen werden. Dennoch ließ sich aus den Intensitäten der Molekülionen eine gewisse Tendenz bezüglich der Quantität der Biosyntheseprodukte ablesen.
Fig. 8: ES-Massenspektren von Dechlorobalhimycin (Mutante PH4) und Balhimycin (Wildtyp) . Die charakteristischen Isotopenmuster beweisen die Inaktivierung der Halogenase BhaA. Linienspektren entsprechen den theoretisch erwarteteen Isotopenverteilungen . Optimierte Aufreinigung
Vorreinigung der Peptide
Zur Entfernung des zur Selektion eingesetzten Erythromycins wurden die filtrierten Kulturüberstände je dreimal mit dem Volumen des Kulturfiltrats mit Ethylacetat ausgeschüttelt. Vor dem Auftragen auf die XADlδ-Säule wurden die Kulturüberstände nochmals übe eine Porzellanfritte (Filter G3 ) filtriert und mit dem in Tabelle 2 angegebenen Stufengradienten eluiert. Die Fraktionen wurden mit HPLC-MS auf den Gehalt an Rohpeptid untersucht, das Lösungsmittel am Vakuum entfernt und gefriergetrocknet .
Tabelle 2: Parameter für die chromatographische Trennung an XAD-Adsorberharz
Präparative RP 18-HPLC
Die Rohpeptidfraktionen wurden im Anfangsgradienten (H20 : ACN (9:1); 0,1 % TFA) gelöst und filtriert (Millex®-GV; 0,22 μm; Millipore) . Die nach der Trennung aufgefangenen Fraktionen wurden mit ES-MS analysiert, gefriergetrocknet und vereinigt. Analysenparameter Chromatograph Waters 600 Multisolvent Delivery System
(Waters) Detektor Lamda-Max, Model 481 (Waters)
Säule Nucleosil RP-C18, 5 μ , 20 x 250 mm
(Grom, Herrenberg) Probenaufgabeventil Altex 210 Valve (Beckmann) Auftragsmenge 10 mg Rohpeptid
Trennparameter
Fließmittel A: Wasser (0,1 % TFA)
B: Acetonitril (0,1 % TFA) Flußrate 10 ml /min
Detektionswellenlänge 214 nm
Tabelle 3: Gradient zur Trennung der Dechloro-Metabolite
HD-Metabolite
c ) Elektrospray-Massenspektrometrie
Die ES-MS-Spektren wurden auf einem API-III Triple Quadrupol Massenspektrometer (Sciex, Thornhill, Kanada) aufgenommen. Sofern nicht anderes vermerkt, wurden die Proben in ACN/H20 (1:1, 0,1 % Ameisensäure) gelöst und die Spektren im Positivionenmodus aufgenommen. Die Probenzuführung erfolgte über eine Microbore-Pumpe (140A Solvent Delivery System, ABI, Weiterstadt) mit einer Flußrate nach Split von 5 μl/min. Zur Detektion diente ein UV-Detektor (Linear UWIS 204, Linear Instruments, Reno, Nevada). Als mobile Phase diente 0,1 % Trifluoressigsäure (Laufmittel A) und Acetonitril mit 0,1 % Trifluoressigsäure (Lauf- mittel B) . Die Trennungen erfolgten auf einer analytischen Säule (Nucleosil RP-C18, 5 μm, 2 x 100 mm, Grom, Herrenberg) . Dechlorobalhimycin
Für die Detektion der Dechlorobalhimycin-Metabolite wurde ein optimaler Gradient verwendet (Tabelle 4).
Tabelle 4: Optimierter Gradient für die HPLC-MS-Analytik von Dechlorobalhimycin-Derivaten

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Halogenierung, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung in Gegenwart einer Halogenase halogeniert wird, wobei die Halogenase von der
(a) in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenz codiert wird oder von
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
(c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert wird oder von einer (d) Sequenz codiert wird, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chemische Verbindung eine Verbindung der allgemeinen
Struktur I verwendet wird:
(X) wobei die Variablen und Substituenten in Formel I folgende Bedeutung haben:
R1 = Wasserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cιo-Alkenyl-, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyloxy- , R6R7N-,
O
R8 C O— ;
Zeichn. R2 = Wasserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cχ-Cιo-Alkyl, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl-, C2-Cι0-Alkenyloxy- , RδR7N- ;
R3 = asserstoff , Hydroxy-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cχ-Cιo-Alkyl-, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl- , C2-Cιo-Alkenyloxy- , Cι-Cιo-Alkylcarbonyl-, C2-Cιo-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Hetaryl-,
0
II
R9— Y— C— ; R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy-,
Halogen-, Nitro-, Cyano-, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, Cι-Cιo-Alkoxy-, C2-Cιo-Alkenyl- , C2~Cιo-Alkenyloxy-, substituiertes oder unsubstituiertes C -Cιo-Cycloalkyl-, Aryl-, Hetaryl-, R6R7N- und wobei zwei Reste R4 und R5 an benachbarten Kohlenstoffatomen zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden können, der ein oder mehrere Heteroatome wie O, N oder S enthalten kann;
R6 und R7 unabhängig voneinander Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-;
R8 = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cιo~Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-;
R9 = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes Cι-Cιo-Alkyl-, C2-Cιo-Alkenyl- , substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-;
X = -CH- oder N; Y = O oder N; m = 0 oder 1; n = 0 , 1 , 2 oder 3 ; p = 0 oder 1.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß für das Verfahren ein Mikroorganismus, der eine Halogenase enthält, oder ein freies Enzym verwendet wird.
5 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahren mindestens ein natürlicher oder synthetischer Elektronendonator verwendet wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich- 10 net, daß der oder die Elektronendonator (en) im Verfahren in einer weiteren Reaktion regeneriert werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bakterien, Pilze, Hefen,
15 pflanzliche oder tierische Zellen verwendet werden.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahren Organismen der Gattung Amycolatopsis, Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Brevibacterium,
20 Clostridium, Micrococcus, Streptomyces, Mycobacterium,
Gordona, Actinomyces, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Pseudomonas, Hansenula, Candida, Pichia, Rhodotorula, Sporobolomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Aspergillus, Beauveria, Canningharnella, Mucor, Neurospora,
25 Penicillium oder Rhizoctonia verwendet werden.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit ruhenden oder wachsenden Zellen durchgeführt wird.
30
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Halogendonator anorganische halogenierte Verbindungen verwendet werden.
35 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in Gegenwart eines Puffers oder unter pH kontrollierten Bedingungen durchgeführt wird.
40
45
11. Nukleinsäurefragment, enthaltend eine Halogenase,
(a) die von der in SEQ ID NO: 1 genannten oder einer aufgrund des degenerierten genetischen Codes davon abgeleiteten
5 Sequenz codiert wird oder
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein funktionelles Fragment von (a) oder
(c) einer mit (a) oder (b) unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenz codiert oder
10 (d) die für eine Sequenz codiert, die mit der unter (a) genannten Sequenz eine über 30%ige Identität oder über 60%ige Ähnlichkeit aufweist, und
die mit einem oder mehreren homologen oder heterologen 15 Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression und/oder Proteinexpression funktionell verknüpft ist und/oder dessen natürliche Regulation ausgeschaltet ist.
12. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß 20 Anspruch 11.
13. Organismus, enthaltend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11 oder einen Vektor gemäß Anspruch 12.
25 14. Verwendung eines Proteins, das durch ein Halogenasegen mit der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz, ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11 oder einen Vektor gemäß Anspruch 12 codiert wird, in der chemischen Synthese.
30
35
0
5
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3793812B2 (ja) * 2002-08-12 2006-07-05 独立行政法人産業技術総合研究所 低温での組み換えタンパク質の発現に適した新規発現ベクター
JP3944577B2 (ja) * 2003-04-21 2007-07-11 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における組換えタンパク質を生産する方法
ITPD20050164A1 (it) 2005-05-30 2006-11-30 Fidia Farmaceutici Processo per la preparazione e l'isolamento di fosfatidi
ATE553190T1 (de) * 2006-02-22 2012-04-15 Brain Biotechnology Res & Information Network Ag Neue halogenase
CN103695384A (zh) * 2013-12-20 2014-04-02 武汉大学 一种催化碳-氟和碳-氯键形成的卤化酶
CN108728390B (zh) * 2017-04-19 2021-04-09 上海医药工业研究院 一种生产a82846b的基因工程菌及其制备方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2930087A1 (de) 1979-07-25 1981-02-26 Biotechnolog Forschung Gmbh Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden alpha -hydroxycarbonsaeuren
DE2930070A1 (de) 1979-07-25 1981-02-19 Biotechnolog Forschung Gmbh Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden aminosaeuren
DE3307094A1 (de) 1983-03-01 1984-09-06 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von (alpha)-hydroxycarbonsaeuren in entsprechende optisch aktive (alpha)-aminocarbonsaeuren
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
DE3631228A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Verfahren zur durchfuehrung enzymatischer oxidationen
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
DE68922546T2 (de) * 1988-08-16 1995-11-09 Otsuka Pharma Co Ltd Gen-Regulationskassetten, Expressionsvektoren, die diese enthalten und Mikroorganismen, die mit diesen transformiert sind.
EP0388186A1 (de) 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Externe Regulierung der Genexpression
IN171883B (de) 1990-07-27 1993-01-30 Hoechst India
TW213468B (de) 1991-06-29 1993-09-21 Hoechst Ag
PT637339E (pt) 1992-04-13 2002-03-28 Syngenta Ltd Construcoes de adn e plantas que as incorporam
DE4226102A1 (de) 1992-08-07 1994-02-10 Hoechst Ag Glycopeptid-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0077182A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US6794170B2 (en) 2004-09-21
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AU4758100A (en) 2001-01-02
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US6566110B1 (en) 2003-05-20

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