EP0385379B1 - Verfahren zur Abtrennung von Thiaminmonophosphat aus einer Lösung von Thiaminphosphaten - Google Patents

Verfahren zur Abtrennung von Thiaminmonophosphat aus einer Lösung von Thiaminphosphaten Download PDF

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EP0385379B1
EP0385379B1 EP90103759A EP90103759A EP0385379B1 EP 0385379 B1 EP0385379 B1 EP 0385379B1 EP 90103759 A EP90103759 A EP 90103759A EP 90103759 A EP90103759 A EP 90103759A EP 0385379 B1 EP0385379 B1 EP 0385379B1
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thiamine
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monophosphate
cocarboxylase
phosphates
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Wolfgang Dr. Schul
Joachim Dr. Paust
Alfred Dr. Mitschker
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • the invention relates to a process for the separation of thiamine monophosphate from a solution of thiamine phosphates, which contains the thiamine monophosphate and cocarboxylase as valuable products, a cation exchanger being used and the thiamine monophosphate being eluted with acid.
  • the phosphorylation of thiamine generally gives a mixture of the following composition: approximately 70% thiamine monophosphate, approximately 20% cocarboxylase (thiamine diphosphate) and approximately 5% thiamine triphosphate and thiamine tetraphosphate.
  • the mixture is usually separated by first removing the phosphoric acid and then passing the mixture over a weakly basic ion exchanger. This eliminates residual amounts of phosphoric acid.
  • the deacidified mixture is then passed through a strongly acidic ion exchanger, e.g.
  • the invention has for its object to design a method of the type mentioned in such a way that the removal of the thiamine monophosphate proceeds considerably better. It should also be avoided that the resulting solutions of cocarboxylase are greatly diluted.
  • cation exchangers have a pK a value of 1.0 to 4.5.
  • the pK a value of the cation exchanger is understood to mean the apparent pK value, as can be determined according to F. Helfferich, Ion Exchanger, Vol. 1, page 84 (1959), Verlag Chemie GmbH, Weinheim, Bergstrasse.
  • a solution having a pH of 4.5 to 5.5 is particularly advantageously used.
  • Aqueous, 1 to 30% hydrochloric acid has been found to be particularly suitable for elution.
  • the cation exchange resins with amino and / or imino methylenephosphonic acid groups are polystyrene / divinylbenzene polymers which preferably contain an amino and / or iminodimethylenephosphonic acid group as a functional group.
  • Cation exchange resins with amino and / or iminoalkylene, in particular with amino and / or iminomethylene-phosphonic acid groups are known (see, for example, J. Appl. Chem. 8th (1958), 459; US-A 4,002,564; CA) 93 , 168909x) and commercially available.
  • the cation exchange resin with amino and / or iminodimethylenephosphonic acid groups offered by Bayer AG under the name Lewatit® OC 1060 has proven particularly useful.
  • the cation exchange resins with amino and / or iminomethylenephosphonic acid groups are distinguished by a particularly high selectivity and by a surprisingly high capacity with respect to thiamine monophosphate. If a solution having the above composition and having a pH of 2 to 7, preferably 4.5 to 5.5, is passed over these resins, the thiamine monophosphate is selectively adsorbed.
  • the cocarboxylase and the higher phosphates are eluted, and surprisingly the concentration of the eluate steadily increases as the elution proceeds. So this is not a classic exchange process, but surprisingly a displacement chromatography. The consequence of this is that the concentration of the cocarboxylase in the eluate is equal to the concentration in the application solution.
  • the cocarboxylase can be extracted from the eluate in a conventional manner, e.g. by evaporation.
  • the thiamine tri and tetraphosphate are separated from the cocarboxylase by methods of the prior art.
  • the capacity of the ion exchanger When the capacity of the ion exchanger is exhausted, rinse with water and then with 1 to 30% aqueous HCl, preferably eluted with 7.5% HCl: The thiamine monophosphate is eluted as a saturated solution in the form of the hydrochloride. The ion exchanger is ready for operation again after neutral rinsing with water. This enables a fast sequence of separation cycles in a technical process.
  • the capacity of the Lewatit®OC-1060 is only limited by the proportion of thiamine monophosphate. For an optimal separation this must not be exceeded. The capacity was found with approx. 140 g thiamine monophosphate / l resin.
  • a solution of any composition of thiamine, thiamine monophoshate, cocarboxylase and higher phosphates can be separated as described above, with no dilution occurring for the cocarboxylase and the thiamine monophosphoric acid up to an amount of 140 g / l Lewatit®OC-1060 selective Will get removed.
  • a mixture was separated in which the cocarboxylase had already been enriched to about 37% (see example below).
  • the method according to the invention is advantageous in many ways.
  • the product concentration remains the same or even increases.
  • the hydrochloric acid used as displacer returns the ion exchange resin to its initial state, so that a separate regeneration stage is not required.
  • the method according to the invention also enables a fast sequence of separation cycles, which is extremely important for a technical method. Particularly advantageous is the fact that the resin capacity is high and e.g. for Lewatit®OC-1060 is up to 140 g thiamine monophosphate / l resin.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • FIG. 1 means the elution diagram of the separation. It can be seen that the concentration of cocarboxylase in the eluate increases continuously in accordance with the metering time of the mixture. The monophosphate begins to break through towards the end of the elution peak for cocarboxylase. By adding HCl after a short intermediate rinsing time, the monophosphate is eluted in high purity and concentration. The elution peak is sharp, there is no bleeding ("tailing"). After a rinsing phase with water, the next product mixture can be added.
  • An elution diagram of a separation is also plotted in FIG.
  • the same resin was used here, Levatit®OC1060. This was loaded with only 50% of the capacity for thiamine monophosphate and with a solution of approx. 20% cocarboxylase and 75% thiamine monophosphate. A lot of water was rinsed between the dosing of the application solution and elution with HCl. It was found that the monophosphate remains stable on the resin despite the long rinsing process. The subsequent elution with hydrochloric acid takes place suddenly. The thiamine monophosphate can be cleaned well by rinsing with water and a pure eluate is obtained.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Thiaminmonophosphat aus einer Lösung von Thiaminphosphaten, die das Thiaminmonophosphat und Cocarboxylase als Wertprodukte enthält, wobei man einen Kationenaustauscher einsetzt und das Thiaminmonophosphat mit Säure eluiert.
  • Bei der Phosphorylierung von Thiamin wird in der Regel ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung erhalten: etwa 70 % Thiaminmonophosphat, etwa 20 % Cocarboxylase (Thiamindiphosphat) sowie etwa 5 % Thiamintriphosphat und Thiamintetraphosphat. Wie in der DE-A-1 085 527 beschrieben, wird das Gemisch üblicherweise dadurch aufgetrennt, daß man zuerst die Phosphorsäure entfernt und dann das Gemisch über einen schwach basischen Ionenaustauscher leitet. Hierbei werden Restmengen an Phosphorsäure eliminiert. Anschließend wird das entsäuerte Gemisch über einen stark sauren Ionenaustauscher wie z.B. Amberlite®IR-120 geleitet, wobei Thiaminmonophosphorsäure haften bleibt, während die Cocarboxylase und die höheren Phosphate, im wesentlichen Thiamintri- und -tetraphosphat, eluiert werden. Bei dieser Verfahrensweise fällt die Cocarboxylase in Form einer sehr verdünnten Lösung an, was nicht unerhebliche Eindampfkosten verursacht. Ferner hydrolysiert ein Teil der Cocarboxylase durch den stark sauren Ionenaustauscher zu Thiaminmonophosphat, wodurch sich die Gesamtausbeute an Cocarboxylase verringert. Anstelle eines stark sauren Ionenaustauscherharzes wird auch ein schwach saures Ionenaustauscherharz wie z.B. Amberlite®IRC-50 verwendet. Hier handelt es sich ebenfalls um einen selektiven Ionenaustauschprozeß, wobei die eluierte Cocarboxylase wieder in stark verdünnter Lösung anfällt.
  • So wird z.B. in dem Verfahren gemaß GB 793 753 bei Verwendung von Amberlite® IRC 50 für die Auftrennung einer Lösung enthaltend etwa 1 kg Thiaminphosphate eine Trennsäule mit einer Kapazität von 100 bis 300 Litern benötigt, wodurch entsprechend große Mengen an Eluaten anfallen.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verfahren der eingangs genannten Art so auszugestalten, daß die Abtrennung des Thiaminmonophosphats erheblich besser verläuft. Es soll auch vermieden werden, daß die anfallenden Lösungen von Cocarboxylase stark verdünnt ist.
  • Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Lösung, welche das Thiaminmonophosphat und die Cocarboxylase enthält, einen pH von 2 bis 7 aufweist und daß man ein Kationenaustauscherharz verwendet, welches als funktionelle Gruppen Aminomethylen- und/oder Iminodimethylenphosphonsäurereste enthält.
  • Diese Kationenaustauscher weisen einen pKa-Wert von 1,0 bis 4,5 auf.
  • Unter dem pKa-Wert des Kationenaustauschers versteht man den scheinbaren pK-Wert, wie er nach F. Helfferich, Ionenaustauscher, Bd. 1, Seite 84 (1959), Verlag Chemie GmbH, Weinheim, Bergstraße, bestimmt werden kann.
  • Besonders zweckmäßig verwendet man eine Lösung, die einen pH von 4,5 bis 5,5 aufweist. Zum Eluieren erweist sich wäßrige, 1 bis 30 %ige Salzsäure als besonders geeignet.
  • Bei den Kationenaustauscherharzen mit Amino- und/,oder Imino methylenphosphonsäuregruppen handelt es sich um Polystyrol/Divinylbenzolpolymerisate, die vorzugsweise eine Amino- und/oder Iminodimethylenphosphonsäuregruppe als funktionelle Gruppe enthalten. Kationenaustauscherharze mit Amino- und/oder Iminoalkylen-, insbesondere mit Amino- und/oder Iminomethylen-phosphonsäure-Gruppen sind bekannt (vgl. z.B. J. Appl. Chem. 8. (1958), 459; US-A 4 002 564; CA 93, 168909x) und im Handel erhältlich. Besonders bewährt hat sich das von der Bayer AG unter der Bezeichnung Lewatit® OC 1060 angebotene Kationenaustauscherharz mit Amino- und/oder Iminodimethylenphosphonsäure-Gruppen.
  • Die Kationenaustauscherharze mit Amino- und/oder Iminomethylenphosphonsäure-Gruppen zeichnen sich durch eine besonders hohe Selektivität und durch eine bezüglich Thiaminmonophosphat überraschend hohe Kapazität aus. Wird eine Lösung, die die obige Zusammensetzung aufweist und einen pH von 2 bis 7, vorzugsweise 4,5 bis 5,5 hat, über diese Harze geleitet, wird das Thiaminmonophosphat selektiv adsorbiert. Die Cocarboxylase und die höheren Phosphate werden eluiert, wobei überraschenderweise die Konzentration des Eluats mit fortschreitender Elution stetig ansteigt. Es handelt sich hier also nicht um einen klassischen Austauschprozeß, sondern überraschenderweise um eine Displacementchromatographie . Dies hat zur Folge, daß die Konzentration der Cocarboxylase im Eluat gleich ist der Konzentration in der Auftragslösung. Die Cocarboxylase kann aus dem Eluat auf übliche Weise, z.B. durch Eindampfen, gewonnen werden. Die Abtrennung des Thiamintri- und -tetraphosphats von der Cocarboxylase erfolgt nach Methoden des Standes der Technik.
  • Wenn die Kapazität des Ionenaustauschers erschöpft ist, wird mit Wasser zwischengespült und dann mit 1 bis 30 %iger, wäßriger HCl, vorzugsweise mit 7,5 %iger HCl eluiert: Das Thiaminmonophosphat wird als gesättigte Lösung in Form des Hydrochlorids eluiert. Der Ionenaustauscher ist nach dem Neutralspülen mit Wasser wieder in betriebsfertigem Zustand. Dies ermöglicht in einem technischen Verfahren eine schnelle Abfolge von Trennzyklen. Die Kapazität des Lewatit®OC-1060 wird nur durch den Anteil des Thiaminmonophosphats begrenzt. Für eine optimale Trennung darf diese nicht überschritten werden. Die Kapazität wurde mit ca. 140 g Thiaminmonophosphat/l Harz gefunden. Es kann also erfindungsgemäß eine Lösung von jeder beliebigen Zusammensetzung an Thiamin, Thiaminmonophoshat, Cocarboxylase und höheren Phosphaten wie oben beschrieben aufgetrennt werden, wobei für die Cocarboxylase keine Verdünnung eintritt und die Thiaminmonophosphorsäure bis zu einer Menge von 140 g/l Lewatit®OC-1060 selektiv entfernt wird. Es wurde so ein Gemisch aufgetrennt, in dem die Cocarboxylase bereits auf ca. 37 % angereichert war (siehe nachfolgendes Beispiel).
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist in vielerlei Weise vorteilhaft. So bleibt beim Reinigungsschritt die Produktkonzentration gleich oder steigt sogar an. Darüber hinaus führt die als Displacer eingesetzte Salzsäure das Ionenaustauscherharz wieder in den Anfangszustand über, so daß eine getrennte Regenerationsstufe entfällt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht außerdem eine für ein technisches Verfahren äußerst wichtige schnelle Abfolge von Trennzyklen. Besonders vorteilhaft ist die Tatsache, daß die Harzkapazität hoch ist und z.B. beim Lewatit®OC-1060 bis zu 140 g Thiaminmonophosphat/l Harz beträgt.
  • Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel weiter erläutert.
    • Beispiel
  • Man trägt 2000 g einer Lösung der nachfolgenden Zusammensetzung mit pH 6 auf eine Trennsäule mit einer Abmessung von 330 x 65 mm auf.
    • Zusammensetzung:
  • Gehalt in g % Anteil d.Trockensubstanz Konz. in der Lösung
    Thiaminmonophosphosphat 150 ( 57 %) 7,5 %ig
    Cocarboxylase 95 ( 36 %) 4,8 %ig
    Rest (Thiamintri- und -tetraphosphat) 18 ( 7 %) 0,9 %ig
    Trockensubstanz 263 (100 %) 13,2 %ige Lösung = 2 000 g Lösung (ca. 2 000 ml)
    • Folgende Volumina wurden aufdosiert:
  • Auftragslösung 1,8 BV (1 BV = 1 100 ml; BV = Bettvolumen);
    Wasser 1,0 BV
    HCl 7,5 %ig 0,5 BV
    Wasser 2,2 BV
    Dosiervolumen 5,5 BV
    • Folgende Fraktionen wurden erhalten:
  • Vorlauf 0,9 BV
    Cocarboxylase 1,8 BV 4,8 %ig
    Monophosphat 1,0 BV 13,5 %ig
    Nachlauf 1,8 BV
    Fraktionsvolumen 5,5 BV
  • Das erhaltene Ergebnis ist in der Figur 1 graphisch dargestellt. Der Versuch wurde bei ca. 100 % der Kapazität des Lewatit®OC-1060 für Thiaminmonophosphat durchgeführt. Die Figur 1 bedeutet das Elutionsdiagramm der Trennung. Es ist zu ersehen, daß die Konzentration an Cocarboxylase im Eluat entsprechend der Dosierzeit des Gemisches stetig steigt. Das Monophosphat beginnt gegen Ende des Elutionspeak für Cocarboxylase durchzubrechen. Durch Zudosierung von HCl nach einer kurzen Zwischenspülzeit eluiert man das Monophosphat in hoher Reinheit und Konzentration. Der Elutionspeak ist scharf, es findet kein Nachbluten ("Tailing") statt. Nach einer Spülphase mit Wasser kann das nächste Produktgemisch aufdosiert werden.
  • In der Figur 2 ist ebenfalls ein Elutionsdiagramm einer Trennung aufgetragen. Hierbei wurde mit dem selben Harz Levatit®OC1060 gearbeitet. Dieses wurde nur mit 50 % der Kapazität für Thiaminmonophosphat und mit einer Lösung von ca. 20 % Cocarboxylase und 75 % Thiaminmonophosphat beladen. Zwischen der Dosierung der Auftragslösung und dem Eluieren mit HCl wurde mit viel Wasser zwischengespült. Hierbei wurde festgestellt, daß trotz des langen Spülvorgangs das Monophosphat stabil auf dem Harz verbleibt. Die anschließende Elution mit Salzsäure erfolgt schlagartig. Durch das Zwischenspülen mit Wasser läßt sich das Thiaminmonophosphat gut reinigen, und man erhält ein reines Eluat.

Claims (3)

  1. Verfahren zur Abtrennung von Thiaminmonophosphat aus einer Lösung von Thiaminphosphaten, die das Thiaminmonophosphat und Cocarboxylase enthält, unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes und Eluieren des Thiaminmonophosphats mit wäßriger Salzsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung einsetzt, die einen pH-Wert zwischen 2 und 7 aufweist, und ein Kationenaustauscherharz verwendet, welches als funktionelle Gruppen Aminomethylen- und/oder Iminodimethylenphosphonsäurereste enthält.
  2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung einsetzt, die einen pH-Wert von 4,5 bis 5,5 aufweist.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure zum Eluieren des Thiaminmonophosphats wäßrige 1 bis 30 %ige Salzsäure verwendet.
EP90103759A 1989-03-02 1990-02-26 Verfahren zur Abtrennung von Thiaminmonophosphat aus einer Lösung von Thiaminphosphaten Expired - Lifetime EP0385379B1 (de)

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