CN110759980B - 一种降低小麦籽粒储藏蛋白含量的转录因子nac2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能抑制小麦籽粒麦谷蛋白（Glutenin）合成的转录因子NAC2及其应用。转录因子是TuNAC2及其在普通小麦中的同源基因TaNAC2的三个拷贝：TaNAC‑A2、TaNAC‑B2或TaNAC‑D2，分别由SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成。本发明还公开了该转录因子在普通小麦中抑制灌浆期SSP基因的表达最终降低成熟籽粒中的SSP含量的应用。TuNAC2过表达株系和TaNAC2敲除株系以及RNAi株系的株高、有效分蘖、穗粒数、粒长和粒宽等农艺性状都没有受到明显影响。转录因子在体外能够抑制所有类型SSP基因的表达，最终在转基因株系中降低胚乳中麦谷蛋白的含量。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种降低小麦籽粒储藏蛋白含量的转录因子及其应用。
背景技术
普通小麦 (Triticum aestivum L., 2n=6x=42, AABBDD) 是人类主要的粮食作物之一，能够给人类提供20%的能量和22%的蛋白质。其籽粒中的储藏蛋白 (Seed storageprotein, SSP) 赋予了小麦面团黏弹特性从而使得面粉可以被加工成丰富多样的美食。
小麦储藏蛋白包括麦谷蛋白和醇溶蛋白，麦谷蛋白又包括高分子量麦谷蛋白（High-molecular-weight subunits, HMW-GSs）和低分子量麦谷蛋白（Low-molecular-weight subunits，LMW-GSs），分别占储藏蛋白的5-10%和33%，醇溶蛋白占储藏蛋白的40-50%。储藏蛋白的基因组成和蛋白含量都能影响小麦面粉的加工品质，但其营养价值并不高，主要是由于储藏蛋白缺乏一些人类生活所需的必需氨基酸如赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等。在小麦籽粒中，由于补偿效应，当降低储藏蛋白的含量籽粒中其他的非储藏蛋白含量增加，从而提升小麦的综合品质。
转录因子主要通过与其靶基因启动子区的顺式作用元件结合从而调控其靶基因的表达。SSP的积累主要受SSP基因转录水平和翻译水平的影响。而SSP基因主要在灌浆期表达，故改变SSP基因在籽粒灌浆过程中的表达水平是改变SSP在胚乳最终积累量的关键。到目前为止，人们在禾本科作物中主要鉴定了三类转录因子bZIP、Dof和 MYB参与SSP基因的表达调控，如小麦中的SPA (bZIP), WPBF (Dof), GAMYB-D (MYB) 和TaGAMyb (MYB)，玉米中O2 (bZIP), ZmbZIP22 (bZIP)和PBF (Dof)，水稻中的RISBZ1 (bZIP), RPBF (Dof)和OsMYB5 (MYB)，大麦中的BLZ1 (bZIP), BLZ2 (bZIP), BPBF (Dof)和HvGAMYB (MYB)。这三类转录因子分别和SSP基因启动子区的顺式作用元件GLM (5’-RTGASTCAT-3’)、P-box (5’-TGTAAAG-3’)和5’-AACNNA-3’结合调控SSP基因的表达。由于其庞大的基因组，人们迄今仅是通过同源克隆的方法在普通小麦中鉴定了调控SSP基因表达的bZIP类转录因子SPA和Dof类转录因子WPBF以及R2R3 MYB类转录因子TaGAMyb，但对它们的调控机理研究较少。并且在小麦中除了新发现的bZIP类转录因子SHP抑制SSP基因的表达外，其他转录因子均上调SSP基因的表达。对SSP基因表达调控的研究将极大地丰富小麦品质改良的基因资源。
发明内容
本发明人通过对乌拉尔图小麦G1812籽粒灌浆期胚乳的转录组测序数据分析，其表达的22个SSP（Seed storage protein，储藏蛋白）基因的转录都起始于花后5 d，在花后10-15 d达到高峰并随后快速下降。通过共表达分析鉴定了TuNAC2与SSP基因具有相近的表达模式。小麦原生质体细胞和胚乳的共转化都表明TuNAC2抑制SSP基因启动子的活性，通过亚细胞定位将TuNAC2定位于细胞核。胚乳的过表达实验和双荧光素酶报告系统的检测都证明了TuNAC2在普通小麦中的同源基因TaNAC2能下调SSP基因的表达，且以TaNAC-D2拷贝的强度最大。小麦转基因的结果也表明TuNAC2下调未成熟种子中所有SSP基因的表达并最终降低成熟种子储藏蛋白的含量。同时，RNAi和Knock-out转基因株系成熟种子中的储藏蛋白的含量显著增加。
本发明的目的是提供一种调控SSP基因表达的转录因子，该转录因子下调SSP基因的表达，所述转录因子是由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成的基因。
本发明所提供的转录因子TuNAC2来源于乌拉尔图小麦，是具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的基因。SEQ ID No.1所示的DNA长度为1179 bp, 属于NAC家族，编码392个氨基酸残基的蛋白质。TuNAC2在普通小麦的同源基因为TaNAC2, 其有三个拷贝TaNAC-A2和TaNAC-B2以及TaNAC-D2，它们分别是具有SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成的基因，其DNA序列长度均为 1179 bp, 编码392个氨基酸残基的蛋白质。
本发明提供扩增TuNAC2和TaNAC2全长的通用引物对。其中，正向引物的序列为SEQID No.5所示，反向引物的序列为SEQ ID No.6所示。
本发明还提供所述转录因子在小麦中抑制灌浆期SSP基因的表达中的应用。
进一步地是将所述转录因子转化小麦，筛选所述转录因子的过量表达阳性植株。
优选地，所述小麦为普通小麦。
优选地，将所述转录因子用Glu-1Bx14的启动子驱动，转化普通小麦；利用正向引物的序列为SEQ ID No.7，反向引物的序列为SEQ ID No.8，对转基因植株进行鉴定筛选得到阳性植株。
更优选地，将所述转录因子的过表达载体通过基因枪的方法转化普通小麦。
本发明还提供所述的转录因子在普通小麦中降低成熟籽粒中的SSP含量中的应用。
其是通过沉默普通小麦中的所述转录因子来实现，更具体的可以采用RNAi技术来实现。
本发明提供利用共表达分析确定调控SSP基因表达候选转录因子的方法，其通过RNA-Seq分析乌拉尔图小麦灌浆期胚乳的转录组，找到和SSP基因具有相近表达模式的转录因子。
本发明提供检测转录因子对SSP基因启动子区调控强度的方法，将转录因子的过表达载体和SSP基因启动子驱动萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 基因表达的报告载体共转化拟南芥原生质体细胞，并以海肾荧光素 (Renilla luciferase) 作为对照，检测转录因子调控SSP基因启动子活性的强度。
本发明提供通过胚乳过表达检测转录因子对SSP基因表达调控的方法，其将转录因子的过表达载体通过基因枪的方法转化普通小麦花后15 d的胚乳，高渗培养基中暗培养48 h，用RT-PCR检测胚乳中SSP基因表达量的变化。
本发明提供的乌拉尔图小麦TuNAC2下调过表达转基因小麦未成熟种子中所有SSP基因的表达并最终降低成熟种子储藏蛋白的含量。其在普通小麦中的同源基因TaNAC2在胚乳中的过表达下调SSP基因的转录，并且TuNAC2的RNAi及Knock-out转基因株系成熟种子中的储藏蛋白含量增加。在双荧光素酶报告系统中，TuNAC2显著降低所有SSP基因启动子区的活性。当在普通小麦胚乳中瞬时过表达，TuNAC2和TaNAC2都抑制所有SSP基因的转录。在TuNAC2的过表达株系中，所有类型麦谷蛋白基因的表达在整个灌浆期都受到抑制，而部分醇溶蛋白基因的表达在灌浆早期受到抑制，在灌浆中后期由于SSP的补偿效应反而增加。最终，过表达株系籽粒中的麦谷蛋白含量显著降低，而醇溶蛋白含量没有明显变化甚至在一些系中明显增加。相反的，TaNAC2的敲除株系和RNA干扰 (RNAi) 株系的麦谷蛋白含量显著增加了。TuNAC2过表达株系和TaNAC2敲除株系以及RNAi株系的株高、有效分蘖、穗粒数、粒长和粒宽等农艺性状都没有受到明显影响。总之，NAC2在体外能够抑制所有类型SSP基因的表达，最终在转基因株系中降低胚乳中麦谷蛋白的含量。另外，本发明还提供了验证转录因子调控SSP基因表达的实验体系。因此，NAC2对小麦的品质改良具有重要意义。
附图说明
图1 乌拉尔图小麦中NAC家族转录因子TuNAC2在灌浆期的胚乳中与SSP基因具有相近的表达模式。其中，A为TuNAC2的结构特征，其中no apical meristem (NAM) domain为108-133 aa；B为TuNAC2及其普通小麦同源基因TaNAC2的进化树分析；C为TuNAC2在小麦原生质体中定位在细胞核中；D为RT-PCR的结果证明乌拉尔图中TuNAC2与SSP基因在灌浆期的胚乳具有相近的表达模式；E为TuNAC2在乌拉尔图不同组织中的表达情况，其主要在胚乳中表达。
图2 TuNAC2在体外和体内抑制SSP基因的表达。其中，A为双荧光素酶报告基因系统中报告载体、表达载体和内参的示意图，其中REN，海肾荧光素酶；LUC，萤火虫荧光素酶；Ubi，ubiquitin；P，启动子；ter，终止子；B为TuNAC2在双荧光素酶报告基因系统中抑制SSP基因的启动子活性； C为TuNAC2在胚乳中过表达载体示意图；D为TuNAC2在胚乳中的过表达抑制SSP基因的转录；E和F为TuNAC2在普通小麦转基因株系中过表达，分别为RNA-Seq和qRT-PCR的结果；G、H和I为TuNAC2在小麦灌浆的早期（10 DPA）、中期（15 DPA）和后期（20DPA）抑制SSP基因的表达；J、K和L为qRT-PCR验证RNA-Seq的结果。
图3 TuNAC2降低过表达转基因株系成熟种子中的储藏蛋白含量。其中，A为用RP-HPLC对转基因系籽粒中谷蛋白的检测；B为用RP-HPLC对转基因系籽粒中醇溶蛋白的检测；C为TuNAC2降低过表达转基因系成熟种子中HMW-GSs的含量；D为TuNAC2降低过表达转基因系成熟种子中LMW-GSs的含量；E为TuNAC2过表达转基因株系成熟种子中HMW-GSs和LMW-GSs的SDS-PAGE胶图；F为TuNAC2降低过表达转基因系成熟种子中glutenins的含量；G为TuNAC2过表达转基因系成熟种子中gliadins的含量；H为 TuNAC2增加过表达转基因系成熟种子中Gli/Glu的比值；I为TuNAC2过表达转基因系成熟种子中SSP的含量；J为TuNAC2降低过表达转基因系SDS-沉降值。
图4 TuNAC2对过表达转基因株系的农艺性状产生微弱的影响。其中，A和D分别为野生型与过表达系植株和穗部形态；B、C和E分别为野生型与过表达系的株高、有效分蘖和每穗小穗数；F为野生型与过表达系籽粒的粒长与粒宽形态；G和H为TuNAC2对转基因系的籽粒宽度和长度没有影响；I为TuNAC2过表达转基因株系成熟籽粒的电镜扫描（SEM），箭头分别指A-型淀粉粒、B-型淀粉粒和储藏蛋白；J为TuNAC2降低过表达转基因系的千粒重。
图5 TaNAC2降低普通小麦中SSP基因的表达。其中，A为TaNAC2的三个拷贝，TaNAC- A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2在普通小麦不同组织中的表达情况，其主要在胚乳中表达，并以TaNAC-D2的表达量最高；B为TaNAC2的三个拷贝，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2与SSP基因在灌浆期胚乳中有相同的表达模式；C为TauNAC2的三个拷贝，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC- D2在胚乳中过表达载体示意图；D为TuNAC2的三个拷贝，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2在胚乳中的过表达抑制SSP基因的转录。
图6 TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的储藏蛋白含量增加。其中，A为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的HMW-GSs含量增加；B为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的LMW-GSs含量；C为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的glutenins含量增加；D为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的gliadins含量；E为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的Gli/Glu的比值；F为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子中的SSPs含量；G为TaNAC2 RNAi转基因株系SDS-沉降值；H为TaNAC2 RNAi转基因株系成熟种子的千粒重。
图7 TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的储藏蛋白含量增加。其中A为用RP-HPLC对Knock-out转基因系籽粒中谷蛋白的检测；B为用RP-HPLC对Knock-out转基因系籽粒中醇溶蛋白的检测；C为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的HMW-GSs含量增加；D为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的LMW-GSs含量增加；E为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的glutenins含量增加；F为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的gliadins含量增加；G为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的Gli/Glu的比值；H为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中的SSPs含量增加；I为TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟种子中HMW-GSs和LMW-GSs的SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 乌拉尔图小麦TuNAC2及其在普通小麦同源基因TaNAC2的获得
1. 乌拉尔图小麦TuNAC2和SSP基因的共表达分析，具体包括如下步骤：
（1）RNA-Seq分析：选取已经基因组测序的乌拉尔图小麦G1812穗子中部的小穗，将种子从颖壳中剥离，切去胚，收集10粒种子的胚乳于经液氮冷冻的研钵，加入液氮研磨至粉末；用盐酸胍法提取总RNA，采用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)做初步的纯化和回收；用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测RNA的浓度和质量，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，保证每个样品至少有5 μg，且浓度在100 ng/μL以上。采用DynabeadsmRNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 对mRNA做进一步纯化，送测序公司进行建库测序。
（2）基因表达量 (RPKM) 的计算：Raw data过滤掉低质量reads得到clean reads；将克隆得到的SSP基因的编码区序列加入G1812的基因组序列中形成整合的基因组序列，且保证每个SSP基因仅保留一条序列；用TopHat (TopHat v2.0.10) 软件，将clean reads比对到G1812整合后的参考基因组中，保留比对到基因组上唯一位置的reads；通过HTseq(Version 0.5.4p5) 计算每个基因的read count，RPKM (Reads per kilobase permillion mapped reads) 是将比对到基因的read数除以比对到基因组上的所有read数与RNA的长度。
（3）共表达分析：通过将从乌拉尔图小麦基因组序列中预测得到的50类共888个转录因子和SSP基因的表达模式共聚类，以期找到和SSP基因具有相近表达模式的转录因子，并把它们当做参与SSP基因表达调控的候选基因。结果如图1A所示，乌拉尔图小麦的SSP基因在胚乳特异表达，始于花后5 d，随后急剧上升并在花后10 d至15 d达到峰值，然后迅速下降，至花后20 d趋于最低值。在所有的转录因子中，TuNAC2 (TRIUR3_21467) 和SSP基因的表达模式非常相近，它们同在聚类分析的一个分支上，TuNAC2和SSP基因的表达模式相关系数达到0.90。
2. TuNAC2和TaNAC2基因的克隆，具体包括如下步骤：
（1）乌拉尔图小麦TuNAC2的克隆：根据TRIUR3_21467的5’端和3’端的序列，设计扩增TuNAC2的全长引物（正向引物的序列为SEQ ID No.5所示，反向引物的序列为SEQ IDNo.6所示），以乌拉尔图小麦花后15 d胚乳的mRNA为模板，克隆得到TuNAC2，序列为SEQ IDNo.1。
（2）普通小麦TaNAC2的克隆：利用盐酸胍法提取普通小麦中国春花后15 d胚乳的总RNA，并反转录成cDNA，利用TuNAC2的全长引物从中扩增得到普通小麦TaNAC2的三个拷贝TaNAC-A2, TaNAC-B2和TaNAC-D2，它们的序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4。
实施例2 乌拉尔图小麦TuNAC2及其在普通小麦同源基因TaNAC2的表达模式分析
1. TuNAC2和TaNAC2与SSP基因表达模式，具体包括如下步骤：
（1）乌拉尔图小麦TuNAC2和SSP基因表达模式的验证：在乌拉尔图小麦灌浆期的胚乳中，利用TuNAC2和SSP基因的特异引物，通过RT-PCR验证两者的表达模式。结果如图1D所示，TuNAC2和所选SSP基因的表达都始于花后5 d，在花后15 d达到峰值并随后降低，这和RNA-Seq的结果是基本一致的。
（2）普通小麦TaNAC2和SSP基因表达模式：利用盐酸胍法提取普通小麦中国春花后5 d、10 d、15 d、20 d和25 d胚乳的总RNA，并反转录成cDNA，利用TaNAC2和SSP基因的特异引物，通过 RT-PCR检测了普通小麦中国春灌浆期胚乳中TaNAC2和SSP基因的表达模式，结果如图5B所示，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2与SSP基因具有相同的表达模式，即起始于花后5 d，并在花后5-15 d缓慢升高，随后迅速上升并在花后15 d 或20 d达到峰值，然后表达量开始下降；这也预示着这三个拷贝有可能参与了普通小麦SSP基因的表达调控。
2.小麦NAC2基因的进化树分析和组织特异性表达分析
（1）进化树分析：将TuNAC2和TaNAC2以及GenBank中（2018-12前）与它们序列相似性80%以上基因的氨基酸序列用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) 软件比对后，用Mega 5.05 (http://www.megasoftware.net/) 构建进化树，采用邻接法 (Neighbor-joining) 和P-distance模型，并用1,000次重复做Bootstrap检验。结果如图1B所示，TuNAC2及其在小麦族的同源基因在进化树分析中单独聚为一个分支，而来自其它族的基因在不同的分支，这表明NAC2基因为小麦族特有。
（2）TuNAC2和TaNAC2组织特异性表达分析：采用盐酸胍法分别提取乌拉尔图和普通小麦中国春植株的根、茎、旗叶和胚乳的总RNA，用TuNAC2、TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC- D2的特异引物，通过RT-PCR验证它们的组织特异性表达。TuNAC2组织特异性表达结果如图1E所示，在根和茎中TuNAC2有微量表达，在叶片中TuNAC2有少量的表达，在胚乳中TuNAC2有大量表达。TaNAC2组织特异性表达结果如图5A所示，在根、茎和叶中，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2有少量的表达，在胚乳中，TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2都有大量表达，且以TaNAC-D2的表达量最高。
3. TuNAC2的亚细胞定位
（1）亚细胞定位：将TuNAC2和pJIT163-hGFP (http://www.pgreen.ac.uk/) 载体构建重组质粒pJIT163-TuNAC2-hGFP，并将pJIT163- TuNAC2-hGFP重组质粒中的35S启动子替换成ubiquitin启动子，用以转化小麦叶片原生质体细胞。结果如图1C所示，TuNAC2定位于原生质体细胞的细胞核。TuNAC2在细胞核的定位表明其在核内行使功能，符合转录因子的特征。
实施例3 小麦NAC2基因的功能
1. TuNAC2对SSP基因的直接调控
（1）双荧光素酶报告基因系统检测TuNAC2对SSP基因启动子的调控：将TuNAC2重组于pRT107载体 (由中科院遗传发育所张劲松研究员提供)，使其中的35S启动子驱动TuNAC2大量表达，用SSP基因的启动子 (2,000 bp) 替换报告基因载体的35S启动子来驱动萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 基因的表达(图2A)。将两个重组载体共转化拟南芥原生质体细胞，以海肾荧光素酶 (Renilla luciferase) 作为对照，即可检测TuNAC2对SSP基因启动子区的启动强度。采用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒 (Promega,Madison, USA) 和Gloma 20/20 Luminometer (Promega, Madison, USA) 检测荧光强度。结果如图2B所示，TuNAC2极显著地抑制了SSP基因TuGlu-1Ax, TuGlu-1Ay, TuA3-520,TuA3-538a, Gli-α-1, Gli-α-8, Gli-γ-1和Gli-ω-1的启动子活性。
（2）NAC2的胚乳共转化：pJIT163-UBI-hGFP载体 (氨苄抗性) (由中科院遗传发育所高彩霞研究员提供) 是由ubiquitin启动子驱动GFP的表达。通过用TuNAC2、 TaNAC-A2、TaNAC-B2和TaNAC-D2的编码区替换GFP的编码区来构建其过表达载体pJIT163-UBI-TuNAC2/ TaNAC2（图2C 和图5C），用ubiquitin启动子驱动NAC2大量表达。
将中国春花后15 d的籽粒用70%的酒精消毒，于超净台内剥去种皮，用手术刀将籽粒纵向切开，切面朝上摆放于高渗培养基中央2-3 cm范围内，高渗处理3-4 h；往金粉中加入灭菌的50%甘油，使终浓度为150 mg/mL；取50 μL稀释好的金粉，加入3 μL质粒(pJIT163-UBI-TuNAC2/ TaNAC2, 1 μg/μL)、50 μL 2.5 M CaCl2和20 μL 0.1 M 亚精胺，移液枪吹打混匀，通过基因枪轰击胚乳，后续于高渗培养基中避光培养24 h；提取胚乳的总RNA，并反转录成cDNA；RT-PCR验证TuNAC2、 TaNAC-A2、TaNA-B2和TaNAC-D2的瞬时表达及其对SSP基因表达的影响。TuNAC2的结果如图2D所示，和未导入过表达质粒的野生型胚乳相比，TuNAC2能下调所有类型的SSP基因的表达。TaNAC2的结果如图5D所示，和未导入过表达质粒的野生型胚乳相比，TaNAC-A2、TaNA-B2和TaNAC-D2都能下调所有类型SSP基因的表达，其中以TaNAC-A1的下调强度最大。
2. TuNAC2过表达载体的转化及转基因株系RNA-Seq
（1）过表达载体的构建及普通小麦的转化：将TuNAC2重组于pUbi1::cas载体，并用Glu-1Bx14的启动子替换重组载体的ubiquitin启动子，构建TuNAC2的过表达载体。利用基因枪轰击的方法，在中国科学院遗传与发育生物学研究所转基因平台进行转化，得到T0代转基因植株。
（2）TuNAC2过表达转基因株系的鉴定筛选：将转化得到的T0代转基因植株种于温室，取2-3 cm叶片，用CTAB法提取基因组DNA。取1 μl基因组DNA为模板，用引物对（SEQ IDNo.7所示和SEQ ID No.8所示），通过常规PCR扩增，以野生型小麦KN199基因组DNA为对照，鉴定筛选得到阳性植株，在温室进行加代种植。
（3）TuNAC2过表达转基因株系的RNA-Seq：将T3代转基因植株在大田种植，在灌浆期分别对过表达系OE89、OE94和OE139三个系花后10 d、15 d 和20 d未成熟的种子取样，并用液氮迅速冷冻，然后将材料放置于-80℃冰箱保存。用Trizol法对所取的样品提取总RNA，将RNA样品送至公司进行RNA-Seq。同时将RNA反转录成cDNA，以Ta4045作为内参，通过RT-PCR对RNA-Seq的结果进行验证。结果如图2E和图2F，RNA-seq和RT-PCR验证结果均表明TuNAC2在转基因株系中过表达；图2G和图2J表明TuNAC2在花后10 d能够显著下调所有类型的SSP基因的表达；图2H和图2K所示，在花后15 d，TuNAC2能持续下调HMW-GS和LMW-GS基因的表达，但下调幅度有所降低，部分醇溶蛋白基因的表达量上升；在花后20 d，由于补偿效应部分HMW-GS和LMW-GS基因的表达量有微弱的上升（图2I和图2L）。这些结果都说明TuNAC2下调小麦SSP基因的表达。
3. TuNAC2过表达转基因株系表型鉴定
对在堤上和赵县两个地点种植的T3代过表达转基因系OE89、OE94和OE139的种子磨成全粉，进行蛋白的提取和品质指标的测定。
（1）TuNAC2过表达转基因株系成熟籽粒蛋白的提取：称取45 mg全麦粉到2 ml 离心管中，加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡1小时，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为醇溶蛋白。剩下的沉淀中加入1 ml 7.5%的正丙醇（含0.3 MNaI），混匀后室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 50% (v/v)的异丙醇65℃孵育30分钟，期间晃动2-3次，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；重复上一步2次，加入500 μl提取液A（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1% DTT），65℃孵育1小时，期间晃动2-3次；然后加入500 μl提取液B（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1.4% 4-VP），65℃孵育30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为麦谷蛋白。
（2）TuNAC2过表达转基因株系成熟籽粒蛋白的测定：将提取的麦谷蛋白和醇溶蛋白用0.45 μm 的有机滤膜进行过滤，吸取10 μl 进行RP-HPLC分析（图3A和图3B），并用1mg/ml的BSA标准液进行定量。如图3C、图3D和图3F所示，转基因系的HMW-GSs、LMW-GSs和总glutenins的含量与对照相比均显著降低；由于补偿效应，部分过表达系的gliadins 有明显升高（图3G）；Total SSPs 的含量显著降低（图3I），Gli/Glu的比值显著增加（图3H），SDS-PAGE的结果也显示转基因系的蛋白条带明显减弱（图3E）。这些结果都说明TuNAC2降低小麦籽粒中储藏蛋白的积累。
（3）SDS-沉淀值的测定：称取1 g 全麦粉于35 ml的量筒中，加入16.89 ml的水混匀，室温震荡5分钟；然后加入16.89 ml 2% SDS溶液（含0.002% 乳酸），混匀室温震荡5分钟，随后静置5分钟后读数。如图3J所示，转基因系的SDS-沉淀值显著降低。
4. TuNAC2过表达转基因株系农艺性状考察
（1）过表达转基因株系农艺性状的调查：对两个地点的转基因小麦的农艺性状进行调查，如图4A、图4D和图4F分别表示野生型和过表达系的植株，穗子和籽粒性状；图4B、图4C和图4E分别表示野生型和过表达系的株高、有效分蘖和单株小穗数没有明显变化；图4G、图4H和图4J分别表示籽粒的粒宽、粒长和千粒重，其中粒宽和粒长没有显著差异，过表达系的千粒重显著降低。
（2）成熟种子电镜扫描：野生型和三个过表达系OE89、OE94和OE139的成熟籽粒用刀片横切，并对横切面进行电镜扫描（图4I），箭头分别指A-型淀粉粒、B-型淀粉粒和储藏蛋白，与野生型相比，过表达系的蛋白减少。
5. TaNAC2 RNAi转基因株系表型鉴定
对在堤上和赵县两个地点种植的T3代RNAi转基因系RNAi 1、RNAi 2和RNAi 3的种子磨成全粉，进行蛋白的提取和品质指标的测定。
（1）TaNAC2 RNAi转基因株系成熟籽粒蛋白的提取：称取45 mg全麦粉到2 ml 离心管中，加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡1小时，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为醇溶蛋白。剩下的沉淀中加入1 ml 7.5%的正丙醇（含0.3 M NaI），混匀后室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 50% (v/v)的异丙醇65℃孵育30分钟，期间晃动2-3次，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；重复上一步2次，加入500 μl提取液A（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1% DTT），65℃孵育1小时，期间晃动2-3次；然后加入500 μl提取液B（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1.4% 4-VP），65℃孵育30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为麦谷蛋白。
（2）TaNAC2 RNAi转基因株系成熟籽粒蛋白的测定：将提取的麦谷蛋白和醇溶蛋白用0.45 μm 的有机滤膜进行过滤，吸取10 μl 进行RP-HPLC分析，并用1 mg/ml的BSA标准液进行定量。如图6A、图6B和图6C所示，转基因系的HMW-GSs、LMW-GSs和总glutenins的含量与对照相比均显著增加；醇溶蛋白的含量堤上显著增加，赵县变化不明显（图6D）；赵县地点Gli/Glu的比值显著降低（图6E）；总储藏蛋白的含量显著增加（图6F），最终导致部分系的千粒重增加（图6H）。这些结果都说明在TaNAC2 RNAi转基因株系成熟籽粒中储藏蛋白的含量显著增加。
（3）SDS-沉淀值的测定：称取1 g 全麦粉于35 ml的量筒中，加入16.89 ml的水混匀，室温震荡5分钟；然后加入16.89 ml 2% SDS溶液（含0.002% 乳酸），混匀室温震荡5分钟，随后静置5分钟后读数。如图6G所示，RNAi转基因系的SDS-沉淀值显著升高。
6. TaNAC2 Knock-out转基因株系表型鉴定
对在温室种植的T2代Knock-out转基因系nac2 kn -a, nac2 kn -d, nac2 kn -bd和nac2 kn -abd的种子磨成全粉，进行蛋白的提取和品质指标的测定。
（1）TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟籽粒蛋白的提取：称取45 mg全麦粉到2 ml离心管中，加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡1小时，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为醇溶蛋白。剩下的沉淀中加入1 ml 7.5%的正丙醇（含0.3 MNaI），混匀后室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 70% (v/v)的酒精室温震荡30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；加入1 ml 50% (v/v)的异丙醇65℃孵育30分钟，期间晃动2-3次，12,000 rpm 离心10分钟，弃上清；重复上一步2次，加入500 μl提取液A（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1% DTT），65℃孵育1小时，期间晃动2-3次；然后加入500 μl提取液B（50% 异丙醇， 0.08 M Tris-HCl， pH 8.0 和1.4% 4-VP），65℃孵育30分钟，12,000 rpm 离心10分钟，吸取上清到新的2 ml 离心管中，即为麦谷蛋白。
（2）TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟籽粒蛋白的测定：将提取的麦谷蛋白和醇溶蛋白用0.45 μm 的有机滤膜进行过滤，吸取10 μl 进行RP-HPLC分析（图7A和图7B），并用1 mg/ml的BSA标准液进行定量。如图7C、图7D、图7E、图7F和图7H所示，转基因系的HMW-GSs、LMW-GSs、总glutenins、总gliadins以及总的储藏蛋白含量与对照相比均显著增加；由于麦谷蛋白和醇溶蛋白含量都增加，Gli/Glu的比值没有显著变化（图7G），SDS-PAGE的结果也显示转基因系的蛋白条带明显增强（图7I）。这些结果都说明TaNAC2 Knock-out转基因株系成熟籽粒中蛋白含量增加。
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种降低小麦籽粒储藏蛋白含量的转录因子NAC2及其应用
<160> 8
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213>小麦属，普通小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 1
1 ATGGAGATGC CGCCGCTCCC TCCTGGATAC CGCTTCCACC CAACTGACGT CGAGCTCACC
61 CTCTACTATC TCAAGAGGAA GCTGCTGGGC AAAAAGTTGC TCTGCAACGC CGTTGCAGAA
121 GTTGATATCT ACAAGCATGC CCCCTGGGAT CTTCCAGCAA AATCGTCAAT GCCGACCGGG
181 GATCTCCAGT GGTACTTCTT TTGCACCCGT GGCAGAAAGT ACTCTGTTGG GCATAGAGCT
241 AACCGTTCAA CCGAAGGTGG CTACTGGAAG GCTACTGGAA AGGACAGGCA AGTGGTGTAT
301 GAAAATCGCA CTGTTGGCAT GAAGAGGACC CTGGTGTTTC ACTCTGGCAA GGCGCCCAAG
361 GGTACAAGGA CCGACTGGGT CATGTATGAA TATAGGCTCG TCCAAGGTGA AATACCTGAC
421 GCTGGTGTTA GACTGGATGA TTCCGTTCTC TGCAAAGTCC ATAAGAAAAG CGGTCCAGGT
481 CCCAAGATTG GGGAACAGTA TGGCGCTCCA TTTGAGGAAC AGGAAGAGGA ATTGAATGAT
541 GCGAATGGGG ACGCTTCCTG TTTATCCCCC GCTGCGCCCC ATTCCGCCCC TGGACCAAGC
601 CATGGTGGTG TGCTGAACTC TGCAGGTCAG CAACTTAGTA ACGGCGGTGG GGTTTCCCTG
661 AGCCTTTTGG CAGCAAATAA TGGCGGCACC AGTGGTGCCC GTCCTGACAG GGCCTCTCAC
721 CCAGATGTTA ACTGGGACAG CATACATGTA GAGCAGCTAG CTGATATCAT CGGTCGTCTC
781 TCGACGAATC CTGAAGGCCA ACATGGCCCA TCGTCTGATT TGACGACCGC TAACCAAGAC
841 AGCGAAACTA TATTTGACAT AACGGGGCAG GTCATCCCTT GTTCACTGGA GAGCAGCCTG
901 TGCAAGCAGT GTGACGAGTG CGGTGTGCGG CTGGCTGACC CTTTGCTGGA ACCGGCGGCT
961 GGTGAGCCGT ACATGGAGCT GAATGACCTG TTGTCGCGGT GCCATGCTGC CCGACAGGTT
1021 GCAGATGGCA GCAGCAGCCA GGTGGTGGTG GTGTCGAATG GTGAGGGCCC TGTGTTGGAT
1081 CTGGAGCTGA AGCTTGGGGT TGAGTCCTCT GACAGCGTTG GGCAAAGTAG CGGCGCCGTG
1141 TCTGCGGCGG CTTCTGGATC GGGGGCCCCG TCTAGCTAG
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<400> 2
1 ATGGAGATGC CGCCGCTCCC CCCTGGATAC CGCTTCCACC CAACCGACGT CGAGCTCACC
61 CTCTACTATC TCAAGAGGAA GCTGCTGGGA AAAAAGCTGC TCTGCAACGC CGTTGCAGAA
121 GTTGATATCT ACAAGCACGC TCCCTGGGAT CTTCCAGCGA AATCGTCCAT GCCGACCGGG
181 GATCTCCAGT GGTACTTCTT TTGCACCCGT GGCAGAAAGT ACTCTGTTGG CCAAAGAGCT
241 AACCGTTCAA CCGAAGGTGG GTACTGGAAG GCTACTGGAA AGGACCGGCA GGTGGTGTAT
301 GAAAATCGCA CTGTTGGGAT GAAGAGGACC CTGGTGTTTC ACGCTGGCAA GGCGCCCAAG
361 GGTACAAGGA CCGACTGGGT CATGTATGAA TATAGGCTCG TCCAAGGTGA AATACCTGAC
421 GCTGGTGTTA GACTGGATGA TTCCGTTCTC TGCAAAGTCC ATAAGAAGAG CGGTCCAGGT
481 CCCAAGATTG GGGAACAATA CGGCGCCCCA TTTGAGGAAG AGGAAGAGGA ATTGAATGAT
541 GCGAATGGGA ACGCTTCCTG TTTATCCCCT GCTGCGCCCC ATTCCGCCCC TGGACCAAGT
601 CACGGTGGCG TGTTGAACTC CGTGGGTCAA AAACTTAGTC ACGGCGGCGG GGATTCCTTG
661 TCTGTTTCGC CAGCAAATAA CGGCGGTACC AGTGGCGCCG GTCCTGACAG GGCCTCTTGT
721 CTGGATGTTA ACTGGGACAG CATACATGTA GAGCAGTTAG CTGATATCAT CGGTCGTCTT
781 TCTACAAATC CTGTAAGCCA AGATGGCTTA TCGTCTGATT TGACGACCGC TAACCAAGAC
841 AGCGAAACAA TATTTGAAAT AACGGACCAG ATCGTCCCTT CCTCACTGTG TAGCAGCCTT
901 TGCAAGCAGT GTGACAAGTG TGGCGTGCGG CTGGTCGACC CTTTGCTGGA ACCGGCGGCG
961 GGAGAGCCAT ACGTGGAGCT GAATGACCTG TTGTCGCGGT GCCGTGCTGC CGGGCAGGTT
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1 ATGGAGATGC CGCCGCTCCC TCCTGGATAC CGCTTCCACC CAACCGACGT CGAGCTCACC
61 CTCTACTATC TCAAGAGGAA GCTGCTGGGA AAAAAGCTGC TCTGCAACGC TGTTGCAGAA
121 GTTGATATCT ACAAGCACGC CCCCTGGGAT CTCCCAGCGA AATCGTCTAT GCCGACCGGG
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361 GGTACAAGAA CCGACTGGGT CATGTATGAA TATAGGCTCG TCCAAGGTGA AATACCTGAC
421 GCTGGTGTTA GACTGGATGA TTCCGTTCTC TGCAAAGTCC ATAAGAAGAG CGGTCCAGGT
481 CCCAAGATTG GGGAACAATA CGGCGCCCCA TTTGAGGAAG AGGAAGAGGA ATTGAATGAT
541 AAGAATGGGG ACACTTCCTG TTTATCCCCT GCTGCGCCCC ATTCCGCCCC TGGACCAAGT
601 CACGGTGGCA TGTTGAACTC CGCGGGTCAA CAACTTAGTC ACAGCGGTGG GGATTCCTTG
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721 CTGGATGTTA ACTGGGACAG CATACATGTA GAGCAGCTAG CTGATATCAT CGGTCGTCTT
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ATGGAGATGCCGCCGCTCCCT
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CTAGCTAGACGGCGCCCCTGA
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<400> 7
CCCATCCAAC CTTCACAATC
<210> 8
<211>25
<212> DNA
<400> 8
TACCTTAATG ATGATGATGA TGATG
Claims (6)
1.降低小麦籽粒中储藏蛋白含量的转录因子在小麦中抑制灌浆期SSP基因的表达中的应用，其中所述转录因子是由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成的基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述转录因子转化小麦，筛选所述转录因子的过量表达阳性植株。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述转录因子用Glu-1Bx14的启动子驱动，转化普通小麦；利用引物对转基因植株进行鉴定筛选得到阳性植株，其中，所述引物的正向引物序列为SEQ ID No.7所示，反向引物序列为SEQ ID No.8所示。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述转录因子的过表达载体通过基因枪的方法转化普通小麦。
5.降低小麦籽粒中储藏蛋白含量的的转录因子在普通小麦中降低成熟籽粒中的SSP含量中的应用，其中所述转录因子是由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、或SEQ IDNo.4所示核苷酸序列组成的基因。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：通过在普通小麦中过表达所述转录因子而实现。
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