CN116949091A - 提高薯类植物产量性状的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高薯类植物产量性状的方法及应用。本发明首次研究及揭示了一种功能性基因MADS23，其编码一条具有重要生物功能的多肽，可以调控薯类植物产量性状。并且，本发明还首次揭示了新的包含MADS23的EIN3‑MADS23‑CYCB2；3或EIN3‑MADS23‑HB52信号通路及其在植物薯类植物产量性状改良中的应用。本发明披露了MADS23参与的新机制，对于植物性状的遗传改良具有重要意义。

Description

提高薯类植物产量性状的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种提高薯类植物产量性状的方法及应用。
背景技术
薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物应尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。
以甘薯为代表的薯类作物，具有高的光、热、水资源利用效率和单位面积生物量、淀粉含量高、适合种植于干旱瘠薄土地而不与粮食争地等特性，是目前最有开发前景的能源作物。甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，在保证生物质能和粮食安全等方面具有重要作用。
甘薯属旋花科，甘薯属，甘薯种，为蔓生性草本植物。甘薯植株可分为根、茎、叶、花、果实、种子等部分。甘薯不仅是一种重要的粮食作物，也是食品加工业的重要原料，营养价值丰富。因此，甘薯品种优化以及培植、再生技术的研究具有重要的意义。常见的与甘薯一样具有块根结构的植物还有：木薯，紫薯，何首乌呢等，马铃薯为块茎植物。
薯类植物的储藏根是重要的储能器官，储藏根的发育是一个复杂的生物学过程，包括膨大启始和后续加厚等。这些过程不仅受内源激素和基因的调控，还受外界环境的影响。然而，目前对于调控储藏根膨大发育的分子机制还知之甚少。
因此，本领域有必要研究薯类植物中能够调控薯类植物的储藏根的优良基因，从而为植物的改良提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高薯类植物产量性状的方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高薯类植物产量性状的方法，包括：上调薯类植物中MADS23的表达或活性；或调节薯类植物中EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路，促进MADS23响应乙烯信号。
在一种或多种实施方式中，所述提高薯类植物产量性状包括：提高产量；提高储藏根数量；促进根系发育和生长；提高直链淀粉含量；提高木质素含量或促进细胞分裂。
在一种或多种实施方式中，上调MADS23的表达或活性包括：将MADS23的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入薯类植物中；对MADS23进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进MADS23表达；或，以增强子促进MADS23表达。
在一种或多种实施方式中，所述调节EIN3-MADS23-CYCB2；3为调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用(如下调EIN3以提高MADS23表达)、进而上调CYCB2；3的表达或活性。
在一种或多种实施方式中，所述调节EIN3-MADS23-HB52为调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用(如下调EIN3以提高MADS23表达)、进而下调HB52的表达或活性。
在一种或多种实施方式中，EIN3与MADS23的相互作用包括：EIN3作用于MADS23，较佳地结合于MADS23基因的启动子，抑制MADS23转录。也即，IbMADS23作为乙烯受体IbEIN3的下游靶基因响应乙烯信号。
在一种或多种实施方式中，MADS23与CYCB2；3的相互作用包括：MADS23作用于CYCB2；3，较佳地结合于CYCB2；3基因的启动子，促进MADS23转录。也即MADS23正调控CYCB2；3的表达。
在一种或多种实施方式中，CYCB2；3已知功能为控制细胞周期的细胞分裂；其表达提高有利于细胞的分裂增殖，促进薯类储藏根细胞分裂，储存淀粉，进而促进储藏根膨大，提高产量。
在一种或多种实施方式中，MADS23与HB52的相互作用包括：MADS23作用于HB52，较佳地结合于HB52基因的启动子，抑制HB52转录。也即MADS23负调控HB52的表达。
在一种或多种实施方式中，HB52已知功能为促进韧皮部的分化；其表达下降有利于维管形成层细胞更多地向木质部分化，木质部占比增多，薄壁细胞增多，淀粉积累增多，储藏根膨大以提高产量。
在一种或多种实施方式中，下调EIN3或HB52的表达或活性包括：对驱动EIN3或HB52表达的启动子进行转录抑制；敲除或沉默EIN3或HB52的编码基因，或抑制EIN3或HB52的活性；较佳地，包括：以特异性干扰EIN3或HB52的编码基因表达的干扰分子来沉默EIN3或HB52，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除EIN3或HB52的编码基因，以同源重组的方法敲除EIN3或HB52编码基因，或在含有EIN3或HB52的植物中将EIN3或HB52进行功能丧失性突变。
在一种或多种实施方式中，所述的功能丧失性突变包括：使得EIN3或HB52蛋白的翻译提前终止，从而丧失功能；较佳地，通过基因编辑，在EIN3或HB52蛋白编码基因中进行碱基的插入、缺失或突变，使得EIN3或HB52蛋白的翻译提前终止。
在一种或多种实施方式中，所述的方法还包括：在培养所述薯类植物时，添加乙烯或乙烯前体；较佳地所述乙烯前体为ACC；较佳地所述乙烯前体(在培养基中)的添加量为0.5～50μmol/L(优选1～45μmol/L，更优选2～40μmol/L，更优选3～35μmol/L，更优选5～30μmol/L，更优选6～25μmol/L，更优选8～20μmol/L；如9、10、12、14、15、16、18μmol/L)。
在一种或多种实施方式中，所述乙烯或乙烯前体添加于薯类植物的培养基中。
在一种或多种实施方式中，所述的薯类植物在培养基中培养，所述培养基中添加NAA，6-BA，蔗糖。
在一种或多种实施方式中，所述NAA的添加量为0.05～0.5mg/L(较佳地0.06～0.4mg/L；更佳地0.07～0.3mg/L，如0.08、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25mg/L)。
在一种或多种实施方式中，所述6-BA的添加量为0.1～1mg/L(较佳地0.12～0.8mg/L；更佳地0.15～0.6mg/L，如0.16、0.18、0.2、0.22、0.25、0.3、0.4、0.5mg/L)。
在一种或多种实施方式中，所述蔗糖的添加量为2～8％(w/v)(较佳地2～7％；更佳地3～6％，如3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％)。
在本发明的另一方面，提供一种MADS23、包含其的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路或它们的调节剂的用途，用于提高薯类植物产量性状；其中，所述的调节剂包括MADS23上调剂，或为调节薯类植物中EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路、促进MADS23响应乙烯信号的试剂。
在一种或多种实施方式中，所述的MADS23上调剂包括：外源的MADS23编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子；或，对MADS23进行功能获得性点突变的试剂；较佳地，为在发生MADS23突变的薯类植物中将突变体回复为MADS23野生型的试剂。
在一种或多种实施方式中，所述的MADS23、EIN3、CYCB2；3或、HB52包括cDNA序列、基因组序列(gDNA)，含启动子的cDNA或gDNA，或在它们基础上人工优化或改造的序列。
在一种或多种实施方式中，术语上调、促进、提高或增强表示显著性的上调、促进、提高或增强，如上调、促进、提高或增强20％、40％、60％、80％、90％或更高。
在一种或多种实施方式中，术语下调、降低、抑制、弱化或减弱表示显著性的下调、降低、抑制、弱化或减弱，如下调、降低、抑制、弱化或减弱20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在一种或多种实施方式中，所述的MADS23或包含其的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路中的蛋白或基因包括它们的同源物。
在一种或多种实施方式中，所述的薯类植物为含有MADS23或其同源物的植物。
在一种或多种实施方式中，所述的薯类植物为含有EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路或所述信号通路蛋白的同源物的植物。
在一种或多种实施方式中，所述的薯类植物包括(但不限于)：甘薯、紫薯、木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果。
在一种或多种实施方式中，所述的MADS23的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有MN510435.1所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如MN510435.1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与MN510435.1所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)MN510435.1所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在MN510435.1所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定薯类植物的方法，所述方法包括：鉴定测试薯类植物中的MADS23的表达或序列特征；若是该测试薯类植物的MADS23高表达，则其为产量高的植株；若是该测试薯类植物的MADS23低表达或不表达，则其为产量低的植株。
在一种或多种实施方式中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种薯类植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高。
在一种或多种实施方式中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种薯类植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低。
在本发明的另一方面，提供一种筛选提高薯类植物产量性状的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达MADS23的体系中；(2)检测所述体系，观测其中MADS23的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于提高薯类植物产量性状的物质。
在一种或多种实施方式中，所述方法还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中MADS23表达或活性与对照组的差异。
在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52通路蛋白或其编码基因或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物)等。
在本发明的另一方面，提供一种促进薯类植物根的生长的方法，包括：在培养所述薯类植物时，添加乙烯或乙烯前体；较佳地所述乙烯前体为ACC；较佳地所述乙烯前体(在培养基中)的添加量为0.5～50μmol/L(优选1～45μmol/L，更优选2～40μmol/L，更优选3～35μmol/L，更优选5～30μmol/L，更优选6～25μmol/L，更优选8～20μmol/L；如9、10、12、14、15、16、18μmol/L)。
在一种或多种实施方式中，所述乙烯或乙烯前体添加于薯类植物的培养基中。
在一种或多种实施方式中，所述促进薯类植物根的生长，进一步提高薯类植物产量。
在一种或多种实施方式中，所述的薯类植物在培养基中培养，所述培养基中添加NAA，6-BA，蔗糖。
在一种或多种实施方式中，所述NAA的添加量为0.05～0.5mg/L(较佳地0.06～0.4mg/L；更佳地0.07～0.3mg/L，如0.08、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25mg/L)。
在一种或多种实施方式中，所述6-BA的添加量为0.1～1mg/L(较佳地0.12～0.8mg/L；更佳地0.15～0.6mg/L，如0.16、0.18、0.2、0.22、0.25、0.3、0.4、0.5mg/L)。
在一种或多种实施方式中，所述蔗糖的添加量为2～8％(w/v)(较佳地2～7％；更佳地3～6％，如3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、甘薯Ayamurasaki试管苗诱导3周后膨大根表型(0.1mg/L NAA，0.2mg/L6-BA，5％蔗糖)。
图2、甘薯Ayamurasaki试管苗诱导3周后膨大根表型((0.1mg/L NAA，0.2mg/L6-BA，4％蔗糖)。
图3、施加NAA和6-BA诱导4周的甘薯试管苗和根石蜡切片结果。左：施加NAA和6-BA诱导4周的甘薯试管苗；右：石蜡切片进行甲苯胺蓝染色。
图4、AgNO3浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图5、AgNO3浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型及根石蜡切片(横切)甲苯胺蓝染色结果。
图6、AgNO3浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图7、CoCl2浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图8、CoCl2浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图9、CoCl2浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图10、ACC浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图11、ACC浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图12、ACC浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型。
图13、乙烯通路相关基因表达量检测。
图14、IbMADS23转基因表达载体构建。
图15(A)-(B)、IbMADS23转基因甘薯的分子鉴定。
图16(A)-(D)、IbMADS23转基因甘薯田间表型。
图17、不同发育时期野生型和IbMADS23转基因甘薯根系石蜡切片的甲苯胺蓝染色和碘染。
图18(A)-(D)、野生型和IbMADS23转基因甘薯根中次生代谢物含量。
图19(A)-(B)、KEGG富集分析和差异表达基因热图。
图20(A)-(C)、IbMADS23正向调控IbCYCB2；3的表达。
图21(A)-(C)、IbMADS23负向调控IbHB52的表达。
图22(A)-(E)、IbMADS23作为乙烯受体IbEIN3的下游靶基因响应乙烯信号。
具体实施方式
本发明首次研究及揭示了一种功能性基因MADS23，其编码一条具有重要生物功能的多肽，可以调控薯类植物产量性状。并且，本发明还首次揭示了新的包含MADS23的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路及其在植物薯类植物产量性状改良中的应用。本发明披露了MADS23参与的新机制，对于植物性状的遗传改良具有重要意义。
MADS23
如本发明所用，除非特别说明，所述的MADS23指具有MN510435.1所示序列的多肽或其编码基因，还包括具有与MADS23多肽相同功能的序列变异形式。所述的编码基因可以是gDNA或cDNA，也可以包含启动子。
所述MADS23多肽的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的MADS23多肽同源性高(比如与MN510435.1)所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有MADS23多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于甘薯以外其它物种的与MN510435.1所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
本发明中，所述的“MADS23”也包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种甘薯的MADS23，但是获自其它物种的与所述MADS23高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
编码所述MADS23多肽的多核苷酸(基因)可以是来自植物的天然基因，也可以是它们的简并的序列。
包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
MADS23参与的信号通路
如本发明所用，所述的“(信号)通路”是指由一系列蛋白或基因发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路包括下组蛋白或其编码基因：EIN3、MADS23、CYCB2；3；或包括下组蛋白或其编码基因：EIN3、MADS23HB52。
如本发明所用，术语“EIN3-MADS23-CYCB2；3”或“EIN3-MADS23-HB52”信号通路与“MADS23/MADS23/CYCB2；3”或“MADS23/MADS23/HB52”信号通路可互换使用。
所述的EIN3的氨基酸序列例如甘薯数据库g51031所示。
所述的CYCB2；3的氨基酸序列例如甘薯数据库g29491所示。
所述的HB52的氨基酸序列例如甘薯数据库g34553所示。
在一些实施方式中，在CYCB2；3或HB52的下游，还可包括其它调控基因，参与到所述信号通路的下游机制。或，在EIN3的上游，还可包括其它调控基因，参与到所述信号通路的下游机制。
本发明人发现，所述的信号通路中，调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用(如下调EIN3以提高MADS23表达)、进而上调CYCB2；3的表达或活性。CYCB2；3已知功能为控制细胞周期的细胞分裂；其表达提高有利于细胞的分裂增殖，促进薯类储藏根细胞分裂，储存淀粉，进而促进储藏根膨大，提高产量。。
本发明人发现，所述的信号通路中，调节EIN3-MADS23-HB52为调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用(如下调EIN3以提高MADS23表达)、进而下调HB52的表达或活性。HB52已知功能为促进韧皮部的分化；其表达下降有利于维管形成层细胞更多地向木质部分化，木质部占比增多，薄壁细胞增多，淀粉积累增多，储藏根膨大以提高产量。
当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式(如突变体、截短体、衍生物、修饰产物等)都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。
改良薯类植物的方法
如本文所用，所述的“植物”包括表达MADS23或包含EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路的植物，也包括MADS23或所述含有其的通路蛋白的同源物。根据本领域的知识，存在MADS23或包含EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些优选方式中，所述的植物为薯类植物(作物)。较佳地，所述的薯类植物包括(但不限于)：甘薯、紫薯、木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果等。
在本发明人的研究工作中，发现MADS23过表达植株产量提高，储藏根数量增加使得产量明显高。MADS23促进薯类植物根系发育并调节维管形成层的活性，过表达转基因株系中维管形成层活性明显较野生型高，维管形成层细胞区域较野生型宽度增加，木质部薄壁细胞大量增殖，淀粉积累更多。MADS23也调节薯类植物储藏根次生代谢和淀粉粒径。
进一步的研究工作显示，MADS23通过调控细胞分裂相关基因CYCB2；3来调控甘薯根系发育。CYCB2；3是MADS23的下游靶基因。分析其启动子，发现上面有MADS家族的DNA结合元件CArG-box(CCATAATTTG)，说明MADS23可以结合CYCB2；3的启动子。MADS23是CYCB2；3上游的正调控转录因子。MADS23通过正向调控细胞分裂相关基因CYCB2；3的表达来促进细胞分裂，促进甘薯根系发育和生长。
进一步的研究工作显示，MADS23通过调控HD-zip家族基因HB52来调控甘薯维管形成层的分化。MADS23可直接结合HB52启动子上的CCATTAATGG序列，抑制HB52的转录水平。MADS23是HB52的上游转录抑制因子。
进一步的研究工作显示，MADS23响应乙烯信号并作为乙烯受体EIN3的下游靶基因参与调控甘薯根系发育。EIN3可以结合MADS23的启动子上ATGTACC序列。EIN3可以结合MADS23的启动子上包含ATGTACC核心序列在内的30bp探针序列。EIN3可以抑制MADS23的转录，说明EIN3是MADS23上游的转录抑制因子。因此，MADS23作为乙烯受体EIN3的下游靶基因来响应乙烯信号。
上述的研究结果表明，MADS23作为乙烯受体EIN3的下游靶基因响应乙烯信号，并调控细胞分裂相关基因CYCB2；3和HD-zip家族转录因子HB52的表达调控维管形成层的分裂和分化，正向调控甘薯储藏根的膨大。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内MADS23的表达或活性，进而提高薯类植物产量性状，促进薯类的增产。
如本发明所用，所述的“提高薯类植物产量性状”包括：提高储藏根数量；促进根系发育和生长；提高直链淀粉含量；提高木质素含量；促进细胞分裂。
本发明提供了一种使植物、特别是低表达(包括不表达)MADS23的植物表现为产量增加的方法，包括：上调MADS23的表达或活性，和/或促进EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路的相互作用，该相互作促进MADS23响应乙烯信号。
应理解，在得知了所述MADS23以及包含MADS23的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路(较佳地，也包括其上游或下游基因)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的MADS23的表达或活性或调节所述EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来过表达MADS23。或采用本领域技术人员熟知的方法来增强或减弱信号通路的运行。
本发明中，所述的MADS23蛋白、EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路蛋白或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高MADS23或其它信号通路蛋白的活性、提高MADS23或其它信号通路蛋白的稳定性、上调MADS23或其它信号通路基因的表达、增加MADS23或其它信号通路蛋白有效作用时间的物质、增加各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于上调MADS23或信号通路有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
本发明中，所述的MADS23的蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低MADS23蛋白或EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路蛋白的活性、降低MADS23或其它信号通路蛋白或其编码基因的稳定性、下调MADS23或其它信号通路蛋白的表达、减少MADS23或其它信号通路蛋白有效作用时间、抑制MADS23或其它信号通路基因的转录和翻译的物质、或降低各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调MADS23有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰MADS23或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑MADS23的基因编辑试剂，等等。
本发明还提供了一种上调植物中MADS23表达的方法，所述的方法包括：将MADS23的编码基因或含有所述编码基因的表达构建物或载体转入植物中。
下调植物中信号通路基因如EIN3或HB52的方法包括但不限于：进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使EIN3或HB52转变为其截短体，从而改变植物的性状。作为另一种实施方式，下调植物中EIN3或HB52的表达的方法包括：(1)将干扰EIN3或HB52基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
本发明的技术方案可被应用于进行多种途径的分子设计育种中。
植物定向筛选或靶向性筛选
在得知了MADS23或EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行薯类植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控薯类植物产量性状的物质或潜在物质。
因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定薯类植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的MADS23的表达或序列特征，或鉴定植物中EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路的相互作用情况；若是该测试植物的MADS23高表达，则其为可用于提高薯类植物产量性状的植株；或者，若所述信号通路呈现增强的对响应乙烯信号的能力，则其为可用于提高薯类植物产量性状的植株。
本发明提供了一种调节薯类植物产量性状或细胞分裂素水平的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达MADS23的体系中；(2)检测所述体系，观测其中MADS23的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于提高薯类植物产量。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于MADS23或EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路，对薯类植物产量性状有调控作用的潜在物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、植物材料
野生型甘薯Ayamurasaki；
泰中六号；
IbMADS23转基因甘薯(过表达株系和RNAi株系)；为了探究IbMADS23在甘薯中的生物学功能以及对甘薯根系发育的影响，构建了IbMADS23过表达和IbMADS23 RNAi载体。从甘薯数据库下载IbMADS23的CDS序列，对于过表达载体，将其插入到p1301S载体中。对于RNAi载体，将240bp的片段分别插入PBS载体的BamH I、Xho I位点和Kpn I、Cla I位点，然后连入p1301S载体中，并利用农杆菌LBA4404侵染甘薯愈伤组织的稳定转化方法，获得了IbMADS23转基因甘薯。
本氏烟草。
2、菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α、TOP10；
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：LBA4404(RifrChlr)、GV3101(RifrTetr)；参见van der Fits L,Deakin EA,Hoge JH,Memelink J.The ternarytransformation system:constitutive virG on a compatible plasmid dramaticallyincreases Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol Biol.2000Jul；43(4):495-502。
3、质粒
pCAMBIA1301s(pCAMBIA1301骨架，Kanr)；
pBSRNAi(pBluescriptSK骨架，Ampr)：将240bp的片段分别插入PBS载体的BamH I、Xho I位点和Kpn I、Cla I位点。
所述240bp的片段的序列如下(SEQ ID NO:1)：
catcaagaaaatctggaactgtataagaaggtaaaactcattcaacaagaaaattcggaactgtacagaaaggcttatggtacaagggatccagatgctgctgcagtgaccaagaatacaacacctactccatctgatttcaccttctgtggggattcacttagccccatagatctccagttaagccagcctgagccccctcaaaactttgatgtcatgtcaagagcatcagactctggg
pAbAi载体：将顺式作用元件三次重复合成，通过HindIII和XhoI连入pAbAi载体。
pGADT7载体：将克隆的正确目的CDS通过NdeI和EcoRI酶切位点连接到pGADT7载体上。
pGEX-4T：将要表达的CDS序列通过BamHI和EcoRI酶切位点连接到载体上。
p1300-GFP全称pCAMBIAsuper1300-GFP，为商业质粒。
4、引物和探针
本发明中所用的引物及探针序列如表1。
表1
5、关于培养基
将甘薯品种Ayamurasaki继代到BBM培养基中生长3天左右，至长出1cm以内的初生根，转移到诱导培养基中继续生长3-4周。膨大根切下后立即用FAA固定液进行固定，之后进行石蜡切片步骤。切片后用甲苯胺蓝进行染色观察根的次生结构。
(1)关于蔗糖
甘薯基础培养基(MS粉，0.2％Gelrite)；进一步添加：终浓度0.1mg/L NAA，0.2mg/L 6-BA，分别添加4％和5％的蔗糖，调节PH至5.8。其中MS粉溶于ddH2O。
(2)ACC浓度梯度处理(Ayamurasaki)
甘薯基础培养基(MS粉，0.2％Gelrite)，进一步添加：终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，终浓度4％的蔗糖，调节PH至5.8，再分别加入终浓度为0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的ACC。
(3)AgNO3浓度梯度处理(Ayamurasaki)
甘薯基础培养基(MS粉，0.2％Gelrite)，进一步添加：终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，终浓度4％的蔗糖，调节PH至5.8，再分别加入终浓度为0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的AgNO3。
(4)CoCl2浓度梯度处理(Ayamurasaki)
甘薯基础培养基(MS粉，0.2％Gelrite)，进一步添加：终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，终浓度4％的蔗糖，调节PH至5.8，再分别加入终浓度为0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的CoCl2。
最终激素浓度：
甘薯基础培养基(MS粉，0.2％Gelrite)，终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，终浓度4％的蔗糖，调节PH至5.8，终浓度为10μmol/L的ACC或1μmol/L的AgNO3或1μmol/L的CoCl2。
6、转基因植物的制备及机制研究
构建IbMADS23过表达和RNAi载体，并利用农杆菌转化法稳定转化甘薯愈伤组织，获得IbMADS23过表达和RNAi转基因甘薯。
将野生型和IbMADS23转基因甘薯进行田间中试，观察表型。
利用分子生物学、转录组测序等技术手段探究IbMADS23调控甘薯储藏根膨大的分子机制。
实施例1、甘薯培养基
对于甘薯的培养基，本发明人在利用MS培养基作为基础培养基的基础上，广泛地分析研究了种类众多的添加物，包括各种组培用添加物、培养基添加物、多种化合物成分等等。结果显示蔗糖、NAA、6-BA有利于甘薯培养基的优化改良；进一步地，乙烯前体ACC的添加有利于促进甘薯根的膨大。
1、不同浓度蔗糖诱导甘薯根膨大
(1)终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，5％(w/v)蔗糖
使用甘薯基础培养基，添加终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，5％蔗糖。甘薯Ayamurasaki试管苗诱导3周后膨大根表型如图1。
根据图1，根系明显变红，由于甘薯储藏根是由处于起始发育阶段的红须根逐渐发育形成，根变红表明接近储藏根早期发育状态。
(2)终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖
使用甘薯基础培养基，添加终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖。甘薯Ayamurasaki试管苗诱导3周后膨大根表型如图2，根系膨大明显且发红。
综合以上，相对而言，终浓度为0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖的培养基对甘薯Ayamurasaki试管苗的诱导效果最佳，诱导的根最接近甘薯膨大根状态。石蜡切片结果显示其次生结构并不明显(图3)。后续，发明人在此培养基的基础上进一步进行改良。
2、不同浓度AgNO3诱导的甘薯根
使用甘薯基础培养基，添加终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖；进一步地添加不同浓度的AgNO3。
(1)AgNO3浓度为0.1μmol/L
AgNO3浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图4，可观察到根无明显变化。
(2)AgNO3浓度为1μmol/L
AgNO3浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型及根石蜡切片(横切)甲苯胺蓝染色结果如图5，可见根膨大受到抑制且呈现被毒害状，须根数量增多，切片结果显示不进行次生生长。
(3)AgNO3浓度为10μmol/L
AgNO3浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图6，愈伤膨大明显，但储藏根无膨大表型。
3、不同浓度CoCl2诱导的甘薯根
使用甘薯基础培养基，添加终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖；进一步地添加不同浓度的CoCl2。
(1)CoCl2浓度为0.1μmol/L
CoCl2浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图7，根无膨大趋势，愈伤组织较大。
(2)CoCl2浓度为1μmol/L
CoCl2浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图8，根发红发黑，有增粗趋势，但次生生长受到抑制。
(3)CoCl2浓度为10μmol/L
CoCl2浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图9，愈伤组织有膨大趋势。
4、不同浓度ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)诱导甘薯根的膨大
使用甘薯基础培养基，添加终浓度0.1mg/L NAA和0.2mg/L 6-BA，4％蔗糖；进一步地添加不同浓度的ACC。
(1)ACC浓度为0.1μmol/L
ACC浓度为0.1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图10，初生根已有膨大趋势。
(2)ACC浓度为1μmol/L
ACC浓度为1μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图11，根系有膨大趋势但膨大效果不显著。
(3)ACC浓度为10μmol/L
ACC浓度为10μmol/L时甘薯试管苗诱导4周表型如图12，根膨大效果最明显。切片结果显示根的次生生长活跃。
结论
综上，诱导甘薯根膨大的最佳激素浓度为：终浓度4％蔗糖、0.1mg/L NAA、0.2mg/L6-BA和10μmol/L ACC。甘薯品种Ayamurasaki的试管苗在此培养基上诱导4周后，植株根明显加粗，且切片结果显示次生结构已形成，次生导管和形成层明显，薄壁细胞中有淀粉粒积累(蓝色颗粒状)。而AgNO3和CoCl2则抑制根的膨大，表明乙烯对甘薯根的膨大具有促进作用。
实施例2、IbMADS23基因通过响应乙烯参与甘薯储藏根膨大的机制
对诱导(采用终浓度4％蔗糖、0.1mg/L NAA、0.2mg/L 6-BA；添加或不添加10μmol/L ACC培养)8天的根进行乙烯通路基因表达量分析，发现乙烯通路基因EIN3在遮光处理的根中表达量很高，这与甘薯储藏根主要在地下部生长发育相对应，同时发现10μmol/L ACC遮光处理和施加1μmol/L AgNO3会造成IbMADS23基因的表达量显著升高(图13)，暗示ACC处理通过影响IbMADS23基因来影响甘薯储藏根发育的起始进而影响甘薯储藏根膨大，本发明人进一步验证其内在的分子机制。
1、IbMADS23转基因表达载体构建及转基因甘薯的获得
首先在甘薯数据库中找到甘薯IbMADS23基因序列(MN510435.1)，设计引物以泰中六号的cDNA克隆基因。随后用酶切连接方法将CDS区构建到pCAMBIA1301s载体上形成以35S启动子驱动的过表达载体(MOE)，转化大肠杆菌并进行菌落PCR验证和测序，正确无误后抽提质粒进行保存(图14)。
对于RNAi载体的构建，选取IbMADS23基因特异的序列240bp，分别设计带有KpnI和ClaI以及BamHI和XhoI的两对引物扩增片段，先后连入中间载体PBS，然后将两个片段一起连入pCAMBIA1301s形成RNA干扰载体(pP35RNAi)(图14)。
将IbMADS23转基因表达载体构建转入LBA4404农杆菌中，经转化、共培养、筛选、再生等阶段获得IbMADS23转基因甘薯，从中选取过表达转基因甘薯三个株系(M-OE)，RNAi转基因甘薯四个株系(M-Ri)，对转基因甘薯进行分析鉴定，Southern blot结果显示有3个单拷贝过表达株系(2、9、11)和3个单拷贝RNAi株系(13、23、25)(图15A)。
本发明人还对得到的转基因株系进行了转录水平的表达量检测，q-RT结果显示，与野生型相比，过表达转基因株系中IbMADS23的表达量上调10倍左右，RNAi转基因株系中M-Ri-13与野生型相比无明显差异，但其余3个RNAi株系中IbMADS23的表达量均显著低于野生型(图15B)。
2、转基因甘薯田间中试
根据转基因甘薯在人工气候室生长的状况来看，地上部与野生型并无明显差异(图16A)。从田间收获的表型进行分析，发现与野生型相比，过表达转基因株系中储藏根数目显著增多，为野生型的1-2倍，由于过表达转基因株系中IbMADS23的表达量较野生型高，可能导致甘薯储藏根形状及数目的变化。而RNAi株系中储藏根数目明显减少，几乎不能形成储藏根，多数发育为木质化程度较高且细长的牛蒡根(图16B，C)。
对田间收获的甘薯进行产量统计，发现IbMADS23过表达植株中OE-2和OE-9与野生型相比产量有一定提高，OE-11由于储藏根数量大大增加导致产量明显高于野生型，约为野生型产量的2倍。RNAi株系的产量明显低于野生型，减产50％以上(图16D)。
3、IbMADS23影响甘薯根系发育并影响维管形成层的活性
本发明人进一步选取不同发育时期的野生型和IbMADS23转基因甘薯根系进行石蜡切片观察，将S8、S10和S16时期的野生型、M-OE-2和M-Ri-23株系的根进行甲苯胺蓝染色和碘染，结果显示在S8时期，与野生型相比，M-OE-2转基因株系发育较快，已经有淀粉在韧皮部积累，少量淀粉在木质部细胞积累；而M-Ri-23转基因株系发育较慢，淀粉积累较少。在S10和S16时期，M-OE-2转基因株系中维管形成层活性明显较野生型高，维管形成层细胞区域较野生型宽度增加，木质部薄壁细胞大量增殖，淀粉积累更多；而M-Ri-23转基因株系维管形成层活性较低，维管形成层细胞区域较野生型细胞层数少，淀粉大多积累在韧皮部而不是在木质部，且木质部的薄壁细胞分裂较少，木质部淀粉积累较少(图17)。
4、IbMADS23影响甘薯储藏根次生代谢和淀粉粒径
从IbMADS23转基因甘薯的田间表型来看，RNAi转基因株系形成较多高木质化程度且细长的牛蒡根，说明甘薯根系中木质素和纤维素等次生代谢物发生变化，因此本发明人检测了野生型和IbMADS23转基因株系根中总淀粉含量、直链淀粉含量、木质素含量和纤维素含量。
结果显示，与野生型相比，IbMADS23过表达和RNAi转基因株系中总淀粉含量有所下降，约20％～30％；IbMADS23过表达和RNAi转基因株系中直链淀粉含量有所升高，约1.5％～9％；木质素含量显著升高，在RNAi株系中尤为明显，较野生型增加6％～40％；转基因株系中纤维素含量也有所升高，较野生型相比增加了2％～7％(图18A-D)。
5、野生型和IbMADS23RNAi转基因株系根中差异表达基因分析
鉴于IbMADS23RNAi转基因株系的田间表型与野生型相比差异较大，且石蜡切片染色结果显示细胞发育迟缓，为了进一步探究IbMADS23调控甘薯储藏根发育的分子机制，本发明人选取田间生长两个月的野生型和IbMADS23RNAi株系的根系进行转录组测序(RNA-seq)。转录组测序数据分析获得5246个差异表达基因，其中与野生型相比，IbMADS23RNAi株系中上调表达基因有2924个，下调表达基因有2322个。通过对转录组分析得到的差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，发现差异基因较多的通路为碳水化合物代谢、信号转导、细胞生长和死亡以及次生代谢等过程(图19A)，这与前面所涉及的田间表型和石蜡切片的染色表型是一致的，即在IbMADS23RNAi转基因株系中细胞发育迟缓，根系发育受阻，碳水化合物积累严重减少而木质素和纤维素等次生代谢物含量增加。
根据这一分析结果，本发明人分析并挑选了这几个生物学过程中差异显著的基因，进行热图绘制。结果显示，碳水化合物代谢阻遏物基因CCR4明显上调，而多数细胞分裂相关基因和淀粉合成相关基因下调(图19B)。
6、IbMADS23通过调控细胞分裂相关基因CYCB2；3来调控甘薯根系发育
根据前面转录组测序分析所得出的结果，本发明人挑选了几个细胞分裂相关的基因作为IbMADS23潜在的下游靶基因，其启动子区域有MADS家族蛋白的结合位点，进行酵母单杂交的验证。其中，IbCYCB2；3是IbMADS23的下游靶基因。本发明人从甘薯数据库下载IbCYCB2；3的启动子序列1789bp，分析其启动子(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace)，发现上面有MADS家族的DNA结合元件CArG-box(CCATAATTTG)，酵母单杂交结果显示在不加金担子素AbA的SD/-Leu培养基上，转AD空载和CYCB2；3启动子的酵母可以正常生长，转MADS23和CYCB2；3启动子的酵母可以正常生长；但在添加600ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上，转AD空载和CYCB2；3启动子的酵母不能生长，而转MADS23和CYCB2；3启动子的酵母可以正常生长(图20A)，说明IbMADS23可以结合IbCYCB2；3的启动子。为了进一步验证IbMADS23是否通过结合启动子上的CCATAATTTG序列来调控IbCYCB2；3，本发明人合成了探针(序列见附表1)，用凝胶迁移滞缓实验(EMSA)进行验证，结果显示MADS23蛋白可以结合CYCB2；3的探针序列，而将探针的核心元件突变之后，MADS23蛋白不能结合探针序列(图20B)，说明IbMADS23通过结合IbCYCB2；3启动子上的CCATAATTTG序列来调控IbCYCB2；3。在转录组测序数据中，与野生型相比，IbCYCB2；3在IbMADS23RNAi转基因株系中下调表达，说明IbMADS23对IbCYCB2；3起到正向调控作用，因此本发明人用双荧光素酶活性实验进行验证。结果显示，IbMADS23对IbCYCB2；3具有转录激活作用(图20C)，说明IbMADS23是IbCYCB2；3上游的正调控转录因子。
这些实验结果说明，IbMADS23通过正向调控细胞分裂相关基因IbCYCB2；3的表达来促进细胞分裂，促进甘薯根系发育和生长。
7、IbMADS23通过调控HD-zip家族基因HB52来调控甘薯维管形成层的分化
由于甘薯储藏根膨大的本质是维管形成层的分化和木质部薄壁细胞中淀粉的积累，本发明人还关注了维管形成层分化相关的基因，如最近报道的HD-zip家族基因。分析转录组数据发现HD-zip家族基因HB52在IbMADS23RNAi转基因株系中上调表达20倍以上，本发明人推测IbMADS23通过调控IbHB52的表达来参与甘薯维管束的分化。
本发明人从甘薯数据库中下载了IbHB52的启动子2000bp，分析该启动子上的转录因子结合元件，发现上面有MADS家族的DNA结合元件CArG-box(CCATTAATGG)，然后分别用酵母单杂交实验、凝胶迁移滞缓实验EMSA和双荧光素酶实验验证了IbMADS23可以直接结合IbHB52启动子上的CCATTAATGG序列，抑制IbHB52的转录水平。酵母单杂交实验显示与AD空载对照相比，转IbHB52启动子和IbMADS23的酵母可以在施加600ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上正常生长(图21A)；EMSA显示IbMADS23可以结合IbHB52启动子上的探针序列，而不能结合突变后的探针序列(表1)，且当加入竞争性探针后，IbMADS23结合正常探针的能力减弱(图21B)；双荧光素酶实验结果显示IbMADS23结合IbHB52的启动子并抑制其转录(图21C)。
综上，IbMADS23是IbHB52的上游转录抑制因子。
8、IbMADS23响应乙烯信号并作为乙烯受体EIN3的下游靶基因参与调控甘薯根系发育
为了进一步探究IbMADS23上游的调控信号，本发明人分析了IbMADS23的启动子，发现其上有乙烯响应的元件和乙烯受体EIN3的结合位点，另外，由于在转录组测序数据中，与野生型相比，IbMADS23 RNAi植株中植物激素信号转导发生显著变化，尤其是乙烯信号通路的相关基因和响应因子。因此本发明人用10μM乙烯合成前体ACC(1-氨基环丙烷羧酸)处理野生型组培苗，分别在处理0、1、3、6、9、12、24小时取根系检测IbMADS23和相关基因表达量。
结果显示，IbMADS23在10μM ACC处理1小时后表达量达到最高峰，IbCYCB2；3和IbHB52在10μM ACC处理下也会被上调表达，约为处理前的5-10倍(图22A)。为了进一步确定IbMADS23是否受到乙烯信号的诱导，本发明人用10μM ACC处理proMADS23::GUS的转基因甘薯组培苗，结果显示在处理3小时后材料中的蓝色明显加深，说明转基因甘薯中GUS基因表达增多，说明IbMADS23的启动子受到ACC信号的诱导其表达上调(图22B)。由于IbMADS23启动子上有乙烯受体EIN3的结合位点，所以本发明人推测EIN3可能是IbMADS23上游的调控因子。接下来用不同的实验方法验证IbEIN3是否结合IbMADS23的启动子，酵母单杂交实验显示转IbMADS23启动子和EIN3-AD的酵母可以在添加800ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上正常生长，而转IbMADS23启动子和AD空载的酵母以及转IbMADS23突变元件启动子和EIN3-AD的酵母则不能在添加800ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上生长(图22C)，说明IbEIN3可以结合IbMADS23的启动子上ATGTACC序列。同样地，EMSA实验结果显示IbEIN3可以结合IbMADS23的启动子上包含ATGTACC核心序列在内的30bp探针序列，随着竞争性探针的增加，IbEIN3结合IbMADS23探针的能力减弱(图22D)。双荧光素酶实验显示IbEIN3可以抑制IbMADS23的转录(图22E)，说明IbEIN3是IbMADS23上游的转录抑制因子。因此，IbMADS23作为乙烯受体IbEIN3的下游靶基因来响应乙烯信号。
结论
综上所述，IbMADS23作为乙烯受体IbEIN3的下游靶基因响应乙烯信号，并调控细胞分裂相关基因IbCYCB2；3和HD-zip家族转录因子IbHB52的表达调控维管形成层的分裂和分化，正向调控甘薯储藏根的膨大。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 提高薯类植物产量性状的方法及应用
<130> 220608
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas L. Lam)
<400> 1
catcaagaaa atctggaact gtataagaag gtaaaactca ttcaacaaga aaattcggaa 60
ctgtacagaa aggcttatgg tacaagggat ccagatgctg ctgcagtgac caagaataca 120
acacctactc catctgattt caccttctgt ggggattcac ttagccccat agatctccag 180
ttaagccagc ctgagccccc tcaaaacttt gatgtcatgt caagagcatc agactctggg 240
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttctacacag ccatcggtcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccatgtgta tcactggcaa 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtattgtgct cgattctggt ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agcgacataa gcaagtttct cc 22
<210> 6
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gctgaatcct gcagttgctg 20
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<400> 8
aacatgtcag tcccgactcc 20
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<400> 9
ggcaaagctc gatcaagaag 20
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<400> 10
acgcaggaaa tgctcttctc 20
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<400> 11
gcaagcataa agctccttgg 20
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aacggtcagc agttttcagg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gacccagact tgtgaggttc a 21
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ttaaaaaaaa tgtacctcca aataatcata 30
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tatgattatt tggaggtaca ttttttttaa 30
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<211> 30
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ttaaaaaaac cctacctcca aataatcata 30
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<211> 21
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tatgattatt tggaggtagg g 21
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tatgctgtca tccataattt gaatgcaacg 30
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<211> 30
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<211> 30
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<400> 22
attttccatt aatggtatta tctaatacat 30
<210> 23
<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<400> 23
ttagataata ccattaatgg aaaatatgta 30
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<400> 24
tacatatttt ccggtaattt tattatctaa 30
<210> 25
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<213> Artificial Sequence
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ttagataata aaattaccgg aaaatatgta 30
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gatctggttc cgcgtggatc catggggagg ggaaagattg agat 44
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctcgagtcga cccgggaatt ccccagagtc tgatgctctt gac 43
<210> 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gatctggttc cgcgtggatc catgtcgaga gctcaagatg gaattc 46
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ctcgagtcga cccgggaatt cttggcggca catcaacagg tctatc 46
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
aatgatgaat tgaaaagctt attgggtttg taatgcagca ctgta 45
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
catacagagc acatgcctcg agatcagatg caatcatgtt ctcttga 47
<210> 32
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<213> Artificial Sequence
<400> 32
ggtcgacggt atcgataagc ttattgggtt tgtaatgcag cactgta 47
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ccgctctaga actagtggat ccatcagatg caatcatgtt ctcttga 47
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aatgatgaat tgaaaagctt tgatgagttt ctatttctct gtatg 45
<210> 35
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catacagagc acatgcctcg agtaaggaga tgaagaaagt tgagaag 47
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ggtcgacggt atcgataagc tttgatgagt ttctatttct ctgtatg 47
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ccgctctaga actagtggat cctaaggaga tgaagaaagt tgagaag 47
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tgt 63
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atc 63
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<211> 63
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<400> 42
gatgaattga aaagcttaaa cctaccaaac ctaccaaacc taccctcgag gcatgtgctc 60
tgt 63
<210> 43
<211> 63
<212> DNA
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<400> 43
acagagcaca tgcctcgagg gtaggtttgg taggtttggt aggtttaagc ttttcaattc 60
atc 63
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
ggtcgacggt atcgataagc ttactccatg gttcatgtgc agaccaaac 49
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
ccgctctaga actagtggat ccactccatg gctgatcttc gcttagcta 49

Claims (13)

1.一种提高薯类植物产量性状的方法，包括：
上调薯类植物中MADS23的表达或活性；或
调节薯类植物中EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路，促进MADS23响应乙烯信号。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提高薯类植物产量性状包括：
提高产量；
提高储藏根数量；
促进根系发育和生长；
提高直链淀粉含量；
提高木质素含量；
促进细胞分裂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上调MADS23的表达或活性包括：将MADS23的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入薯类植物中；对MADS23进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进MADS23表达；或，以增强子促进MADS23表达。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节EIN3-MADS23-CYCB2；3为调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用、进而上调CYCB2；3的表达或活性；或
所述调节EIN3-MADS23-HB52为调节通路蛋白的EIN3与MADS23的相互作用、进而下调HB52的表达或活性。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：在培养所述薯类植物时，添加乙烯或乙烯前体；较佳地所述乙烯前体为ACC；较佳地所述乙烯前体的添加量为0.5～50μmol/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的薯类植物在培养基中培养，所述培养基中添加NAA，6-BA，蔗糖；
较佳地，所述NAA的添加量为0.05～0.5mg/L；
较佳地，所述6-BA的添加量为0.1～1mg/L；
较佳地，所述蔗糖的添加量为2～8％(w/v)。
7.一种MADS23、包含其的EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路或它们的调节剂的用途，用于提高薯类植物产量性状；其中，所述的调节剂包括MADS23上调剂，或为调节薯类植物中EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路、促进MADS23响应乙烯信号的试剂。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的MADS23上调剂包括：外源的MADS23编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子；或，对MADS23进行功能获得性点突变的试剂；较佳地，为在发生MADS23突变的薯类植物中将突变体回复为MADS23野生型的试剂。
9.如权利要求1～8任一所述，其特征在于，所述的薯类植物为含有MADS23或其同源物的植物；或
所述的薯类植物为含有EIN3-MADS23-CYCB2；3或EIN3-MADS23-HB52信号通路或所述信号通路蛋白的同源物的植物；或
所述的薯类植物包括：甘薯、紫薯、木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜、雪莲果。
10.一种定向选择或鉴定薯类植物的方法，所述方法包括：鉴定测试薯类植物中的MADS23的表达或序列特征；若是该测试薯类植物的MADS23高表达，则其为产量高的植株；若是该测试薯类植物的MADS23低表达或不表达，则其为产量低的植株。
11.一种筛选提高薯类植物产量性状的物质的方法，包括：
(1)将候选物质加入到表达MADS23的体系中；
(2)检测所述体系，观测其中MADS23的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为可用于提高薯类植物产量性状的物质。
12.一种促进薯类植物根的生长的方法，包括：在培养所述薯类植物时，添加乙烯或乙烯前体；较佳地所述乙烯前体为ACC；较佳地所述乙烯前体的添加量为0.5～50μmol/L。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的薯类植物在培养基中培养，所述培养基中添加NAA，6-BA，蔗糖；
较佳地，所述NAA的添加量为0.05～0.5mg/L；
较佳地，所述6-BA的添加量为0.1～1mg/L；
较佳地，所述蔗糖的添加量为2～8％(w/v)。
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