IT201900002109A1 - Composizioni comprendenti amminoacidi per l'uso nel trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“Composizioni comprendenti amminoacidi per l’uso nel trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale”
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell’invenzione
La presente descrizione si riferisce in generale a composizioni comprendenti amminoacidi. Più in particolare, la descrizione si riferisce a composizioni comprendenti amminoacidi per l’uso nel trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale in un soggetto.
Sfondo
Il sistema nervoso centrale (SNC) comprende il cervello, che coordina le funzioni di livello superiore, e il midollo spinale che serve principalmente come via di comunicazione tra il cervello e la periferia. Disabilità derivanti da lesioni del sistema nervoso centrale variano in funzione della modalità, della gravità e della posizione anatomica dell’insulto. Indipendentemente dalla posizione iniziale dell’insulto al SNC, la lesione è un processo che evolve, con danni primari che portano a una cascata di eventi deleteri che possono influire sul corpo cellulare e sulla funzione assonale, con conseguente disfunzione continua e degenerazione prolungata.
Una lesione cerebrale traumatica (TBI, traumatic brain injury) e una lesione del midollo spinale (SCI, spinal cord injury) traumatica si verificano quando un insulto fisico esterno provoca un danno e tali lesioni possono variare da lievi a gravi. Una lesione del midollo spinale è causa di disabilità con risultati neurologici devastanti e limitate opportunità terapeutiche. Esistono due principali tipi di lesione del midollo spinale (SCI), sezione del midollo spinale e contusione del midollo spinale. Una SCI si traduce in una perdita parziale o totale delle funzioni motorie o sensoriali al disotto del livello della lesione, con conseguenze devastanti per il paziente sia a livello fisico che psicologico. Il fondamento patologico sotteso alle disabilità è la perdita di tessuto neurale che disconnette gli impulsi neuronali dal sistema nervoso centrale ai muscoli. In tutto il mondo circa 250.000-500.000 persone subiscono una lesione al midollo spinale ogni anno (il che corrisponde a 30-60 persone ogni ora). Questi pazienti richiedono un’assistenza medica completa per tutta la loro vita, con un costo stimato di 1-4 milioni di euro per il periodo di vita del paziente. Sebbene le SCI rappresentino un importante onere sociale ed economico, sono disponibili poche nuove opzioni terapeutiche. Negli ultimi 30 anni, il progresso nell’assistenza medica ha aumentato il tasso di sopravvivenza dei pazienti con SCI. La ricerca di base e traslazionale, tuttavia, non è riuscita a migliorare sostanzialmente l’esito neurologico.
Sintesi dell’invenzione
La presente descrizione fornisce composizioni a base di amminoacidi particolarmente efficaci nel trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale in un soggetto.
Secondo la presente descrizione, il suddetto scopo viene raggiunto grazie all’oggetto specificamente richiamato nelle rivendicazioni che seguono, intese come parte integrante della presente descrizione.
Una forma di realizzazione della presente descrizione fornisce una composizione per l’uso nel trattamento di una lesione del sistema nervoso centrale in un soggetto, la composizione comprendendo un agente attivo, detto agente attivo contenendo gli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina e gli acidi carbossilici acido citrico, acido succinico, acido malico.
In una o più forme di realizzazione, l’agente attivo della composizione contiene inoltre uno o più amminoacidi scelti nel gruppo costituito da istidina, fenilalanina, metionina, triptofano, cisteina e tirosina.
In una forma di realizzazione preferita, la lesione del sistema nervoso centrale è scelta nel gruppo costituito da lesione cerebrale, lesione del midollo spinale, lesione di nervi periferici, malattia demielinizzante. In una o più forme di realizzazione, la lesione del midollo spinale comprende una lesione contusiva del midollo spinale (contusive spinal cord injury).
Un’ulteriore forma di realizzazione della presente descrizione fornisce un procedimento per trattare lesioni del sistema nervoso centrale in un soggetto, il procedimento comprendendo la selezione di una composizione comprendente un agente attivo, detto agente attivo contenendo gli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina e gli acidi carbossilici acido citrico, acido succinico e acido malico, e la somministrazione della composizione per il trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale.
Breve descrizione dei disegni
L’invenzione verrà ora descritta, solo a titolo di esempio, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- La Figura 1 mostra una quantificazione dell’area mitocondriale in NSC (cellule staminali neurali) in fase di differenziamento in vitro trattate con una composizione secondo forme di realizzazione della presente descrizione. I dati sono presentati come media ± SEM. *=p<0,05; **=p<0,01;
- La Figura 2 mostra una quantificazione del metabolismo ossidativo in NSC in fase di differenziamento in vitro trattate con una composizione secondo forme di realizzazione della presente descrizione. L’analizzatore di flusso extracellulare Seahorse consente la misurazione di diversi parametri bioenergetici mediante iniezione sequenziale di diversi inibitori della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale. L’iniezione di Rotenone e Antimicina-A consente il calcolo dell’OCR non mitocondriale e della respirazione mitocondriale di riferimento. L’iniezione di Oligomicina consente la misurazione della respirazione associata alla sintesi di ATP e la respirazione massima è indotta da FCCP disaccoppiante. I dati sono presentati come media ± SEM. **=p<0,01; ***=p<0,001; ****=p<0,0001;
- La Figura 3 mostra un modello di maturazione neuronale di NSC in fase di differenziamento in vitro integrate con una composizione secondo forme di realizzazione della presente descrizione. I grafici in A e B mostrano l’analisi quantitativa di Neuroni MAP2<+ >a 10 DIV in condizioni di controllo, ALPHA5 0,1%, ALPHA5 0,5% e ALPHA5 1%. I dati sono presentati come media ± SEM. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001; ****=p<0,0001;
- La Figura 4 mostra la maturazione di spine dendritiche e l’espressione di marcatori sinaptici eccitatori in NSC in fase di differenziamento in vitro integrate con una composizione secondo forme di realizzazione della presente descrizione. I dati sono presentati come media ± SEM. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001; ****=p<0,0001; - La Figura 5 mostra il peso degli animali al momento dell’intervento in tre diversi gruppi di esperimenti (BCaa1-SCI, BCaa2-SCI, BCaa3-SCI). I dati sono mostrati come media ± SEM. SCI = lesione del midollo spinale;
- La Figura 6 mostra il risultato dell’analisi del recupero della funzione locomotoria in animali di controllo e trattati dopo SCI grave. Il grafico rappresenta il punteggio BMS di animali trattati con la composizione (linea con triangoli) e di animali di controllo (linea con quadrati) dopo SCI grave. La freccia indica il giorno di inizio della somministrazione della composizione (3 dpi). Topi lesionati hanno ricevuto l’integrazione con la composizione in acqua sterile (n=22 in 3 esperimenti) o solo acqua sterile (topi di controllo, n=25 in 3 esperimenti). I dati sono mostrati come media ± SEM. *p≤0,05, **p≤0,01, ***p≤0,001, ****p≤0,0001. BMS = scala di Basso per topi; dpi = giorni dopo la lesione;
- La Figura 7 mostra un grafico che rappresenta il punteggio del movimento della caviglia in topi di controllo (linea con quadrati) e in topi trattati (linea con triangoli) dopo SCI grave. I dati sono mostrati come media ± SEM. **p≤0,01, *p <0,05. BMS = scala di Basso per topi; dpi = giorni dopo la lesione;
- La Figura 8 mostra un grafico che rappresenta la diuresi giornaliera di topi di controllo (linea con quadrati) e di topi trattati (linea con triangoli) dopo SCI grave. I dati sono mostrati come media ± SEM; dpi = giorni dopo la lesione;
- La Figura 9 rappresenta sezioni immunocolorate di midollo spinale trasversali che mostrano la reazione di cicatrizzazione gliale e l’area Cistica in topi di controllo e trattati dopo SCI grave. Sezioni di midollo spinale trasversali immunocolorate con il marcatore astrocitario specifico GFAP e TO-PRO3<TM >di un topo di controllo (A) e di un topo trattato (B) che illustrano le regioni considerate per le quantificazioni. Sezioni di midollo spinale trasversali immunocolorate con il marcatore astrocitario specifico GFAP e TO-PRO3<TM >di un topo di controllo (C) e trattato (D). L’area tratteggiata in grigio indica l’area di cicatrizzazione gliale. L’area tratteggiata in bianco indica l’area cistica. L’area tratteggiata in bianco e l’area tratteggiata in grigio (delineate con una linea bianca) indicano l’area della lesione totale. (E) Grafico che rappresenta il rapporto in percentuale dell’area cistica rispetto all’area lesionata totale in un topo di controllo e in un topo trattato. (F) Grafico che rappresenta il rapporto in percentuale dell’area di cicatrizzazione gliale rispetto all’area della lesione totale in un topo di controllo e in un topo trattato. I dati quantitativi sono espressi come media ± SEM; *p≤0,05; **p≤0,01. n=3 animali e 8 sezioni/animale sono stati analizzati per ciascun gruppo. GFAP=Proteina Fibrillare Acida della Glia;
- La Figura 10 mostra un grafico che rappresenta il rapporto in percentuale dell’area di cicatrizzazione gliale rispetto all’area della sezione totale in topi di controllo e trattati dopo SCI grave. I dati quantitativi sono espressi come media ± SEM; *p≤0,05. n = 3 animali e 8 sezioni/animale sono stati analizzati per ciascun gruppo;
- La Figura 11 mostra un grafico che rappresenta il numero di cellule NeuN-positive nel midollo spinale di animali trattati e di controllo nell’area perilesionata. I dati sono mostrati come media ± SEM; n=3 animali e 8 sezioni/animali sono stati analizzati per ciascun gruppo. **p <0,01;
- La Figura 12 mostra un grafico che rappresenta il rapporto in percentuale dell’area coperta da Neurofilamento-200 sulla regione di interesse (ROI) scelta in topo trattato e di controllo. I dati quantitativi sono espressi come media ± SEM; SCI= lesione del midollo spinale; n=3 animali e 8 sezioni /animali sono stati analizzati per ciascun gruppo;
- Figura 13: nel riquadro A e B, sezioni trasversali di midollo spinale colorate con Luxol Fast Blue (LFB) rispettivamente di un topo trattato e di controllo. LFB consente l’identificazione del contenuto di mielina nel parenchima del midollo spinale dall’area demielinizzata (area bianca). C) Il grafico rappresenta la percentuale del contenuto di mielina nella colonna dorsale delle sezioni di midollo spinale di topi trattati e di controllo calcolata come pixel mielina-positivi nella colonna dorsale tra i pixel dell’area totale della colonna dorsale. I dati sono mostrati come media ± SEM; n=3 animali e 8 sezioni/animali sono stati analizzati per ciascun gruppo. ns=non significativo. SCI=lesione del midollo spinale.
Descrizione dettagliata di forme di realizzazione preferite
Nella seguente descrizione, vengono forniti numerosi dettagli specifici per fornire una comprensione approfondita di forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o più dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a “un’unica forma di realizzazione” o “una forma di realizzazione” significa che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione è compreso/compresa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni “in un’unica forma di realizzazione” o “in una forma di realizzazione” in vari punti in tutta la presente descrizione non sono necessariamente tutte riferite alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione. I titoli qui forniti sono solo per comodità e non interpretano l’ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
L’Inventore della presente domanda ha sorprendentemente trovato che aggiungendo acidi carbossilici specifici in quantità specifiche a una composizione comprendente una combinazione di leucina, isoleucina, valina, treonina e lisina si verifica un aumento di efficacia nel favorire e aumentare il metabolismo ossidativo in cellule neuronali in fase di differenziamento.
La caratteristica dei neuroni maturi differenziati è la commutazione dalla glicolisi a un metabolismo più ossidativo (Zheng et al., 2016). Per indagare se l’integrazione della composizione qui descritta potesse migliorare questa commutazione metabolica (metabolismo pro-ossidativo) e promuovere il differenziamento neuronale, è stato analizzato l’effetto dell’integrazione della composizione su NSC (cellule staminali neurali) derivate dalla zona sub-ventricolare (SVZ) in fase di differenziamento. Inoltre, per indagare ulteriormente se la composizione qui descritta influenzasse il differenziamento di cellule neuronali e la maturazione di NSC di altra origine, l’analisi è stata estesa alle cellule Gliali Radiali Simili neurogene presenti nelle meningi (Bifari et al., 2017c).
NSC meningee e NSC derivate da SVZ sono state isolate come descritto in precedenza (Bifari et al., 2017) e selezionate, rispettivamente, per l’espressione dei marcatori PDGFRβ e CD133/Prominina-1.
Dopo la coltura, le NSC meningee e le NSC derivate da SVZ sono state espanse come neurosfere e differenziate in neuroni modificando le condizioni dei mezzi (Bifari et al., 2009). I mezzi sono stati integrati con una composizione secondo forme di realizzazione della presente domanda in concentrazione crescente a partire dallo 0,1%, allo 0,5% e all’1%.
La composizione secondo forme di realizzazione della presente domanda ha dimostrato di potenziare la maturazione neuronale in vitro, come descritto nella sezione “Risultati”.
Inoltre, a seguito dei risultati molto promettenti e sorprendenti ottenuti in vitro, l’Inventore ha anche testato l’effetto della somministrazione della composizione su un modello animale preclinico di lesione del midollo spinale (SCI contusiva) completa (grave).
La SCI si traduce in una perdita parziale o totale delle funzioni motorie o sensoriali al disotto del livello della lesione, con conseguenze devastanti per il paziente sia a livello fisico che psicologico.
La composizione qui descritta - comprendente come agente attivo gli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina in combinazione con tre acidi carbossilici, che sono substrati del ciclo dell’acido tricarbossilico, comprendenti acido citrico, acido succinico e acido malico in quantità specifiche - ha dimostrato di essere molto efficace nel contrastare la perdita di tessuto neurale e favorire la rigenerazione neuronale dopo una SCI contusiva completa, cioè una lesione che non ha recupero spontaneo e riflette principalmente la condizione osservata negli esseri umani. Le composizioni qui descritte sono significativamente più efficaci di una composizione di amminoacidi simile ma priva di tali specifici acidi carbossilici.
In una o più forme di realizzazione, nella composizione qui descritta il rapporto in peso tra la quantità totale di acido citrico, acido succinico e acido malico e la quantità totale degli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina è compreso tra 0,05 e 0,3, preferibilmente tra 0,1 e 0,25.
In una o più forme di realizzazione, l’agente attivo può inoltre comprendere uno o più amminoacidi scelti nel gruppo costituito da istidina, fenilalanina, metionina, triptofano, cisteina e tirosina.
In una o più forme di realizzazione, gli acidi carbossilici contenuti nella composizione possono essere costituiti da acido citrico, acido succinico e acido malico.
In un’ulteriore forma di realizzazione, l’agente attivo della composizione qui descritta può anche includere acido aspartico e/o ornitina L-alfa-chetoglutarato (OKG).
Secondo una forma di realizzazione, la composizione comprende un agente attivo, l’agente attivo essendo costituito da leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, istidina, fenilalanina, metionina, triptofano, cisteina e opzionalmente tirosina, nonché acido citrico, acido succinico, e acido malico, detti amminoacidi essendo gli unici amminoacidi contenuti nella composizione. L’acido citrico, l’acido succinico e l’acido malico possono essere gli unici acidi carbossilici contenuti nella composizione.
In un’ulteriore forma di realizzazione, la composizione può comprendere gli amminoacidi isoleucina, leucina e valina in una quantità compresa tra il 35% e il 65% in peso, preferibilmente tra il 42% e il 56% in peso, rispetto al peso dell’agente attivo.
In una o più forme di realizzazione, il rapporto in peso tra leucina e acido citrico è compreso tra 5 e 1, preferibilmente tra 2,50 e 3,50.
In un’ulteriore forma di realizzazione, la quantità in peso o molare di acido citrico è superiore alla quantità in peso o molare di ciascun acido tra acido malico e acido succinico. Preferibilmente, la quantità in peso o molare di acido citrico è superiore alla quantità in peso o molare totale di acido malico più acido succinico. In un’ulteriore forma di realizzazione, il rapporto in peso tra acido citrico e la somma di acido malico e acido succinico è compreso tra 1,0 e 4,0, preferibilmente tra 1,5 e 2,5. In una forma di realizzazione preferita, il rapporto in peso acido citrico:acido malico:acido succinico è compreso tra 10:1:1 e 2:1,5:1,5, preferibilmente tra 7:1:1 e 1,5:1:1, più preferibilmente tra 5:1:1 e 3:1:1. In una forma di realizzazione preferita il rapporto in peso acido citrico:acido malico:acido succinico è 4:1:1.
Secondo alcune forme di realizzazione della presente descrizione, il rapporto molare preferito isoleucina:leucina è compreso nel range 0,2-0,7, preferibilmente nel range 0,30-0,60 e/o il rapporto in peso preferito valina:leucina è compreso nel range 0,2-0,70, preferibilmente nel range 0,30-0,65.
In un’ulteriore forma di realizzazione, il rapporto molare treonina:leucina è compreso nel range 0,10-0,90, preferibilmente nel range 0,20-0,70 e/o il rapporto in peso lisina:leucina è compreso nel range 0,20-1,00, preferibilmente nel range 0,40-0,90. In una forma di realizzazione preferita, il rapporto tra la quantità molare totale di acido citrico, acido malico, acido succinico e la quantità molare totale di metionina, fenilalanina, istidina e triptofano è superiore a 1,35.
In una o più forme di realizzazione, il rapporto in peso tra la somma di acido citrico, acido malico, acido succinico e la somma degli amminoacidi a catena ramificata leucina, isoleucina, valina è compreso tra 0,1 e 0,4, preferibilmente tra 0,15 e 0,35.
In un’ulteriore forma di realizzazione, la quantità in peso totale degli amminoacidi a catena ramificata, leucina, isoleucina, valina più treonina e lisina è superiore alla quantità in peso totale dei tre acidi carbossilici, come acido citrico, acido malico e acido succinico. Preferibilmente, la quantità in peso del singolo acido carbossilico (acido citrico, acido succinico o acido malico) è inferiore alla quantità in peso di ciascuno dei singoli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina e lisina.
In un’ulteriore forma di realizzazione, la quantità molare totale di lisina e treonina è superiore alla quantità molare totale dei tre acidi carbossilici acido citrico, acido succinico, acido malico. Preferibilmente, il rapporto tra la quantità molare totale dei tre acidi carbossilici acido citrico, acido succinico, acido malico e la quantità molare totale di lisina e treonina è compreso tra 0,1 e 0,7, preferibilmente tra 0,15 e 0,55.
In una o più forme di realizzazione, la composizione qui descritta comprende inoltre vitamine, preferibilmente scelte nel gruppo di vitamine B, come vitamina B1 e/o vitamina B6. In un’ulteriore forma di realizzazione della presente descrizione, la composizione può comprendere carboidrati, additivi e/o sostanze aromatizzanti.
In una o più forme di realizzazione, le composizioni qui descritte sono destinate all’uso nel trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale preferibilmente scelte nel gruppo costituito da lesione cerebrale, lesione del midollo spinale, lesione di nervi periferici, malattia demielinizzante. La lesione del midollo spinale può comprendere una lesione contusiva del midollo spinale.
Quando si preparano le composizioni secondo la presente descrizione, e specificamente l’agente attivo, l’amminoacido arginina viene preferibilmente evitato. Inoltre, ulteriori amminoacidi preferibilmente evitati dalla composizione qui descritta possono essere serina, prolina, alanina. Tali amminoacidi possono essere controproducenti o addirittura dannosi in alcune concentrazioni o rapporti stechiometrici all’interno della composizione.
Gli amminoacidi descritti nella presente domanda possono essere sostituiti da rispettivi derivati farmaceuticamente accettabili, cioè sali.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, le composizioni di amminoacidi possono comprendere eccipienti farmaceuticamente accettabili, come ad esempio proteine, vitamine, carboidrati, dolcificanti naturali e artificiali e/o sostanze aromatizzanti. In una forma di realizzazione preferita, gli eccipienti farmaceuticamente accettabili possono essere scelti tra proteine del siero del latte, maltodestrine, fruttosio, caseinato di calcio, olio di pesce, sucralosio, esteri di saccarosio, vitamina D3, vitamine del gruppo B.
Per uso orale, le composizioni secondo la descrizione possono essere sotto forma di compresse, capsule, granuli, gel, polvere gelificabile o polvere.
La composizione qui descritta può essere somministrata a un soggetto in dosaggio/giorno di agente attivo che varia da 8,0 g a 24,0 g.
La descrizione fornisce anche un procedimento per trattare lesioni del sistema nervoso centrale in un soggetto, il procedimento comprendendo la selezione di una composizione comprendente un agente attivo, detto agente attivo contenendo gli amminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, e gli acidi carbossilici acido citrico, acido succinico e acido malico, e la somministrazione della composizione per il trattamento delle lesioni del sistema nervoso centrale.
Ulteriori specificazioni, in termini di quantità e rapporti tra i vari amminoacidi previsti per le composizioni, sono contenute nelle rivendicazioni allegate, che formano parte integrante dell’insegnamento tecnico qui fornito in relazione all’invenzione.
ESEMPI
La Tabella 1 mostra la composizione a base di amminoacidi denominata “alfa 5m (α5m)” testata in vitro e in vivo.
Tabella 1
La composizione α5m può essere preparata dapprima setacciando tutti i componenti con un vaglio da 0,8 mesh. Per ottenere una pre-miscela, ciascun ingrediente (in una quantità <10% in peso della quantità totale) viene messo in una busta di polietilene insieme ad una porzione di L-lisina HCl in modo da ottenere il 10% del peso della composizione totale. La busta viene quindi sbattuta manualmente per 5 minuti. La pre-miscela viene quindi caricata in un miscelatore (Planetaria) insieme al resto degli ingredienti e miscelata per un periodo di 15 minuti a 120 giri al minuto per ottenere una composizione finale omogenea.
PROCEDIMENTI
Coltura cellulare e Trattamenti
Colture cellulari di NSC (Neural Stem Cell, Cellule Staminali Neurali) meningee, NSC derivate dalla zona sub-ventricolare (SVZ), (Neuroni men e Neuroni SVZ) sono state integrate con la composizione α5m (α5m). α5m è stata aggiunta allo specifico mezzo di coltura (0,1%, 0,5%, 1%), quindi il pH del mezzo è stato regolato a 7,4 e il mezzo è stato filtrato prima di essere aggiunto alle diverse colture cellulari. α5m è stata cambiata ogni 2-3 giorni e integrata fino alla maturazione dei Neuroni men e Neuroni SVZ a 10 giorni in vitro (DIV).
Immunofluorescenza della coltura cellulare
In primo luogo, le cellule sono state piastrate su vetrini rivestiti con poli-D-lisina. Dopo una fase di fissazione in paraformaldeide al 4% (PFA, Sigma-Aldrich), i siti di legame aspecifico sono stati bloccati mediante incubazione in soluzione bloccante (3% di siero bovino fetale, 1% di sieroalbumina di bovino, 0,3% di Triton X-100 in PBS 1X). Successivamente, le cellule sono state poste in incubazione in una soluzione di anticorpo primario (anticorpi primari specifici in soluzione bloccante) per 1,5 h a temperatura ambiente, lavate due volte con soluzione bloccante e poste in incubazione nella soluzione di anticorpo secondario specifico (anticorpi secondari specifici in soluzione bloccante) per 1 h. Dopo tre lavaggi in soluzione bloccante, i vetrini sono stati posti in incubazione con il colorante nucleare TO-PRO3 (Thermo Fisher Scientific) per 10 minuti e montati su vetrini per microscopio in vetro per la quantificazione al microscopio confocale (microscopio confocale Zeiss LSM 710). Anticorpo primario: proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2 coniglio, Sigma, 1:200) per marcare i neuroni maturi, TOMM20 (topo, 1:200, Abcam) per marcare i mitocondri. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi secondari: anti-coniglio di asino Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, 1:500), anti-coniglio di capra Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:500).
Animali e procedure chirurgiche
I protocolli sperimentali sono stati approvati e condotti in conformità con la Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE), e il Ministero della Sanità Italiano, e hanno rispettato le Linee Guida Nazionali sulla Protezione degli Animali.
Topi C57BL/6J adulti (7 settimane) di sesso femminile sono stati esposti a laminectomia e la lesione (SCI) contusiva è stata eseguita a livello della vertebra toracica 11 (T11). Sono stati eseguiti tre diversi esperimenti rispettivamente con 18, 20 e 12 animali.
Prima di eseguire ogni intervento chirurgico SCI, tutti gli animali sono stati pesati e solo i topi con un peso compreso in un range di 16-21 g sono stati presi in considerazione per gli esperimenti. I pesi degli animali al momento dell’intervento sono mostrati nella Figura 5.
La procedura di SCI grave, per la difficoltà degli interventi chirurgici eseguiti o per complianze durante il periodo di recupero, ha causato la morte di 1 animale su 50.
Gli animali sono stati alloggiati separatamente in gabbie di polipropilene pulite e divisi in 2 gruppi: 1) gruppo con alimentazione di controllo (CTRL, n=22); 2) gruppo alimentato con α5m (α5m, n=25), cioè il gruppo di animali alimentato con la composizione di amminoacidi mostrata nella Tabella 1.
Valutazione locomotoria
Per valutare gli effetti dell’integrazione con α5m sul recupero delle funzionalità motorie dopo una SCI grave, è stata eseguita l’analisi basata sulla Scala di Basso per Topi (BMS) (Basso et al., 2006). Le prestazioni locomotorie di ciascun topo sono state valutate a 1, 3, 5, 7 dpi (giorni dopo la lesione) durante la prima settimana dopo l’intervento SCI e due volte a settimana (10, 14, 17, 21, 28, 31 dpi) fino alla fine dell’esperimento (31 dpi), quando i topi sono stati perfusi e il midollo spinale è stato dissezionato. Solo i topi che mostravano un punteggio BMS pari a “0” a 1 dpi sono stati inclusi nell’analisi, i topi con un punteggio BMS più alto sono stati esclusi dallo studio.
Analisi del movimento della caviglia
Questo parametro consente di determinare se il trattamento applicato mostra un effetto benefico evitando l’instaurarsi di una condizione spastica dei muscoli legati al movimento dell’articolazione della caviglia. In questa analisi è stato assegnato un punteggio al movimento dell’articolazione della caviglia destra e sinistra in base alla qualità del loro movimento: “0” corrisponde a nessun movimento (condizione spastica) “0,5” a un movimento non completo, e “1” a un movimento normale.
Valutazione della funzionalità della vescica
La diuresi degli animali è stata analizzata partendo da 1 dpi fino alla fine dell’esperimento. Le vesciche venivano vuotate manualmente e l’urina veniva raccolta e pesata due volte al giorno fino a 5 dpi e poi una volta al giorno fino alla fine dell’esperimento.
Istologia tissutale e analisi immunoistochimica
Fissazione e trattamento del midollo spinale
Gli animali sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di cloralio idrato (2,2,2-Tricloroetan-1,1-diolo, 2 ml/kg) e perfusi per via intracardiaca con soluzione salina (NaCl 0,9%) facendo seguire paraformaldeide al 4% (PFA, Sigma-Aldrich) a cui è stato aggiunto saccarosio al 4% in PBS 1X. Il midollo spinale è stato estratto e post-fissato per una notte in 4% PFA/4% saccarosio. Quindi è stato conservato in soluzione di saccarosio al 30% a 4°C per crioproteggere i tessuti. Per l’analisi istochimica, 1,5 cm di midollo spinale dissezionato (0,75 cm rostrale e 0,75 cm caudale dal sito della lesione) sono stati incorporati con il reagente Optimal Cutting Temperature (OCT) compound e criosezionati (sezioni trasversali spesse 25 �m o sezioni longitudinali spesse 20�m). Le sezioni ottenute sono state conservate a -20°C e analizzate con procedimenti istologici e immunoistochimici.
Colorazione con Luxol Fast Blue (Fig.13)
Il contenuto di mielina è stato quantificato nelle sezioni di tessuto mediante colorazione con Luxol Fast Blue (LFB). In primo luogo, una soluzione di LFB allo 0,1% è stata preparata solubilizzando LFB (Sigma-Aldrich) in etanolo al 95% (EtOH, Carlo Erba) e acido acetico glaciale all’1,22% (Carlo Erba). Quindi, le sezioni sono state idratate in soluzioni di EtOH (100%, 95%, 70% e 50%) e colorate con una soluzione di LFB allo 0,1% a 40°C per 40 minuti. Sono state quindi lavate con acqua di rubinetto e differenziate in soluzione di Li2CO3 allo 0,05% (Sigma-Aldrich), disidratate in soluzioni di EtOH (50%, 70%, 95% e 100%), chiarificate in xilene (Carlo Erba) e montate con Entellan (Merck-Millipore) per l’analisi al microscopio ottico del contenuto di mielina (Zeiss Axioscop2).
Analisi del tessuto del midollo spinale
Le criosezioni sono state scongelate, lavate con PBS 1X e poste in incubazione per 30 minuti in soluzione bloccante (0,25% di Triton X-100, 2% di sieroalbumina di bovino in PBS 1X) per bloccare i siti di legame aspecifico. Le sezioni sono state poste in incubazione con una soluzione di anticorpi primari (anticorpi primari specifici in soluzione bloccante) per una notte a 4°C. Dopo aver eseguito il lavaggio 6 volte per 5 minuti in soluzione bloccante, le sezioni sono state poste in incubazione con la soluzione di anticorpo secondario specifico (anticorpi secondari specifici in soluzione bloccante) per 4 ore a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi in soluzione bloccante e tre in PBS 1X, le sezioni sono state poste in incubazione con il colorante nucleare TOPRO3 (Thermo Fisher Scientific) o 4’,6-Diamidin-2-Fenilindolo (DAPI, Thermo Fisher Scientific, 1:2000) per 10 minuti e montati utilizzando 1,4-Diazabiciclo(2.2.2)ottano (DABCO, Sigma-Aldrich) per la quantificazione al microscopio (microscopio confocale Zeiss LSM 710). Anticorpi primari usati: Proteina Fibrillare Acida della Glia (GFAP capra, 1:200, Abcam) per marcare gli astrociti (Fig. 9), Neurofilamento-200 (NF200 coniglio, 1:200, Sigma) per marcare la proteina del neurofilamento 200 KDa del citoscheletro neuronale (Fig. 12), NeuN (NeuN topo, Chemicon, 1:200) per marcare i neuroni (Fig. 11). Anticorpo secondario utilizzato: anti-coniglio di asino Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, 1:500), anti-coniglio di capra Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:500), anti-topo di asino Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:500), anti-topo di capra CY3 (Amersham, 1:500), anti-capra di asino Alexa Fluor 488 (Lifetechnologies, 1:500).
RISULTATI
Analisi in vitro
Contenuto mitocondriale in NSC in fase di differenziamento in vitro Mediante analisi confocale e per immunofluorescenza, è stata valutata l’area coperta dal marcatore mitocondriale TOMM20 in cellule neuronali MAP2-positive.
Il grafico in Figura 1 mostra la quantificazione dell’area mitocondriale (cioè l’area di TOMM20+) per dendrite MAP2+ in neuroni in fase di differenziamento, che dimostra che l’integrazione con α5m è in grado di aumentare il contenuto mitocondriale a una concentrazione dello 0,5%.
Metabolismo ossidativo in NSC in fase di differenziamento in vitro
Il metabolismo ossidativo di cellule NSC in fase di differenziamento è stato valutato analizzando il tasso di consumo di ossigeno (OCR) di Neuroni men e Neuroni SVZ di controllo e trattati con α5m (concentrazione 0,5%) utilizzando la tecnologia Seahorse.
Un aumento statisticamente significativo dell’OCR è stato osservato nei neuroni in fase di differenziamento trattati con la composizione α5m (Figura 2A) e, di conseguenza, un aumento della respirazione basale e massima come mostrato nella Figura 2B e C.
E’ interessante osservare che la produzione di ATP è raddoppiata (Neuroni men: da 125,1 a 280,1 pmol/min/ug, Figura 2D; Neuroni SVZ: da 156,1 a 523,0 pmol/min/ug) indicando più energia a disposizione.
In linea con i risultati precedenti, quindi, è stato osservato un aumento della funzionalità mitocondriale per le cellule trattate con la composizione della presente domanda.
Arborizzazione dendritica di cellule NSC in fase di differenziamento
I Neuroni men e i Neuroni SVZ hanno mostrato un aumento del metabolismo ossidativo e dell’attività mitocondriale dopo l’integrazione con α5m. Per confrontare la maturazione neurale di NSC meningee e derivate da SVZ in condizioni di controllo e con integrazione, neurosfere sono state indotte a differenziarsi in neuroni e sono stati analizzati i cambiamenti morfologici mediante analisi per immunofluorescenza e confocale per il marcatore neuronale MAP2, a 10 DIV.
Mentre l’integrazione con α5m non ha modificato la percentuale di cellule in fase di differenziamento MAP2<+>, è stato osservato un aumento significativo della morfologia neuronale matura, includente lo sviluppo di ramificazioni e spine dendritiche (Fig.3 e Fig.4).
Analizzando la morfologia delle cellule MAP2<+ >ramificate, è stato osservato un aumento statistico del numero medio di ramificazioni (cioè il segmento MAP2<+ >compreso tra due punti di giunzione)/cellula in Neuroni men con integrazione allo 0,5% (da 15,07 a 18,55 ramificazioni, Fig.3A), e una tendenza simile è stata osservata anche nei Neuroni SVZ con integrazione allo 0,5% (da 15,27 a 17,07 ramificazioni).
L’aumento del numero medio di ramificazioni era in linea con l’aumento statistico della lunghezza dendritica totale, in entrambe le popolazioni trattate con la composizione α5m (Neuroni men: da 301,6 a 458,6 μm Fig.3B; Neuroni SVZ: da 225,5 a 285,2 �m). Questi dati suggeriscono un aumento della complessità cellulare e una maggiore copertura di dendriti dopo l’integrazione con la composizione α5m.
Al fine di caratterizzare ulteriormente l’aumento della maturazione neuronale in neuroni sottoposti a integrazione con α5m, sono stati valutati il numero e la densità di spine dendritiche per ogni condizione sperimentale utilizzando il software ImageJ. Il numero di spine dendritiche aumenta progressivamente in neuroni sottoposti a integrazione allo 0,5% (Neuroni men: da 119,6 a 198,2 spine/neurone MAP2+ Fig.4A; Neuroni SVZ da 109,2 a 152,0 spine/neurone MAP2+). La morfologia specifica delle spine è stata analizzata utilizzando il software Neuron Studio (Rodriguez et al., 2008). Le spine dendritiche di neuroni maturi modificano la morfologia da spine sottili allungate a spine tozze e fungiformi più stabili.
Nei Neuroni men è stato osservato un aumento di spine tozze con una concentrazione dello 0,1% e 0,5% della composizione α5m (rispettivamente dal 36,15% al 48,62% e 47,56%) e nei neuroni SVZ un aumento della frazione di spine fungiformi allo 0,1% e 0,5% (rispettivamente dal 22,81% al 28,58% e 29,03%).
Questi dati suggeriscono che le spine dendritiche nei Neuroni men e nei Neuroni SVZ trattati con la composizione α5m acquisiscono una morfologia stabile (cioè rispettivamente tozza e fungiforme) confermando l’effetto del trattamento con la composizione α5m nel potenziamento della maturazione neuronale.
Per confermare la maturazione dei neuroni in fase di differenziamento, la presenza di sinapsi è stata valutata analizzando l’espressione di marcatori eccitatori pree post-sinaptici Sinaptofisina e PSD95, in neuroni di controllo e integrati con α5m utilizzando il software ImageJ (Dzyubenko et al., 2016).
Il numero di punti immunoreattivi alla Sinaptofisina (Figura 4B), così come il numero di punti immunoreattivi a PSD95 (Figura 4C) è aumentato nei neuroni sottoposti a integrazione rispetto al controllo.
Questi risultati confermano l’incremento della maturazione di neuroni trattati con α5m rispetto al controllo; tali neuroni presentano, infatti, un maggior numero di ramificazioni, di spine mature e marcatori sinaptici, per effetto di un potenziamento del metabolismo ossidativo in fase di differenziamento.
Analisi in vivo
Topi C57BL/6J adulti di sesso femminile sono stati esposti a laminectomia e la lesione contusiva è stata eseguita a livello della vertebra toracica 11 (T11). La procedura di SCI grave, per la difficoltà degli interventi chirurgici eseguiti o complicanze durante il periodo di recupero, ha causato la morte di 1 animale su 50.
La supplementazione con la composizione α5m (3 g/giorno in acqua potabile) è avvenuta mediante somministrazione della stessa tre giorni dopo SCI (3 dpi). Questo approccio terapeutico inizia approssimativamente alla fine della fase sub-acuta della patogenesi legata alla SCI. L’integrazione è stata mantenuta per 31 giorni. Sono stati confrontati il recupero locomotorio e l’istologia tissutale di animali trattati e di controllo.
Valutazione locomotoria
Per valutare gli effetti dell’integrazione con α5m sul recupero delle funzionalità motorie dopo una SCI grave, è stata eseguita l’analisi basata sulla Scala di Basso per Topi (BMS). Le prestazioni locomotorie di ciascun topo sono state valutate a 1, 3, 5, 7 dpi durante la prima settimana dopo l’intervento SCI e due volte a settimana (10, 14, 17, 21, 28, 31 dpi) fino alla fine dell’esperimento (31 dpi), quando i topi sono stati perfusi e il midollo spinale è stato dissezionato. Solo i topi che mostrano un punteggio BMS pari a “0” a 1 dpi sono stati inclusi nell’analisi; i topi con punteggio BMS più alto sono stati esclusi dallo studio.
Il grafico di Fig. 6 rappresenta il punteggio BMS di animali trattati con la composizione α5m (linea superiore con i triangoli) e di controllo (linea inferiore con i quadrati) dopo SCI grave. La freccia indica il giorno di inizio della somministrazione della composizione α5m (3 dpi). Ai topi lesionati è stata somministrata la composizione α5m in acqua sterile (n=22 in 3 esperimenti) o solo acqua sterile (n=25 in 3 esperimenti).
Il punteggio BMS dei topi trattati aumenta gradualmente e significativamente rispetto ai topi SCI di controllo nei 28 giorni di somministrazione.
A 31 dpi, i topi trattati hanno raggiunto un punteggio BMS medio di 1,773 ± 0,2434 mentre il gruppo di controllo ha raggiunto un punteggio BMS medio di 0,92 ± 1,772 (le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate con test ANOVA a 2 vie e post-test post-hoc di Tukey).
Pertanto, i topi trattati con la composizione α5m hanno mostrato un miglioramento significativo nel recupero locomotorio rispetto ai topi di controllo. Come mostrato nella Figura 6, l’analisi post-hoc ha rivelato significative differenze tra i gruppi nel punteggio BMS a 14, 17, 21, 24, 28, 31 dpi.
Analisi del movimento della caviglia
Per “spasticità” si intende un sintomo comune derivante da una lesione (Adam e Hick, 2005) ed è una delle principali cause di disabilità in individui affetti da una varietà di malattie del sistema nervoso centrale (come sclerosi multipla, ictus e paralisi cerebrale) e trauma (tra cui SCI e lesione cerebrale).
Per determinare se l’integrazione con la composizione α5m avesse un effetto nell’evitare l’instaurarsi di una condizione spastica dei muscoli, è stato valutato il grado di movimento dell’articolazione della caviglia. La spasticità di ciascun topo trattato e di controllo è stata valutata giornalmente partendo da 21 dpi fino alla fine dell’esperimento (31 dpi), Figura 7.
La flessibilità dell’articolazione della caviglia degli animali trattati mostra un miglioramento significativo rispetto a quella di controllo. A 31 dpi, il movimento della caviglia presentato dagli animali trattati era di 0,6888 ± 0,0455, mentre per il controllo era di 0,5939 ± 0,0651 (le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate con il test ANOVA a 2 vie e il post-test post-hoc di Tukey).
I topi trattati con la composizione α5m hanno quindi mostrato un movimento della caviglia significativamente maggiore rispetto ai topi di controllo da 21 dpi a 29 dpi, indicando un recupero più rapido dalla spasticità muscolare dopo la lesione.
Valutazione della funzionalità della vescica
Uno degli effetti più comuni dopo una SCI è la disfunzione dell’attività della vescica. Dopo una SCI, la vescica, di solito indicata come vescica neurogena, subisce cambiamenti drammatici che si traducono in una vescica spastica o flaccida (Taweel W.A et al., 2015). Per indagare se, dopo una SCI grave, la somministrazione della composizione α5m potesse esercitare un ruolo benefico nel recupero della funzionalità della vescica, è stata analizzata la diuresi giornaliera di topi di controllo e trattati con la composizione α5m.
Gli animali di controllo e gli animali trattati con la composizione α5m hanno mostrato, durante l’esperimento, una diuresi giornaliera simile (Figura 8). A 31 dpi, il gruppo trattato ha mostrato una diuresi giornaliera media di 0,6359 g ± 0,1073 g mentre il gruppo di controllo di 0,5889 g ± 0,1145 g, il che fornisce quindi la prova dell’effetto della composizione α5m nel recupero della funzionalità della vescica dopo la lesione.
Istologia tissutale
Insulti traumatici al midollo spinale portano a danni meccanici e conseguente degenerazione dei tessuti. Questi eventi sono associati alla recisione delle membrane cellulari e degli assoni, alla rottura della barriera sangue-midollo spinale, alla degradazione della mielina, alla trasmigrazione delle cellule immunitarie e alla morte delle cellule del midollo spinale (Zhang et al., 2012). Per indagare come il trattamento con la composizione α5m contribuisca alla rigenerazione del tessuto leso, sono stati analizzati: la formazione di cicatrice gliale e cistica (cisti) del parenchima del midollo spinale, numero neuronale, contenuto di mielina.
Formazione di cicatrice gliale e cistica
Dopo la SCI, la formazione di una cicatrice gliale e di una formazione cistica (Hu R et al., 2010, Yi-Min Yuan e Cheng He, 2013) intorno al sito della lesione contribuiscono a limitare l’area lesionata. Tuttavia, questo inibisce la rigenerazione assonale dopo una SCI (Rooney GE et al., 2009) agendo come barriera fisica e molecolare (Fehlings M.G. e Tator C.H., 1999).
Considerando l’importanza della risposta delle cellule gliali alla lesione, l’Inventore della presente domanda ha valutato se la somministrazione della composizione α5m avesse un ruolo sulla formazione di una cicatrice e sulla reazione degli astrociti. È stata eseguita una colorazione a immunofluorescenza utilizzando il marcatore specifico per astrociti, Proteina Fibrillare Acida della Glia (GFAP). Sono state osservate sezioni trasversali del midollo spinale che coprono un segmento del parenchima di 1,5 cm di lunghezza (15 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) al centro del sito della lesione (lesione eseguita a livello della vertebra T11).
La Fig. 9 mostra sezioni trasversali di midollo spinale immunocolorate con il marcatore astrocitario specifico GFAP e TO-PRO3<TM >di un topo di controllo (A, C) e di un topo trattato con la composizione α5m (B, D), illustrando le regioni considerate per le quantificazioni. L’area tratteggiata in grigio indica l’area di cicatrizzazione gliale. L’area tratteggiata in bianco indica l’area cistica (cisti). Come mostrato nel riquadro E, la somministrazione della composizione qui descritta ha portato a una significativa riduzione dell’area cistica (21,62 ± 2,505%) rispetto al controllo (42,94% ± 3,249). Il riquadro F mostra che, dopo la somministrazione della composizione α5m, gli animali mostravano un’area di cicatrizzazione gliale significativamente più grande (78,81% ± 2,232%) rispetto al controllo (57,06% ± 3,294%).
La Fig.10 mostra un grafico che rappresenta il rapporto in percentuale dell’area di cicatrizzazione gliale rispetto all’area della sezione totale in topo di controllo e trattato con α5m. Dopo il trattamento con α5m, gli animali hanno mostrato un’area cistica significativamente più piccola (3,55% ± 0,6756%) rispetto agli animali di controllo (7,2% ± 0,77068%).
Questi dati evidenziano l’elevata efficacia della composizione qui descritta nel contrastare la perdita di tessuto neurale dopo una lesione.
Contenuto neuronale
La degenerazione del tessuto del midollo spinale dovuta alla prima lesione meccanica è seguita da un insulto secondario che determina un’ulteriore distruzione delle cellule neuronali (Zhang N. et al., 2012).
Per indagare gli effetti del trattamento con la composizione α5m sul contenuto neuronale dopo una SCI grave, l’Inventore ha valutato il numero di neuroni nel parenchima lesionato del midollo spinale mediante colorazione a immunofluorescenza con il marcatore neuronale specifico NeuN. Sono state analizzate le sezioni trasversali del midollo spinale, che coprono un segmento di parenchima di 1,5 cm di lunghezza (15 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) al centro del sito della lesione (lesione eseguita a livello della vertebra T11).
Prima di tutto, è stato valutato il numero di cellule NeuN-positive nell’intera sezione di midollo spinale. Sorprendentemente, l’analisi ha mostrato che nella zona perilesionata, nel gruppo trattato con α5m erano presenti più neuroni (613,3 ± 24,04) rispetto al gruppo di controllo (224,9 ± 58,03) e la differenza era statisticamente significativa (Fig. 11).
L’Inventore ha anche valutato se la differenza nel contenuto neuronale fosse mantenuta anche nell’area ventrale delle sezioni di midollo spinale, dove si trovano i motoneuroni. Anche in questo caso, il numero di cellule NeuN-positive è risultato significativamente più alto nel gruppo trattato con α5m (255,8 ± 12,35) rispetto al gruppo di controllo (62,66 ± 13,51). La differenza era statisticamente significativa fornendo così la prova dell’effetto delle composizioni qui descritte nel recupero del contenuto neuronale dopo la lesione.
Analisi dei neurofilamenti
Le principali proteine strutturali negli assoni dei neuroni maturi sono i neurofilamenti (NF). La loro espressione è strettamente associata alla crescita assonale e al mantenimento dell’omeostasi neuronale (Wang H. et al., 2012). Dopo la SCI, la perdita neuronale nella materia grigia è accompagnata da una perdita di proteine della mielina e della catena dei neurofilamenti (Qian J. et al., 2010).
Per indagare la presenza di ricrescita assonale in topi SCI trattati con la composizione α5m, l’Inventore ha eseguito una colorazione a immunofluorescenza utilizzando il marcatore specifico per le proteine dei neurofilamenti, Neurofilamento-200 (NF200). Per l’analisi, l’Inventore ha preso in considerazione sezioni longitudinali di midollo spinale che coprono un’area del parenchima di 1,5 cm di lunghezza (6 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) al centro del sito della lesione (lesione eseguita a livello della vertebra T11). Il grafico mostrato in Figura 12 rappresenta il rapporto in percentuale dell’area coperta dalla marcatura per Neurofilamento-200 sulla regione di interesse (ROI) scelta in un topo trattato con α5m e in un topo di controllo.
Il gruppo trattato mostra una tendenza a un più alto contenuto di NF200 (23,56 ± 6,441%) rispetto al gruppo di controllo (16,22 ± 3,31%; Fig.12).
Questi risultati mostrano la capacità della composizione α5m nel favorire la ricrescita assonale dopo la lesione.
Potenziale di rimielinizzazione
La demielinizzazione costituisce una componente significativa della patologia legata a una SCI e contribuisce alla perdita di funzione (Waxman SG et al., 1989). Per valutare il potenziale di rimielinizzazione a seguito dell’integrazione con la composizione α5m su topi dopo una SCI grave, è stata eseguita la colorazione con Luxol Fast Blue (LFB). LFB consente l’identificazione del contenuto di mielina nel parenchima del midollo spinale (area blu), dall’area demielinizzata (area bianca), come mostrato in Fig. 13. L’analisi è stata condotta su sezioni trasversali di midollo spinale che coprono un segmento di parenchima di 1,5 cm di lunghezza (15 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) al centro del sito della lesione (lesione eseguita a livello della vertebra T11). Il grafico di Fig. 13 rappresenta la percentuale del contenuto di mielina nella colonna dorsale delle sezioni di midollo spinale di animali trattati con α5m (39,64% ± 0,3677) e di controllo (38,47% ± 0,8927), calcolata come pixel mielinapositivi nella colonna dorsale tra i pixel dell’area totale della colonna dorsale. A 31 dpi, gli animali che avevano ricevuto l’integrazione con α5m presentavano un contenuto di mielina simile rispetto agli animali di controllo, fornendo così la prova del potenziale di rimielinizzazione della composizione α5m dopo SCI grave.
I risultati forniti nella presente descrizione dimostrano che le composizioni di amminoacidi qui descritte, comprendenti una combinazione di leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, con acido citrico, acido succinico e acido malico, sono in grado di potenziare il metabolismo ossidativo in neuroni in fase di differenziamento, favorendo la ricrescita assonale dopo una lesione e di contrastare la perdita di tessuto neurale in un modello animale di SCI.
Da quanto precede, emerge chiaramente come le composizioni secondo la presente descrizione siano utili per il trattamento di lesioni del sistema nervoso centrale in un soggetto, in cui le lesioni sono preferibilmente scelte nel gruppo costituito da lesione cerebrale, lesione del midollo spinale, lesione di nervi periferici, una malattia demielinizzante.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizione per l’uso nel trattamento di una lesione del sistema nervoso centrale in un soggetto, la composizione comprendendo un agente attivo, detto agente attivo contenendo gli aminoacidi leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina e gli acidi carbossilici acido citrico, acido succinico, acido malico.
- 2. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui il rapporto in peso tra la quantità totale di acido citrico, acido malico, acido succinico e la quantità totale di leucina, isoleucina, valina, lisina, treonina è compreso tra 0,05 e 0,3, preferibilmente tra 0,1 e 0,25.
- 3. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui il rapporto in peso tra la quantità totale di acido citrico, acido malico, acido succinico e la quantità totale di leucina, isoleucina, valina è compreso tra 0,1 e 0,4, preferibilmente tra 0,15 e 0,35.
- 4. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il rapporto in peso tra acido citrico e la somma di acido malico e acido succinico è compreso tra 1,0 e 4,0, preferibilmente tra 1,5 e 2,5.
- 5. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il rapporto in peso acido citrico:acido malico:acido succinico è compreso tra 10:1:1 e 2:1,5:1,5, preferibilmente tra 7:1:1 e 1,5:1:1, più preferibilmente tra 5:1:1 e 3:1:1.
- 6. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto agente attivo comprende inoltre almeno un amminoacido scelto nel gruppo costituito da istidina, fenilalanina, metionina, triptofano, tirosina, cisteina.
- 7. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto agente attivo comprende inoltre istidina, fenilalanina, metionina, triptofano, cisteina e opzionalmente tirosina.
- 8. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il rapporto tra la quantità molare totale di acido citrico, acido malico, acido succinico e la quantità molare totale di metionina, fenilalanina, istidina e triptofano è superiore a 1,35.
- 9. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il rapporto tra la quantità molare totale dei tre acidi carbossilici acido citrico, acido succinico, acido malico e la quantità molare totale di lisina e treonina è compreso tra 0,10 e 0,70 preferibilmente tra 0,15 e 0,55.
- 10. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la quantità in peso o molare di acido citrico è superiore alla quantità in peso o molare totale di acido malico e acido succinico.
- 11. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il rapporto in peso tra leucina e acido citrico è compreso tra 5 e 1, preferibilmente tra 2,50 e 3,50.
- 12. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la composizione comprende inoltre una o più vitamine, preferibilmente scelte nel gruppo di vitamine B, più preferibilmente vitamina B1 e/o vitamina B6.
- 13. Composizione per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12, in cui la lesione del sistema nervoso centrale è scelta nel gruppo costituito da lesione cerebrale, lesione del midollo spinale, lesione di nervi periferici, malattia demielinizzante.
- 14. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 13, in cui la lesione del midollo spinale comprende una lesione contusiva del midollo spinale.
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