EA026298B1 - Лекарственная форма с фосфатидилсерином и куркумином для лечения болезни альцгеймера, сенильной или пресенильной деменции или сосудистой деменции - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лекарственной форме, содержащей фосфатидилсерин или его соль и куркумин, для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера, сенильной или пресенильной деменции или сосудистой деменции, где фосфатидил серин находится в форме натриевой соли и в количестве от 50 до 400 мг на дозу, и куркумин присутствует в количестве от 50 до 1000 мг на дозу, причем лекарственная форма свободна от продуктов деградации фосфатидилсерина, и способу предупреждения или лечения указанных заболеваний и предупреждения и лечения остеопороза и/или остеоартрита.

Description

Настоящее изобретение описывает и заявляет стабильные фармацевтические композиции и/или пищевые добавки на основе фосфатидилсерина (ФС) и куркумина, которые в результате не содержат продуктов деградации, для применения для предупреждения и лечения расстройств, ассоциированных со старением головного мозга, и для предупреждения и лечения остеопороза и/или остеоартрита.

Область изобретения

Функциональное ухудшение центральной нервной системы (ЦНС), которое имеет место при физиологическом процессе старения головного мозга, часто вызывает ухудшение когнитивных функций у пожилых людей, что может принимать форму поведенческих расстройств с изменениями временной и пространственной памяти.

Такое функциональное ухудшение ассоциировано с биохимическими и структурными изменениями липидного состава мембран нейронов и со сниженной активностью ферментов головного мозга, что может приводить к уменьшению синаптических уплотнений.

Так как фосфатидилсерин (ФС) является основным кислым фосфолипидом в головном мозге, в научных исследованиях длительно искали фармакологическое лечение связанных с возрастом когнитивных расстройств на основании фосфолипидов, которое может предотвращать (и/или частично восстанавливать) такой структурный и функциональный дефицит стареющих нейрональных мембран.

Доклинические и клинические исследования, проводимые на людях, продемонстрировали, что особенно у пожилых людей пероральное применение ФС может вызывать существенное повышение способности к обучению и временной и пространственной памяти, даже в случае особенно инвалидизирующих расстройств, таких как старческая деменция и болезнь Альцгеймера (СепассЫ Т. с1 а1 Адшд СПп Ехр Кек; 1993; 5: 123-133; Νπηζί МС е! а1.; Αάν Ехр Мей Βίο1; 1992; 318: 393-8).

Физиологическое и патологическое ухудшение когнитивных функций пожилых людей часто может быть ассоциировано со снижением гормонов из-за нормального снижения эндокринной функции (такого как менопауза или андропауза) или внезапного прекращения продукции определенных гормонов из-за хирургического удаления секретирующего органа (такого как частичная или полная овариэктомия). За указанной ситуацией часто следуют другие расстройства, такие как остеопороз.

Термин остеопороз обозначает состояние, вследствие которого скелет приобретает больший риск переломов из-за снижения массы и модификации микроархитектуры кости. Остеопороз определяют как потерю более чем 30% кости. Он главным образом развивается в трабекулярных костях, которые подвергаются наибольшему количеству переломов, и начинается со снижения содержания кальция костной массы (остеопения). Кости, наиболее часто поражаемые снижением содержания кальция, представляют собой поясничные позвонки, бедро и запястье. При прогрессировании остеопении может развиваться разрушение позвонков или перелом шейки бедра.

Остеопороз классифицируют как первичный (оригинальный) или вторичный, т. е. возникающий в результате сопутствующего явления; однако, первичная форма определяет почти все случаи (95%).

Первичный остеопороз включает постменопаузальный остеопороз и сенильный остеопороз (последний развивается вследствие различных причин, включающих отсутствие подвижности и низкое потребление кальция, магния, витамина Ό и других важных микроэлементов).

Вторичный остеопороз может быть классифицирован как вызванный длительной иммобилизацией, ревматоидным артритом, злокачественными опухолями или сниженной абсорбцией питательных веществ в кишечнике.

Он наиболее широко распространен среди различных костных заболеваний, поражает лиц обоих полов, но преимущественно женщин в постменопаузе; в США большинство взрослых старше 50 лет страдают от остеопороза или сниженной плотности кости.

Причиной является дисбаланс между остеобластами и остеокластами; первая категория клеток участвует в образовании кости, тогда как вторая участвует в резорбции кости, так что если остеокласты работают быстрее чем остеобласты, кость разрушается. Во время менопаузы продукция остеокластов увеличивается из-за потери эстрогенов, что приводит к повышению уровня цитокинов, коррелирующему с продукцией остеокластов. При второй форме активность остеобластов снижается с возрастом.

Доступные профилактические и лечебные мероприятия включают введение холекальциферола для обеспечения абсорбции кальция в кишечнике, добавку кальция и магния, введение бисфосфонатов, которые ингибируют активность остеокластов, заместительную гормональную терапию эстрогенами и прогестогенами для женщин в менопаузе и тестостероном для мужчин, ингибирование остеокластов кальцитонином, клодронат с подкожным кальцитонином для лечения боли при переломах.

Остеоартрит (ОА) часто ассоциирован с остеопорозом в пожилом возрасте; это высоко инвалидизирующее заболевание характеризуется прогрессирующим разрушением суставного хряща из-за деградации матрицы сустава и потери клеточных компонентов. Физиологический процесс старения поверхности суставов вероятно включает ферментативные механизмы ОА.

- 1 026298

Известно, что механический дисбаланс, воздействующий на сустав, в целом может запускать развитие указанного расстройства.

Такая нестабильность сустава может, по существу, быть вызвана различными факторами (такими как травма, воспаление суставной системы, эрозия хряща, неправильная походка или поза), и может приводить к изменениям тонкого баланса между синтезом и разрушением внеклеточного матрикса, который главным образом синтезируется хондроцитами и синовиоцитами.

Когда такое состояние совершенного, но хрупкого гомеостаза нарушается, разрушение матрицы превосходит ее синтез и начинается медленный, но прогрессирующий процесс деградации, который плохо компенсируется соответствующим процессом синтеза в результате потери хондроцитов.

Избыточная и/или неправильная нагрузка на сустав может вызывать ответ хондроцитов, проявляющийся синтезом ферментов, ответственных за разрушение хряща. Протеазные ферменты, ответственные за деградацию хряща, называются матриксными металлопротеиназами (ММР), и синтезируются хондроцитами при стимуляции воспалительными цитокинами, такими как 1Ь-1 и ΤΝΕ-α, которые продуцируются и высвобождаются в суставную полость, особенно в дебюте воспалительного заболевания. 1Ь1 стимулирует синтез большого количества оксида азота (ответственного за смерть хондроцитов в результате апоптоза) и также ингибирует синтез хондроцитами протеогликанов (компоненты матрицы) (Όοζίη В. е! а1., Майтх Вю1о§у, 2002, 21:449-459).

Доступные методы лечения включают введение стероидных и нестероидных лекарственных препаратов в сочетании с введением в сустав препаратов, улучшающих скольжение суставных поверхностей.

Фармацевтические композиции, содержащие антиоксиданты, такие как куркумин, в настоящее время продаются в качестве профилактических или лечебных средств для вышеупомянутых нейродегенеративных расстройств и воспалительных заболеваний в общем.

Куркумин (диферулоилметан; 1,7-бис-[4-гидрокси-3-метоксифенил]-1,6-гептадиен-3,5-дион) представляет собой жирорастворимую молекулу и его вместе с моно- и диметоксипроизводными, известными как куркуминоиды, получают путем экстракции растворителем из высушенного и измельченного корневища растения Сигсита 1опда (куркума). Куркуму исторически использовали в Индийской Аюрведической медицине для лечения большого количества заболеваний, но до 20 века не было клинических исследований, идентифицирующих куркумин как фактор, ответственный за основную долю ее биологических действий. Куркумин стал предметом множества доклинических и клинических исследований, так что его противовоспалительная и антиоксидантная эффективность хорошо задокументирована: он обладает способностью регулировать окислительный баланс клеток, участвуя во множестве механизмов различными путями; в частности он ингибирует ряд факторов с сильной воспалительной активностью (СОХ 1 и 2, ΤΝΕ, липоксигеназа и интерферон-гамма). Наконец, его эффективность как противоопухолевого средства была продемонстрирована ίη νίΐτο (Вепдтагк δ., ίΡΕΝ, 2006, 30(1):45-51).

Однако его клиническое применение ограничено очень низкой биодоступностью при пероральном введении вследствие низкой абсорбции в желудочно-кишечном тракте, обусловленной липофильностью указанного активного ингредиента. По указанным причинам было сделано множество попыток повышения биодоступности куркумина, таких как комбинация его с пиперином (который является токсичным) или с другими маслами Сигсита 1опда (υδ 7736679), или его инкапсуляция в липосомы или фитосомы, состоящие из фосфолипидов/лецитина (ЕР 1991244).

Однако пероральная биодоступность куркумина остается ограниченной.

Фосфатидилсерин представляет собой кислый фосфолипид с тремя ионизируемыми группами (амино, фосфат и карбоксил), которые преимущественно присутствуют во внутренней части плазматической мембраны; множество исследований продемонстрировало его эффективность в улучшении нейрональной активности, которая зависит от мембран клеток, и в нормализации плотности нейрональных рецепторов для восстановления нормальных уровней ацетилхолина и допамина.

ФС, существующий в настоящее время на рынке, основан на процессах продукции и очистки (известных специалисту), включающих ферментативную конверсию фосфатидилхолина (ФХ) и/или фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в ФС посредством реакции трансфосфатидилирования, катализируемой ферментом фосфолипазой Ό (РЬИ), с последующей очисткой посредством конечной экстракции органическими растворителями.

ФС получают в виде порошка, но продают преимущественно в жидкой форме, обычно смешанным с масляными растворителями, содержащими триглицериды, для его рецептирования в виде мягких капсул.

Однако указанный фосфолипид имеет существенные проблемы стабильности композиции по трем основным причинам:

присутствие следов фермента РЬИ в конечной композиции мягких капсул, что приводит к быстрому разложению ФС с последующим образованием фосфатидовой кислоты (ФК) и/или фосфатидилглицерина, вследствие замены серина глицерином, присутствующим в капсуле (ЕР 1663157);

в присутствии свободных радикалов (ΚΟδ) ФС может подвергаться процессу перекисного окисления липидов полиненасыщенных жирных кислот молекулы (ВοсЬкον V., ЛпОо.хИапЦ & Ребо.х δίβη-ιΠη^; 2010, 12(8): 1009-1058);

- 2 026298 наконец, ФС также может подвергаться процессу окисления на полярной головке, серине, что приводит к накоплению ФК (Мас1е1 Е. е! а1., 1 Ат §ос Макк 8рес!гот, 201 1, 22(10): 1804-14).

Предметом настоящего изобретения является новая фармацевтическая композиция, содержащая комбинацию ФС и куркумина, так как заявители обнаружили, что она стабилизирует указанный фосфолипид путем замедления и/или остановки процессов его множественного распада и окисления (ранее описанных), таким образом допуская рецептирование стабильной комбинации ФС/куркумин, лишенной продуктов деградации, для получения фармацевтических композиций (и добавок) во всех фармацевтических и нефармацевтических формах, известных специалисту в настоящее время (капсулы, батончики, растворы/дисперсии для ампульных препаратов).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение описывает и заявляет новые фармацевтические композиции или пищевые добавки на основе ФС и куркумина для применения для предупреждения и лечения расстройств, ассоциированных со старением головного мозга, описанных выше, и для предупреждения и лечения остеопороза и/или остеоартрита.

Заявители обнаружили, что комбинация куркумина с фосфатидилсерином стабилизирует указанный фосфолипид таким образом, что фармацевтические композиции (или другие композиции), содержащие указанную комбинацию, не содержат ФС в деградированной/окисленной форме или даже продуктов деградации ФС, описанных выше, таким образом сохраняя неизменными все фармакологические свойства ФС. Заявители также описали новые фармацевтические формы, такие как мягкие капсулы или таблетки, растворы и/или дисперсии, батончики или другие композиции, известные специалисту, содержащие новую стабильную комбинацию, состоящую из ФС/куркумина.

Предметом настоящего изобретения является новое терапевтическое применение фармацевтических композиций, содержащих ФС и куркумин:

применение для предупреждения и лечения нейродегенеративных расстройств со снижением когнитивных аспектов и нарушениями памяти, таких как болезнь Альцгеймера, сенильная или пресенильная деменция и сосудистая деменция;

применение для предупреждения и лечения первичного и вторичного остеопорозов; применение для предупреждения и лечения остеоартрита (ОА).

Заявители продемонстрировали синергический эффект новой стабильной комбинации ФС/куркумина в снижении продукции оксида азота (N0).

Полученные результаты являются чрезвычайно важными, так как N0 вовлечен в патогенез: окислительного повреждения клеток, которое развивается, например, при реперфузии после ишемии;

нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, сенильная и пресенильная деменция и сосудистая деменция;

нарушений структуры костей и суставов, таких как остеопороз и остеоартрит.

В ЦНС патогены, состояние стресса, возраст или нейродегенеративные расстройства могут запускать воспалительный ответ, обусловленный активацией глиальных клеток (в частности, микроглиальных клеток), который посредством секреции провоспалительных молекул, нейротрансмиттеров и реактивных форм, таких как N0, модулирует указанные воспалительные процессы. В частности, высокие концентрации N0 были обнаружены в нейронах и глии, где он участвует в поддержании и прогрессировании нейровоспалительного процесса из-за его определенной способности создавать свободные радикалы, которые повреждают целостность клетки, подвергая ее окислительному стрессу (Регпапбе/ АР е! а1., Сигг РЬагт Эек, 2010, 16(25):2837-50). Кроме того, N0 также вероятно вовлечен в процессы развития кости путем увеличения дифференцировки остеокластов, таким образом изменяя минеральную плотность кости (№пош1уа ЕТ., Рок!ег §еккюп-Вопе Се11 Вю1оду, 2001, 47!Ь АМ о£ 0г1ЬораеФс ВекеагсЬ 8ос1е1у, СаЬ£огта). Наконец, было продемонстрировано присутствие и активная роль N0 в ткани суставов пациентов, страдающих от ОА: высокая концентрация N0 ингибирует митохондриальную активность хондроцитов и синовиоцитов и вызывает образование свободных радикалов и впоследствии клеточную смерть.

Воспалительные вещества, сильно вовлеченные в описанные процессы, включают цитокины, особенно интерлейкины. Они продуцируются активированными макрофагами и отвечают за ряд функций клетки, включая апоптоз. В частности, было продемонстрировано, что в клетках нервной системы интерлейкины вовлечены в воспалительный каскад, который влияет на развитие и течение дегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (Кйа/а\уа е! а1., 1 1ттипо1, 2011, 187, 6539-6549).

Роль ФС в ингибировании фермента, ответственного за синтез N0, и последующее замедление процесса остеокластогенеза, который вызывает потерю трабекулярной кости, хорошо известны (Агатак! Υ., ВюсЬет ВюрЬук Век Соттип, 2001, 280(4):982-7).

Наконец, способность куркумина ингибировать продукцию N0 путем регуляции фермента N0синтазы также известна; из-за его противовоспалительной активности, таким образом, куркумин тестировали при нейродегенеративных расстройствах, ОА и для предупреждения повреждения кости (Кгт №.К., 1 Се11 ВюсЬет, 2011, 112(11):3159-66).

Заявители в настоящее время неожиданно обнаружили и впоследствии продемонстрировали синер- 3 026298 гический эффект новой стабильной комбинации ФС/куркумина в снижении продукции оксида азота (ΝΟ) в клетках микроглии после стимуляции провоспалительными средствами (ЬР8).

Такой результат был полностью неожиданным и в свете известных эффектов ΝΟ, описанных выше, поддерживает новое терапевтическое применение фармацевтической композиции, содержащей стабильную комбинацию ФС/куркумина и при нейродегенеративных расстройствах и при таковых, вовлекающих костную систему.

Предметом настоящего изобретения, следовательно, являются новые методы применения и методы лечения следующих заболеваний, включающие ежедневное введение 1 или больше фармакологически активных доз фармацевтической композиции на основе ФС/куркумина:

предупреждение и лечение нейродегенеративных расстройств, включающих снижение когнитивных аспектов и нарушения памяти, таких как болезнь Альцгеймера, сенильная и пресенильная деменция и сосудистая деменция;

предупреждение и лечение первичного и вторичного остеопорозов; предупреждение и лечение остеоартрита (О А).

ФС, применяемые в описанной комбинации, получают посредством фермента ΡΕΏ, который катализирует трансфосфатидилирование между ФХ и серином, реакцию, которая имеет место в водном окружении (ЕР 1231213, ЕР 1048738) или двухфазной системе воды/растворителя (ЕР 0776976, ЕР 1890706). Однако предпочтительно использовать ФС, получаемый в соответствии с патентом ЕР 1890706, где ФС получают в присутствии оксида двухвалентного металла в водно-спиртовом реакционном окружении, или в окружении, содержащем апротонный растворитель или двухфазную систему; получение ФС в двухфазной системе, образованной водным раствором и органическим растворителем в присутствии оксида кальция, является еще более предпочтительным, так как такая система допускает получение ФС с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты.

Куркумин (с его производными, такими как сложные эфиры, которые действуют как пролекарства), применяемый в настоящем изобретении, может быть использован как таковой (обычно ассоциированный с другими куркуминоидами, присутствующими в меньших пропорциях, таких как Сигеишт Сотр1ех), или в виде Вюсигситт (ВСМ-95®), ассоциированный с маслами и полимерами, которые увеличивают его биодоступность (ИЗ 20070148263), или рецептирован в комбинации с пиперином (ЗЕоЪЕа е! а1., Р1ап1а Мей, 1998, 64: 353-56), или полученным в виде микро- или наноэмульсий/нанодисперсий, в которых используют лецитин, и/или жирные кислоты, и/или триглицериды и необязательно также поверхностноактивные вещества, такие как Тмееп 80, для стабилизации молекулы и повышения ее биодоступности.

Новая стабильная комбинация, являющаяся предметом настоящего изобретения, состоит из

ФС (предпочтительно в виде натриевой соли) в концентрации от 50 до 400 мг на дозу фармацевтической композиции, предпочтительно от 100 до 200 мг;

куркумина в концентрации от 50 до 1000 мг на дозу активного ингредиента, предпочтительно от 100 до 600 мг в зависимости от исходной композиции активного ингредиента, используемого в комбинации с ФС.

Предпочтительными фармацевтическими (и нефармацевтическими) формами являются мягкие капсулы, саше, таблетки, батончики или растворы/дисперсии для ампульных препаратов.

Особенно предпочтительными фармацевтическими формами являются мягкие капсулы и саше; комбинация ФС и куркумина может быть рецептирована в композициях, полученных как известно специалисту, с использованием, например, липидных вспомогательных веществ (таких как жирные кислоты, триглицериды и/или фосфолипиды); поверхностно-активных веществ (таких как полисорбаты); адсорбирующих средств (таких как сорбит и маннит); консервантов/антиоксидантов (таких как аскорбиновая кислота); регуляторов рН (таких как лимонная кислота); и наконец новые композиции по изобретению также могут содержать фармацевтически/биологически активные вещества натурального и/или синтетического происхождения, такие как витамины, минеральные соли, тонизирующие вещества (такие как женьшень и гингко билоба), противовоспалительные средства и аминокислоты.

Некоторые примеры композиции новой комбинации ФС и куркумина по изобретению показаны ниже в качестве примера, но не ограничения, вместе с результатами исследования ίη νΐΐίο.

Пример 1. Получение саше, содержащих 200 мг ФС/400 мг куркумина.

Ингредиенты

- 4 026298

Саше должны содержать однородный, текучий гранулят, который приятно принимать, и стабильный с течением времени.

Диоксид кремния делает гранулят текучим и предотвращает образование агрегатов; маннит и лецитин облегчают диспергирование активного ингредиента в воде, тогда как фруктоза предпочтительно с размером частиц менее чем 150 мкм допускает получение однородной смеси ФС/куркумина с вспомогательными веществами.

Процесс получения: смешивание ингредиентов ФС, предварительно смешанный с соответствующим образом просеянным лецитином и куркумином, загружали в мешалку с кубическим барабаном и затем добавляли все оставшиеся вспомогательные вещества после просеивания.

Атмосферу делали инертной с помощью тока фильтрованного азота и смешивание продолжали в течение 30 мин.

Затем смесь использовали для заполнения саше (снова под током азота), которые герметизировали жаром.

Пример 2. Получение мягких капсул, содержащих 100 мг ФС/200 мг куркумина.

Ингредиенты

Натриевая соль ФС	10 0 мг
Куркумин (95%)	200 мг
Лецитин	50 мг
Растительное масло	300 мг

Ингредиенты оболочки

Желатин	36 0 мг
Глицерин	14 0 мг
Коричневый оксид железа Е172	3 мг
Красный оксид железа Е172	1,2 мг
Этил п-гидроксибензоат натрия	1, 6 мг
Пропил п-гидроксибензоат натрия	0, 9 мг

Процесс получения.

Смешивание ингредиентов.

Для указанной процедуры использовали турбоэмульгатор ΡΡΥΝΑ УМЕ 400; сначала в него вливали описанное количество растительного масла и нагревали до однородной температуры 25°С.

Добавляли половину общего количества ФС, куркумина и оставшихся ингредиентов.

Прибор закрывали и создавали вакуум; затем турбину запускали в течение 15 мин. Добавляли вторую половину ингредиентов и снова создавали вакуум. Турбину запускали в течение дополнительных 40 мин. Температура не должна превосходить 40°С.

Затем также активировали гомогенизирующую мельницу в течение всего 90 мин, пока активные составляющие и оставшиеся ингредиенты полностью и равномерно диспергировались.

Мельницу выключали, тогда как турбина оставалась работающей в течение дополнительных 10 мин.

Полученную смесь затем использовали для заполнения капсул.

Пример 3. ФС/куркумин: синергическое ингибирование продукции N0.

Указанный эксперимент проводили для оценки способности стабильной комбинации ФС/куркумина модулировать активацию микроглии ίη νίΐΓΟ по сравнению с эффектом, создаваемым отдельно ФС и отдельно куркумином.

Материалы и методы

ФС (натриевую соль), продуцируемую и очищенную в соответствии с ЕР 1890706 (пример 3), ресуспендировали в 2:1 хлороформе/метаноле, сушили выпариванием и ресуспендировали в РВ8 в конечной концентрации 100 мкМ. 95%-ный чистый куркумин, полученный в ИМ80 в конечной концентрации активного ингредиента 20 мМ, использовали для проводимого эксперимента.

Экспериментальная модель.

Модель активации глии ίη νίΐΓΟ с использованием мышиной клеточной линии микроглии ВУ-2 выбирали для указанного эксперимента:

50000 клеток/ячейку исходно сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали в ИМЕМ, содержащей 10% РС8, глютамин и антибиотики при 37°С. При активации ЬР8 (липополисахаридом, эндотоксином грамотрицательных бактерий, обычно используемым в качестве провоспалительного стимула и ίη νίίτο и ίη νίνο), такие клетки высвобождали N0 в культуральной среде; следовательно, в эксперименте использовали их стимуляцию с помощью 0,1 мкг/мл ЬР8 в течение ночи в присутствии или отсутствие ФС (10 и 30 мкМ) или куркумина (2,5 и 5 мкМ) в различных концентрациях.

Наконец, для оценки синергии между двумя активными составляющими комбинацию ФС/куркумина исследовали в присутствии ЬР8 0,1 мкг/мл (как описано выше):

- 5 026298 мкМ ФС+2,5 мкМ куркумина и мкМ ФС+5 мкМ куркумина.

Конечное содержание N0 в среде измеряли с помощью теста Грисса: коротко, аликвоты среды смешивали с равными объемами реагента Грисса (0,1% дигидрохлорида Ж1-нафтил)этилендиамина. 1% сульфаниламида и 0.4М НС1). Через 15 мин реакции поглощение измеряли при 570 нм.

Результаты.

На фиг. 1 показан эффект, вызванный ФС и куркумином (в вышеупомянутых концентрациях), в отношении высвобождения N0 в культуральной среде клетками мышиной микроглии ВУ-2: обе молекулы ингибировали высвобождение N0 в среду дозозависимо, так оба ФС и куркумин снижали продукцию N0 в клетках, активированных ЬР8, таким образом подтверждая их противовоспалительную эффективность, описанную в литературе и ранее упомянутую.

На фиг. 2 четко и ясно продемонстрирован синергический эффект, проявляемый новой стабильной комбинацией ФС/куркумина в ингибировании высвобождения N0 активированной микроглией: действительно, 10 мкМ ФС в комбинации с 5 мкМ куркумина ингибируют 50% высвобождения N0 в культуральную среду, тогда как одиночное лечение 10 мкМ ФС не превосходило 10%, и одиночное лечение 5 мкМ куркумина вызывало менее чем 20% ингибирование.

Синергический эффект обусловлен (по меньшей мере, частично) стабилизацией ФС.

Пример 4. Биодоступность комбинаций ФС/куркумина.

Биодоступность куркумина определяли после перорального введения композиций, содержащих экстракт Сигейта 1опца, в сочетании с фосфолипидами в различных соотношениях. Используемыми фосфолипидами были фосфатидилсерин (ФС) и фосфатидилхолин (ФХ), которые обычно используют коммерчески для увеличения абсорбции куркумина.

Сравнение проводили по сравнению с в/в введением куркумы отдельно.

Композиции и дозы.

Композиции получали, как указано далее.

В/в введение (Т1): 3 мг/кг	Куркума (10% ΏΜ5Ο, 5% раствор в Н2О): 2 мг/кг
Пероральное введение (Т2) : 340 мг/кг	Липосомы куркума/ФС — 1:4 масс/масс, фосфатный буфер рН 7,4: 10 мл/кг
Пероральное введение (ТЗ) : 340 мг/кг	Липосомы куркума/ФС/РС — 1:2:2 масс/масс/масс, фосфатный буфер рН 7,4: 10 мл/кг

Композиции Т2 и Т3 получали путем растворения куркумы в этаноле (500 мг куркумы/75 мл ЕЮН), нагревания растворов до 60°С и добавления фосфолипидов к полученному раствору. Затем раствор перемешивали в течение 3 ч для индукции образования липосом. Растворитель экстрагировали в вакууме. Композиции получали перед каждой обработкой путем ресуспендирования смеси липосом в фосфатном буфере рН 7,4 (14,7 мл).

Животные и лечение.

Использовали крыс Зргадие-ОаМеу (масса тела 225-250 г). Всех животных взвешивали каждый день лечения и мониторировали с регулярными интервалами для выявления любых реакций на лечение. Каждое животное идентифицировали красителем, распыляемым на спину перед экспериментом. В конце эксперимента животных умерщвляли под анестезией посредством в/в сверхдозы пентотала натрия, 1п1сгус1. Эксперимент проводили в соответствии с применимым Итальянским законодательством (Законодательный акт 1 16/92).

Образцы крови.

В/в лечение (Т1): образцы крови забирали из хвостовой вены через 3, 10, 20, 60, 90, 120, 180 и 360 мин.

Пероральное лечение (Т2-Т3): образцы крови забирали из хвостовой вены через 10, 30, 60, 90, 120, 180, 360 и 480 мин.

Фармакокинетический анализ.

Следующие параметры оценивали для каждого пациента:

Стах максимальная концентрация в плазме.

Стах/Ό максимальная концентрация в плазме, нормализованная по дозе (фиг. 3).

1тах время, требующееся для достижения максимальной концентрации в плазме.

Результаты и заключения.

Биодоступность куркумина оценивали путем сравнения композиций в липосомах ФС или ФХ/ФС в различных соотношениях при в/в введении. Как ожидали, абсолютная биодоступность оказалась в общем очень низкой из-за метаболизма в печени (например, из-за образования конъюгатов).

Анализ данных, представленных на фиг. 3, четко показывает, что композиция Т2 обладает превос- 6 026298 ходной биодоступностью, которая сразу после введения четко сравнима с таковой в/в лечения. Концентрация в плазме остается высокой, стабильной и постоянной в течение длительного периода времени, таким образом позволяя снизить количество введений в сутки. Композиция Т3, однако, индуцирует более низкий уровень в крови.

Очевидно, что фосфатидилсерин обладает эффектом, который четко обеспечивает абсорбцию куркумы, в большей степени, чем фосфатидилхолин.

Действительно, так как общее соотношение куркумы/фосфолипидов составляет 1:4 в обеих пероральных композициях, улучшение биодоступности композиции Т2, очевидно, зависит не только от простого присутствия фосфолипидов, использование которых хорошо известно для такой цели, а также природы используемого фосфолипида.

Пример 5. ФС/куркумин: синергическое ингибирование высвобождения ГЬ-ф.

Эксперимент проводили в две стадии и он был создан для оценки эффекта на ίη νίΐΓΟ высвобождение Ш-ф из клеток микроглии ВУ-2, стимулированных ЬР§, после введения ФС и куркумина. Ш-ф представляет собой цитокин, четко вовлеченный в воспалительные процессы, лежащие в основе и костно-суставных заболеваний, и нейродегенерации.

Материалы и методы.

Мышиные клетки микроглии ВУ-2 стимулировали, как описано в примере 3 (0,1 г/мл ЬР8 в течение 16 ч), и затем обрабатывали ФС и куркумином в концентрации 1 или 5 мкМ. Уровни Ш-ф определяли посредством анализа ЕЬРЗЛ. Контроль (контр.) представлен клетками, стимулированными ЬР§, но не леченными.

На фиг. 4 четко показано, что ни ФС, ни куркумин, вводимые отдельно, достоверно не ингибировали высвобождение 1Ь-ф из клеток ВУ-2, стимулированных ЬР§; ограниченный эффект возникает при более высоких концентрациях (5 мкМ) для обоих веществ.

На второй стадии эксперимента эффекты комбинации двух веществ оценивали по тому же параметру в соответствии с тем же протоколом. Для демонстрации синергии было решено скомбинировать концентрации, которые давали наименьший ингибирующий эффект при отдельном введении.

Результаты показаны на фиг. 5.

Комбинация ФС/куркумина достоверно и синергически ингибировала высвобождение Ш-ф; синергия была даже более очевидной в свете того факта, что наилучшее ингибирование получали с концентрациями, которые давали наихудший результат в первой частиц эксперимента (1 мкМ ФС+1 мкМ куркумина).

Пример 6. ФС/куркумин: повышенное высвобождение βΙΙΙ тубулина.

Целью эксперимента было исследовать модулирующую роль ФС и куркумина на эффекты нейровоспалительных процессов, которые сильно ингибируют дифференцировку нейронов, путем оценки экспрессии белка βΙΙΙ тубулина, индикатора дифференцировки.

Материалы и методы.

Эксперимент проводили в соответствии с применимым Итальянским законодательством.

Использовали культуры стволовых клеток/клеток предшественников нейронов (ИРС), полученные из суправентрикулярной зоны взрослых мышей. ИРС культивировали в условиях дифференцировки посредством механической диссоциации нейросфер и посева отдельных клеток на планшеты, покрытые полиорнитином и ламинином в культуральной среде, содержащей только фактор ЬРСР, в соответствии с современными существующими методиками.

Культуры ИРС, полученные таким образом, делили на аликвоты, каждую из которых обрабатывали отдельно, как указано далее:

a) воздействие на культуральную среду клеток микроглии, активированных ЬР§, для индукции воспалительного повреждения, которое предотвращает или сильно ингибирует дифференцировку;

b) обработка а) и введение ФС и куркумина последовательно в различных концентрациях;

c) обработка а) и ФС/куркумином, комбинированными в различных относительных концентрациях.

Контроль был представлен необработанными ИРС клетками.

Дифференцировку нейронов оценивали через 6 дней посредством иммуноцитохимического анализа с антителами, направленными против специфического маркера βΙΙΙ тубулина, экстраполируя % концентрации белка, присутствующего в среде.

Результаты представлены на фиг. 6. Концентрации выражали в мкМ.

Как ожидалось в свете их известных свойств в присутствии липосом только ФС (1 и 5 мкМ) и только куркумина (1 и 5 мкМ), процентное отношение клеток, положительных к βΙΙΙ тубулину, было уже немного повышено при наименьшей концентрации для обоих веществ, но достоверно не отличалось от такового, наблюдаемого в присутствии только ЬР8. Неожиданно, однако, комбинация ФС/куркумина полностью отменяла ингибирование дифференцировки нейронов, индуцированное ЬР8, восстанавливая ее до контрольных значений при минимальных используемых концентрациях.

Такие последние результаты демонстрируют, что комбинация ФС и куркумина обладает неоспоримым синергическим эффектом в восстановлении дифференцировки нейронов, сниженной в условиях

- 7 026298 воспаления, в отличие от двух веществ, используемых отдельно.

В заключение в настоящем изобретении заявители продемонстрировали, что фармацевтические композиции, содержащие новую стабильную комбинацию ФС/куркумина, описанную в настоящем описании, обладают очень высокой биодоступностью после перорального введения;

что новая стабильная комбинация ФС/куркумина обладает синергическим эффектом в снижении продукции оксида азота (N0);

что новая стабильная комбинация ФС/куркумина обладает синергическим эффектом в снижении высвобождения ΙΌ-Ιβ, цитокина, сильно вовлеченного в воспалительные процессы;

что новая стабильная комбинация ФС/куркумина обладает синергическим эффектом в обеспечении дифференцировки нейронов в клетках, подвергнутых нейровоспалительной стимуляции;

и, следовательно, описывает и заявляет применение фармацевтических композиций, содержащих указанную комбинацию для предупреждения заболеваний, ассоциированных со старением головного мозга, описанных выше, и для предупреждения и лечения остеопороза и/или остеоартрита.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Лекарственная форма, содержащая фосфатидилсерин или его соль и куркумин, для применения для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера, сенильной или пресенильной деменции или сосудистой деменции, где фосфатидилсерин находится в форме натриевой соли и в количестве от 50 до 400 мг на дозу и куркумин присутствует в количестве от 50 до 1000 мг на дозу, причем лекарственная форма свободна от продуктов деградации фосфатидилсерина.
2. 2. Лекарственная форма, содержащая фосфатидилсерин или его соль и куркумин, для применения для предупреждения или лечения первичного и вторичного остеопороза или остеоартрита, где фосфатидилсерин находится в форме натриевой соли и присутствует в количестве от 50 до 400 мг на дозу и куркумин присутствует в количестве от 50 до 1000 мг на дозу, причем лекарственная форма свободна от продуктов деградации фосфатидилсерина.
3. 3. Лекарственная форма по п. 1 или 2, где фосфатидилсерин присутствует в количестве от 100 до 200 мг на дозу, и куркумин присутствует в количестве от 100 до 600 мг на дозу.
4. 4. Лекарственная форма по любому из пп.1-3, где фосфатидилсерин получен в двухфазной системе, образованной водным раствором и органическим растворителем в присутствии оксида кальция.
5. 5. Лекарственная форма по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая одно или более липидных вспомогательных веществ, таких как жирные кислоты, триглицериды, и/или фосфолипиды, и/или поверхностно-активные вещества, и/или адсорбирующие средства, и/или консерванты/антиоксиданты, и/или регуляторы рН.
6. 6. Лекарственная форма по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая одно или более фармакологически и/или биологически активных средств натурального и/или синтетического происхождения, таких как витамины, минеральные соли, тонические средства, противовоспалительные средства и аминокислоты.
7. 7. Лекарственная форма по любому из предшествующих пунктов в форме мягких капсул, таблеток, батончиков, растворов или дисперсий.
8. 8. Лекарственная форма по любому из пп.2-7 для предупреждения или лечения первичного и вторичного остеопороза.
9. 9. Лекарственная форма по любому из пп.2-7 для предупреждения или лечения остеоартрита.
10. 10. Способ предупреждения или лечения болезни Альцгеймера, сенильной или пресенильной деменции или сосудистой деменции, включающий ведение лекарственной формы, содержащей фосфатидилсерин или его соль и куркумин, где фосфатидилсерин находится в форме натриевой соли и в количестве от 50 до 400 мг на дозу и куркумин присутствует в количестве от 50 до 1000 мг на дозу, причем дозированная форма свободна от продуктов деградации.
11. 11. Способ предупреждения или лечения первичного и вторичного остеопороза или остеоартрита, включающий введение лекарственной формы, содержащей фосфатидилсерин или его соль и куркумин, где фосфатидилсерин находится в форме натриевой соли и присутствует в количестве от 50 до 400 мг на дозу и куркумин присутствует в количестве от 50 до 1000 мг на дозу, причем дозированная форма свободна от продуктов деградации.
12. 12. Способ по п.10 или 11, где в лекарственной форме фосфатидилсерин присутствует в количестве от 100 до 200 мг на дозу и куркумин присутствует в количестве от 100 до 500 мг на дозу.
13. 13. Способ по любому из пп.10-12, где в лекарственной форме фосфатидилсерин получен в двухфазной системе, образованной водным раствором и органическим растворителем в присутствии оксида кальция.
14. 14. Способ по любому из пп.10-13, где лекарственная форма дополнительно содержит одно или более липидных вспомогательных веществ, таких как жирные кислоты, триглицериды, и/или фосфолипиды, и/или поверхностно-активные вещества, и/или адсорбирующие средства, и/или консерван- 8 026298 ты/антиоксиданты, и/или регуляторы рН.
15. 15. Способ по любому из пп.10-14, где лекарственная форма дополнительно включает одно или более фармакологически и/или биологически активных средств натурального и/или синтетического происхождения, таких как витамины, минеральные соли, тонические средства, противовоспалительные средства и аминокислоты.
16. 16. Способ по любому из пп.10-15, где лекарственная форма представлена в форме мягких капсул, таблеток, батончиков, растворов или дисперсий.
17. 17. Способ по любому из пп.11-16 для предупреждения или лечения первичного и вторичного остеопороза.
18. 18. Способ по любому из пп. 11-16 для предупреждения или лечения остеоартрита.
19. 19. Способ по любому из пп.10 и 12-16 для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера.
20. 20. Способ по любому из пп.10 и 12-16 для предупреждения или лечения сенильной или пресенильной деменции или сосудистой деменции.