EA029227B1

EA029227B1 - Способ увеличения урожайности семян и стимуляции роста растений

Info

Publication number: EA029227B1
Application number: EA201290915A
Authority: EA
Inventors: Эккехард Нойхаус; Оливер Трентманн; Александра Вормит; Карина Вингентер
Original assignee: Технише Универзитэт Кайзерслаутерн
Priority date: 2010-03-27
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2018-02-28
Also published as: CA2794318C; EP2552946A1; US20130205445A1; EA201290915A1; US20200120890A1; CN103097401A; CA2794318A1; DE102010013166B4; EP3246337B1; CN103097401B; EP2552946B1; DE102010013166A1; PL2552946T3; HUE036118T2; EP3246337A1; ES2637617T3; WO2011120549A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу увеличения урожайности семян и стимуляции роста однодольных и двудольных растений посредством повышенной экспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) в изогенных или трансгенных клетках растений. Настоящее изобретение относится также к трансгенному растению, обладающему свойством увеличенной урожайности семян и усиленного роста по сравнению с диким типом, содержащему нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), а также регуляторную нуклеотидную последовательность, функционально связанную с ней, для контроля повышенной экспрессии гена белка ТМТ в растительной клетке трансгенного растения. Также оно относится к применению трансгенного растения для культивирования и получения культурных растений и полезных растений или биомассы, масел или белков, получаемых из них.

Description

изобретение относится к способу увеличения урожайности семян и стимуляции роста однодольных и двудольных растений посредством повышенной экспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) в изогенных или трансгенных клетках растений. Настоящее изобретение относится также к трансгенному растению, обладающему свойством увеличенной урожайности семян и усиленного роста по сравнению с диким типом, содержащему нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), а также регуляторную нуклеотидную последовательность, функционально связанную с ней, для контроля повышенной экспрессии гена белка ТМТ в растительной клетке трансгенного растения. Также оно относится к применению трансгенного растения для культивирования и получения культурных растений и полезных растений или биомассы, масел или белков, получаемых из них.

029227

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу увеличения урожайности семян и стимуляции роста однодольных и двудольных растений посредством повышенной экспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), или его гомолога, или аналога в изогенных или трансгенных клетках растений. Настоящее изобретение относится также к трансгенному растению, обладающему свойством увеличенной урожайности семян и усиленного роста по сравнению с диким типом, содержащему последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), а также регуляторную нуклеотидную последовательность, функционально связанную с нею, для контроля увеличенной экспрессии гена белка ТМТ в растительной клетке указанного трансгенного растения. Также настоящее изобретение относится к применению трансгенного растения для культивирования и получения культурных растений и полезных растений или биомассы, масел или белков, получаемых из них. Настоящее изобретение также относится к генетической конструкции, содержащей последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) АгаЫборк1К ШаПапа ТМТ1.

Уровень техники

Многие растения используют в качестве основы для получения масел и белков и поэтому представляют собой важное сырье для пищевой промышленности. В связи с этим, в первую очередь можно привести в пример рапс (Вгакк1са парик), который имеет мировое агрономическое значение и содержит большое количество масла и белка в своих семенах. Только в Германии в 2009 г. было собрано приблизительно 6,2 млн тонн семян рапса. Из-за стойкости масла при хранении этот вид растений особенно желателен для сельского хозяйства для получения масел и белков, что подтверждают многочисленные попытки повысить урожайность семян и выход продукта растения. Производство масла из семян рапса занимает третье место в мире после соевого масла и пальмового масла Па\уогк1б с1 а1., 1993, Сапо1а кееб утеШ ίη ге1абоп 1о Нагуек! тебюбк. 1п .Ташск, ΪΕ §1шоп, ебк, Ые\у Сгорк. \УПеу. Ые\у Уогк, р. 330-301). Основными ингредиентами семян рапса являются преимущественно масло (приблизительно 35-45%) и белок (20-22%). Масло является соответственно главными запасом энергии зрелых зерен.

Близким родственником рапса является модельный организм АгаЫборк1К ТйаПапа, который используют в генетических исследованиях и который является превосходным примером физиологии высших растений. По этой причине результаты, полученные на модельном растении АгаЫборк1К Тйайапа также можно перенести на другие виды растений. Из-за способности растений выступать источником масла и белка, уже в течение долгого периода времени предпринимались попытки повысить урожайность растений и урожайность семян при культивировании для того, чтобы в конечном итоге увеличить количество масла или белка, полученного на производстве. Если можно успешно повысить урожайность семян, то соответственно можно ожидать увеличения выхода масла и белка на гектар.

Такой подход использовали в публикации XVО 2008/092935 А2. В ней описан способ увеличения урожая растений посредством модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок ΥΕΡ (белок, повышающий урожай). ΥΕΡ выбирают из группы клеточных белков, в частности полипетида, подобного белку сборки нуклеосом 1 (ΝΑΡ1 -подобный), полипептида Ыке8ш (белка Ькт), усеченного полипептида циклинаН (СусНТг), полипептида Кетопп и белка ΌΡΕΒ. Трансфекция растительных клеток ΥΕΡ приводит к усиленному росту растений и частей растений, таких как, например, семена. Указанный способ соответственно основан на введении чужеродных генов и их экспрессии в трансгенных растениях. Однако отсутствует упоминание транспорта сахара из цитозоля в растительную вакуоль.

Для получения семян, которые могут накапливать масла и белки, должно существовать сообщение между зелеными фотосинтетически активными листьями и запасающими органами; иными словами, продукты фотосинтеза переносятся из листьев в семена, где они откладываются в виде липидов и белков. Фотосинтез представляет собой процесс, при котором энергия света превращается в биохимическую энергию, и в конечном итоге в листьях образуются сахара, крахмал, аминокислоты и неорганические соли. Если в частности сахара не удаляются из листьев достаточно быстро, происходит их накопление в цитозоле отдельных фотосинтезирующих клеток. Это отложение сахара является сигналом для листа, что фотосинтез прошел достаточно успешно, и затем он понижается за счёт генетической регуляции (Ко11апб е1 а1., 2002, §идаг кепкшд апб ыдпайпд ίη р1ап1к, ΡΕιηΙ Се11 14: 185-205). Это означает, что под действием высокой концентрации сахара в цитозоле снижается экспрессия генов, необходимых для эффективного фотосинтеза, что приводит к снижению эффективности фотосинтеза (Косй, 1996, СагЬойубга1е-тоби1а1еб депе ехргеккюп ίη р1ап1к, Αηη Кеу ΡΕιηΙ Ρ^κώ1 ΡΕιηΙ Мо1 Вю1 47: 509-540). Это, в свою очередь, приводит к тому, что максимально достижимый уровень фотосинтеза подавляется высокими концентрациями Сахаров, в частности, глюкозы, в цитозоле фотосинтетически активных клеток.

У различных однодольных и двудольных растений, таких как Ыебюадо (идентификационный номер АС131026), νίίίκ уппГега (идентификационный номер ААХ47312) и рис (Огу/а кайуа; идентификационный номер Ок02д13560) был открыт белок, который отвечает за транспорт сахара из цитоплазмы растительной клетки в ее вакуоль. Растительные вакуоли играют центральную роль в долго- и кратковременном отложении Сахаров. В запасающих тканях, таких растений как свекла (ВеТа уи1даг1к) и §ассйагит оГйсшагит, накапливаются большие количества сахарозы для того, чтобы служить источником энергии

- 1 029227

для метаболизма растения. Сахара накапливаются в листьях в течение дня и высвобождаются в вакуоль ночью.

Наконец у растения ЛгаЫбор818 был обнаружен ген, белковый продукт которого является транспортером сахара, расположенным в мембране вакуоли фотосинтетически активных клеток и способен импортировать глюкозу (моносахарид) из цитозоля в вакуоль (^отшй е( а1., 2006, Мо1еси1аг кеиййсабои апб рйу8ю1одюа1 сНагас(еп/а(юп ой а поуе1 топокассНапбе йапкройет йот АгаЫбор818 шуокеб ίη уаеио1ат кидаг йаикрой. Р1ап( Се11 18: 3476-3490). Этот транспортный белок, известный как транспортер моносахаридов в тонопласте (ТМТ), расположен в мембране крупнейшей органеллы клетки. Вакуоль как органелла растительной клетки занимает объем равный приблизительно 90% в фотосинтетически активной растительной клетке (Майшо1а е( а1., 2007, Уасио1ат (гапкрог(егк апб 1Не1г еккепйк го1е ίη р1ап( теЮЪоПкпт 1 Ехр Во( 58: 83-102) и поэтому имеет колоссальное значение для отложения сахара уже только по причине её размера (Ыеибаик НЕ, 2007, Ттапкрой ой рйтату те1аЪо1йек асгокк 1Не р1ап( уасио1ат тетЪтапе. РЕВ§ Ьей 581: 2223-2226). Белок транспортер моносахаридов в тонопласте (ТМТ) у АтаЫбор818 (НаПапа включает три изоформы, которые обозначаются как ТМТ1, ТМТ2 и ТМТ3. Гены ТМТ1 и ТМТ2 проявляют ткане- и клеткоспецифичный рисунок экспрессии, тогда как ген ТМТ3 экспрессируется на низком уровне. С помощью нокаутов этих генов стало возможным показать, что измененные таким образом растения накапливали значительно меньше глюкозы и фруктозы в вакуоле по сравнению с растениями дикого типа. Различия для дисахарида сахарозы замечены не были.

Только в растениях вида ЛгаЫбор818 (НаПапа было обнаружено более 60 изоформ белков транспортеров моносахаридов в тонопласте, и их распределили по различным группам (Ьа1опбе е( а1., 2004, Тгапкрой тесйашктк йог огдашс йогтк ой сагЪоп апб тйодеп ЪеРтееп коигсе апб 81пк, Аппи, Кеу. Р1ап( Вю1, 55, 341-372). Некоторые из этих транспортных белков, вероятно, локализуются в мембране вакуоли.

Описание изобретения

С учетом этого целью настоящего изобретения является обеспечить способ и трансгенное растение, урожайность семян и рост которого можно увеличить. Таким образом, в том числе, можно увеличить выход масла и белка, продуцируемых указанных растением.

Указанную цель можно достигнуть с помощью способа, имеющего признаки пункта 1 формулы изобретения. Предпочтительные варианты реализации можно обнаружить в прилагаемой формуле.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что сверхэкспрессия мутанта белка транспортера моносахаридов в тонопласте (ТМТ) приводит к концентрированию сахаров, таких как глюкоза, в вакуоли растительной клетки, тогда как концентрации сахара в цитозоле были понижены. Сверхэкспрессия белка транспортера Сахаров в тонопласте приводила к усиленной экспрессии генов, отвечающих за фотосинтез (что также можно наблюдать по увеличению эффективности фотосинтеза) и в конечном итоге к увеличению веса семян растения. Количество семян в стручке не менялось. Общее количество семян на растение, тем не менее, значительно увеличивалось. Это привело к заключению, что сверхэкспрессия белка белка транспортера сахаров, расположенного в мембране вакуоли, приводит к увеличению урожайности семян и стимуляции роста растений. Поскольку транспортные белки для переноса моно- и дисахаридов из цитоплазмы в вакуоль должны быть во всех клетках растения, содержащих вакуоль, способ согласно настоящему изобретению можно применять как для однодольных, так и для двудольных растений. Если результаты, полученные в соответствии с настоящим изобретением перенести от АтаЫбор818 на рапс, то способ согласно настоящему изобретению можно применять для значительного увеличения выхода масла и белка у рапса. С помощью настоящего изобретения можно повысить урожайность культурных и полезных растений, имеющих мировое значение, и продуктов, полученных из них.

Способ согласно настоящему изобретению основан на сверхэкспрессии белка транспортера моносахаридов в тонопласте (ТМТ) или его гомолога или аналога в изогенных или трансгенных клетках однодольных или двудольных растений. Клонированная кДНК согласно настоящему изобретению (идентификационный номер 8В8Т74) кодирует 734 аминокислоты и проявляет идентичность последовательностей на 32% с бактериальным транспортером глюкозы ОТК ДупесНосукОк и сходство на 26% с белком транспортером глюкозы АтаЫбор818 8ТР1, расположенным в плазматической мембране (\Уогпп( е( а1., 2006, Мо1еси1аг 1бепййса1юп апб рНу81о1од1са1 сНагасЮп/аОоп ой а поуе1 топокассНапбе йапкройет Ггот АгаЫбор818 шуойеб ш уасио1аг кидаг йапкрой. Р1ап( Се11 18: 3476-3490). Этот белок известен как транспортерный белок моносахаридов в тонопласте (ТМТ)1. С помощью полимеразной цепной реакции стало возможно амплифицировать две дополнительные изоформы ТМТ кроме ТМТ1, белок ТМТ2, содержащий 739 аминокислотных остатка, и белок ТМТ3, содержащий 729 аминокислотных остатка.

Белок ТМТ1 имеет 12 трансмембранных доменов и относительно большую центрально расположенную гидрофильную петлю, которая соединяет домены 6 и 7 друг с другом. Указанная петля содержит приблизительно 320 аминокислотных остатков и соответственно в четыре или пять раз больше, чем аналогичные структуры в других известных белках транспортерах моносахаридов у прокариот и эукариот. Последовательность кДНК белка транспортера моносахаридов в тонопласте ((опор1ак( топокассНапбе йапкройет, ТМТ) АтаЫбор818 (НаПапа представлена на 8ЕО ГО N0: 2, и аминокислотная последовательность, полученная от нее, показана на 8ЕО ГО N0: 1.

Исследования, проведенные в следующих примерах, ясно показывают, что с помощью сверхэкс- 2 029227

прессии белка транспортера моносахаридов в тонопласте (ТМТ) АгаЬ1йорв1в ШаНапа ТМТ1 можно увеличить вес семян по сравнению с растениями дикого типа, и содержание масла и белка в созревших семенах ЛтаЫбор515 повышается. Более того, урожайность семян в различных линиях АтаЬМорв1в также может быть повышена.

Сверхэкспрессия также приводит к получению растений АтаЫборв1в, развивающихся заметно быстрее по сравнению с диким типом и демонстрирующих усиленный рост. Это предположительно объясняется тем фактом, что сверхэкспрессия белка ТМТ приводит к накоплению сахара из цитозоля в вакуоли растения и таким образом увеличивает скорость фотосинтеза. В другом случае, можно предположить, что более крупные семена мутантов со сверхэкспрессией обеспечивают проросткам большее количество энергии, что является преимуществом по сравнению с проростками дикого типа в частности на ранней стадии развития. Поскольку несколько белков транспортеров сахара, которые располагаются в мембране вакуоли, известны как для клеток однодольных, так и двудольных растений, будет понятно, что принцип согласно настоящему изобретению в целом можно перенести на соответствующие белки транспорта Сахаров.

Поскольку белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), обнаруженный у АтаЫборв1в 1ПаПапа. также проявляет гомологию последовательностей с транспортными белками в других растительных клетках (смотрите введение), транспортные белки, гомологичные с транспортным белком ТМТ1 ЛтаЫборв1в (НаПапа также включены в объём настоящего изобретения.

Термин "гомолог" в пределах объёма настоящего изобретения обозначает транспортный белок, который проявляет высокое степень идентичности последовательностей с белком ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) АгаЬ1борв1в (НаПапа ТМТ1. Предпочтительно гомолог имеет последовательность, идентичную на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности белка (транспортер моносахаридов в тонопласте) ТМТ АгаЬ1борв1в (НаПапа ТМТ1.

С целью различения термин "аналог" в рамках настоящего изобретения обозначает белок, участвующий в транспорте сахара, который располагается в мембране вакуоли и выполняет функцию переноса сахара из цитоплазмы в вакуоль, при этом он не обязательно должен иметь гомологию последовательности с белком ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте). Таким образом, аналог выполняет ту же функцию, что и белок ТМТ1, но может быть структурно отличающимся. В отличие от гомолога, генетическое родство не является обязательным условием.

Предпочтительно белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) АгаЬ1борв1в (НаПапа ТМТ1, имеющий аминокислотную последовательность согласно 8ЕО ГО N0: 1, или его гомолог или аналог применяют для увеличения урожайности семян для стимуляции роста однодольных и двудольных растений. Для сверхэкспрессии или регулируемой экспрессии генов нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолог или аналог, предпочтительно вводят в растительную клетку и осуществляют его сверхэкспрессию в указанной растительной клетке под контролем конститутивного или индуцибельного промотора. Примерами конститутивных промоторов являются 358 промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин/октопин синтазы ЛдгоЬасЮпит ЩтсГааспв или промотор Ети кукурузы. Кроме этого, существуют индуцируемые светом промоторы, такие как, например, промотор малой субъединицы КИВ18С0 тЬс8 (рис, томат). Способы генной экспрессии генов в растительной клетки обычно традиционно известны и описаны в литературе, также как и специфические методы клонирования и контролируемой регуляции экспрессии гена. Кроме промоторов также могут потребоваться последовательности терминаторов контролируемой экспрессии генов. Для отбора проростков также дополнительно можно вводить маркерные гены (например, СЕР) или другие гены отбора, для которых доступны специфичные антитела для детекции, например, против мотива с-тус.

Экспрессию гена можно осуществлять как с помощью клонирования плазмиды с соответствующей нуклеотидной последовательностью, так и посредством осуществления встраивания в геном растительной клетки. Стабильное встраивание в геном растительной клетки и возможность направленной регуляции экспрессии гена приводит к стабильной экспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолога или аналога в растительной клетке.

Согласно настоящему изобретению сверхэкспрессия белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолога или аналога может происходить как в изогенных, так и в трансгенных клетках растений. В изогенных клетках растений происходит сверхэкспрессия эндогенного гена исследуемого белка транспортера, и в конечном этого это приводит к усиленной выработке семян и более быстрому росту растения по сравнению с диким типом. Кроме этого, также можно использовать белок переноса сахара растений других видов для сверхэкспрессии, таким образом, что получают экспрессию трансгенного гена в трансфецированной растительной клетке. Например, можно осуществить трансфекцию гена белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) АтаЫборв1в (НаПапа ТМТ1 в растение рапса Вгаввюа парив, и этот ген может экспрессироваться.

Экспрессия белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолога или аналога в клетках растения, в частности в растительных клетках, имеющих высокую вместимость вакуоли, таких

- 3 029227

как Втакк1са парик, особенно интересна с экономической точки зрения, так как в этом случае могут вырабатываться большие количества масла или белка. Например, развитие эндосперма или образование клубней можно усилить с помощью направленной вставки гена согласно настоящему изобретению белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) и его экспрессии, в результате чего достигается повышенный выход крахмала, что, в свою очередь, увеличивает производство биологического этанола.

Направленное встраивание и экспрессия белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолога или аналога в изогенных или трансгенных клетках растений также приводит к увеличению урожайности на единицу площади, поскольку растения достигают нужного для сбора размера намного раньше и могут быть соответственно модифицированы. Поэтому возможно снимать несколько урожаев с одной площади культивирования в более короткие сроки. Способ согласно настоящему изобретению приводит к заметному увеличению урожайности с заметно повышенным выходом биомассы на единицу площади по сравнению с растениями дикого типа.

Способ согласно настоящему изобретению принципиально можно применять для всех однодольных и двудольных растений. В частности являются интересными с экономической точки зрения культурные растения и полезные растения, такие как, например, рапс Втаккюа парик. Предпочтение отдается, например, видам и их высшим родам ЛтаЫборык (НаПана, Втаккюа парик, Втаккюа о1егасеа, Втаккюа гара, ЛтасЫк буродеа, Воесйета кбтс!а, Втидшета дутпогЫ/а, Сйгик рагабЫ Ропсиик бт£оба1е, ЕирйотЫа еки1а, Ртадаба уекса, Ооккуршт ЫткиШт, Ооккуршт гашоиби, О1усте тах, НеПапбшк аппиик, 1ротоеа т1, Ьусорегкюоп екси1еп1ит, Ьас!иса регептк, Ьас!иса кабдпа, Ьас!иса кето1а, ЬасШса кабуа, Ьо!ик .(аротсик, Ма1ик ботекбса, Мебюадо бипса!и1а, №собапа 1аЬасит, Огу/а аикбабепбк, Огу/а ЬгасбуаШб, Огу/а рипс(а(а, Огу/а бб1еу1, Огу/а гийродоп, Огу/а кабуа, Рори1ик бтсбосатра, Ропсиик бт£бба!а, Ргипик реткюа, Зо1апит киЬетокит Зотдбит Ысо1от, Тббсит аекбуит, 2еа таук, ЗассНагит оГбстагит, Ратсит убда!ит, Мтсайбик, УШк У1ш£ега, СаппаЫк кабуа.

Настоящее изобретение также относится к трансгенному растению, имеющему свойство увеличенной урожайности семян и усиленного роста по сравнению с диким типом, содержащим последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте), а также регуляторную нуклеотидную последовательность, функционально соединенную с указанной последовательностью, для контроля повышенной экспрессии гена белка ТМТ в растительных клетках указанного трансгенного растения. Предпочтительно последовательность нуклеотидов кодирует белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) ЛтаЫборбк (НаПапа ТМТ1 согласно ЗЕЦ ГО ЫО: 1 или его гомолог или аналог.

Трансгенное растение согласно настоящему изобретению можно применять для культивирования культурных растений или полезных растений. Также его можно применять для получения биомассы, масел или белков, получаемых их них.

Настоящее изобретение также охватывает генетическую конструкцию, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) ЛтаЫборбк (НаПапа согласно ЗЕЦ ГО ΝΌ: 1 или его гомолог или аналог, а также регуляторные нуклеотидные последовательности, функционально соединенные с указанной последовательностью, для контроля повышенной экспрессии гена белка ТМТ в растительной клетке. Настоящее изобретение изложено более подробно на следующих фигурах.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана диаграмма клонирования для получения конструкции сверхэкспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте);

на фиг. 2 показано схематичное изображение вставок Т-ДНК двойного мутанта ТМТ 1-2;

на фиг. 3 приведен вес тысячи семян ЛгаЫборбк;

на фиг. 4 показано содержание масла и жира в семенах ЛгаЫборбк;

на фиг. 5 показано число семян на стручок ЛтаЫбортк;

на фиг. 6 показан общий вес семян на растение ЛтаЫбортк;

на фиг. 7 показано развитие растений ЛтаЫборбк через 15 и 34 дней.

Лучший способ осуществления изобретения Примеры

Клонирование плазмидной конструкции для сверхэкспрессии белка ТМТ (ЛйтН)

Для экспрессии белка, участвующего в траспорте сахара использовали кДНК белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) ЛгаЫборбк (НаПапа ТМТ1 (= Лбтк-кДНК). Для получения конструкции для сверхэкспрессии использовали измененную ЛбтбкДНК, которая содержала мотив с-тус в области гидрофильной петли между предполагаемыми трансмембранными доменами 6 и 7. Это представляет собой конструкцию рМИТЗ (см. фиг. 1).

Полную кДНК сначала вырезали из плазмиды рМИТЗ с использованием ферментов рестрикции ЕсоКб и С1а1 и лигировали в плазмиду рНаптЬа1, линеаризированную с помощью тех же ферментов (рЗКЗ). Таким образом, получали кассету экспрессии, в которой промотор 35З вируса мозаики цветной капусты располагался против направления транскрипции от ТМТ1-кДНК, и терминатор ОСЗ был расположен по направлению транскрипции от гена на его конце (сигнал полиаденилирования гена октопин- 4 029227

синтазы). Дальнейшая обработка ферментами рестрикции Νοΐΐ из плазмиды р§К3 приводила к выделению кассеты, которую в конечном итоге вводили в вектор трансформации растений рЛКТ27 (р§К6).

Последовательность кДНК АйтП (8Еф ГО N0: 2) со встроенным мотивом с-тус (выделен красным) показана ниже

АгаддсетАссеАстстсЕтгЕотртсессассдсйАтсеаслАТТТСТТАсаАевювводСАгчесСАсждтгастеойЕСТ

еталатАтдгсмаилсАпл^ААтстАССАлсстсготтоикк^ттстссттсстлгбгскгтвА'Рсевтбстлссс!^

^ВДсеАСттестсд£^совАТДГсте;отрсз«л'стос»<«^еессАтгестедттетйтса5’САвттАтегАттгс©тстбс

АСАСТТбТСССТОТТТАСАТГТСТОАААОСбСТаСТССЗвеАбАгСАсаИаеАСАСТТАААГАСТСГСССГСДЭТТТСГТОеСГСТ ветаЗААТвТт’ТСГСАТАСТСТАПЧЮТГТТСАСТАТВТСССТСАСТСДСТССССТАеСМСЗАВЛЗССА.ТОСТСеаТОТССТС тсеАтсосттетсттсэтзжттгстттстсАссстчзттгсАттсесссвАйтетестсбттесхгтоез’т&втАААебАДОААТб САСОЙЖТААесейеТТСТТСАМАСТХАТСТОТСАСЗАШЛеАтеТТАСОвАТвАОАТЗССРГТАСТЛЭТГСАДОСАСТЙСАТ ДО&осА€€АСАААААА£А&тбСААВАтстсттАОТААС1^|ТГСз<а£ЖА$сАТвАА{Ж?бАдЧаАТАС№ттоАААсссттвАТо?и? амсоАСУи11тзсеест1тат«зААссх^йАБААтои\тсетАссггестАСАсстогстсдеАдсАААкгАестсАсти^ев СТАтестстсбссги^АмэтггАвсАААссАААесАтаАтссттААйейдссбстоэтсАКТСТТГТТоесАотстссаоейе ААйАтвссАОАдссАесссаАААсдстсотАото(ЯЗА!1ТгтссстсА'тсвеААвСАтеттсАотАстАстесс^|аАтосасст САСССТАААОСввСЛК^ТТСЗВгААААС<ЗЪСАТАСА6АСХХАТТАСААСАААаАСААФЗА1^№С1АТЗС1»(?£1>АТ6А7ССТОСО СААСАААААСгГа1СГССаСАСААЗАТГТСССТАССССС7ГТААТОТССС6ССА(ЗАССАСААССАТаЗАСАад<ЗАТАТСАТСССА сатйстасаастссаассастттаасса^,тоаоассасасазтассс1^|,2адсзсдабссаасс{зсваааотасзсат1зо<зааз^,тссг1 '35ТСОТ^и1ЧЭТС^АТ00аАТАТАЗАТАСаААААа1АТСААТА1УУЩДйОТ^,АТТаТСТТАААСИ№С1АТСН5АестеААТСТе13СС0Т еосттеАТСАТсгсаАттсссоаАэстс(ЗЮАтастооАозсА(к:тАСАТТ<асесттстессстт5ТААосАдАТСтеттстт сзетсстАААта^еттсАтв^тсетстустбсттсстеоееАСААААттестссстстсоАссАстсгтетсгастсттсттеАА. 0СТЙЭ1вТТААЯС<ЗТОССТТ^ТТСТТ36Тет005СМТСАААТАСТ0СА0СА0ТТТ1САееГАТСаАТООДет'РСГСТАС1АС 7+^ССТСАеАГТСТСОААСЗбаСТССЗСС1АСАТАЛСТТСТ^,ТТ<ХА<5ССТС1?МСТААОТТССАТСТ^,СТОССТСАТГССТСАТС АООевТТТАА1^АаСТТАСТСАТССТСССА®ССаПТСТССТТСИХ:АТСАСАСТСАТСеАТСта.ТСОв(ЗААаААвОТСАТТАСТТ СГСТССАСАМСССАВТТСТСАТТеТС^САСТтеДСб'ГСС'етОТСАТСАвесЗАвСЗ'САТССАСАП’САеСААДеТССТеААСССА 0САСТСТС<ЖСАсЗОЯТ1ИвТСа1^1СГ11АСТТСЛССТТСТГС6?1<ЗАТ<36(?ГТАСв6ТСССА2ТССАААСАТССТСТСТТСТеАА А^СТТСССААСААОАетСОЗТСвТСТСТССАТСаХАТАТеТССТАТОеТСТТТТССАТТСейбАСаТТАТТЗТСАСеТАСТСА СТТСССбТТСТССа'САесТСбАТОвСЗАСТАйТТСЗСТаттСАОСАТПАСССтеСОЗТгаСЗСЗйТТАТСТСЖТСэОЯГСТТСВТТ таСАЯОААДСТСССбОМЗАСГААЙваСАТСМСТТГОаААСПТааСАСАЕАСтаСТТТгаСТТЯЮАЙСТСААОСТСАадСТТСТ ОСТССТТСГААВвАТАТАТАА

На диаграмме клонирования, представленной на фиг. 1, показано получение конструкции сверхэкспрессии р§К6, основанной на кДНК АйтП.

Последовательности векторов рМиТЗ и р§К3, полученных таким образом, приведены в списке последовательностей или на 8Е0 ГО N0: 3 и 8Еф ГО N0: 4.

Получение линий со сверхэкспрессией ЛйтП

Для получения конструкции сверхэкспрессии в геноме растений АгаЫйор818 использовали метод "окунания соцветий". При этом соцветия погружали в суспензию агробактерий (штамм СУ3101), которую предварительно трансформировали конструкцией р§К6.

Трансформированные растения представляли собой гомозиготные клеточные линии со вставкой ΐДНК, в которых как природный ген 1тП, так и природный ген 1т(2 были делетированы с помощью вставки трансформируемой ДНК (см., ^оттй с1 а1., 2006: Мо1еси1аг 1йепййсайоп аий рку8ю1одюа1 скагасΙΟΓίζαΙίοη οί а поуе1 топо8асскапйе 1гаи8рог1ег йот ЛгаЫйор818 шуоКей ίη уасио1ат 8идаг 1гап8рой. Р1аи1 Се11 18: 3476-3490). Таким образом, предотвращали образование природной мРНК 1т11 и 1т(2 и предотвращали ко-супрессию искусственной мРНК. Вместо делеции нативных генов 1т11 и 1т12 также может происходить сверхэкспрессия гетерологичной последовательности 1тЕ Экспрессия нативной последовательности 1тП-кДНК также возможна.

После выполнения трансформации семян собирали урожай растений для проращивания на чашках с агаром, содержащим канамицин, для отбора трансгенных клеточных линий. Так как трансфицированные растительные клетки несут ген устойчивости к канамицину, развиваться могут только те проростки, в которых успешно проходила трансфекция 1тП-кДНК, поскольку такие клетки приобретают устойчивость к антибиотику.

Отбор клеточный линий со сверхэкспрессией проводили методом Нозерн-блоттинга, отбирая те линии, в которых проявлялось заметное увеличение количества транскриптов Лйт(1 по сравнению с диким типом.

Указанная ситуация также схематично изображена на фиг. 2. Показаны отдельные вставки ΐ-кДНК в участки экзонов кДНК ЛйтП и Лйт(2.

Культивирование растения для анализа семян

Перед прорастанием семена АтаЫйор818 инкубировали в течение двух дней в темноте при 4°С для ингибирования. Растения дикого типа, гомозиготную мутантную клеточную линию 11Ш1-2 и три клеточных линии со сверхэкспрессией 1тП 1, 4 и 10 культивировали на планшетах в течение девяти недель при 22°С в условиях короткого дня (10 ч света, 14 ч темноты) в камере для роста. После этого растения переносили в условиях длинного дня (14 ч света, 10 ч темноты) при 22°С. Полив продолжали в течение трех недель при данных условиях. Затем полив прекращали, и растения далее культивировали до полного высыхания проростков. Семена отдельных растений вынимали с помощью машины для уборки семян (Агасоп 720).

Анализ семян

Для количественного определения жирных кислот 0,1 г полностью зрелых и высушенных на воздухе семян гомогенизировали в ступке в жидком азоте. Затем добавляли 1,5 мл изопропанола и проводили дальнейшую гомогенизацию. Указанную суспензию переносили в реактор объемом 1,5 мл и инкубировали в течение 12 ч при 4°С в шейкере при 100 об/мин.

- 5 029227

Затем образцы центрифугировали в течение 10 мин при 12,000 д и супернатант переносили в предварительно измеренные реакторы объемом 1,5 мл. Реакторы инкубировали в течение 8 ч при 60°С для испарения изопропанола. Методом гравиметрии определяли общее содержание жиров.

Для определения белка в семенах гомогенизировали 0,1 г семян в ступке при комнатной температуре. Затем добавляли 1000 мкл буферной среды (50 мМ ΗΕΡΕ3, 5 мМ МСС12, рН 7.5, 1% Ίηΐοη Х100, 15% глицерол, 2% 8Ό8, 1 м ΕΌΤΑ, ΡΜδΡ, 1/100 (ν/ν)) и проводили дальнейшую гомогенизацию. Суспензию переносили в реакционные сосуды 1,5 мл и центрифугировали образцы в течение 10 мин при 12,000 д при комнатной температуре. Супернатант переносили в новые реакторы объемом 1,5 мл и определяли белки с реагентом ВСА согласно рекомендациям изготовителя.

Результаты

На фиг. 3 показан вес тысячи семян АгаЫДор818. В качестве контроля использовали растения АгаЫάορδίδ дикого типа, а также мутант 1ш11-2, который проявлял существенно сниженную активность вакуольного ТМТ (ΧνοπηίΙ с1 а1., 2006, Мо1еси1аг Леп0Пса1юп апй ρΗνδίοΙοβίοαΙ сНагасЗсп/аПоп οί а ηονοί тοηοδассЬа^^άе ΙππίδροΠοΓ Ггот Απιόίάορδίδ ίηνοίνοά ίη νасиο1а^ δυβητ ΙππίδροΠ. ΡίηηΙ Се11 18: 3476-3490). Сверхэкспрессия линий сверхэкспрессии 1, 4 и 10 приводила к значительному увеличению веса тысячи семян по сравнению с диким типом.

На фиг. 4 показано содержание масла и липидов в семенах ΑιπΒίάορδίδ. Содержание масла (Фиг. 4А) и содержание белка (фиг. 4В) увеличивалось по сравнению с растениями ΑιπΒίάορδίδ дикого типа (νΤ) и тремя независимыми линиями сверхэкспрессии ТМТ1.

На фиг. 5 показано количество семян на стручок Απιόίάορδίδ. Среднее количество семян на стручок было практически одинаковым у растений Απιόίάορδίδ дикого типа (νΤ) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1.

На фиг. 6 представлен общий вес семян на растение Απιόίάορδίδ. Показан средний общий вес всех зрелых семян растений ΑιπΒίάορδίδ дикого типа (VI) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. Общий вес семян заметно увеличивался в линиях сверхэкспрессии по сравнению с диким типом. На фиг. 6А это уже можно увидеть, тогда как на фиг. 6В выполнили количественный учет семян на растение.

На фиг. 7 показано развитие растений Απιόίάορδίδ через 15 и 34 дня. Линии сверхэкспрессии проявляли заметно стимулированный рост уже через 15 дней и были явно больше по сравнению с растениями ΑκΦίάορδίδ дикого типа. Таким образом, сверхэкспрессия ТМТ1 приводит к усиленному росту растений.

В целом, полученные результаты однозначно показали, что урожайность семян, всхожесть семян и рост растений можно повысить с помощью сверхэкспрессии белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте).

Описание фигур

Фиг. 1. Диаграмма клонирования для получения конструкции сверхэкспрессии ΑΐΙιηΠ ρδΚ6 атρ: ген устойчивости к ампициллину; СаМУ-358: 353 промотор вируса мозаики цветной капусты; ОС3: сигнал полиаденилирования гена октопинсинтазы; 1т11 - стус: кДНК ΑΐΙιηΠ со вставленным мотивом с-тус;

Фиг. 2. Схематическое изображение вставок Т-ДНК двойного мутанта 1т(1-2 ΑίίΜΤΙ со вставкой ТДНК, В: ΑίίΜΤ2 со вставкой Т-ДНК;

Фиг. 3. Вес тысячи семян ΑιπΒίάορδίδ. Показан вес растений Απ-ιόίάορδίδ дикого типа (VI. на основе 100%) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. 1т(1-2 представляет собой мутанта, который не проявляет активности вакуольного ТМТ (νοηηίΐ е1 а1., 2006). Данные являются статистически значимыми (средние значения +/-стандартное отклонение) и получены на трех независимых культивирований растений;

Фиг. 4. Содержание масла и липидов в семенах Απ-ιόίάορδίδ. Показано содержание масла (А) и белка (В) у растений Απ-ιόίάορδίδ дикого типа (VI) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. 1т(1-2 представляет собой мутанта, который не проявляет активность вакуольного ТМТ (νοηηίΐ ег а1., 2006). Данные являются статистически значимыми (средние значения +/- стандартное отклонение) и получены на трех независимых культивирований растений;

Фиг. 5. Количество семян на стручок ΑιπΒίάορδίδ. Показано среднее количество семян на стручок у растений ΑιπΒίάορδίδ дикого типа (VI) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. 1т(1-2 представляет собой мутанта, который не проявляет активность вакуольного ТМТ (νοηηίΐ ег а1., 2006). Данные являются статистически значимыми (средние значения +/- стандартное отклонение) и получены на трех независимых культивирований растений;

Фиг. 6. Общий вес семян на растение ΑκΦίάορδίδ. Показан средний общий вес всех зрелых семян растений ΑιπΒίάορδίδ дикого типа (VI) и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. 1т(1-2 представляет собой мутанта, который не проявляет активность вакуольного ТМТ (νοηηίΐ е1 а1., 2006). А. Изображение, В. Подсчёт семян. Данные являются статистически значимыми (средние значения +/стандартное отклонение) и получены на трех независимых культивирований растений;

Фиг. 7. Развитие растений ΑιπΒίάορδίδ через 15 и 34 дня. Показано состояние развития растений Αγηόίάορδίδ дикого типа (VI), мутантов 1шП-2, у которых не работает транспортер вакуолярной глюкозы ТМТ (Vο^т^ΐ ег а1., 2006), и трех независимых линий сверхэкспрессии ТМТ1. Можно четко наблюдать более быстрое развитие линий сверхэкспрессии ТМТ.

- 6 029227

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (К ЗАЯВКЕ № 201290915)

<110> ТЕХНИШЕ УНИВЕРЗИТЭТ КАЙЗЕРСЛАУТЕРН

<120> СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ СЕМЯН И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ

<130> ТМТ ТгапзрогЬег

<160> 4

<170> РаЬепЫп уегзЧоп 3.3

<210> 1

<211> 1468

<212> РКТ

<213> АгаЫЬорзЧз ЬЬаНапа

<400> 1

МеЬ 1

Ьуз

О1у

А1а

ТЬг 5

Ьеи

Уа1

А1а

Ьеи

А1а А1а 10

ТЬг

11е

О1у

Азп 15

РЬе

Ьеи

О1п

О1у

Тгр

Азр

Азп

А1а

ТЬг

11е

А1а

О1у

А1а

МеЬ

Уа1

Туг

11е

20

25

30

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

ТЬг

Бег

Уа1

О1п

О1у

Ьеи

Уа1

А1а

35

40

45

МеЬ

Бег

Ьеи

11е

О1у

А1а

ТЬг

Уа1

11е

ТЬг

Суз

Бег

О1у

Рго

11е

50

55

60

Бег

Азр

Тгр

Ьеи

О1у

Агд

Рго

МеЬ

Ьеи

11е

Ьеи

Бег

Уа1

МеЬ

65

70

75

80

Туг

РЬе

Уа1

Суз

О1у

Ьеи

11е

МеЬ

Ьеи

Тгр

Бег

Рго

Азп

Уа1

Туг

Уа1

85

90

95

Ьеи

Суз

РЬе

А1а

Агд

Ьеи

Азп

О1у

РЬе

О1у

А1а

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

Туг

11е

Бег

О1и

ТЬг

А1а

Рго

О1и

11е

Агд

115

120

125

О1у

О1п

Ьеи

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

О1п

РЬе

Ьеи

О1у

Бег

О1у

МеЬ

РЬе

130

135

140

Ьеи

Бег

Туг

Суз

МеЬ

Уа1

РЬе

ТЬг

МеЬ

Бег

Ьеи

Бег

Азр

Бег

Рго

Бег

145

150

155

160

Тгр

Агд

А1а

МеЬ

Ьеи

О1у

Уа1

Ьеи

Бег

11е

Рго

Бег

Ьеи

Туг

Ьеи

165

170

175

- 7 029227

РЬе

Ьеи

ТЬг

Уа1 180

РЬе

Туг

Ьеи

Рго

О1и 185

Зег

Рго

Агд

Тгр

Ьеи 190

Уа1

Зег

Ьуз

О1у

Агд

МеЬ

Азр

О1и

А1а

Ьуз

Агд

Уа1

Ьеи

О1п

Ьеи

Суз

О1у

195

200

205

Агд

О1и

Азр

Уа1

ТЬг

Азр

О1и

МеЬ

А1а

Ьеи

Уа1

О1и

О1у

Ьеи

Азр

210

215

220

11е

О1у

О1и

Ьуз

ТЬг

МеЬ

О1и

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

О1и

Азр

225

230

235

240

Ηΐ3

О1и

О1у

Азр

ТЬг

Ьеи

О1и

ТЬг

Уа1

Азр

О1и

Азр

О1у

О1п

МеЬ

245

250

255

Агд

Ьеи

Туг

О1у

ТЬг

Нгз

О1и

Азп

О1п

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Агд

Рго

Уа1

260

265

270

Рго

О1и

О1п

Азп

Зег

Ьеи

О1у

Ьеи

Агд

Зег

Агд

Нгз

О1у

Зег

Ьеи

275

280

285

А1а

Азп

О1п

Зег

МеЬ

11е

Ьеи

Ьуз

Азр

Рго

Ьеи

Уа1

Азп

Ьеи

РЬе

О1у

290

295

300

Зег

Ьеи

Н1з

О1и

Ьуз

МеЬ

Рго

О1и

А1а

О1у

Азп

ТЬг

Агд

Зег

О1у

305

310

315

320

11е

РЬе

Рго

Нгз

РЬе

О1у

Зег

МеЬ

РЬе

Зег

ТЬг

А1а

Азр

А1а

Рго

325

330

335

Ηΐ3

О1у

Ьуз

Рго

А1а

Нгз

Тгр

О1и

Ьуз

Азр

11е

О1и

Зег

Нгз

Туг

Азп

340

345

350

Ьуз

Азр

Азп

Азр

Туг

А1а

ТЬг

Азр

О1у

А1а

О1у

Азр

355

360

365

Азр

Зег

Азр

Азп

Азр

Ьеи

Агд

Зег

Рго

Ьеи

МеЬ

Зег

Агд

О1п

ТЬг

370

375

380

Зег

МеЬ

Азр

Ьуз

Азр

МеЬ

11е

Рго

Нгз

Рго

ТЬг

Зег

О1у

Зег

ТЬг

Ьеи

385

390

395

400

Зег

МеЬ

Агд

Нгз

Зег

ТЬг

Ьеи

МеЬ

О1п

О1у

Азп

О1у

О1и

Зег

405

410

415

МеЬ

О1у

11е

О1у

Тгр

Нгз

МеЬ

О1у

Туг

Агд

Туг

О1и

Азп

Азр

420

425

430

- 8 029227

О1и

Туг

Ьуз 435

Агд

Туг

Ьеи

Ьуз 440

О1и

Азр

О1у

А1а

О1и 445

Зег

Агд

О1у

Зег

11е

Зег

11е

Рго

О1у

Рго

Азр

О1у

Зег

Туг

450

455

460

11е

Ηΐ3

А1а

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

Зег

Агд

Зег

Уа1

Ьеи

О1у

Рго

Ьуз

Зег

465

470

475

480

ναι

Ηΐ3

О1у

Зег

А1а

Мер

Уа1

Рго

О1и

Ьуз

11е

А1а

Зег

О1у

485

490

495

Рго

Ьеи

Тгр

Зег

А1а

Ьеи

О1и

Рго

О1у

Уа1

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

Уа1

500

505

510

ναι

О1у

Уа1

О1у

11е

О1п

11е

Ьеи

О1п

РЬе

Зег

О1у

11е

Азп

О1у

515

520

525

ναι

Ьеи

Туг

ТЬг

Рго

О1п

11е

Ьеи

О1и

Агд

А1а

О1у

Уа1

Азр

11е

530

535

540

Ьеи

Зег

Ьеи

О1у

Ьеи

Зег

11е

Зег

А1а

Зег

РЬе

Ьеи

11е

545

550

555

560

Зег

О1у

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Мер

Ьеи

Рго

А1а

11е

Уа1

А1а

Мер

565

570

575

Агд

Ьеи

Мер

Азр

Уа1

Зег

О1у

Агд

Зег

Ьеи

Тгр

ТЬг

11е

580

585

590

Рго

Уа1

Ьеи

11е

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

11е

Зег

О1и

Ьеи

11е

595

600

605

Ηΐ3

11е

Зег

Ьуз

Уа1

Азп

А1а

Ьеи

Зег

ТЬг

О1у

Суз

Уа1

610

615

620

Ьеи

Туг

РЬе

Суз

РЬе

Уа1

Мер

О1у

Туг

О1у

Рго

11е

Рго

Азп

11е

625

630

635

640

Ьеи

Суз

Зег

О1и

11е

РЬе

Рго

ТЬг

Агд

Уа1

Агд

О1у

Ьеи

Суз

11е

А1а

645

650

655

11е

Суз

А1а

Мер

Уа1

РЬе

Тгр

11е

О1у

Азр

11е

Уа1

ТЬг

Туг

Зег

660

665

670

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Зег

11е

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Уа1

РЬе

Зег

11е

- 9 029227

675

680

685

Туг

А1а

Уа1

Суз

Уа1

11е

Зег

Тгр

11е

РЬе

Уа1

Туг

Мер

Ьуз

Уа1

690

695

700

Рго

О1и

ТЬг

Ьуз

О1у

Мер

Рго

Ьеи

О1и

Уа1

11е

ТЬг

Азр

Туг

РЬе

А1а

705

710

715

720

РЬе

О1у

А1а

О1п

А1а

О1п

А1а

Зег

А1а

Рго

Зег

Ьуз

Азр

11е

Мер

Ьуз

725

730

735

О1у

А1а

ТЬг

Ьеи

Уа1

А1а

Ьеи

А1а

ТЬг

11е

О1у

Азп

РЬе

Ьеи

О1п

740

745

750

О1у

Тгр

Азр

Азп

А1а

ТЬг

11е

А1а

О1у

А1а

Мер

Уа1

Туг

11е

Азп

Ьуз

755

760

765

Азр

Ьеи

Азп

Ьеи

Рго

ТЬг

Зег

Уа1

О1п

О1у

Ьеи

Уа1

А1а

Мер

Зег

770

775

780

Ьеи

11е

О1у

А1а

ТЬг

Уа1

11е

ТЬг

Суз

Зег

О1у

Рго

11е

Зег

Азр

785

790

795

800

Тгр

Ьеи

О1у

Агд

Рго

Мер

Ьеи

11е

Ьеи

Зег

Уа1

Мер

Туг

РЬе

805

810

815

Уа1

Суз

О1у

Ьеи

11е

Мер

Ьеи

Тгр

Зег

Рго

Азп

Уа1

Туг

Уа1

Ьеи

Суз

820

825

830

РЬе

А1а

Агд

Ьеи

Азп

О1у

РЬе

О1у

А1а

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

Ьеи

835

840

845

ναι

Рго

Уа1

Туг

11е

Зег

О1и

ТЬг

А1а

Рго

О1и

11е

Агд

О1у

О1п

850

855

860

Ьеи

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

О1п

РЬе

Ьеи

О1у

Зег

О1у

Мер

РЬе

Ьеи

Зег

865

870

875

880

Туг

Суз

Мер

Уа1

РЬе

ТЬг

Мер

Зег

Ьеи

Зег

Азр

Зег

Рго

Зег

Тгр

Агд

885

890

895

А1а

Мер

Ьеи

О1у

Уа1

Ьеи

Зег

11е

Рго

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

РЬе

Ьеи

900

905

910

ТЬг

Уа1

РЬе

Туг

Ьеи

Рго

О1и

Зег

Рго

Агд

Тгр

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

О1у

915

920

925

- 10 029227

Агд

МеЬ 930

Азр

О1и

А1а

Ьуз

Агд 935

Уа1

Ьеи

О1п

Ьеи 940

Суз

О1у

Агд

О1и

Азр 945

Уа1

ТЬг

Азр

О1и

МеЬ 950

А1а

Ьеи

Уа1

О1и 955

О1у

Ьеи

Азр

11е

О1у 960

О1у

О1и

Ьуз

ТЬг

МеЬ 965

О1и

Азр

Ьеи

Уа1 970

ТЬг

Ьеи

О1и

Азр

Н1з 975

О1и

О1у

Азр

ТЬг 980

Ьеи

О1и

ТЬг

Уа1

Азр 985

О1и

Азр

О1у

О1п

МеЬ 990

Агд

Ьеи

Туг О1у ТЬг Ηΐ3 О1и Азп О1п Зег Туг Ьеи А1а Агд Рго Уа1 Рго О1и 995 1000 1005

О1п Азп

Зег

Ьеи

О1у

Ьеи 1015

Агд

Зег

Агд

Н1з

О1у 1020

Зег

Ьеи

А1а

1010

Азп

О1п

Зег

МеЬ

11е

Ьеи

Ьуз

Азр

Рго

Ьеи

Уа1

Азп

Ьеи

РЬе

О1у

1025

1030

1035

Зег

Ьеи

Н1з

О1и

Ьуз

МеЬ

Рго

О1и

А1а

О1у

Азп

ТЬг

Агд

Зег

1040

1045

1050

О1у

11е

РЬе

Рго

Н1з

РЬе

О1у

Зег

МеЬ

РЬе

Зег

ТЬг

А1а

Азр

1055

1060

1065

А1а

Рго

Н1з

О1у

Ьуз

Рго

А1а

Н1з

Тгр

О1и

Ьуз

Азр

11е

О1и

Зег

1070

1075

1080

Н1з

Туг

Азп

Ьуз

Азр

Азп

Азр

Туг

А1а

ТЬг

Азр

О1у

А1а

1085

1090

1095

О1у

Азр

Зег

Азр

Азп

Азр

Ьеи

Агд

Зег

Рго

Ьеи

МеЬ

1100

1105

1110

Зег

Агд

О1п

ТЬг

Зег

МеЬ

Азр

Ьуз

Азр

МеЬ

11е

Рго

Н1з

Рго

1115

1120

1125

ТЬг

Зег

О1у

Зег

ТЬг

Ьеи

Зег

МеЬ

Агд

Н1з

Зег

ТЬг

Ьеи

МеЬ

1130

1135

1140

О1п

О1у

Азп

О1у

О1и

Зег

МеЬ

О1у

11е

О1у

Тгр

Н1з

1145

1150

1155

МеЬ

О1у

Туг

Агд

Туг

О1и

Азп

Азр

О1и

Туг

Ьуз

Агд

Туг

Ьеи

1160

1165

1170

- 11 029227

Ьуз

О1и 1175

Азр

О1у

А1а

О1и

Зег 1180

Агд

О1у

Зег

11е 1185

11е

Зег

11е

Рго

О1у

Рго

Азр

О1у

Зег

Туг

11е

Н1з

А1а

Зег

А1а

1190

1195

1200

Ьеи

Уа1

Зег

Агд

Зег

Уа1

Ьеи

О1у

Рго

Ьуз

Зег

Уа1

Н1з

О1у

Зег

1205

1210

1215

А1а

МеЬ

Уа1

Рго

О1и

Ьуз

11е

А1а

Зег

О1у

Рго

Ьеи

Тгр

1220

1225

1230

Зег

А1а

Ьеи

О1и

Рго

О1у

Уа1

Ьуз

Агд

А1а

Ьеи

Уа1

О1у

1235

1240

1245

ναι

О1у

11е

О1п

11е

Ьеи

О1п

РЬе

Зег

О1у

11е

Азп

О1у

Уа1

1250

1255

1260

Ьеи

Туг

ТЬг

Рго

О1п

11е

Ьеи

О1и

Агд

А1а

О1у

Уа1

Азр

11е

1265

1270

1275

Ьеи

Зег

Ьеи

О1у

Ьеи

Зег

11е

Зег

А1а

Зег

РЬе

Ьеи

1280

1285

1290

11е

Зег

О1у

Ьеи

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Ьеи

Рго

А1а

11е

Уа1

1295

1300

1305

А1а

МеЬ

Агд

Ьеи

МеЬ

Азр

Уа1

Зег

О1у

Агд

Зег

Ьеи

1310

1315

1320

Тгр

ТЬг

11е

Рго

Уа1

Ьеи

11е

Уа1

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

11е

1325

1330

1335

Зег

О1и

Ьеи

11е

Ηΐ3

11е

Зег

Ьуз

Уа1

Азп

А1а

Ьеи

Зег

1340

1345

1350

ТЬг

О1у

Суз

Уа1

Ьеи

Туг

РЬе

Суз

РЬе

Уа1

МеЬ

О1у

Туг

1355

1360

1365

О1у

Рго

11е

Рго

Азп

11е

Ьеи

Суз

Зег

О1и

11е

РЬе

Рго

ТЬг

Агд

1370

1375

1380

ναι

Агд

О1у

Ьеи

Суз

11е

А1а

11е

Суз

А1а

МеЬ

Уа1

РЬе

Тгр

11е

1385

1390

1395

О1у

Азр

11е

Уа1

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи

Зег

1400

1405

1410

- 12 029227

11е	О1у 1415	Ьеи	Уа1	О1у	Уа1	РЬе 1420	Зег
11е	Зег 1430	Тгр	11е	РЬе	Уа1	Туг 1435	МеЕ
МеЕ	Рго 1445	Ьеи	О1и	Уа1	11е	ТЬг 1450	Азр
А1а	О1п 1460	А1а	Зег	А1а	Рго	Зег 1465	Ьуз

Азр 11е

11е	Туг	А1а	А1а 1425	Уа1	Суз	Уа1
Ьуз	Уа1	Рго	О1и 1440	ТЬг	Ьуз	О1у
Туг	РЬе	А1а	РЬе 1455	О1у	А1а	О1п

<210> 2 <211> 2205 <212> ΌΝΑ <213> АгаЫЬорз1з ЕЬаНапа <400> 2 аЕдаадддад сдасЕсЕсдЕ ЕдсЕсЕсдсс	дссасааЕсд	дсааЕЕЕсЕЕ	асааддаЕдд	60
дасааЕдсса	ссаЕЕдсЕдд	адсЕаЕддЕЕ	ЕаЕаЕсааса	аадасЕЕдаа	ЕсЕассаасс	120
ЕсЕдЕЕсаад	дЕсЕЕдЕсдЕ	ЕдсЕаЕдЕса	ЕЕдаЕсддЕд	саасддЕсаЕ	сасдасЕЕдс	180
Есаддассда	ЕаЕсЕдаЕЕд	дсЕсддсада	сдссссаЕдс	ЕсаЕЕЕЕаЕс	аЕсадЕЕаЕд	240
ЕаЕЕЕсдЕсЕ	дсддЕЕЕдаЕ	ааЕдЕЕдЕдд	ЕсЕсссааЕд	ЕсЕаЕдЕЕсЕ	дЕдсЕЕЕдсЕ	300
аддсЕЕсЕЕа	аЕдддЕЕЕдд	ЕдссдддсЕс	дсддЕЕасас	ЕЕдЕсссЕдЕ	ЕЕасаЕЕЕсЕ	360
дааассдсЕс	сЕссддадаЕ	сададдасад	ЕЕаааЕасЕс	ЕсссЕсадЕЕ	ЕсЕЕддсЕсЕ	420
ддЕддааЕдЕ	ЕЕЕЕдЕсаЕа	сЕдЕаЕддЕЕ	ЕЕсасЕаЕдЕ	сссЕдадЕда	сЕссссЕадс	480
Еддададсса	ЕдсЕсддЕдЕ	ссЕсЕсдаЕс	ссЕЕсЕсЕЕс	ЕЕЕаЕЕЕдЕЕ	ЕсЕсасддЕд	540
ЕЕЕЕаЕЕЕдс	ссдадЕсЕсс	ЕсдЕЕддсЕд	дЕЕадЕааад	даадааЕдда	сдаддсЕаад	600
сдадЕЕсЕЕс	аасадЕЕаЕд	Еддсададаа	даЕдЕЕассд	аЕдадаЕддс	ЕЕЕасЕадЕЕ	660
дааддасЕад	аЕаЕаддадд	адааааааса	аЕддаадаЕс	ЕсЕЕадЕаас	ЕЕЕддаддаЕ	720
саЕдааддЕд	аЕдаЕасасЕ	ЕдааассдЕЕ	даЕдаддаЕд	дасаааЕдсд	дсЕЕЕаЕдда	780
асссасдада	аЕсааЕсдЕа	ссЕЕдсЕада	ссЕдЕсссад	аасааааЕад	сЕсасЕЕддд	840
сЕасдсЕсЕс	дссасддаад	сЕЕадсааас	сааадсаЕда	ЕссЕЕааада	ЕссдсЕсдЕс	900
ааЕсЕЕЕЕЕд	дсадЕсЕсса	сдадаадаЕд	ссадаадсад	дсддааасас	ЕсддадЕддд	960
аЕЕЕЕсссЕс	аЕЕЕсддаад	саЕдЕЕсадЕ	асЕасЕдссд	аЕдсдссЕса	сддЕааассд	1020
дсЕсаЕЕддд	ааааддасаЕ	адададссаЕ	Еасаасааад	асааЕдаЕда	сЕаЕдсдасЕ	1080
даЕдаЕддЕд	сддаасаааа	асЕЕаЕсЕсд	дсадаадаЕЕ	ЕдсдЕадссс	сЕЕааЕдЕсд	1140
сдссадасса	саадсаЕдда	сааддаЕаЕд	аЕсссасаЕс	сЕасаадЕдд	аадсасЕЕЕа	1200

- 13 029227

адсаРдадас	дасасадРас	дсРРаРдсаа	ддсаасддсд	ааадРадсаР	дддааРРддР	1260
ддРддРРддс	аРаРдддаРа	РадаРасдаа	аасдаРдааР	асаададдРа	РРаРсРРааа	1320
даадаРддад	сРдааРсРсд	ссдРддсРсд	аРсаРсРсРа	РРсссддадд	РссддаРддР	1380
ддаддсадсР	асаРРсасдс	РРсРдсссРР	дРаадсадаР	сРдРРсРРдд	РссРаааРса	1440
дРРсаРддаР	ссдссаРддР	Рсссссддад	ааааРРдсРд	ссРсРддасс	асРсРддРсР	1500
дсРсРРсРРд	аассРддРдР	РаадсдРдсс	РРддРРдРРд	дРдРсддсаР	РсаааРасРд	1560
садсадРРРР	саддРаРсаа	РддадРРсРс	РасРасасРс	сРсадаРРсР	сдаасдддсР	1620
ддсдРадаРа	РРсРРсРРРс	дадссРсдда	сРаадРРсса	РсРсРдсдРс	аРРссРсаРс	1680
адсддРРРаа	саасаРРасР	саРдсРссса	дссаРРдРсд	РРдссаРдад	асРсаРддаР	1740
дРаРссддаа	дааддРсаРР	асРРсРсРдд	асааРсссад	РРсРсаРРдР	сРсасРРдРс	1800
дРссРРдРса	РсадсдадсР	саРссасаРс	адсааадРсд	Рдаасдсадс	асРсРссаса	1860
ддРРдРдРсд	РдсРсРасРР	сРдсРРсРРс	дРдаРдддРР	асддРсссаР	РссааасаРс	1920
сРсРдРРсРд	аааРсРРссс	аасаададРс	сдРддРсРсР	дсаРсдссаР	аРдРдсРаРд	1980
дРсРРРРдда	РРддадасаР	РаРРдРсасд	РасРсасРРс	ссдРРсРссР	садсРсдаРс	2040
ддасРадРРд	дРдРРРРсад	саРРРасдсР	дсддРРРдсд	РРаРсРсаРд	даРсРРсдРР	2100
РасаРдааад	Рсссддадас	РаааддсаРд	ссРРРддаад	РРаРсасада	сРасРРРдсс	2160
РРРддадсРс	аадсРсаадс	РРсРдсРссР	РсРааддаРа	РаРаа		2205

<210> 3

<211> 5166

<212> ΌΝΑ

<213> АгаЫ0.орз1з РЬаНапа

<400> 3

сРаааРРдРа	адсдРРааРа	РРРРдРРааа	аРРсдсдРРа	ааРРРРРдРР	аааРсадсРс	60
аРРРРРРаас	сааРаддссд	аааРсддсаа	ааРсссРРаР	аааРсаааад	ааРадассда	120
даРадддРРд	адРдРРдРРс	садРРРддаа	саададРсса	сРаРРааада	асдРддасРс	180
саасдРсааа	дддсдааааа	ссдРсРаРса	дддсдаРддс	ссасРасдРд	аассаРсасс	240
сРааРсаадР	РРРРРддддР	сдаддРдссд	РааадсасРа	ааРсддаасс	сРааадддад	300
сссссдаРРР	ададсРРдас	ддддааадсс	ддсдаасдРд	дсдадааадд	аадддаадаа	360
адсдааадда	дсдддсдсРа	дддсдсРддс	аадРдРадсд	дРсасдсРдс	дсдРаассас	420
сасасссдсс	дсдсРРааРд	сдссдсРаса	дддсдсдРсс	саРРсдссаР	РсаддсРдсд	480
саасРдРРдд	даадддсдаР	сддРдсдддс	сРсРРсдсРа	РРасдссадс	Рддсдааадд	540
дддаРдРдсР	дсааддсдаР	РаадРРдддР	аасдссаддд	РРРРсссадР	сасдасдРРд	600
Раааасдасд	дссадРдадс	дсдсдРааРа	сдасРсасРа	РадддсдааР	РдддРассдд	660

- 14 029227

дсссссссЕс	даддЕсдасд	дЕаЕсдаЕаа	дсЕЕдаЕЕЕа	ЕаЕаЕссЕЕа	дааддадсад	720
аадсЕЕдадс	ЕЕдадсЕсса	ааддсааадЕ	адЕсЕдЕдаЕ	аасЕЕссааа	ддсаЕдссЕЕ	780
ЕадЕсЕссдд	дасЕЕЕсаЕд	Еааасдаада	ЕссаЕдадаЕ	аасдсааасс	дсадсдЕааа	840
ЕдсЕдаааас	ЕссаасЕадЕ	ЕсдаЕсдадс	Едаддадаас	дддаадЕдад	ЕасдЕдасаа	900
ЕааЕдЕсЕсс	ааЕссаааад	ассаЕадсас	аЕаЕддсдаЕ	дсададасса	сддЕсЕдсЕЕ	960
дЕЕдддаада	ЕЕЕсадааса	даддаЕдЕЕЕ	ддааЕддасс	дЕаасссаЕс	асдаадаадс	1020
адаадЕадад	сасдасасаа	ссЕдЕддада	дЕдсЕдсдЕЕ	сасдасЕЕЕд	сЕдаЕдЕдда	1080
ЕдадсЕсдсЕ	даЕдасаадд	асдасаадЕд	адасааЕдад	аасЕдддаЕЕ	дЕссададаа	1140
дЕааЕдассЕ	ЕсЕЕссддаЕ	асаЕссаЕда	дЕсЕсаЕддс	аасдасааЕд	дсЕдддадса	1200
ЕдадЕааЕдЕ	ЕдЕЕааассд	сЕдаЕдадда	аЕдасдсада	даЕддаасЕЕ	адЕссдаддс	1260
Есдааадаад	ааЕаЕсЕасд	ссадсссдЕЕ	сдадааЕсЕд	аддадЕдЕад	ЕададаасЕс	1320
саЕЕдаЕасс	ЕдаааасЕдс	ЕдсадЕаЕЕЕ	дааЕдссдас	ассаасаасс	ааддсасдсЕ	1380
Еаасассадд	ЕЕсаадаада	дсадассада	дЕддЕссада	ддсадсааЕЕ	ЕЕсЕссдддд	1440
даассаЕддс	ддаЕссаЕда	асЕдаЕЕЕад	дассаадаас	адаЕсЕдсЕЕ	асаадддсад	1500
аадсдЕдааЕ	дЕадсЕдссЕ	ссассаЕссд	дассЕссддд	ааЕададаЕд	аЕсдадссас	1560
ддсдадаЕЕс	адсЕссаЕсЕ	ЕсЕЕЕаадаЕ	ааЕассЕсЕЕ	дЕаЕЕсаЕсд	ЕЕЕЕсдЕаЕс	1620
ЕаЕаЕсссаЕ	аЕдссаасса	ссассааЕЕс	ссаЕдсЕасЕ	ЕЕсдссдЕЕд	ссЕЕдсаЕаа	1680
дсдЕасЕдЕд	ЕсдЕсЕсаЕд	сЕЕааадЕдс	ЕЕссасЕЕдЕ	аддаЕдЕддд	аЕсаЕаЕссЕ	1740
ЕдЕссаЕдсЕ	ЕдЕддЕсЕдд	сдсдасаЕЕа	аддддсЕасд	саааЕсЕЕсЕ	ЕссдадаЕаа	1800
дЕЕЕЕЕдЕЕс	сдсассаЕса	ЕсадЕсдсаЕ	адЕсаЕсаЕЕ	дЕсЕЕЕдЕЕд	ЕааЕддсЕсЕ	1860
сЕаЕдЕссЕЕ	ЕЕсссааЕда	дссддЕЕЕас	сдЕдаддсдс	аЕсддсадЕа	дЕасЕдааса	1920
ЕдсЕЕссдаа	аЕдадддааа	аЕсссасЕсс	дадЕдЕЕЕсс	дссЕдсЕЕсЕ	ддсаЕсЕЕсЕ	1980
сдЕддадасЕ	дссааааада	ЕЕдасдадсд	даЕсЕЕЕаад	даЕсаЕдсЕЕ	ЕддЕЕЕдсЕа	2040
адсЕЕссдЕд	дсдададсдЕ	адсссаадЕд	адсЕаЕЕЕЕд	ЕЕсЕдддаса	ддЕсЕадсаа	2100
ддЕасдаЕЕд	аЕЕсЕсдЕдд	дЕЕссаЕааа	дссдЕаЕЕЕд	ЕссаЕссЕса	ЕсаасддЕЕЕ	2160
саадЕдЕаЕс	аЕсассЕЕса	ЕдаЕссЕсса	аадЕЕасЕаа	дадаЕсЕЕсс	аЕЕдЕЕЕЕЕЕ	2220
сЕссЕссЕаЕ	аЕсЕадЕссЕ	ЕсаасЕадЕа	аадссаЕсЕс	аЕсддЕааса	ЕсЕЕсЕсЕдс	2280
сасаЕаасЕд	ЕЕдаадаасЕ	сдсЕЕадссЕ	сдЕссаЕЕсЕ	ЕссЕЕЕасЕа	ассадссаас	2340
даддадасЕс	дддсаааЕаа	аасассдЕда	дааасаааЕа	аадаададаа	дддаЕсдада	2400
ддасассдад	саЕддсЕсЕс	садсЕадддд	адЕсасЕсад	ддасаЕадЕд	аааассаЕас	2460
адЕаЕдасаа	ааасаЕЕсса	ссададссаа	дааасЕдадд	дададЕаЕЕЕ	аасЕдЕссЕс	2520

- 15 029227

+да+с+ссдд	аддадсдд++	+садааа+д+	ааасадддас	аад+д+аасс	дсдадсссдд	2580
сассааассс	а++аадаадс	с+адсааадс	асадааса+а	даса++ддда	дассасааса	2640
++а+сааасс	дсадасдааа	+аса+аас+д	а+да+аааа+	дадса+дддд	сд+с+дссда	2700
дссаа+сада	+а+сдд+сс+	дадсаад+сд	+да+дассд+	+дсассда+с	аа+даса+ад	2760
саасдасаад	асс++дааса	дадд++дд+а	да++саад+с	+++д++да+а	+ааасса+ад	2820
с+ссадсаа+	дд+ддса++д	+ссса+сс++	д+аадааа++	дссда++д+д	дсддсдадад	2880
саасдадад+	сдс+ссс++с	а+а+сдаа++	сс+дсадссс	ддддда+сса	с+ад++с+ад	2940
адсддссдсс	ассдсдд+дд	адс+ссадс+	+++д++ссс+	++ад+даддд	++аа++дсдс	3000
дс++ддсд+а	а+са+дд+са	+адс+д+++с	с+д+д+дааа	++д++а+ссд	с+сасаа++с	3060
сасасааса+	асдадссдда	адса+ааад+	д+ааадсс+д	ддд+дсс+аа	+дад+дадс+	3120
аас+саса++	аа++дсд++д	сдс+сас+дс	ссдс+++сса	д+сдддааас	с+д+сд+дсс	3180
адс+дса++а	а+даа+сддс	саасдсдсдд	ддададдсдд	+++дсд+а++	дддсдс+с++	3240
ссдс++сс+с	дс+сас+дас	+сдс+дсдс+	сдд+сд++сд	дс+дсддсда	дсдд+а+сад	3300
с+сас+сааа	ддсдд+аа+а	сдд++а+сса	садаа+садд	дда+аасдса	ддааадааса	3360
+д+дадсааа	аддссадсаа	ааддссадда	ассд+ааааа	ддссдсд++д	с+ддсд++++	3420
+сса+аддс+	ссдсссссс+	дасдадса+с	асааааа+сд	асдс+саад+	сададд+ддс	3480
дааасссдас	аддас+а+аа	ада+ассадд	сд+++ссссс	+ддаадс+сс	с+сд+дсдс+	3540
с+сс+д++сс	дассс+дссд	с++ассдда+	асс+д+ссдс	с+++с+ссс+	+сдддаадсд	3600
+ддсдс+++с	+са+адс+са	сдс+д+адд+	а+с+сад++с	дд+д+адд+с	д++сдс+сса	3660
адс+дддс+д	+д+дсасдаа	ссссссд++с	адсссдассд	с+дсдсс++а	+ссдд+аас+	3720
а+сд+с++да	д+ссаасссд	д+аадасасд	ас++а+сдсс	ас+ддсадса	дссас+дд+а	3780
асадда++ад	сададсдадд	+а+д+аддсд	д+дс+асада	д++с++даад	+дд+ддсс+а	3840
ас+асддс+а	сас+адаадд	асад+а+++д	д+а+с+дсдс	+с+дс+даад	ссад++асс+	3900
+сддааааад	ад++дд+адс	+с++да+ссд	дсааасааас	сассдс+дд+	адсдд+дд++	3960
+++++д+++д	саадсадсад	а++асдсдса	дааааааадд	а+с+саадаа	да+сс+++да	4020
+с++++с+ас	дддд+с+дас	дс+сад+дда	асдаааас+с	асд++ааддд	а++++дд+са	4080
+дада++а+с	ааааадда+с	++сасс+ада	+сс++++ааа	++ааааа+да	ад++++ааа+	4140
саа+с+ааад	+а+а+а+дад	+ааас++дд+	с+дасад++а	ссаа+дс++а	а+сад+дадд	4200
сасс+а+с+с	адсда+с+д+	с+а+++сд++	са+сса+ад+	+дсс+дас+с	сссд+сд+д+	4260
ада+аас+ас	да+асдддад	ддс++асса+	с+ддссссад	+дс+дсаа+д	а+ассдсдад	4320
асссасдс+с	ассддс+сса	да+++а+сад	саа+ааасса	дссадссдда	адддссдадс	4380
дсадаад+дд	+сс+дсаас+	++а+ссдсс+	сса+ссад+с	+а++аа++д+	+дссдддаад	4440

- 16 029227

сЕададЕаад	ЕадЕЕсдсса	дЕЕааЕадЕЕ	ЕдсдсаасдЕ	ЕдЕЕдссаЕЕ	дсЕасаддса	4500
ЕсдЕддЕдЕс	асдсЕсдЕсд	ЕЕЕддЕаЕдд	сЕЕсаЕЕсад	сЕссддЕЕсс	саасдаЕсаа	4560
ддсдадЕЕас	аЕдаЕссссс	аЕдЕЕдЕдса	ааааадсддЕ	ЕадсЕссЕЕс	ддЕссЕссда	4620
ЕсдЕЕдЕсад	аадЕаадЕЕд	дссдсадЕдЕ	ЕаЕсасЕсаЕ	ддЕЕаЕддса	дсасЕдсаЕа	4680
аЕЕсЕсЕЕас	ЕдЕсаЕдсса	ЕссдЕаадаЕ	дсЕЕЕЕсЕдЕ	дасЕддЕдад	ЕасЕсаасса	4740
адЕсаЕЕсЕд	адааЕадЕдЕ	аЕдсддсдас	сдадЕЕдсЕс	ЕЕдсссддсд	ЕсааЕасддд	4800
аЕааЕассдс	дссасаЕадс	адаасЕЕЕаа	аадЕдсЕсаЕ	саЕЕддаааа	сдЕЕсЕЕсдд	4860
ддсдаааасЕ	сЕсааддаЕс	ЕЕассдсЕдЕ	ЕдадаЕссад	ЕЕсдаЕдЕаа	сссасЕсдЕд	4920
сасссаасЕд	аЕсЕЕсадса	ЕсЕЕЕЕасЕЕ	ЕсассадсдЕ	ЕЕсЕдддЕда	дсааааасад	4980
дааддсаааа	Едссдсаааа	аадддааЕаа	дддсдасасд	даааЕдЕЕда	аЕасЕсаЕас	5040
ЕсЕЕссЕЕЕЕ	ЕсааЕаЕЕаЕ	ЕдаадсаЕЕЕ	аЕсадддЕЕа	ЕЕдЕсЕсаЕд	адсддаЕаса	5100
ЕаЕЕЕдааЕд	ЕаЕЕЕадааа	ааЕааасааа	ЕаддддЕЕсс	дсдсасаЕЕЕ	ссссдаааад	5160

Едссас 5166

<210> 4

<211> 7242

<212> ΌΝΑ <213> АгаЫборз1з ЕбаНапа <400> 4 ЕдассаадЕс адсЕЕддсас ЕддссдЕсдЕ	ЕЕЕасаасдЕ	сдЕдасЕддд	аааасссЕдд	60
сдЕЕасссаа	сЕЕааЕсдсс	ЕЕдсадсаса	ЕсссссЕЕЕс	дссадсЕддс	дЕааЕадсда	120
ададдсссдс	ассдаЕсдсс	сЕЕсссааса	дЕЕдсдсадс	сЕдааЕддсд	ааЕдддаааЕ	180
ЕдЕааасдЕЕ	ааЕаЕЕЕЕдЕ	ЕааЕаЕЕЕЕд	ЕЕааааЕЕсд	сдЕЕаааЕЕЕ	ЕЕдЕЕаааЕс	240
адсЕсаЕЕЕЕ	ЕЕаассааЕа	ддссдаааЕс	ддсааааЕсс	сЕЕаЕаааЕс	аааадааЕад	300
ассдадаЕад	ддЕЕдадЕдЕ	ЕдЕЕссадЕЕ	Еддаасаада	дЕссасЕаЕЕ	ааадаасдЕд	360
дасЕссаасд	Есааадддсд	ааааассдЕс	ЕаЕсадддсд	аЕддсссасЕ	асдЕдаасса	420
ЕсасссЕааЕ	саадЕЕЕЕЕЕ	ддддЕсдадд	ЕдссдЕааад	сасЕаааЕсд	даасссЕааа	480
дддаЕдсссс	даЕЕЕададс	ЕЕдасдддда	аадссддсда	асдЕддсдад	аааддааддд	540
аадааадсда	ааддадсддд	сдсЕадддсд	сЕддсаадЕд	ЕадсддЕсас	дсЕдсдсдЕа	600
ассассасас	ссдссдсдсЕ	ЕааЕдсдссд	сЕасадддсд	сдЕсаддЕдд	сасЕЕЕЕсдд	660
ддаааЕдЕдс	дсддаасссс	ЕаЕЕЕдЕЕЕа	ЕЕЕЕЕсЕааа	ЕасаЕЕсааа	ЕаЕдЕаЕссд	720
сЕсаЕдадас	ааЕаасссЕд	аЕаааЕдсЕЕ	сааЕааЕаЕЕ	даааааддаа	дадЕаЕдадЕ	780
аЕЕсаасаЕЕ	ЕссдЕдЕсдс	ссЕЕаЕЕссс	ЕЕЕЕЕЕдсдд	саЕЕЕЕдссЕ	ЕссЕдЕЕЕЕЕ	840
дсЕсасссад	ааасдсЕддЕ	дааадЕаааа	даЕдсЕдаад	аЕсадЕЕддд	ЕдсасдадЕд	900

- 17 029227

ддЬЬасаЬсд	аасЬддаЬсЬ	саасадсддЬ	аадаЬссЬЬд	ададЬЬЬЬсд	ссссдаадаа	960
сдЬЬЬЬссаа	ЬдаЬдадсас	ЬЬЬЬааадЬЬ	сЬдсЬаЬдЬд	дсдсддЬаЬЬ	аЬсссдЬаЬЬ	1020
дасдссдддс	аададсаасЬ	сддЬсдссдс	аЬасасЬаЬЬ	сЬсадааЬда	сЬЬддЬЬдад	1080
ЬасЬсассад	Ьсасадаааа	дсаЬсЬЬасд	даЬддсаЬда	садЬаадада	аЬЬаЬдсадЬ	1140
дсЬдссаЬаа	ссаЬдадЬда	ЬаасасЬдсд	дссаасЬЬас	ЬЬсЬдасаас	даЬсддадда	1200
ссдааддадс	ЬаассдсЬЬЬ	ЬЬЬдсасаас	аЬдддддаЬс	аЬдЬаасЬсд	ссЬЬдаЬсдЬ	1260
Ьдддаассдд	адсЬдааЬда	адссаЬасса	аасдасдадс	дЬдасассас	даЬдссЬдЬа	1320
дсааЬддсаа	саасдЬЬдсд	сааасЬаЬЬа	асЬддсдаас	ЬасЬЬасЬсЬ	адсЬЬсссдд	1380
саасааЬЬаа	ЬадасЬддаЬ	ддаддсддаЬ	ааадЬЬдсад	дассасЬЬсЬ	дсдсЬсддсс	1440
сЬЬссддсЬд	дсЬддЬЬЬаЬ	ЬдсЬдаЬааа	ЬсЬддадссд	дЬдадсдЬдд	дЬсЬсдсддЬ	1500
аЬсаЬЬдсад	сасЬддддсс	адаЬддЬаад	сссЬсссдЬа	ЬсдЬадЬЬаЬ	сЬасасдасд	1560
дддадЬсадд	саасЬаЬдда	ЬдаасдаааЬ	адасадаЬсд	сЬдадаЬадд	ЬдссЬсасЬд	1620
аЬЬаадсаЬЬ	ддЬаасЬдЬс	адассаадЬЬ	ЬасЬсаЬаЬа	ЬасЬЬЬадаЬ	ЬдаЬЬЬаааа	1680
сЬЬсаЬЬЬЬЬ	ааЬЬЬаааад	даЬсЬаддЬд	аадаЬссЬЬЬ	ЬЬдаЬааЬсЬ	саЬдассааа	1740
аЬсссЬЬаас	дЬдадЬЬЬЬс	дЬЬссасЬда	дсдЬсадасс	ссдЬадаааа	даЬсааадда	1800
ЬсЬЬсЬЬдад	аЬссЬЬЬЬЬЬ	ЬсЬдсдсдЬа	аЬсЬдсЬдсЬ	Ьдсааасааа	аааассассд	1860
сЬассадсдд	ЬддЬЬЬдЬЬЬ	дссддаЬсаа	дадсЬассаа	сЬсЬЬЬЬЬсс	дааддЬаасЬ	1920
ддсЬЬсадса	дадсдсадаЬ	ассаааЬасЬ	дЬссЬЬсЬад	ЬдЬадссдЬа	дЬЬаддссас	1980
сасЬЬсаада	асЬсЬдЬадс	ассдссЬаса	ЬассЬсдсЬс	ЬдсЬааЬссЬ	дЬЬассадЬд	2040
дсЬдсЬдсса	дЬддсдаЬаа	дЬсдЬдЬсЬЬ	ассдддЬЬдд	асЬсаадасд	аЬадЬЬассд	2100
даЬааддсдс	адсддЬсддд	сЬдаасдддд	ддЬЬсдЬдса	сасадсссад	сЬЬддадсда	2160
асдассЬаса	ссдаасЬдад	аЬассЬасад	сдЬдадсЬаЬ	дадааадсдс	сасдсЬЬссс	2220
даадддадаа	аддсддасад	дЬаЬссддЬа	адсддсаддд	Ьсддаасадд	ададсдсасд	2280
адддадсЬЬс	садддддааа	сдссЬддЬаЬ	сЬЬЬаЬадЬс	сЬдЬсдддЬЬ	ЬсдссассЬс	2340
ЬдасЬЬдадс	дЬсдаЬЬЬЬЬ	дЬдаЬдсЬсд	Ьсаддддддс	ддадссЬаЬд	дааааасдсс	2400
адсаасдсдд	ссЬЬЬЬЬасд	дЬЬссЬддсс	ЬЬЬЬдсЬддс	сЬЬЬЬдсЬса	саЬдЬЬсЬЬЬ	2460
ссЬдсдЬЬаЬ	ссссЬдаЬЬс	ЬдЬддаЬаас	сдЬаЬЬассд	ссЬЬЬдадЬд	адсЬдаЬасс	2520
дсЬсдссдса	дссдаасдас	сдадсдсадс	дадЬсадЬда	дсдаддаадс	ддаададсдс	2580
ссааЬасдса	аассдссЬсЬ	ссссдсдсдЬ	ЬддссдаЬЬс	аЬЬааЬдсад	сЬддсасдас	2640
аддЬЬЬсссд	асЬддааадс	дддсадЬдад	сдсаасдсаа	ЬЬааЬдЬдад	ЬЬадсЬсасЬ	2700
саЬЬаддсас	сссаддсЬЬЬ	асасЬЬЬаЬд	сЬЬссддсЬс	дЬаЬдЬЬдЬд	ЬддааЬЬдЬд	2760

- 18 029227

адсддаЕаас	ааЕЕЕсасас	аддааасадс	ЕаЕдассаЕд	аЕЕасдааЕЕ	ЕддссаадЕс	2820
ддссЕсЕааЕ	асдасЕсасЕ	аЕадддадсЕ	сдЕсдадсдд	ссдсЕсдасд	ааЕЕааЕЕсс	2880
ааЕсссасаа	аааЕсЕдадс	ЕЕаасадсас	адЕЕдсЕссЕ	сЕсададсад	ааЕсдддЕаЕ	2940
ЕсаасасссЕ	саЕаЕсаасЕ	асЕасдЕЕдЕ	дЕаЕаасддЕ	ссасаЕдссд	дЕаЕаЕасда	3000
ЕдасЕддддЕ	ЕдЕасааадд	сддсаасааа	сддсдЕЕссс	ддадЕЕдсас	асаадаааЕЕ	3060
ЕдссасЕаЕЕ	асададдсаа	дадсадсадс	ЕдасдсдЕас	асаасаадЕс	адсааасада	3120
саддЕЕдаас	ЕЕсаЕсссса	ааддадаадс	ЕсаасЕсаад	сссаададсЕ	ЕЕдсЕааддс	3180
ссЕаасаадс	ссассааадс	ааааадссса	сЕддсЕсасд	сЕаддаасса	аааддсссад	3240
садЕдаЕсса	дссссаааад	адаЕсЕссЕЕ	Едссссддад	аЕЕасааЕдд	асдаЕЕЕссЕ	3300
сЕаЕсЕЕЕас	даЕсЕаддаа	ддаадЕЕсда	аддЕдааддЕ	дасдасасЕа	ЕдЕЕсассас	3360
ЕдаЕааЕдад	ааддЕЕадсс	ЕсЕЕсааЕЕЕ	садааадааЕ	дсЕдасссас	адаЕддЕЕад	3420
ададдссЕас	дсадсаддЕс	ЕсаЕсаадас	даЕсЕасссд	адЕаасааЕс	ЕссаддадаЕ	3480
саааЕассЕЕ	сссаадаадд	ЕЕааадаЕдс	адЕсаааада	ЕЕсаддасЕа	аЕЕдсаЕсаа	3540
даасасадад	ааадасаЕаЕ	ЕЕсЕсаадаЕ	садаадЕасЕ	аЕЕссадЕаЕ	ддасдаЕЕса	3600
аддсЕЕдсЕЕ	саЕааассаа	ддсаадЕааЕ	ададаЕЕдда	дЕсЕсЕаааа	аддЕадЕЕсс	3660
ЕасЕдааЕсЕ	ааддссаЕдс	аЕддадЕсЕа	адаЕЕсаааЕ	сдаддаЕсЕа	асадаасЕсд	3720
ссдЕдаадас	Еддсдаасад	ЕЕсаЕасада	дЕсЕЕЕЕасд	асЕсааЕдас	аадаадаааа	3780
ЕсЕЕсдЕсаа	саЕддЕддад	сасдасасЕс	ЕддЕсЕасЕс	саааааЕдЕс	ааадаЕасад	3840
ЕсЕсадаада	ссааадддсЕ	аЕЕдадасЕЕ	ЕЕсаасааад	даЕааЕЕЕсд	ддааассЕсс	3900
ЕсддаЕЕсса	ЕЕдсссадсЕ	аЕсЕдЕсасЕ	ЕсаЕсдааад	дасадЕадаа	ааддааддЕд	3960
дсЕссЕасаа	аЕдссаЕсаЕ	ЕдсдаЕааад	даааддсЕаЕ	саЕЕсаадаЕ	сЕсЕсЕдссд	4020
асадЕддЕсс	сааадаЕдда	сссссассса	сдаддадсаЕ	сдЕддааааа	даадасдЕЕс	4080
саассасдЕс	ЕЕсааадсаа	дЕддаЕЕдаЕ	дЕдасаЕсЕс	сасЕдасдЕа	адддаЕдасд	4140
сасааЕссса	сЕаЕссЕЕсд	саадасссЕЕ	ссЕсЕаЕаЕа	аддаадЕЕса	ЕЕЕсаЕЕЕдд	4200
ададдасасд	сЕсдаддааЕ	ЕсдаЕаЕдаа	дддадсдасЕ	сЕсдЕЕдсЕс	Есдссдссас	4260
ааЕсддсааЕ	ЕЕсЕЕасаад	даЕдддасаа	ЕдссассаЕЕ	дсЕддадсЕа	ЕддЕЕЕаЕаЕ	4320
саасааадас	ЕЕдааЕсЕас	саассЕсЕдЕ	ЕсааддЕсЕЕ	дЕсдЕЕдсЕа	ЕдЕсаЕЕдаЕ	4380
сддЕдсаасд	дЕсаЕсасда	сЕЕдсЕсадд	ассдаЕаЕсЕ	даЕЕддсЕсд	дсадасдссс	4440
саЕдсЕсаЕЕ	ЕЕаЕсаЕсад	ЕЕаЕдЕаЕЕЕ	сдЕсЕдсддЕ	ЕЕдаЕааЕдЕ	ЕдЕддЕсЕсс	4500
сааЕдЕсЕаЕ	дЕЕсЕдЕдсЕ	ЕЕдсЕаддсЕ	ЕсЕЕааЕддд	ЕЕЕддЕдссд	ддсЕсдсддЕ	4560
ЕасасЕЕдЕс	ссЕдЕЕЕаса	ЕЕЕсЕдааас	сдсЕссЕссд	дадаЕсадад	дасадЕЕааа	4620
ЕасЕсЕсссЕ	садЕЕЕсЕЕд	дсЕсЕддЕдд	ааЕдЕЕЕЕЕд	ЕсаЕасЕдЕа	ЕддЕЕЕЕсас	4680

- 19 029227

ЕаЕдЕсссЕд	адЕдасЕссс	сЕадсЕддад	адссаЕдсЕс	ддЕдЕссЕсЕ	сдаЕсссЕЕс	4740
ЕсЕЕсЕЕЕаЕ	ЕЕдЕЕЕсЕса	сддЕдЕЕЕЕа	ЕЕЕдсссдад	ЕсЕссЕсдЕЕ	ддсЕддЕЕад	4800
Еаааддаада	аЕддасдадд	сЕаадсдадЕ	ЕсЕЕсаасад	ЕЕаЕдЕддса	дадаадаЕдЕ	4860
ЕассдаЕдад	аЕддсЕЕЕас	ЕадЕЕдаадд	асЕадаЕаЕа	ддаддадааа	ааасааЕдда	4920
адаЕсЕсЕЕа	дЕаасЕЕЕдд	аддаЕсаЕда	аддЕдаЕдаЕ	асасЕЕдааа	ссдЕЕдаЕда	4980
ддаЕддасаа	аЕасддсЕЕЕ	аЕддаассса	сдадааЕсаа	ЕсдЕассЕЕд	сЕадассЕдЕ	5040
сссадаасаа	ааЕадсЕсас	ЕЕдддсЕасд	сЕсЕсдссас	ддаадсЕЕад	сааассааад	5100
саЕдаЕссЕЕ	ааадаЕссдс	ЕсдЕсааЕсЕ	ЕЕЕЕддсадЕ	сЕссасдада	адаЕдссада	5160
адсаддсдда	аасасЕсдда	дЕдддаЕЕЕЕ	сссЕсаЕЕЕс	ддаадсаЕдЕ	ЕсадЕасЕас	5220
ЕдссдаЕдсд	ссЕсасддЕа	аассддсЕса	ЕЕдддаааад	дасаЕадада	дссаЕЕасаа	5280
сааадасааЕ	даЕдасЕаЕд	сдасЕдаЕда	ЕддЕдсддаа	сааааасЕЕа	ЕсЕсддаада	5340
адаЕЕЕдсдЕ	адссссЕЕаа	ЕдЕсдсдсса	дассасаадс	аЕддасаадд	аЕаЕдаЕссс	5400
асаЕссЕаса	адЕддаадса	сЕЕЕаадсаЕ	дадасдасас	адЕасдсЕЕа	Едсааддсаа	5460
сддсдааадЕ	адсаЕдддаа	ЕЕддЕддЕдд	ЕЕддсаЕаЕд	ддаЕаЕадаЕ	асдаааасда	5520
ЕдааЕасаад	аддЕаЕЕаЕс	ЕЕааадаада	ЕддадсЕдаа	ЕсЕсдссдЕд	дсЕсдаЕсаЕ	5580
сЕсЕаЕЕссс	ддаддЕссдд	аЕддЕддадд	садсЕасаЕЕ	сасдсЕЕсЕд	сссЕЕдЕаад	5640
садаЕсЕдЕЕ	сЕЕддЕссЕа	ааЕсадЕЕса	ЕддаЕссдсс	аЕддЕЕсссс	сддадааааЕ	5700
ЕдсЕдссЕсЕ	ддассасЕсЕ	ддЕсЕдсЕсЕ	ЕсЕЕдаассЕ	ддЕдЕЕаадс	дЕдссЕЕддЕ	5760
ЕдЕЕддЕдЕс	ддсаЕЕсааа	ЕасЕдсадса	дЕЕЕЕсаддЕ	аЕсааЕддад	ЕЕсЕсЕасЕа	5820
сасЕссЕсад	аЕЕсЕсдаас	дддсЕддсдЕ	адаЕаЕЕсЕЕ	сЕЕЕсдадсс	ЕсддасЕаад	5880
ЕЕссаЕсЕсЕ	дсдЕсаЕЕсс	ЕсаЕсадсдд	ЕЕЕаасааса	ЕЕасЕсаЕдс	ЕсссадссаЕ	5940
ЕдЕсдЕЕдсс	аЕдадасЕса	ЕддаЕдЕаЕс	сддаадаадд	ЕсаЕЕасЕЕс	ЕсЕддасааЕ	6000
сссадЕЕсЕс	аЕЕдЕсЕсас	ЕЕдЕсдЕссЕ	ЕдЕсаЕсадс	дадсЕсаЕсс	асаЕсадсаа	6060
адЕсдЕдаас	дсадсасЕсЕ	ссасаддЕЕд	ЕдЕсдЕдсЕс	ЕасЕЕсЕдсЕ	ЕсЕЕсдЕдаЕ	6120
дддЕЕасддЕ	ссаЕЕссааа	саЕссЕсЕдЕ	ЕсЕдаааЕсЕ	Есссаасаад	садассдЕдд	6180
ЕсЕсЕдсаЕс	дссаЕаЕдЕд	сЕаЕддЕсЕЕ	ЕЕддаЕЕдда	дасаЕЕаЕЕд	ЕсасдЕасЕс	6240
асЕЕсссдЕЕ	сЕссЕсадсЕ	сдаЕсдаасЕ	адЕЕддадЕЕ	ЕЕсадсаЕЕЕ	асдсЕдсддЕ	6300
ЕЕдсдЕЕаЕс	ЕсаЕддаЕсЕ	ЕсдЕЕЕасаЕ	дааадЕсссд	дадасЕааад	дсаЕдссЕЕЕ	6360
ддаадЕЕаЕс	асадасЕасЕ	ЕЕдссЕЕЕдд	адсЕсаадсЕ	саадсЕЕсЕд	сЕссЕЕсЕаа	6420
ддаЕаЕаЕаа	аЕсаадсЕЕа	ЕсдаЕаадсЕ	ЕддаЕссЕсЕ	ададЕссЕдс	ЕЕЕааЕдада	6480
ЕаЕдсдадас	дссЕаЕдаЕс	дсаЕдаЕаЕЕ	ЕдсЕЕЕсааЕ	ЕсЕдЕЕдЕдс	асдЕЕдЕааа	6540

- 20 029227

ааассЕдадс	аЕдЕдЕадсЕ	садаЕссЕЕа	ссдссддЕЕЕ	сддЕЕсаЕЕс	ЕааЕдааЕаЕ	6600
аЕсасссдЕЕ	асЕаЕсдЕаЕ	ЕЕЕЕаЕдааЕ	ааЕаЕЕсЕсс	дЕЕсааЕЕЕа	сЕдаЕЕдЕас	6660
ссЕасЕасЕЕ	аЕаЕдЕасаа	ЕаЕЕааааЕд	аааасааЕаЕ	аЕЕдЕдсЕда	аЕаддЕЕЕаЕ	6720
адсдасаЕсЕ	аЕдаЕададс	дссасааЕаа	сааасааЕЕд	сдЕЕЕЕаЕЕа	ЕЕасаааЕсс	6780
ааЕЕЕЕаааа	ааадсддсад	аассддЕсаа	ассЕаааада	сЕдаЕЕасаЕ	аааЕсЕЕаЕЕ	6840
саааЕЕЕсаа	ааддссссад	дддсЕадЕаЕ	сЕасдасаса	ссдадсддсд	аасЕааЕаас	6900
дЕЕсасЕдаа	дддаасЕссд	дЕЕссссдсс	ддсдсдсаЕд	ддЕдадаЕЕс	сЕЕдаадЕЕд	6960
адЕаЕЕддсс	дЕссдсЕсЕа	ссдааадЕЕа	сдддсассаЕ	ЕсаасссддЕ	ссадсасддс	7020
ддссдддЕаа	ссдасЕЕдсЕ	дссссдадаа	ЕЕаЕдсадса	ЕЕЕЕЕЕЕддЕ	дЕаЕдЕдддс	7080
сссаааЕдаа	дЕдсаддЕса	аассЕЕдаса	дЕдасдасаа	аЕсдЕЕдддс	дддЕссаддд	7140
сдааЕЕЕЕдс	дасаасаЕдЕ	сдаддсЕсад	саддассЕдс	аддсаЕдсаа	дсЕадсЕЕас	7200
ЕадЕдаЕдса	ЕаЕЕсЕаЕад	ЕдЕсассЕаа	аЕсЕдсддсс	дс		7242

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ увеличения урожайности семян и стимуляции роста однодольных и двудольных растений, включающий увеличение количества белка ТМТ (транспортер моносахаридов в тонопласте) или его гомолога, посредством осуществления сверхэкспрессии последовательности нуклеотидов, которая кодирует указанный белок ТМТ или его гомолог в изогенных или трансгенных клетках растения, при этом указанный гомолог выполняет ту же функцию, что и белок ТМТ, причём аминокислотная последовательность указанного гомолога по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 1 белка ТМТ1 АгаЫбор818 Шайапа.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что белок ТМТ содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1 белка ТМТ1 АгаЫбор818 Шайапа.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что последовательность нуклеотидов, которая кодирует указанный белок ТМТ или его гомолог, вводят в растительные клетки и осуществляют ее сверхэкспрессию в растительных клетках под контролем конститутивного или индуцибельного промотора.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного гомолога белка ТМТ на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 белка ТМТ1 АгаЫбор818 ШаПапа.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что растения представляют собой культурные или полезные растения, выбранные из АгаЫбор818 ШаПапа. Вга881еа пари8, Вга881са о1егасеа, Вга881еа гара, АгасШ8 йуродеа, Воесйега 81г1с1а, Вгидшега дутпогИ/а, Сйги8 рагаФ81, Ропсии8 1г1Го11а1е, ЕирйогЫа е8и1а, Егадапа уе8са, 0о88уршт ЫгеиЫт, 0о88уршт гашопби, 01усте тах, НеПап11ш8 аппии8, 1ротоеа п1, Ьусорег8юоп е8си1епЫт, ЬасЫса регепт8, ЬасЫса 8айдпа, ЬасЫса 8ето1а, ЬасЫса 8айуа, Ьо1и8 .)аротси8, Ма1и8 боте8Йса, МеЫсадо 1гипсаЫ1а, №сойапа ЫЬасит, 0гу/а аи81гайеп818, 0гу/а ЬгасйуапЫ, 0гу/а рипс1а1а, 0гу/а гЫ1еу1, 0гу/а гийродоп, 0гу/а 8айуа, Рори1и8 йгсйосагра, Ропаги8 йгГойаЫ, Ргипи8 регеюа, 8о1апит ЫЬего8ит, 8огдйит Ысо1ог, ТгЫсит ае8ЙУит, йеа тау8, 8ассйагит оГйсшагит, Ратсит уйдаЫт, М18сапШи8, νΐΐΐ8 ушгГега, СаппаЫ8 8айуа.
6. Клетка трансгенного растения, обладающего увеличенной урожайностью семян и/или усиленным ростом по сравнению с растением дикого типа, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ТМТ или его гомолог, который выполняет ту же функцию, что и белок ТМТ, а также регуляторную нуклеотидную последовательность, функционально связанную с указанной кодирующей последовательностью, для обеспечения повышенной экспрессии гена указанного белка ТМТ в клетках указанного трансгенного растения, причём аминокислотная последовательность указанного гомолога по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1 белка ТМТ1 АгаЫбор818 ЫаПапа и при этом сверхэкспрессия указанного белка ТМТ или его гомолога в клетках указанного трансгенного растения приводит к увеличению урожайности семян и/или усиленному росту указанного растения.
7. Клетка по п.6, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность указанного гомолога белка ТМТ на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последова- 21 029227

тельности 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 1 белка ТМТ1 АгаЫборз1з Ыайапа.
8. Клетка по п.6 или 7, отличающаяся тем, что указанное растение выбрано из АгаЫборз1з Ыайапа, Вгазз1са париз, Вгазз1са о1егасеа, Вгазз1са гара, АгасЫз Еуродеа, Воесйега з1г1с1а, Вгидшега душпогЫха, Οϊΐгиз рагаЫз1, Ропспиз ЕЫВоНаЕе, ЕирйогЫа ези1а, Егадапа уезса, Ооззуршш ЫгзиЫш, Ооззуршш гатопбп, О1усте тах, НейапЫиз аппииз, 1ротоеа Ы1, Еусорегзюоп езси1епЫш, ЕасЫса регепшз, ЕасЫса зайдпа, ЕасЫса зето1а, ЕасЫса зайуа, ЕоЫз ]арошсиз, Ма1из ботезйса, МеЫсадо ЕипсаЫ1а, №сойапа 1аЬасит, Огуха аиз1гаНепз1з, Огуха ЬгасйуапЫ, Огуха рипсШа, Огуха пЛеуч Огуха гиВродоп, Огуха зайуа, Рори1из ЫсЕосагра, Ропспиз МГоНа1а, Ргипиз регзюа, 8о1апит ЫЬегозит, 8огдйит Ысо1ог, ТгЫсит аезйуит, 2еа тауз, 8ассЕагит оВзстагит, Ратсит упдаЫт, М1зсапЫиз, νϊΐϊ^ утЫега, СаппаЫз зайуа.
9. Применение клетки трансгенного растения по любому из пп.6-8 для получения культурных растений, обладающих увеличенной урожайностью семян и/или усиленным ростом по сравнению с растениями дикого типа.
10. Применение трансгенного растения, содержащего клетку по любому из пп.6-8, для получения потомства, обладающего увеличенной урожайностью семян и/или усиленным ростом по сравнению с растениями дикого типа.

- 22 029227

35 3:(т(1:1-2линия