KR101800040B1 - 릴랙신을 사용한 아쿠아포린의 조절 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 아쿠아포린 채널의 조절 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 릴랙신을 투여하는 것에 의한, 포유동물 조직에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법을 제공한다.

Description

릴랙신을 사용한 아쿠아포린의 조절{MODULATING AQUAPORINS WITH RELAXIN}

본 개시내용은 아쿠아포린(aquaporin) 채널의 조절 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 릴랙신(relaxin)을 투여하는 것에 의한 포유동물 조직에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법을 제공한다.

아쿠아포린 패밀리

아쿠아포린류는 6개의 막횡단 나선을 특징으로 하며, 삼투 구배에 따라 물 또는 기타 소형의 비변경 분자들을 선택적으로 통과시키는, 소형 (24-30 kDa) 세공-형성 통합형 막단백질의 족이다. 이들 단백질은 4량체를 형성하며, 각 단량체는 하나의 세공을 한정한다. 아쿠아포린 단백질 패밀리는 처음에는 지금은 AQP0로 지칭되고 있는 포유동물 수정체의 주요 내재 단백질(major intrinsic protein) (MIP)에 따라 명명되었다. MIP 동족체가 최종적으로 물 채널로서 기능하는 것으로 판명되었을 때, 이 패밀리에 대하여 아쿠아포린이라는 명칭이 채택되었다. 아쿠아포린 패밀리는 고세균, 진정세균, 진균, 식물 및 동물을 포함한 모든 계에 전형을 가지고 있다. 배타적인 물 투과성을 가지는 MIP 동족체들은 아쿠아포린으로 지칭되는 반면, 물- 및 글리세롤-투과성 동족체들은 아쿠아글리세로포린으로 지칭된다. 척추동물에서는, 지금까지 인간 단백질 AQP0-AQP10에 상응하는 11종의 상이한 아쿠아포린이 확인되었다. 이들 중, 7종의 아쿠아포린 (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 및 AQP8)이 포유동물에서 물 수송을 촉진하는 고전적인 아쿠아포린으로 특성화 되어 있다. 다른 4종의 아쿠아포린 (AQP3, AQP7, AQP9 및 AQP10)은 포유동물에서 글리세롤 수송을 촉진하며, 그에 따라 GLP 하위패밀리로 지정되어 있다. 추가적인 아쿠아포린이 이. 콜라이(E. coli), 효모 및 식물에서 확인된 바 있다 (문헌 [Kruse et al . (2006) Genome Biology 7(2)(206):l-6]).

널리 기술되어 있는 아쿠아포린 패밀리의 첫 번째 구성원은 인간 적혈구 막의 채널-형인 통합형 막 단백질이었다. 이 단백질은 원래는 28 kDa 단백질인 CHIP28로 알려져 있었다. 기능 분석을 바탕으로, 이 단백질은 나중에 아쿠아포린-1 (AQP1)으로 재명명되었다. 아쿠아포린-1 (AQP1)의 1차 단백질 서열을 사용한 실험은 5개의 루프 (루프 A-E)에 의해 연결된 6개의 막횡단 나선 (I-VI)을 예상하였다. 루프 A, C 및 E는 세포외이고, 루프 B 및 D는 세포내이다. 또한, 상기 단백질은 단백질의 대략 아미노- 및 카르복시-말단 절반을 포괄하는 2개의 내부 직렬 반복부를 포함한다. 각 반복부는 3개의 막횡단 나선, 및 제2 막횡단 나선에 이어지는 고도로 보존된 루프 (각각 루프 B 및 E)로 구성된다. 상기 루프는 보존된 신호 모티프인 아스파라긴-프롤린-알라닌 ( NPA )를 포함한다. 루프 B 및 E는 막으로 접혀 들어가는 짧은 α 나선을 형성하는데, 루프 B는 세포질 측으로부터 막으로 진입하며, 루프 E는 세포외 측으로부터 진입한다. 이에 따라, 2개의 NPA 박스가 서로 180도로 배향되는 제7의 막횡단 도메인이 형성됨으로써, 단백질성 세공을 통하여 여러 경로를 생성시킨다. 모든 아쿠아포린이 구조적으로 관련되어 있으며, 특히 세공-형성 도메인에는 매우 유사한 공통 영역을 가지고 있기 때문에, 유사한 수송 기작의 가능성이 있다. 루프 B 및 E에 의해 생성되는 소수성 도메인은 기질 특이성 및/또는 크기 제한과 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다. 아쿠아포린 단량체를 통하는 경로는 단일-종렬(single-file) 수소-결합된 물 분자 사슬 형태인 물의 빠른 수송을 가능케 하는 보존된 소수성 잔기들을 따라 정렬되어 있다. 세공은 2개의 협착 부위를 함유하는데, 즉, 보존된 아르기닌 잔기 (Arg195)를 포함하는 방향족 영역이 세공의 가장 좁은 부분을 형성하는 동시에, 고도로 보존된 NPA 모티프들이 단일 물 분자가 2개의 아스파라긴 측쇄와 상호작용하는 제2의 필터를 형성한다. 물 분자와 NPA 모티프 사이에는 직접적인 상호작용이 존재하기 때문에, 쌍극 물 분자는 세공을 통한 통과 동안 180도 회전한다. 양 필터 영역은 정전기 장벽을 구축하는데, 이는 양성자의 투과를 방지한다. 인간 AQP1에서는, 소수성인 페닐알라닌 측쇄 (Phe24)가 세공으로 돌출하여, 단일 투과 물 분자의 NPA 루프와의 상호작용을 강화한다. 사실상, Phe24는 크기-배제 필터로 작용함으로써, AQP1을 통한 글리세롤과 같은 더 큰 분자의 통과를 방지한다. 인간 아쿠아포린에 대한 물 투과도는 AQP0 경우의 0.25×10^-14 cm³/초 내지 AQP4 경우의 24×10^-14 cm³/초 사이인 것으로 추정된다. 그러나, 아쿠아포린은 서로 다른 조직, 기관 및 발생 단계에서는 삼투조절 및 막횡단 물 이동을 위한 서로 다른 요건을 가지는 것으로 여겨진다. 포유동물에서, 아쿠아포린은 고속의 물 흐름을 필요로 하는 상피, 예컨대 신장의 집합관, 폐의 모세관, 및 타액선의 분비 세포에 위치된다. 또한, 포유동물 아쿠아포린은 그의 전사 조절, 전사-후 조절 및 세포하 분포에 있어서 서로 다르다 (문헌 [Kruse et al.] (상기)).

부종

부종은 해당 조직 내에 과도한 액체가 축적되는 경우에 발생하는 조직의 팽창이다. 부종은 전신성 질환, 즉 신체의 여러 기관 시스템에 영향을 주는 질환의 증상이다. 그것은 영향을 받은 사지와만 관련되는 국소적 이상에 의해 야기될 수 있다. 말초 부종에서, 팽창은 간질 공간 또는 사이질로도 알려져 있으며 결합 조직으로 이루어진 피부 아래 조직 내 공간에서의 너무 많은 액체 축적의 결과이다. 세포의 외부에서 발견되는 대부분의 체액은 보통 혈관 및 간질 공간에 저장되어 있다. 다양한 질환 및 소정의 이상하에서는, 이러한 구획 중 어느 하나 또는 양자에 과도한 액체가 축적될 수 있다. 부종을 야기하는 가장 보편적인 국소 이상은 정맥류 및 혈전정맥염, 즉 하지 심정맥의 정맥 염증이다. 이러한 이상은 정맥에 의한 혈액의 부적절한 펌핑으로 이어질 수 있으며, 이는 다시 정맥 부전증으로 이어진다. 결과적인 정맥에서의 증가된 역류압은 액체를 사지, 특히 발목 및 발에 머무르도록 강제한다. 이후, 과량의 액체가 간질 공간으로 누출됨으로써, 부종을 야기한다. 팽창이 하지와 같은 특정 영역으로 제한될 수 있기는 하지만, 신체의 여러 영역에 걸쳐 그것이 확산될 수도 있다. 전신성 부종은 가장 보편적으로는 심장, 간 및 신장 질환과 연관된다. 그것은 주로 신체가 너무 많은 염분, 즉 염화나트륨을 보유하기 때문에 발생한다. 과도한 염분은 신체가 물을 보유하도록 한다. 이와 같은 물은 이후 간질 공간으로 누출되고, 거기에서 부종으로 나타난다.

일반적으로, 부종은 팽창 조직의 위치에 의해 분류된다. 주로 하지의 팽창인 말초 부종; 폐에서의 액체의 축적인 폐 부종; 눈 주변의 팽창인 눈주위 부종; 각막에서의 액체 보유인 안구 부종; 뇌 조직의 팽창인 대뇌 부종; 복수 (복부에서의 과도한 액체); 신체의 많은 부분을 포괄하는 팽창인 대량 부종 (즉 전신부종) 등과 같은 수많은 예들이 존재한다. 팽창될 수 있는 다른 신체 위치에는 잇몸, 임파선, 안면, 복부, 유방, 음낭, 간, 및 관절이 포함된다. 부종의 징후 및 증상은 조직의 위치 및 팽창의 정도에 따라 달라진다. 많은 유형의 부종에서, 액체는 피하에 축적됨으로써, 팽창을 야기하고, 위에 놓인 영역을 신장시켜 광택화한다. 부종은 오목성(pitting) 또는 비-오목성일 수 있다. 오목성 부종에서는, 팽창된 영역을 손가락으로 눌러 그것을 제거하게 되면, 그것은 천천히 사라지는 만입부를 남기게 된다. 부종이 더욱 중증이 되면, 조직이 너무 많이 팽창하여 제거될 수 없게 되고, 비-오목성 부종에서와 같이, 압력 적용 후 피부에 만입부가 남지 않는다. 신체 골 영역상의 압점상에서 발생하는 부종은 특히 누워만 있는 환자에서 중증의 욕창 또는 궤양으로 발전될 수 있다.

부종은 그 자체가 신장, 간 및 심장 질환과 같은 수종의 다른 잠재적인 질환과 연관된 증상인 것으로도 알려져 있다. 따라서, 부종은 중증의 예후를 가지는 장애의 장기간이며 진행성인 표시일 수 있다. 예를 들면, 폐 부종은 심부전의 합병증일 수 있다. 심장이 덜 효율적으로 펌핑할 때, 액체는 폐의 정맥으로부터 누출되어 폐포의 기낭(air sac)에 충진됨으로써, 그것이 호흡하기 어렵게 한다. 폐 부종은 생명을 위협하게 될 수 있으며, 치료되지 않고 방치될 경우, 빠르게 사망으로 이어질 수 있다. 폐 부종의 증상에는 호흡곤란, 호흡시의 그렁거림, 청진기로 분별가능한 폐에서의 탁탁거리고 달그락거리는 소음 (수포음), 쌕쌕거림, 불안, 안절부절, 기침, 과도한 발한, 비정상적으로 창백한 피부 (창백), 비정상적인 심박동 또는 율동, 및 흉부 통증이 포함된다. 그러나, 폐 부종으로는 이어지지 않을 수 있는 덜 중증인 심부전을 가지는 환자도 역시 그의 하지에서는 심각한 팽창을 겪을 수 있다. 부종은 또한 만성 폐 질환에 의해 야기될 수도 있다. 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐기종 또는 만성 기관지염과 같은 중증의 만성 폐 질환은 폐의 혈관에서 혈류를 제한할 수 있다. 제한된 혈류는 혈관에 압력을 생성시키며, 그것은 나머지 순환계 전체에 걸쳐 밀릴 수 있다. 이와 같은 압력은 다시 주변 조직으로 액체가 누출되도록 함으로써, 예컨대 하지 및 발에서 팽창, 즉 부종을 야기한다.

추가적인 부종의 원인으로는 정맥류 (하지에서의 혈액 저류의 결과로서); 기립성 부종에서와 같은 다리뻗고 앉기 또는 서기 (예컨대 더운 날씨, 장시간의 비행기 및 자동차 탑승의 결과로서); 소정 의약 (예컨대 에스트로겐 또는 프로게스테론을 함유하는 경구 피임제, 혈압 의약, 소정 항우울제, 경구 코르티코스테로이드, 테스토스테론); 임신 (전자간증으로 인한 것일 수 있는 하지에서의 증가된 혈압의 결과로서); 알레르기 반응; 일광화상; 영양실조; 손상 또는 외상; 림프계에서의 차단 (예컨대 감염, 염증 또는 암에 의해 야기됨); 고소 부종에서와 같은 고소에의 노출; 일부 여성에서의 월경과 연관된 호르몬 변화; 신증후군 (여기에서는 손상된 신장이 소변으로 과량의 단백질을 상실함으로써, 발목에서의 중증 팽창으로 이어짐); 및 중증의 간 질환 (경화 및 과도한 발목 팽창으로 이어짐)이 있다.

부종이 종종 또 다른 잠재적인 이상의 증상이기 때문에, 부종에 있어서의 위험 인자는 잠재 이상에 있어서의 것과 동일하다. 따라서, 신장, 간, 심장 및 폐 질환에서와 동일한 위험 인자가 부종에 적용된다. 예를 들면, 흡연은 만성 폐 질환에 있어서의 주요 위험 인자이며, 고혈압은 심장 질환에 있어서의 주요 위험 인자이고, 비만은 심장 질환 및 당소변병 모두에 있어서의 주요 위험 인자이다. 이들 위험 인자 모두는 대상체가 부종을 발병할 위험성도 증가시킨다. 또한, 부종은 연령이 더 높은 개체에서 더 보편적으로 발생하는데, 부종의 많은 잠재적인 원인들이 더 고령인 군집에서 더 빈번하게 발생하기 때문이다.

[바람직한 실시양태의 개요]

본 개시내용의 일 측면은 포유동물의 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 릴랙신을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법을 제공한다. 상기 아쿠아포린의 발현은 아쿠아포린 유전자의 발현 및/또는 아쿠아포린 단백질의 발현일 수 있다. 아쿠아포린 유전자 및 단백질 발현 모두는 상향-조절 또는 하향-조절될 수 있다. 일 실시양태에서, 아쿠아포린 채널 유전자에는 아쿠아포린-0 유전자 (aqp0), 아쿠아포린-1 유전자 (aqp1), 아쿠아포린-2 유전자 (aqp2), 아쿠아포린-3 유전자 (aqp3), 아쿠아포린-4 유전자 (aqp4), 아쿠아포린-5 유전자 (aqp5), 아쿠아포린-6 유전자 (aqp6), 아쿠아포린-7 유전자 (aqp7), 아쿠아포린-8 유전자 (aqp8), 아쿠아포린-9 유전자 (aqp9) 및 아쿠아포린-10 유전자 (aqp10)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 아쿠아포린 채널에는 아쿠아포린-0 (AQP0), 아쿠아포린-1 (AQP1), 아쿠아포린-2 (AQP2), 아쿠아포린-3 (AQP3), 아쿠아포린-4 (AQP4), 아쿠아포린-5 (AQP5), 아쿠아포린-6 (AQP6), 아쿠아포린-7 (AQP7), 아쿠아포린-8 (AQP8), 아쿠아포린-9 (AQP9) 및 아쿠아포린-10 (AQP10)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 아쿠아포린 채널 유전자에는 아쿠아포린-1 유전자 (aqp1), 아쿠아포린-2 유전자 (aqp2), 아쿠아포린-3 유전자 (aqp3), 아쿠아포린-4 유전자 (aqp4), 및 아쿠아포린-5 유전자 (aqp5)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 아쿠아포린 채널에는 아쿠아포린-1 (AQP1), 아쿠아포린-2 (AQP2), 아쿠아포린-3 (AQP3), 아쿠아포린-4 (AQP4), 및 아쿠아포린-5 (AQP5)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물의 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 릴랙신을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 아쿠아포린의 발현에는 아쿠아포린 유전자 aqp2, aqp3, aqp4 및 aqp5 및/또는 아쿠아포린 단백질 AQP2, AQP3, AQP4 및 AQP5 중 하나 이상이 포함되는, 포유동물에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법을 제공한다. 일 실시양태에서는, 자궁경부에서 aqp3이 상향-조절된다. 또 다른 실시양태에서는, 자궁경부에서 aqp5가 하향-조절된다. 또 다른 실시양태에서는, 자궁경부에서 AQP3이 상향-조절된다. 또 다른 실시양태에서는, 자궁경부에서 AQP5가 하향-조절된다. 또 다른 실시양태에서는, 신장에서 aqp2 및 aqp4가 상향-조절된다. 또 다른 실시양태에서는, 신장에서 AQP2 및 AQP4가 상향-조절된다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물의 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 릴랙신을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 조직에는 비제한적으로 기관 조직, 근육 조직, 상피 조직 및 내피 조직이 포함되는, 포유동물에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 기관 조직에는 뇌 조직, 신장 조직, 폐 조직, 및 생식기 조직이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다.

본 개시내용에 의해 추가적으로 포괄되는 것은 릴랙신을 포유동물에게 투여하는 것에 의한 포유동물에서의 아쿠아포린 채널의 조절 방법이다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 아쿠아포린 유전자의 발현을 조절한다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 아쿠아포린 단백질의 발현을 조절한다. 또 다른 실시양태에서, 아쿠아포린 유전자에는 아쿠아포린-1 유전자 (aqp1), 아쿠아포린-2 유전자 (aqp2), 아쿠아포린-3 유전자 (aqp3), 아쿠아포린-4 유전자 (aqp4), 및 아쿠아포린-5 유전자 (aqp5)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시양태에서, 아쿠아포린 단백질에는 아쿠아포린-1 (AQP1), 아쿠아포린-2 (AQP2), 아쿠아포린-3 (AQP3), 아쿠아포린-4 (AQP4), 및 아쿠아포린-5 (AQP5)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 부종의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 대상체의 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 릴랙신은 부종을 치료하기 위한 제약 제제의 형태로 제공된다. 본 개시내용의 제약 제제에 사용되는 릴랙신은 예를 들면 합성 또는 재조합 릴랙신, 또는 제약상 유효한 릴랙신 효능제일 수 있다. 본 개시내용의 일 실시양태에서, 릴랙신은 H1 인간 릴랙신이다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 H2 인간 릴랙신이다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 H3 인간 릴랙신이다. 다른 실시양태에서, 릴랙신은 합성 또는 재조합 인간 릴랙신, 또는 제약상 유효한 릴랙신 효능제이다. 따라서, 대상체는 합성 또는 재조합 인간 릴랙신 또는 릴랙신 효능제의 제약 제제, 또는 릴랙신-유사 활성을 가지는 임의의 작용제를 사용하여 부종에 대해 치료될 수 있다. 본 개시내용의 일 실시양태에서, 대상체는 합성 인간 릴랙신을 사용하여 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 재조합 인간 릴랙신을 사용하여 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 제약상 유효한 릴랙신 효능제를 사용하여 치료된다. 릴랙신은 비제한적으로 정맥내, 피하, 근육내, 설하, 비내, 대뇌내, 대뇌뇌실내, 국소, 유리체내 및 흡입을 통한 것을 포함한 수많은 상이한 경로들을 통하여 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 그와 같은 투여 경로에는 정맥내 주입, 정맥내 볼루스(bolus), 피하 주입, 피하 볼루스, 피하 펌프, 유리체내 주사, 및 국소 점안약이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 구체적으로, 릴랙신 또는 릴랙신 효능제의 제약 제제는 1일당 대상체 체중 kg당 약 10 내지 1000 ㎍ 범위의 양으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 그와 같이 하여, 릴랙신은 약 1 내지 약 500 ng/ml의 릴랙신 혈청 농도를 유지하도록 대상체에게 투여된다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 소정 상황에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 뇌에서의 부종의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 대상체의 뇌 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 뇌 부종은 하나 이상의 뇌 영역에 영향을 줄 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 뇌 부종은 대뇌 부종이다. 다른 형태의 뇌 부종 역시 포함된다. 뇌 부종을 치료하기 위하여, 릴랙신은 예를 들면 정맥내로, 피하로, 대뇌내로, 또는 대뇌뇌실내로 투여될 수 있다. 이에 따라, 병에 걸린 대상체는 예를 들면 정맥내 주입을 통하여, 정맥내 볼루스을 통하여, 피하 주입을 통하여, 또는 피하 볼루스을 통하여 릴랙신을 투여받을 수 있다. 릴랙신 투여의 유형은 환자의 상태 및 관련 상황에 따라 달라진다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여된다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 뇌 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 소정 상황에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 뇌 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다. 환자의 상태 및 부종의 중증도에 따라, 액체 축적의 감소는 적절한 시점에 부종의 개선을 알 수 있을 정도로 측정가능할 수 있다. 그와 같은 액체 축적의 감소는 자기 공명 영상화 (MRI) 또는 의사에게 가용한 기타 기술들을 통하여 측정될 수 있다. 또한, 뇌에서의 액체 축적의 감소는 협응, 의식 수준 및 저림의 개선과 같은 환자 거동의 개선은 물론, 현기증, 구역 및 기억 상실의 감소와도 연관될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 뇌 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료 방법을 제공한다. 이와 같은 방법에는 혈관성 및 세포독성 부종을 포함한 뇌 부종이 포함될 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시내용은 또한 해당 인간 대상체의 각막 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료 방법을 고찰한다. 일 실시양태에서, 상기 부종은 안구 부종이다. 안구 부종을 치료하기 위하여, 릴랙신은 정맥내로, 피하로, 국소로, 또는 유리체내로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 정맥내 주입 또는 정맥내 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 피하 투여는 피하 주입 또는 피하 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 국소 투여는 국소 점안약을 통하여 이루어질 수 있다. 유리체내 투여는 주사, 예를 들면 안구에의 주사를 통하여 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여된다. 추가적으로 포괄되는 것은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로의 릴랙신 투여이다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 각막 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 몇몇 환자에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 각막 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다. 환자의 상태 및 안구 부종의 중증도에 따라, 액체 축적의 감소는 적절한 시점에 부종의 개선을 알 수 있을 정도로 측정가능할 수 있다. 그와 같은 액체 축적의 감소는 자기 공명 영상화 (MRI), 의사에 의한 안구 평가를 통한 각막의 팽창 및/또는 염증, 왜곡된 시각의 감소는 물론, 안구 불편 및 눈부심의 감소를 통하여 측정될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 각막 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료 방법을 제공한다. 이와 같은 방법에는 안구 부종이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시내용은 또한 인간 대상체의 폐 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료에 대해 고찰한다. 일 실시양태에서, 상기 부종은 폐 부종이다. 폐 부종 또는 폐에서 발생하는 임의의 부종을 치료하기 위하여, 릴랙신은 정맥내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 정맥내 주입 또는 정맥내 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 피하 투여는 피하 주입 또는 피하 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여된다. 추가적으로 포괄되는 것은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로의 릴랙신 투여이다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 폐 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 몇몇 환자에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 폐 조직에서의 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다. 환자의 상태 및 폐 부종의 중증도에 따라, 액체 축적의 감소는 적절한 시점에 부종의 개선을 알 수 있을 정도로 측정가능할 수 있다. 그와 같은 액체 축적의 감소는 흉부 X-선을 통하여 측정될 수 있다. 또한, 액체 축적의 감소는 환자의 폐 울혈의 경감은 물론, 호흡의 개선 (호흡의 개선을 청취하는 청진에 의한 조사를 통함) 및 증가된 산소 포화도 (동맥혈가스(arterial blood gas)의 측정을 통함)와도 연관될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 폐 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 부종은 폐 부종이다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간 대상체의 팽창된 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 팽창된 조직은 인간 대상체의 피부하 영역을 포함하는, 말초 부종의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 팽창된 조직은 피부의 결합 조직이다. 말초 부종은 울혈성 심부전, 외상, 알콜중독, 고산병, 임신, 고혈압 등을 포함한 특정 이상으로 고통받는 환자 군집과 같은 특정 환자 군집에서 발생할 수 있다. 또한, 그와 같은 환자는 간 질환 또는 특정 유형의 심장 병태로 고통받을 수 있다. 또한, 그와 같은 환자는 일 유형 또는 또 다른 유형의 기관 부전으로 고통받을 수도 있다. 말초 부종은 또한 팽창된 사지를 나타내고, 상기 팽창이 특정 이상과 연관되지 않으며, 특정 질환 또는 기원과 관련지어질 수 없는 환자와 같은 분리군에서 발생할 수도 있다. 때로는, 그와 같은 대상체는 단순히 움직임 없는 오랜 시간 기간 동안의 앉기 또는 서기와 연관된다 (예를 들면 사무실에서 오랜 시간 기간 동안 책상 앞에 않아 있는 사람들 또는 오랜 시간 기간 동안 서 있게 되는 조립 라인에서 일하는 사람들). 릴랙신은 분리군에서 발생하는 말초 부종, 또는 또 다른 질환의 증상이거나 또 다른 질환 상태와 관련된 부종을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 말초 부종을 치료하기 위하여, 릴랙신은 정맥내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 정맥내 주입 또는 정맥내 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 피하 투여는 피하 주입 또는 피하 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여된다. 추가적으로 포괄되는 것은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로의 릴랙신 투여이다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 팽창된 조직에서의 말초 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 몇몇 환자에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 팽창된 조직에서의 말초 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다. 환자의 상태 및 말초 부종의 중증도에 따라, 액체 축적의 감소는 적절한 시점에 부종의 개선을 알 수 있을 정도로 측정가능할 수 있다. 그와 같은 액체 축적의 감소는 물리적 조사시의 팽창의 감소는 물론, 24 내지 48시간에 걸친 급격한 체중의 감소를 통하여 측정될 수 있다. 환자가 물을 상실하게 되면서, 체중이 현저하게 감소하고, 그것은 다시 부종의 감소와 직접적으로 관련된다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 말초 부종의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 조직은 피부하 영역을 포함하는 팽창된 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조직은 결합 조직이다.

본 개시내용은 또한 인간 대상체의 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 부종의 치료 방법을 포함한다. 상기 조직에는 폐, 심장, 신장 및 간이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 말초 부종과 마찬가지로, 전신성 부종은 특정 이상으로 고통받는 환자 군집과 같은 특정 환자 군집에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 환자는 간 질환, 특정 유형의 심장 병태, 갑상선부전성 이상, 폐 이상, 신장 장애 등으로 고통받을 수 있다. 또한, 그와 같은 환자는 일 유형 또는 또 다른 유형의 기관 부전으로 고통받을 수도 있다. 전신성 부종은 경화 및/또는 복수를 나타내며 간의 부종으로 고통받는 환자에서와 같이 단일 기관에서 발생할 수도 있다. 다르게는, 전신성 부종은 하나를 초과하는 기관에서 동시에 발생할 수 있다. 릴랙신은 하나 또는 다수의 기관에서 발생하는 전신성 부종을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 전신성 부종을 치료하기 위하여, 릴랙신은 정맥내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 정맥내 주입 또는 정맥내 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 피하 투여는 피하 주입 또는 피하 볼루스을 통하여 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로 투여된다. 추가적으로 포괄되는 것은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 정맥내 또는 피하 볼루스로의 릴랙신 투여이다. 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 병에 걸린 조직 또는 기관에서의 전신성 부종과 연관된 액체 축적의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 몇몇 환자에서는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체의 병에 걸린 조직 또는 기관에서의 전신성 부종과 연관된 액체 축적의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다. 환자의 상태 및 전신성 부종의 중증도에 따라, 액체 축적의 감소는 적절한 시점에 부종의 개선을 알 수 있을 정도로 측정가능할 수 있다. 그와 같은 액체 축적의 감소는 적절한 증상 경감에 대하여 환자를 조사하는 것, 또는 부종의 바탕이 되는 이상에 맞는 스캔, 예컨대 CT 스캔 또는 초음파 (복위 및 복부 팽만의 감소를 보여줌), MRI (특정 기관의 물 함량 감소를 보여줌), 흉부 X-선 (폐액의 감소를 보여줌), 및 심장초음파상 (심실의 크기, 및 심장 및 그 주변의 기타 변화를 보여줌)를 사용하는 것에 의해 측정될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 조직에서 아쿠아포린의 발현을 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 전신성 부종의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 조직은 폐, 심장, 신장 및 간이다.

본 발명의 또 다른 측면은 동물의 조직에서 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 부종의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 일 실시양태에서, 상기 동물은 개, 고양이 또는 말이다.

본 개시내용에 의해 추가적으로 고찰되는 것은 인간 대상체에서 만성적인 묽은 소변 배설을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신장기원 요붕증(nephrogenic diabetes insipidus) (NDI)의 치료 방법이다. NDI에 걸린 환자는 빈번하고도 많은 배변, 과도한 갈증, 전체적인 무력감으로 고통받기 때문에, 릴랙신 치료의 결과로서의 이러한 증상들 중 하나 이상의 감소는 상기 병태의 개선을 표시하게 된다. 예를 들어, 배변 빈도의 감소, 24시간 소변 부피의 감소, 후속하는 소변 삼투압 측정치, 및/또는 환자의 강한 갈증의 경감은 릴랙신을 통한 NDI의 개선과 직접적으로 연관될 수 있다. 그와 같이 하여, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 인간 대상체에서 약 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 3 ㎍/kg/일 내지 약 150 ㎍/kg/일 범위의 피하 주입 속도로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 약 30 ㎍/kg/일 범위의 피하 주입 속도로 투여된다. 또한, 릴랙신은 간헐적인 피하 주입 또는 펌프에 의한 것을 포함한 여러 상이한 경로로 만성적으로 투여될 수 있다. 특히, 릴랙신은 24시간 이상 동안 연속적으로 투여될 수 있다. NDI 환자에서, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, NDI와 연관된 묽은 소변 배설의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 24시간 이내에 측정가능할 수 있다. 다르게는, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체에서의 NDI와 연관된 묽은 소변 배설의 감소는 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 약 4 내지 6시간 이내로 조기에 측정가능할 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 대상체의 신장 조직에서 아쿠아포린의 발현 및 세포 배치를 변경시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신장기원 요붕증 (NDI)의 치료 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 아쿠아포린은 아쿠아포린-2 (AQP2), 아쿠아포린-3 (AQP3), 및/또는 아쿠아포린-4 (AQP4)이다.

본 개시내용은 바람직한 실시양태를 예시하는 기능을 하는 첨부 도면과 관련하여 해독될 때, 가장 잘 이해된다. 그러나, 본 개시내용이 도면에 개시되어 있는 구체적인 실시양태로 제한되지는 않는 것으로 이해된다.
도 1은 임신 말기의 릴랙신 결핍 (Rln-/-) 마우스의 자궁경부에서의 aqp3 유전자 발현의 감소를 보여준다.
도 2는 AQP3 단백질이 주로 마우스 자궁경부의 상피 세포 (화살표 참조)의 기저 층에 위치한다는 것을 보여준다. Rln-/- 마우스에서는 야생형 (Rln+/+) 마우스에 비해 더 낮은 수준의 AQP3 단백질 발현이 존재한다.
도 3은 릴랙신 처리가 임신한 Rln-/- 마우스의 자궁경부에서, aqp3 유전자 발현을 증가시키고 (도 3A), aqp5 유전자 발현을 감소시킨다는 것 (도 3B)을 보여준다.
도 4는 릴랙신 처리가 임신한 Rln-/- 마우스 자궁경부의 기저측 상피 세포에서, AQP3 단백질 발현 (화살표)을 증가시키고, AQP5 단백질 발현 (별표)을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 5는 수컷 Rln-/- 마우스에서의 혈장 삼투압에 대한 릴랙신 처리의 효과를 보여준다.
도 6은 정량 PCR에 의하여, 수컷 마우스 (도 6A) 및 암컷 마우스 (도 6B) 신장에서의 Rxfp1 릴랙신 수용체의 발현을 보여준다.
도 7은 수컷 및 암컷 래트 신장에서의 Rxfp1 릴랙신 수용체의 발현을 보여준다. 도 7A는 면역조직화학에 의하여, 피질, 외부 수질 및 내부 수질에서의 신세뇨관의 단면에서 RXFP1 단백질을 보여준다. 도 7B 및 7C는 정량-PCR에 의하여, 암컷 및 수컷 래트의 피질 및 수질 영역에서의 Rxfp1 유전자 발현을 보여준다. 도 7D는 웨스턴 블롯 분석에 의해, 피질 및 수질 영역에서의 다량의 단백질 발현을 보여준다.
도 8A는 염수 (VEH) 대조군과 비교하여, 릴랙신으로 처리된 수컷 Rln+/+ 마우스 신장에서의 aqp2 유전자 발현의 증가를 보여준다. β-액틴은 표준화 대조군이다. 도 8B는 5일 동안 릴랙신으로 처리된 수컷 Rln-/- 마우스의 유두에서의 aqp2 유전자 발현의 적정한 증가를 보여준다. 도 8C는 5일 동안 릴랙신으로 치료된 수컷 래트의 수질에서의 aqp2 유전자 발현의 약간의 증가를 보여준다.
도 9는 임신 말기 래트에서의 래트 릴랙신에 대한 모노클로날 항체 (MCA1)를 사용한 처리가 신장의 수질 영역에서 aqp2 유전자 발현을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 10A는 수컷 Rln-/- 마우스 신장에서의 aqp4 유전자 발현의 감소를 보여준다. 도 10B 및 10C는 5 또는 14일 중 어느 하나 동안의 수컷 Rln-/- 마우스에서의 릴랙신을 사용한 처리가 신장의 유두 영역에서 aqp4 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 10D는 5일 동안 릴랙신을 사용하여 처리된 수컷 래트 수질에서의 aqp4 유전자 발현의 증가를 보여준다.
도 11은 5일 동안 릴랙신을 사용하여 처리된 수컷 래트 수질에서의 aqp4 유전자 발현의 증가를 보여준다.

일반적인 개관

본 개시내용은 릴랙신의 투여를 통한 아쿠아포린 채널의 조절 방법에 관한 것이다. 아쿠아포린은 여러 신체 조직에서 물 및 글리세롤의 흐름을 조절하기 위하여 대부분 세포의 세포 막에 매립되어 있는 단백질이다. 본 발명자들은 릴랙신이 이러한 물 채널을 조절할 수 있다는 것, 즉 릴랙신이 특정 조직 및/또는 기관에서 특정 아쿠아포린의 발현을 상향-조절 및/또는 하향-조절할 수 있다는 것을 밝힌 바 있다. 그것은 다시 특정 조직 및/또는 기관에서의 특정 아쿠아포린을 통한 물의 흐름에 영향을 줌으로써, 물에 대한 생물학적 막의 투과도를 변화시키고, 또한 신체 조직 및/또는 기관의 액체 함량을 변경시킨다. 특정 아쿠아포린의 경우에서, 본 발명자들은 그의 유전자 발현을 변경시키는 것의 효과가 한 가지 조직과 또 다른 것 간에 일정하다는 것을 밝힌 바 있다. 아쿠아포린은 대부분의 포유동물 조직에서 발현되며 포유동물계 전체에 걸쳐 고도로 보존되어 있기 때문에, 그의 발현을 상향- 및 하향-조절하는 능력은 많은 질환 과정의 이해를 위한 근본적인 바탕을 제공한다. 예를 들면, 부종은 조직 및/또는 기관에서의 과도한 물 축적의 결과인 이상이며, 그에 따라 릴랙신 치료는 부종 및/또는 그의 증상으로 시달리는 대상체를 이롭게 할 수 있다.

더 구체적으로, 마우스에서의 인간 재조합 (H2) 릴랙신을 사용한 처리는 임신 말기의 자궁경부 상피 세포에서 aqp3 유전자 발현 및 AQP3 단백질의 양을 증가시킨다. 이는 상피 세포를 가로지르는 자궁경부 내강으로부터의 물 유입을 촉진하고, 기질(stroma) 조직의 물 함량을 증가시킴으로써, 세포외 매트릭스의 재형성을 촉진한다. 릴랙신 처리는 동일한 조직에서 아쿠아포린을 감소시킬 수도 있다. 예를 들면, 릴랙신은 임신 말기의 자궁경부 상피 세포의 기저 층에서는 aqp5 유전자 발현 및 AQP5 단백질의 양을 감소시킨다. 또 다른 연구에서, 릴랙신 처리는 2종의 포유동물 종의 신장 수질 및 유두(papilla) 영역에서 aqp2 및 aqp4 유전자 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 신장에서의 이와 같은 작용은 네프론(nephron) 여과액으로부터의 네프론 세포를 가로질러 다시 혈액으로의 물의 이동을 촉진하는데, 이는 소변을 농축하고 혈장 삼투압을 감소시키는 데에 필수적이다.

따라서, 본 개시내용은 추가적으로 병에 걸린 대상체에게 릴랙신을 투여하는 것에 의한 부종의 감소 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 일반적으로 부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인 양으로 제약상 활성인 릴랙신을 투여하는 것을 포함한다. 부종이 많은 질환의 보편적인 부작용 또는 증상이며, 또한 고령자들에게 영향을 주는 이상이기 때문에, 이는 보건 의료 체계에 대한 꾸준히 증가하는 비용과 연관된다. 예를 들면, 비제한적으로 모두 신체 조직 및 기관에서의 액체 축적의 결과인 대뇌 부종, 안구 부종, 폐 부종, 복수, 유전성 혈관부종, 말초 부종 및 전신성 부종을 포함하여, 수많은 형태의 부종이 존재한다. 또한, 뇌 또는 대뇌 부종에서와 같이, 부종은 뇌 및 척수에 대한 외상성 손상과 연관된 보편적인 병태이다. 또한, 부종은 종종 졸중을 동반하는데, 그것은 뇌 종양의 임상 과정을 급격하게 악화시킬 수 있다. 현행 뇌 부종 치료는 예를 들면 삼투압요법 및 글루코코르티코이드를 포함하여 제한되어 있다. 삼투압요법의 사용은 뇌에서의 팽창을 역전시키는 것을 돕기 위한 고장성 만니톨의 투여를 포함한다. 그러나, 삼투압요법은 손상된 영역과 함께 건강한 뇌 조직을 수축시키기 때문에, 이와 같은 치료는 제한적이며, 종종 성공적이지 않다. 마찬가지로, 글루코코르티코이드 역시 대부분 형태의 뇌 부종 치료에서 매우 성공적이었던 바가 없으며, 졸중-관련 부종에서는 완전히 실패하였다. 유사하게, 외과적 감압은 환자를 종종 위험에 처하게 하는 침습성의 절차이다. 유감스럽게도, 이러한 치료들은 지난 70년 동안 사용되어 왔지만, 성공 사례는 매우 적다. 외상성 뇌 손상 및 관련 부종을 위한 치료 비용은 단독으로 매년 140억 USD를 초과하며, 그것은 꾸준히 상승하고 있다. 따라서, 부종에 걸린 환자 군집은 심각한 부작용의 야기 없이 이상을 개선하고 환자를 안정화시키는 새로운 치료법을 필요로 한다. 릴랙신은 부종에 걸린 대상체에게 투여되었을 때 인접 조직에 영향을 주지 않고 부종과 연관되어 있는 조직에서의 액체 축적을 감소시킬 수 있는 자연 발생 물질이다. 따라서, 릴랙신은 환자의 안녕을 향상시키는 새로운 형태의 치료를 제공하며, 또한 부종에 걸린 대상체에 대한 의료 비용을 감소시키기 위한 새로운 길을 제공한다. 또한, 본 개시내용에 포괄되는 것은 병에 걸린 개체에게 제약상 활성인 릴랙신을 투여하는 것에 의한 신장기원 요붕증 (NDI)의 치료이다.

정의

"조절하는"이라는 용어는 비제한적으로 유전자 및 단백질을 포함한 생물학적 실체의 활성 및/또는 존재 및/또는 효과를 조절 또는 조정하는 능력을 지칭한다.

"조직"이라는 용어는 동일 기원의 세포 집합을 지칭한다. 예를 들면, 포유동물 조직은 포유동물 종 유래의 세포 집합이다. 조직을 구성하는 세포가 반드시 동일한 것은 아니나, 그들은 함께 특정 기능을 수행한다. "부종"이라는 용어는 포유동물 신체의 조직 및/또는 기관에서의 액체의 축적을 의미한다. "투여하는 것"이라는 용어는 비제한적으로 정맥내, 피하, 근육내, 설하, 비내, 대뇌내, 대뇌뇌실내, 국소, 유리체내 및 흡입을 통한 것을 포함한 특정 경로를 통하여 제약 치료제 또는 제제를 대상체에게 제공 또는 적용하는 것을 지칭한다. "부종과 연관된 액체 축적을 감소시키는 데 효과적인"에서와 같은 "효과적인"이라는 용어는 환자의 기준 상태, 또는 치료되지 않거나 위약-치료된 (예컨대 릴랙신으로 치료되지 않은) 대상체의 상태와 비교하였을 때 측정가능한 바람직한 의료 또는 임상적 이익을 환자에게 초래하게 되는 제약 활성 릴랙신의 양을 지칭한다.

"릴랙신"이라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있는 펩티드 호르몬을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "릴랙신"이라는 용어에는 무손상인 전체 길이 인간 릴랙신, 또는 생물학적 활성을 보유하는 릴랙신 분자의 일부를 포함한 인간 릴랙신이 포함된다. "릴랙신"이라는 용어에는 인간 H1 프리프로릴랙신, 프로릴랙신, 및 릴랙신; H2 프리프로릴랙신, 프로릴랙신, 및 릴랙신; 그리고 H3 프리프로릴랙신, 프로릴랙신, 및 릴랙신이 포함된다. "릴랙신"이라는 용어에는 또한 재조합, 합성 또는 천연 공급원 유래의 생물학적으로 활성인 (본원에서는 "제약상 활성인"으로도 지칭됨) 릴랙신은 물론, 아미노산 서열 변이체와 같은 릴랙신 변이체도 포함된다. 따라서, 상기 용어는 합성의 H1, H2 및 H3 인간 릴랙신 및 재조합 H1, H2 및 H3 인간 릴랙신을 포함한 합성 인간 릴랙신 및 재조합 인간 릴랙신을 의미한다. 상기 용어에는 또한 릴랙신 수용체 (예컨대 이전에는 각각 LGR7, LGR8, GPCR135, GPCR142로 알려져 있던 RXFP1 수용체, RXFP2 수용체, RXFP3 수용체, RXFP4 수용체)로부터 결합된 릴랙신을 경쟁적으로 치환하는 모든 작용제를 포함하여, 릴랙신 효능제 및/또는 릴랙신 유사체, 및 생물학적 활성을 보유하는 이들의 일부와 같이 릴랙신-유사 활성을 가지는 활성제가 포함된다. 예컨대, 제약상 활성인 릴랙신 또는 릴랙신 효능제는 릴랙신-유사 활성을 가지며, 릴랙신-유사 반응을 이끌어내기 위하여 릴랙신 수용체에 결합할 수 있는 임의의 작용제이다. 또한, 제약상 유효한 릴랙신 또는 릴랙신 효능제는 릴랙신-유사 활성을 가지며, 아쿠아포린 분자 (AQP)의 발현을 상향- 및/또는 하향-조절 및/또는 변경함으로써, 물에 대한 생물학적 막의 투과도를 조절하고/거나 변화시킬 수 있는 (이는 다시 신체 조직 및/또는 기관의 액체 함량을 변경시킬 수 있음) 임의의 작용제이다. 더하여, 본원에서 사용될 때의 인간 릴랙신의 핵산 서열은 인간 릴랙신 (예컨대 H1, H2 및/또는 H3)의 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 적어도 인간 릴랙신의 핵산 서열과 약 40%, 50%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 본원에서 사용될 때의 릴랙신은 당업자에게 알려져 있는 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 그와 같은 방법의 예가 예컨대 U.S. 특허 번호 5,759,807은 물론, 문헌 [Bullesbach et al . (1991) The Journal of Biological Chemistry 266:10754-10761]에 예시되어 있다. 릴랙신 분자 및 유사체의 예는 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,166,191에 예시되어 있다. 자연적으로 발생하는 생물학적 활성 릴랙신은 인간, 뮤린 (즉, 래트 또는 마우스), 돼지, 또는 기타 포유동물 공급원으로부터 유래할 수 있다. 역시 포괄되는 것은 생체내 반감기가 증가되도록 변경된 릴랙신, 예를 들면 PEG화된 릴랙신 (즉 폴리에틸렌 글리콜에 접합된 릴랙신), 분해 효소에 의한 절단에 적용되는 릴랙신 중 아미노산의 변형 등이다. 상기 용어에는 또한 N- 및/또는 C-말단 절단부를 가지는 A 및 B 사슬을 포함하는 릴랙신이 포함된다. 일반적으로, H2 릴랙신에서 A 사슬은 A(1-24) 내지 A(10-24)로, B 사슬은 B(1-33) 내지 B(10-22)로 가변적일 수 있으며; H1 릴랙신에서 A 사슬은 A(1-24) 내지 A(10-24)로, B 사슬은 B(1-32) 내지 B(10-22)로 가변적일 수 있다. 역시 "릴랙신"이라는 용어의 영역 내에 포함되는 것은 하나 이상 아미노산 잔기의 기타 삽입체, 치환체 또는 결실체, 글리코실화 변이체, 비글리코실화 릴랙신, 유기 및 무기 염, 릴랙신의 공유결합 변경된 유도체, 프리프로릴랙신, 및 프로릴랙신이다. 역시 상기 용어에 포함되는 것은 비제한적으로 U.S. 특허 번호 5,811,395에 개시되어 있는 릴랙신 유사체를 포함하여, 야생형 (예컨대 자연 발생) 서열과는 다른 아미노산 서열을 가지는 릴랙신 유사체이다. 릴랙신 아미노산 잔기에 대한 가능한 변형에는 C-말단 기의 N-말단 아미드화, 또는 히드록실 또는 카르복실 기의 에스테르의 형성, 예를 들면 포르밀 기의 첨가에 의한 B2에서의 트립토판 (Trp) 잔기의 변경을 포함하여, 아세틸화, 포르밀화 또는 유사한 유리 아미노 기의 보호가 포함된다. 포르밀 기는 용이하게 제거가능한 보호 기의 전형적인 예이다. 다른 가능한 변경에는 비제한적으로 노르류신 (Nle), 발린 (Val), 알라닌 (Ala), 글리신 (Gly), 세린 (Ser), 또는 호모세린 (HomoSer)을 사용한 B24에서의 Met 모이어티의 치환을 포함하여, 상이한 아미노산 (천연 아미노산의 D-형 포함)을 사용한 B 및/또는 A 사슬에서의 천연 아미노산 중 하나 이상의 치환이 포함된다. 다른 가능한 변형에는 사슬로부터의 천연 아미노산의 결실, 또는 사슬에 대한 하나 이상 추가 아미노산의 부가가 포함된다. 추가적인 변형에는 프로릴랙신의 B/C 및 C/A 연결부에서의 아미노산 치환 (이와 같은 변형은 프로릴랙신으로부터의 C 사슬의 절단을 촉진함); 및 예컨대 U.S. 특허 번호 5,759,807에 기술되어 있는 바와 같은 비-자연 발생 C 펩티드를 포함하는 변이체 릴랙신이 포함된다. "릴랙신"이라는 용어에 또한 포함되는 것은 릴랙신 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 이종성 폴리펩티드 (예컨대 비-릴랙신 폴리펩티드) 융합 파트너는 융합 단백질의 릴랙신 부분에 대하여 C-말단 또는 N-말단일 수 있다. 이종성 폴리펩티드에는 면역학적으로 검출가능한 폴리펩티드 (예컨대 "에피토프 태그"); 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 폴리펩티드 (예컨대 녹색 형광 단백질, 알칼리성 포스파타제와 같은 효소, 및 기타 당업계 공지의 것); 비제한적으로 시토카인, 케모카인, 및 성장 인자를 포함한 치료 폴리펩티드가 포함된다. 그와 같은 모든 변이체, 또는 변이체로 이어지는 릴랙신 분자의 구조의 변경들은 릴랙신의 기능적인 (생물학적인) 활성이 유지되는 한, 본 개시내용의 영역 내에 포함된다. 바람직하게는, 릴랙신 아미노산 서열 또는 구조의 임의의 변형은 해당 릴랙신 변이체를 사용하여 치료되는 개체에서의 그의 면역원성을 증가시키지는 않는 것이다. 기술된 기능적 활성을 가지는 릴랙신의 해당 변이체들은 당업계에 알려져 있는 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 용이하게 식별될 수 있다.

릴랙신

릴랙신은 크기 및 형상이 인슐린과 유사한 폴리펩티드 호르몬이다. 그것은 인슐린 유전자 수퍼패밀리에 속하는 내분비 및 자가분비/주변분비(autocrine/paracrine) 호르몬이다. 코딩되어 있는 단백질의 활성 형태는 2개의 사슬-간 및 하나의 사슬-내 디술피드 결합에 의해 서로 결합되어 있는 A 사슬 및 B 사슬로 구성된다. 따라서, 상기 구조는 디술피드 결합의 배치에 있어서 인슐린과 상당히 유사하다. 인간에서는, 3종의 알려져 있는 비-대립유전자성 릴랙신 유전자인 릴랙신-1 (RLN-1 또는 H1), 릴랙신-2 (RLN-2 또는 H2) 및 릴랙신-3 (RLN-3 또는 H3)이 존재한다. H1 및 H2는 고도의 서열 상동성을 공유한다. 상이한 동형들을 코딩하고 있는 2종의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 이 유전자에 대하여 기술되어 있다. H1 및 H2는 생식 기관에서 차별적으로 발현되는 (U.S. 특허 번호 5,023,321 및 문헌 [Garibay-Tupas et al . (2004) Molecular and Cellular Endocrinology 219:115-125])반면, H3은 주로 뇌에서 발견된다. 해당 수용체에서의 릴랙신 펩티드 패밀리의 진화에 대해서는 당업계에 일반적으로 잘 알려져 있다 (문헌 [Wilkinson et al . (2005) BMC Evolutionary Biology 5:1-17]; 및 [Wilkinson & Bathgate (2007), Chapter 1, Relaxin and Related Peptides, Landes Bioscience and Springer Science+Business Media]). 릴랙신, 릴랙신 수용체, 및 릴랙신 효능제에 대해서는 특허 출원 공개 번호 20100048475에 추가적으로 상세하게 기술되어 있다.

아쿠아포린 -관련 생리학 및 장애

당연히, 아쿠아포린 (AQP)은 많은 생리학적 과정에 관련되어 있다. 예를 들면, 신장에서, AQP1은 신장 근위뇨세관의 정점측 및 기저측 막 모두, 그리고 모세관 내피에 풍부하다. 그에 따라, AQP1은 소변 농축 및 교환을 위한 역류 기작에 기여한다. 타액선에서는, AQP3이 간질로부터 물이 흡수되는 기저측 막에서 발견되며, AQP5가 물이 방출되는 정점측 막에서 발견된다. 신장 기능의 이상, 시력 상실, 뇌 부종의 개시 및 기아를 포함한 일련의 임상적 장애들이 아쿠아포린의 손실 또는 기능장애와 연관된다. 또한, AQP1은 혈관신생, 상처 치유, 기관 재생 및 발암에 관련되어 있는 것으로 여겨지고 있다 (문헌 [Kruse et al .] (상기)).

신경교 세포 막 물 채널인 AQP4는 뇌 부종과 연관되어 있으며, 두부 외상, 종양, 졸중, 감염 및 대사 장애와 같은 신경계 장애의 이환에서 중요한 역할을 한다. 뇌 부종에 대한 현행 치료 선택사항은 고삼투압성 제제 및 외과적 감압에 제한되어 있는데, 이들은 70년이 넘는 옛날에 도입되었던 요법들이다. 일부 연구는 급성 물 중독에 의해 야기되는 뇌 부종의 모델에서, AQP4가 결핍되어 있는 마우스가 야생형 마우스에 비해 더 우수한 생존력을 가진다는 것을 밝힌 바 있다. 여기에서는, AQP4-결핍 마우스에서 뇌 조직 물 함량 및 모세관주위 성상세포 발돌기(foot process)의 팽창이 감소될 수 있다. 특징적인 성상세포 발돌기의 팽창은 두부 손상 환자의 뇌 조직에서도 발견된다. 중간 대뇌 동맥 폐색에 의해 생성되는 허헐성 졸중과 같은 또 다른 뇌 부종 모델에서도, AQP4-결핍 마우스가 역시 개선된 신경학적 결과를 가진다. 대뇌 부종의 상태는 24시간에서의 반구 확대의 백분율을 통하여 측정되는데, AQP4-결핍 마우스에서 35% 감소되는 것으로 나타난다. 이와 같은 발견은 뇌의 물 수송을 조절함에 있어서의 AQP4의 핵심적인 역할을 암시하며, 또한 AQP4 억제가 매우 다양한 대뇌 장애에서 뇌 부종을 감소시키기 위한 새로운 치료 선택사항을 제공할 수 있다는 것을 암시한다 (문헌 [Manley et al . (2000) Nature Medicine 6:159-163]). 그러나, 또 다른 연구에서는, 성상세포 ETB 수용체의 직접적인 활성화가 AQP4 발현을 감소시킴으로써, 부종 액체의 감소된 배설을 초래하고 혈관성 뇌 부종의 악화로 이어지는 것으로 암시된다 (문헌 [Koyama et al . (2010) Neuroscience Letters 469:343-347]). 이와 같은 연구는 또한 세포독성 부종은 물 진입의 방지로 인하여 AQP4 발현의 감소에 의해 개선될 수 있는 반면, 혈관성 부종은 부종 액체의 증가된 유출로 인하여 AQP4 발현의 증가에 의해 개선될 수 있다는 것을 암시한다.

AQP1, AQP4 및 AQP9의 발현은 임신 동안의 뇌에서 연구되고 있다. 여기에서는, 임신 및 분만 후 상태 동안의 상이한 뇌 영역에서의 실시간 정량 PCR이 aqp1, aqp4 및 aqp9의 발현을 평가하는 데에 사용된다. 후방 가역성 뇌병증후군, 자간증 및 전자간증을 포함하여, 대뇌 부종 형성을 수반하는 임신 동안의 병리학적 이상들이 존재한다. 자간증 및 전자간증은 신경학적 증상이 발생하는 심각한 임신 합병증이다. 이러한 증상들은 급성 혈압 상승으로 인한 혈관성 뇌 부종 때문에 발병된다. 자간증에서의 부종 형성은 주로 후방 뇌 영역에서 발견된다. 특히, 자간증이 항상 발병되는 2종의 상태인 임신 말기의 동물 및 분만후 동물 모두의 후방 대뇌 대 전방 대뇌에서는, 더 고도의 AQP4 발현이 관찰된다 (문헌 [Wiegman et al . (2008) Reproductive Sciences 15:506-516]).

AQP1 및 AQP5는 각막 팽창 및 부종과 연관된다. 부종-관련 질환에 걸린 각막은 투명성을 상실함으로써, 심각한 시력 상실을 초래한다. AQP1 및 AQP5는 각각 각막 내피 및 상피 세포에서 발현되며, 삼투압에 의해 구동되는 물 수송을 촉진하는 기능을 한다. 이들 아쿠아포린이 각막 액체 수송 및 투명성과 관련되어 있는지를 시험하기 위하여, 트랜스제닉 마우스가 제조되었다. 예를 들면, 각막 두께, 물 투과도, 및 실험적 팽창에 대한 반응이 야생형 마우스, 및 aqp1 및 aqp5가 결핍된 트랜스제닉 널(null) 마우스에서와 비교되었다. 마우스에서의 aqp5의 결실은 각막 두께를 증가시키고, 각막 상피를 가로지르는 삼투수 투과도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, aqp1 결실은 각막 두께 및 각막 상피를 가로지르는 삼투수 투과도를 감소시키고, 실험적 팽창 후의 각막 투명성의 회복을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 비-독성 차단제에 의한 AQP5 또는 AQP1의 억제는 각막 구조 및 물 함량을 변경시킬 수 있다. 또한, 각막 상피에서의 AQP1의 상향-조절은 각막 부종을 감소시키고 손상 후 투명성을 개선하는 데에 특히 유용할 수 있다 (문헌 [Thiagarajah et al . (2002) The Journal of Biological Chemistry 277:19139-19144]). 유사하게, AQP1, AQP3 및 AQP4는 인공수정체 수포 각막병증 (PBK), 무수정체 수포 각막병증 (ABK) 및 푹스 이영양증과 연관되어 있다. 이들 장애는 병태생리의 주요 구성요소로서 내피 세포 기능장애 및 만성 부종을 가지는 각막 질환들이다. 이러한 병태들이 존재할 경우에는, 상피 세포 내의 액체 축적 및 각막 두께가 증가함으로써, 실질적으로 투명성의 상실 및 감소된 시력을 야기할 수 있다. PBK 및 ABK에서는 각막이 AQP1, AQP3 및 AQP4의 분포가 변경되는 반면, 푹스 이영양증에서는 각막이 AQP1 변화를 겪는 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Kennedy et al . (2004) Journal of Histochemistry and Cytochemistry 52:1341-1350]).

아쿠아포린은 소변 희석 및 농축의 임상적 장애에도 관련되어 있다. AQP1, 및 특히 AQP2, AQP3 및 AQP4는 우레아 및 이온 수송체와 함께 세포 및 분자 수준에서의 소변 희석 및 농축에 대한 더 양호한 이해를 가능케 하였다. 예를 들면, AQP1은 근위뇨세관의 정점측 및 기저측 막 모두, 및 헨레고리(Henle's loop)의 하행각(descending limb)에서 상시적으로 발현된다. aqp1 녹아웃 마우스는 감소된 최대 소변 삼투압으로 고통받는다. aqp1 유전자가 결핍되어 있는 인간의 경우도 그러하다. AQP3 및 AQP4는 집합관 주 세포의 기저측 막에 위치되어 있다. AQP3은 아르기닌 바소프레신 (AVP)에 의해 조절된다. aqp3 녹아웃 마우스는 바소프레신-내성 신장기원 요붕증 (NDI)에 부차적인 실질성 다뇨증을 나타낸다. AQP4는 내부 수질의 기저측 막에 많으며, AVP에 의해 조절되지 않는다. aqp4 녹아웃 마우스 역시 NDI를 나타내지만, aqp3 녹아웃 마우스에서 관찰되는 것에 비해서는 덜 중증인 것이다. AQP3 및 AQP4는 집합관의 기저측 막을 가로지르는 물 이동을 위한 유출 채널을 구성하는 반면, AQP2는 집합관 주 세포의 정점측 막을 가로지르는 물 재흡수를 위한 물 채널이다. 사실상, 아르기닌 바소프레신 (AVP)에 의해 조절되는 집합 세관 및 집합관의 주 세포에서는, AQP2만이 발견된다. 그러나, 일부 발견은 AVP와는 관계없는 고삼투압에 의한 AQP2 조절을 암시한다. 많은 다른 장애들 중에서도, 물 불균형은 임상적으로 관련된 저나트륨혈증 또는 고나트륨혈증 중 어느 하나로 이어질 수 있다. 저나트륨혈증이 더 보편적이며, 입원 환자에서의 가장 빈번한 액체 및 전해질 장애로써, 다시 말하자면, 입원 환자에서의 저나트륨혈증의 유병률이 15 내지 30%만큼 높다 (문헌 [Schrier (2006) Journal of the American Society of Nephrology 17:1820-1832]).

릴랙신은 아쿠아포린을 조절하여 생식 생리에 영향을 준다

임신 말기에는, 자궁경부 성숙 동안 자궁경부의 세포외 매트릭스 (ECM)가 광범위하게 변화됨으로써, 분만시 태아가 산도를 통과하는 것을 가능케 한다. 자궁경부 성숙은 콜라겐 분해 및 분산으로 이어지는 복잡한 일련의 사건들에 의해 이루어진다. 난소 펩티드 릴랙신이 이러한 과정에 관련되는 한 가지 인자이나, 릴랙신 작용의 기작에 대한 현재의 이론은 대답해야 할 많은 의문점들을 남겨두고 있다. 본 출원인은 릴랙신이 아쿠아포린 (AQP)을 조절하는 것에 의해 자궁경부 물 함량 및 콜라겐 섬유 분산을 증가시킨다는 새로운 가설을 시험하였다 (실시예 1 참조). 본 발명자들은 aqp3 유전자 발현이 임신 말기에 릴랙신 녹아웃 (Rln -/-) 마우스의 자궁경부에서 상당히 감소된다는 것을 밝혔다 (도 1). AQP3 단백질은 주로 마우스 자궁경부의 기저 상피 세포에 위치하였는데, Rln -/- 마우스에서는 이 영역에서 면역반응성-AQP3의 감소가 나타났다 (도 1). 2차 연구에서는, 임신한 Rln-/- 마우스를 릴랙신으로 처리하였는데, 이는 위약 대조군에 비해 자궁경부 aqp3의 상당한 증가 및 aqp5 유전자 발현의 감소를 초래하였다 (도 3). 릴랙신을 사용하여 처리된 임신한 Rln -/- 마우스는 위약 대조군에 비해 기저측 상피에서는 더 많은 면역반응성 AQP3을, 상피의 기저 세포에서는 더 적은 면역반응성 AQP5를 가졌다 (도 4). 또한, 릴랙신 처리는 자궁경부 습윤 중량 및 기질 ECM 내의 콜라겐 분산을 상당히 증가시켰다. 이러한 발견은 릴랙신이 생식 조직에서 아쿠아포린 유전자 및 단백질 발현을 조절함으로써 물 균형을 조절할 수 있다는 것을 보여주었다.

AQP5는 cAMP에 의해 조절되는 것으로 보인다. 이는 단백질 키나제 A (PKA) 활성화를 통하여 이루어지는 것으로 여겨지는데, PKA의 억제가 폐 상피 MLE-12에서 cAMP-매개 AQP5 전위를 차단하기 때문이다 (문헌 [Sidhaye et al . (2005) The Journal of Biological Chemistry 280:3590-3596]). 상기에서 언급된 바와 같이, 임신한 Rln -/- 마우스에 대한 릴랙신 처리는 염수-처리 대조군에 비해 AQP5 발현을 감소시켰다. 여기에서, ELISA 데이터는 릴랙신 농도가 주입 6일차에 낮아졌지만, 낮아진 릴랙신 농도가 AQP5 발현에 대한 릴랙신의 억제 효과를 감소시키지는 않는 것을 제시하였다. 본 출원인은 릴랙신이 PKA의 활성화를 수반하는 cAMP 경로를 통하여 AQP5 발현 또는 전위를 조절할 수 있는 것으로 가정하였다. 릴랙신은 또한 2차 파동(second wave)에 요구되는 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 활성화를 통하여 2단계 방식으로 cAMP를 활성화시킨다 (문헌 [Dessauer & Nguyuen (2005) Annals of the New York Academy of Sciences 1041:272-279]). 자궁경부에서, 임신 초기의 AQP5의 기능적 중요성은 기질로의 물의 유입을 가능케 하는 것, 및 또한 상피 세포에서의 점막 분비의 증가이다 (문헌 [Anderson et al . (2006) Endocrinology 147:130-140]). 본 발명자들은 임신 말기 Rln +/+ 마우스의 AQP5 발현 감소가 자연에 존재하는 릴랙신에 의한 억제 효과를 시사하는 것으로 생각한다.

AQP5 경우의 또 다른 가능한 기작은 염증 인자와 관련된다. 자궁경부 성숙이 임신한 자궁경부에서 발견되는 고농도의 염증 인자로 인한 염증 반응인 것으로 제안된 바 있다. 자궁경부에서의 시토카인, 특히 IL-8, 또는 혈소판 활성화 인자 (PAF), 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1) 및 대식세포와 같은 염증 인자들의 정밀한 매개 및 상호-관계에 대해서는 확인해야 할 여지가 있지만, 최고의 염증 인자 농도는 자궁경부 성숙의 활성 단계와 일치한다. AQP5 조절 면에서, 가능한 경로는 TNFR1에 결합하여 AQP5 mRNA (2배) 및 단백질 (10배)을 억제 및/또는 하향-조절하는 염증 인자 TNF-알파를 통한 표준 NF-kB 경로의 활성화이다(문헌 [Towne et al . (2001) The Journal of Biological Chemistry 276:18657-18664]). AQP5는 또한 독립적인 ERK 경로를 통하여, 그러나 고삼투압 조건 동안에만, MLE-15 세포에서 상향-조절된다 (문헌 [Hoffert et al . (2000) The Journal of Biological Chemistry 275:9070-9077]). NF-kB가 ERK 및 MEK와 같은 다수의 신호전달 경로를 활성화시키기는 하지만, AQP5 조절에 대한 주된 효과는 직접적으로 NF-kB 전사체로부터 나온다. 여기에서의 연결점은 인간 THP-1 세포에서, 릴랙신이 2종의 NF-kB 하부단위인 p50 및 p65를 증가시키고 (전사 활성화제), 핵으로의 NF-kB 전위를 억제하는 IkB-알파를 감소시키는 것으로 보고된 최근의 조사이다 (문헌 [Ho et al . (2007) Journal of Leukocyte Biology 81:1303-1310]). 그러나, 이와 같은 연구는 릴랙신의 NF-kB 경로를 통한 MMP-9 유도를 보이기 위하여 수행된 것이며, 따라서 가능한 한가지 기작에 불과하다.

릴랙신은 아쿠아포린을 조절하여 액체 항상성에 영향을 준다

펩티드 호르몬 릴랙신에 대한 대부분의 연구는 포유동물 생식에 초점을 맞추는데, 상기 호르몬이 임신 동안 난소에서 고농도로 분비되기 때문이다. 그의 고전적인 역할은 동물에서의 분만 개시 전에 자궁경부 및 질의 세포외 매트릭스에서 발생하는 조직 재형성 과정과 관련된다. 그러나, 현재는 릴랙신이 신장에서 중요한 역할을 한다는 것이 명백해졌다.

어떤 사막 동물은 다양한 형태학적, 거동적 및 생리학적 개조를 통하여 제한된 물 가용성 문제를 다루는 것으로 알려져 있다. 특히, 그들은 그들의 소변을 농축함으로써, 대사 폐기물이 배설될 때 다량의 물이 손실되는 것을 방지할 수 있다. 이는 특히 건조한 환경에서 육상 척추동물에게 가용한 하나의 가장 중요한 물 보존 기작인 것으로 생각된다. 물 보존은 신장 네프론의 집합관에서 이루어진다. 혈장 삼투압 (즉 용액 리터 (L) 당 용질의 오스몰 (Osm) 수로 규정될 때의 용질 농도 측정치)이 증가하는 경우, 이러한 관은 물에 대하여 고도로 투과성이 되며, 물은 네프론으로부터 주변 수질로 이동한다. 물 재흡수와 관련된 주요 소변-농축 기작 중 하나는 호르몬 바소프레신, 및 신장 유두로 연장되어 있는 집합관에서의 그의 특정 물 채널 분자 (즉, 아쿠아포린), 특히 AQP2와의 상호작용에 따른다. 그러나, 신장 유두의 구체적인 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 흥미롭게도, 가시 마우스(spiny mouse)는 염 섭취 후 많은 물을 마시지 않아도 혈장 삼투압의 대규모 증가를 인내하는 반면, 실험실 마우스는 물을 마셔야 한다. 예를 들면, 스피니펙스 호핑 마우스(spinifex hopping mouse)는 매우 빠르게 소변 부피를 감소시키고 소변 삼투압을 증가시킴으로써, 물 박탈에 대하여 반응한다. 실험실 마우스에서는 그와 같은 것이 일어나지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 발견을 인간을 포함한 다른 동물과 상관시키기 위하여, 실험실 마우스 및 래트에서의 소변 농축 기작의 조사에 착수하였다. 이는 까다로운 것으로 판명되어 있는데, 소변 농축 기작이 증가된 바소프레신 또는 레닌-안지오텐신에 따르지 않는 것이기 대문이다. 여기에서 본 발명자들은, 펩티드 호르몬인 릴랙신 및 그의 수용체 RXFP1에 대하여, 특히 물 박탈 및 증가된 염도에 반응하는 신장에서의 농축된 소변의 생성에서의 새로운 기능을 고찰하였다. 본 발명자들은 릴랙신이 신장에서의 농축된 소변의 생성에 있어서의 핵심 조절 인자이며, 릴랙신이 내부 수질 집합관 세포에 직접적으로 작용하여, 세포내 cAMP를 자극하고, 정점 막으로의 AQP2 트래피킹(trafficking)을 매개하는 것으로 생각한다 (실시예 2 참조). 본 발명자들은 실험실 마우스 유두에서의 RXFP1의 고도 발현 (도 6 참조), 즉 AQP2 및 AQP4를 발현하는 신장의 특정 영역 (도 8 및 10 참조)을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 실험실 래트 신장의 피질 및 수질 영역 모두의 신세뇨관에서 RXFP1의 발현을 발견하였다 (도 7). 서로 다른 종에서의 이러한 발견은 물 투과성을 담당하는 AQP2 및 AQP4를 발현하는 신장 영역에서의 릴랙신에 대한 수용체의 증거를 제공한다. 또한, 릴랙신은 바소프레신과 관계없이 작용할 수 있으며, 신장 자체에 대하여 직접적인 삼투조절 효과를 가질 수 있을 것이다 (실시예 2 참조). 본 발명자들은 마우스 및 래트에서의 릴랙신 처리가 신장에서의 AQP2 및 AQP4의 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다 (도 8, 10 및 11 참조). 이는 릴랙신과 아쿠아포린 사이의 첫 번째 연결점을 확립한다. 래트에서의 릴랙신 처리는 또한 뇌에서 신경 활성을 증가시킴으로써 바소프레신 방출을 자극하는 것으로도 알려져 있다 (문헌 [McKinley et al . (2004) Journal of Neuroendocrinology 16:340-347]). 이러한 발견들을 바탕으로, 본 발명자들은 신장에서의 물-보존 기작이 아쿠아포린을 사용한 릴랙신의 직접적인 조절 작용, 또는 뇌로부터의 바소프레신 방출을 수반하는 AQP에 대한 간접적인 조절 작용에 따른다는 것을 제안한다.

릴랙신을 사용한 부종의 치료

부종은 조직 내에 액체가 포획되는 경우에 야기되는 팽창의 형태이다. 그것은 하지, 즉 발, 발목, 및 다리에서 가장 빈번하게 발생하나, 안면 및 손과 같은 신체의 다른 부분에서 발생할 수도 있다. 부종은 너무 오랫동안 한 장소에 앉아있거나 서있을 때에 발생할 수 있는데, 중력에 의해 물이 다리 및 발로 끌어내려지기 때문이다. 부종은 또한 다리 정맥 판막에서의 약화 (즉, 정맥 부전)의 결과일 수도 있다. 이와 같은 병태는 정맥이 혈액을 다시 심장까지 되돌려 밀어주는 것을 어렵게 함으로써, 정맥류 및 다리에서의 액체의 축적으로 이어진다. 특정 질환 또는 병태 (예컨대 울혈성 심부전, 폐 질환, 간 질환, 신장 질환, 갑상선 질환, 외상성 두부 손상)는 부종을 야기하거나, 그것을 더욱 두드러지게 할 수 있다. 신체의 몸통 하부에서 자궁이 혈관에 압력을 가할 때에는, 임신이 다리에 부종을 야기할 수 있다. 또한, 임신과 관련된 이상인 전자간증 및 자간증이 부종으로 이어질 수 있다. 전자간증은 혈관 내에 변화를 야기함으로써, 그것이 조직으로 "누출"되도록 한다. 누출은 조직의 팽창을 야기하며, 그것은 부종을 초래한다. 전자간증이 더 중증이 되면, 간에서 팽창이 발생할 수 있는데, 잠재적으로 그것은 출혈을 동반한 간의 파열로 이어진다. 때로는, 팽창이 뇌에서 발생할 수도 있는데, 그것은 자간증으로 알려져 있는 발작으로 이어진다.

뇌 부종은 치료되지 않을 경우 사망으로 이어질 수 있는 위험한 병태이다. 그것은 뇌의 세포내 및/또는 세포외 공간에서의 과도한 물 축적의 결과이다. 급성 및 악성 고혈압에서 발생하는 정수압(hydrostatic) 대뇌 부종; 뇌암에 의해 야기되는 대뇌 부종; 및 고소성 대뇌 부종 (HACE)으로 추가 분류되는 혈관성 대뇌 부종을 포함하여, 상이한 형태의 대뇌 부종들이 존재한다. 혈관성 대뇌 부종 이외에도, 세포독성 대뇌 부종 (즉, 신경교 세포 막에서의 나트륨 및 칼륨 펌프의 부적절한 기능을 초래하며, 나트륨 및 물의 세포 보유, 및 회색질 및 백색질에서의 팽창된 성상세포로 이어지는, 세포 대사의 붕괴로 인한 것); 삼투성 대뇌 부종 (즉, 뇌의 대뇌-척수액 (CSF) 및 세포외 액체 (ECF) 삼투압이 붕괴되고, 그에 의해 비정상적인 압력 구배가 생성됨으로써, 물이 뇌로 유입되는 것); 및 간질 대뇌 부종 (CSF가 뇌로 침입하여 백색질의 세포외 공간에 확산되도록 하는 CSF의 뇌실막-통과 흐름을 초래하는 CSF-뇌 장벽의 붕괴에 부종이 기인하는 폐쇄성 뇌수종에서와 같은 것)이 존재한다.

혈관성 부종은 혈액 뇌 장벽의 파괴에 의해 야기된다. 이는 보통은 격리되어 있는 혈관내 단백질 및 액체가 대뇌 실질 세포외 공간으로 침입하는 것을 가능케 한다. 일단 혈장 성분이 혈액 뇌 장벽을 건너고 나면, 종종 매우 빠르게 부종이 확산된다. 물이 백색질에 진입할 때, 그것은 섬유로(fiber tract)를 따라 세포외로 이동하는데, 이는 회색질에도 영향을 줄 수 있다. 이러한 유형의 부종은 두부 외상, 종양, 국소 염증, 말기 단계의 대뇌 허혈 및 고혈압성 뇌병증에 대한 반응으로써 발견된다. 예를 들면, 미국 내에서만 1년 기준으로 약 2백만건의 두부 손상으로 인한 응급실 방문, 약 475,000건의 두부 외상으로 인한 입원, 약 52,000건의 사망, 및 대략 80,000건의 중증 장기 장애가 존재한다. 아직도, 중증 두부 손상 및 그로 인한 부종의 치료를 위한 FDA 승인 약물은 존재하지 않는다. 외상성 두부 손상을 나타내는 환자는 종종 심각하게 손상되어, 일시적이거나 일시적이지 않을 수 있는 의식의 상실, 기억 상실 및 국소적 신경 결함으로 고통받는다.

대뇌 부종은 AQP1, AQP4 및 AQP9와 관계되는 것으로 여겨진다. 특히, 뇌 내에서 가장 풍부한 아쿠아포린인 AQP4가 뇌의 물 생리, 뇌 부종 및 뇌수종에서 역할을 하는 것으로 보인다 (문헌 [Brian et al . (2010) Cerebrospinal Fluid Research 7:15]). 실험적으로 유도된 (예컨대 에피손(epison) 독소 처리를 통함) 래트 모델의 대뇌 부종에서 AQP4 발현이 증가하는데, 이는 이전의 발견들과 일치한다 (문헌 [Manley et al .] (상기) 참조). 그러나, 또 다른 실험 모델에서는, 성상세포 엔도텔린 B (ETB) 수용체의 직접적인 활성화가 AQP4 발현을 감소시킴으로써, 감소된 부종 액체의 배설을 초래하고, 혈관성 뇌 부종의 악화로 이어지는 것으로 보인다 (문헌 [Koyama et al . (2010) Neuroscience Letters 469:343-347]). 흥미롭게도, 상기 연구는 또한 물 진입의 방지로 인하여 AQP4 발현의 감소에 의해 세포독성 부종이 개선될 수 있음과 동시에, 혈관성 부종은 증가된 부종 액체의 유출로 인하여 AQP4 발현의 증가에 의해 개선될 수 있다는 것을 암시하였다. 본 발명자들은 릴랙신 치료가 세포독성 부종에서 AQP4 발현을 감소시킬 수 있을 것으로 생각하는데, 이는 ETB 수용체 효능제 및 엔도텔린-1 길항제로서 릴랙신이 효과적이라는 것과 일치한다 (문헌 [Dschietzig et al . (2003) Circ Res . 92:32-40]). 릴랙신은 또한 혈관성 부종에서 AQP4 발현을 증가시킬 수 있는데, 이는 제2의 기작을 통하여 이루어질 수 있다. 특히, 본 발명자들은 릴랙신을 사용한 처리 후의 (AQP2의 증가 이외의) 신장 조직에서의 AQP4 발현의 증가를 밝혀냈다. 따라서, AQP4와 관련한 유사한 효과가 혈관성 부종의 대뇌 조직에서도 발생할 수 있으며, 이는 잠재적 신규 약물 표적으로서의 AQP4에 부합한다 (문헌 [Manley et al .] 및 [Koyama et al .] (상기) 참조).

안구 부종은 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5와 관련되는 것으로 여겨진다. 인공수정체/무수정체 수포 각막병증 (PBK/ABK) 각막 및 푹스 이영양증 각막과 관련된 안구 부종은 병에 걸린 각막에서 증가된 AQP3 및 AQP4 발현을 나타내는데, 이는 팽창에 기여할 수 있다. 본 발명자들은 릴랙신을 사용하여 안구 부종을 치료하는 것이 환자의 각막에서 AQP3 및/또는 AQP4의 조절을 야기할 수 있을 것으로 생각한다.

폐 부종은 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5와 관련되는 것으로 여겨진다. 래트 및 마우스 모델에서의 실험적으로 유도된 폐 부종에서, AQP1, AQP4 및 AQP5 발현은 감소되며, AQP3 발현은 증가한다. 예를 들면, 티오우레아를 사용한 치료는 이들 아쿠아포린의 발현의 매우 빠른 감소를 야기하는 반면, 산소과잉 치료는 72시간에 걸친 감소를 야기한다. 본 발명자들은 릴랙신을 사용하여 폐 부종을 치료하는 것이 AQP1, AQP3, AQP4 및/또는 AQP5를 조절할 수 있을 것으로 생각한다. 한 가지 가능한 시나리오는 릴랙신 치료의 결과로서의 환자 폐에서의 AQP1, AQP4 및/또는 AQP5 발현의 증가 및 AQP3 발현의 감소이다.

본 개시내용에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 릴랙신이 물 채널 (즉 아쿠아포린)을 조절 및/또는 조정하는 기작을 통하여 전신성 부종을 개선하는 것으로 생각된다. 그러나, 2종의 추가적인 기작 중 하나 이상이 적어도 부분적으로 부종의 감소에 기여할 수 있다. 예컨대, 일부를 담당할 수도 있는 제2의 기작은 예컨대 폐 부종에서의 이온 수송 및 삼투 구배의 조절로써, 릴랙신은 이온 수송 및 그에 따른 폐포 상피 세포를 가로지르는 삼투 구배를 증가시킬 수 있으며, 그에 의해 폐 공간으로부터의 액체 제거를 촉진할 수 있다 (문헌 [Zemans et al . (2004) Critical Care 8:469-477]). 포함될 수 있는 제3의 기작은 혈류역학의 조절로써, 예컨대 나트륨의 과도한 신장 보유가 모든 형태의 전신성 부종에 잠재하는 원인이므로, 신장 혈류역학 및/또는 GFR을 개선하는 것에 의해, 릴랙신은 신장 나트륨 배설을 촉진함으로써 전신성 부종을 개선할 수 있다. 또한, 릴랙신은 적어도 단기간 동안 나트륨이뇨성일 수 있는데, 이는 전신성 부종의 설정에서 신장 나트륨 배설을 촉진하게 된다 (문헌 [Jeyabalan & Conrad (2010) Renal Physiology and Pathophysiology in Pregnancy . In : Renal and Electrolyte Disorders , 4th Edition, RW Schrier, ed. Little Brown and Company]).

요약하면, 본 발명자들은 릴랙신이 다양한 조직에서 아쿠아포린의 발현을 조절할 수 있음을 밝혀냈다. 따라서, 릴랙신은 혈관성 부종의 치료에 효과적일 것으로 예상되는데, 그것이 아쿠아포린의 발현을 증가시키고 부종성 조직 또는 기관으로부터의 물의 이동을 촉진함으로써, 물 축적 및 팽창을 감소시키기 때문이다. 다르게는, 릴랙신은 아쿠아포린의 발현을 감소시키고 조직 또는 기관으로의 물의 추가적인 이동을 감소시킴으로써, 세포독성 부종의 악화를 방지할 수 있다. 또한, 릴랙신은 조직과 혈액 사이의 용질 수송을 조절함으로써, 조직 내 및 외로의 물 이동에 영향을 주어, 조직 및 기관에서 부종을 감소시킬 수 있다. 또한, 이는 다양한 기관에서 혈관계에 대한 릴랙신의 혈류역학적 작용을 수반함으로써, 병에 걸린 기관으로부터의 물의 수송 제거를 개선할 수 있다.

본 발명자들은 릴랙신을 투여하는 것에 의한 환자에서의 부종의 치료 방법을 고안하였다. 그에 따르면, 환자는 1일당 대상체 체중 kg당 약 1 내지 1000 ㎍ 범위의 양의 제약 활성 릴랙신 (예컨대 합성, 재조합, 유사체, 효능제 등) 1일 용량으로 치료된다. 언급된 값의 문맥에서 사용될 때의 "약"이라는 용어는 언급된 값의 상하 10% 까지의 범위 (예컨대 언급된 값의 90-110%)를 포괄한다. 예를 들면, 약 30 ㎍/kg/일의 정맥내 (IV) 주입 속도는 27 ㎍/kg/일 내지 33 ㎍/kg/일의 IV 주입 속도를 포괄한다. 일 실시양태에서, 릴랙신의 투여량은 10, 30, 100 및 250 ㎍/kg/일이다. 이러한 투여량은 약 1, 3, 10, 30, 75 또는 100 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 초래한다. 바람직한 일 실시양태에서, 제약 활성 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 30 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제약 활성 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 10 내지 약 250 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신의 투여는 약 0.5 내지 약 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 300 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 10 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 가장 바람직하게는, 릴랙신의 투여는 10 ng/ml 이상의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 이러한 릴랙신 농도는 비제한적으로 대뇌 부종, 안구 부종, 폐 부종, 복수, 유전성 혈관부종, 말초 부종, 및 전신성 부종을 포함한 부종과 연관된 액체 축적을 개선 또는 감소시킬 수 있다.

릴랙신을 사용한 신장기원 요붕증 ( NDI )의 치료

신장기원 요붕증 (NDI)은 신세뇨관이 바소프레신으로도 지칭되는 항이뇨 호르몬 (ADH)에 대하여 반응하지 않는 경우에 발생하는 병태이다. 결과적으로, 소변 농축 기작이 손상됨으로써, 병에 걸린 대상체의 과도한 묽은 소변 생성을 초래한다. 주 증상인 다량의 묽은 소변 배설 (즉 다뇨증) 이외에도, 병에 걸린 대상체는 소변에서의 물 손실을 보충하기 위한 다량의 물 섭취 (즉, 다음증)를 필요로 한다. 추가적인 합병증에는 빠른 탈수, 과도한 갈증, 과민성, 졸음증, 열, 구토, 변비 또는 설사, 발작, 및 체중 획득 실패가 포함된다.

NDI는 V2 수용체에서의 부분적인 불활성화 돌연변이 또는 SNP에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 릴랙신이 주 세포에서 cAMP를 증가시키는 기작에 의해 NDI를 개선하는 것으로 생각한다. 릴랙신 및 AVP를 위한 cAMP 풀(pool)에 중첩이 존재하므로, 릴랙신은 각각 정점측 및 기저측 막에서의 AQP2 및 AQP3 삽입을 강화할 수 있음은 물론, V2 수용체에서의 부분적인 불활성화 돌연변이 또는 SNP의 설정에서 그의 발현을 증가시킬 수 있다. 그러나, 2종의 추가적인 기작 중 하나 이상이 NDI를 개선하는 데에 적어도 부분적으로 기여할 수도 있다. 따라서, 제2 기작에는 말단 집합관 주 세포에서 cAMP를 증가시키는 것이 포함된다. 상기한 바와 같은 cAMP 신호전달은 막에서의 UT-A1 및 UT-A3의 삽입으로 이어짐으로써, 피질-유두 삼투 구배를 60%만큼 크게 담당하는 내부 수질에서의 우레아 침착을 촉진한다. 제3의 기작에는 그의 활성이 C-P 삼투 구배의 형성, 소변 농축 및 희석에 중추적인 "유일한 효과"를 구성하는 수질성의 두꺼운 ALH에서의 Na/K/2Cl 공동수송체의 발현을 증가시키는 것이 포함된다 (문헌 [Hebert & Andreoli (1984) American Journal of Physiology 246:F745-756]).

본 발명자들은 릴랙신을 투여하는 것에 의한 환자에서의 NDI의 치료 방법을 고안하였다. NDI에 걸린 환자는 1일당 대상체 체중 kg당 약 1 내지 1000 ㎍ 범위의 양으로 제약 활성 릴랙신 (예컨대 합성, 재조합, 유사체, 효능제 등)을 공급하는 피하 펌프를 통하여 치료된다. 일 실시양태에서, 릴랙신의 투여량은 10, 30, 100 및 250 ㎍/kg/일이다. 이러한 투여량은 약 1, 3, 10, 30, 75 또는 100 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 초래한다. 바람직한 일 실시양태에서, 제약 활성 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 30 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제약 활성 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 10 내지 약 250 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신의 투여는 약 0.5 내지 약 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 300 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 10 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 가장 바람직하게는, 릴랙신의 투여는 10 ng/ml 이상의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 이러한 릴랙신 농도는 NDI와 연관된 과도한 묽은 소변 생성 및 동반 합병증을 개선 또는 감소시킬 수 있다.

릴랙신 조성물 및 제제

릴랙신, 릴랙신 효능제 및/또는 릴랙신 유사체는 본 개시내용의 방법에서 사용될 약제로 제제화된다. 릴랙신 수용체에 대한 생물학적으로 또는 제약상 활성인 릴랙신 (예컨대 합성 릴랙신, 재조합 릴랙신), 또는 릴랙신 효능제 (예컨대 릴랙신 유사체 또는 릴랙신-유사 조절제)의 결합과 연관된 생물학적 반응을 자극할 수 있는 어떠한 조성물 또는 배합물도 본 개시내용의 약제로서 사용될 수 있다. 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 일반적인 세부사항들은 과학 문헌에 충분히 기술되어 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton Pa.] 참조). 제약상 활성인 릴랙신을 함유하는 제약 제제는 약제 제조용으로 당업계에 알려져 있는 어떠한 방법에 따라서도 제조될 수 있다. 본 개시내용의 방법에서 사용되는 제약 활성 릴랙신 또는 릴랙신 효능제를 함유하는 제제는 비제한적으로 정맥내, 피하, 근육내, 설하, 비내, 대뇌내, 대뇌뇌실내, 국소, 경구, 유리체내 및 흡입을 통한 것을 포함한 어떠한 통상적으로 허용가능한 방식의 투여를 위해서도 제제화될 수 있다. 예시적인 예는 하기에 제시하였다. 바람직한 일 실시양태에서, 릴랙신은 정맥내 또는 피하로 투여된다.

릴랙신이 정맥내 또는 피하 주사 (예컨대 주입, 볼루스, 펌프)에 의해 전달되는 경우, 제약 활성 릴랙신 또는 제약 활성 릴랙신 효능제를 함유하는 제제는 멸균 주사가능 제제, 예컨대 멸균 주사가능 수성 또는 유질 현탁액의 형태일 수 있다. 이와 같은 현탁액은 상기에서 언급된 적합한 분산 또는 습윤제, 및 현탁화제를 사용하여 공지의 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 비독성인 비경구-허용가능 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용매로는 물 및 링거 용액, 등장성 염화나트륨이 있다. 또한, 멸균 고정 오일(sterile fixed oil)이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이를 위해서는, 합성의 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여, 어떠한 무자극성의 고정 오일도 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산 역시 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

본 개시내용의 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물로서 릴랙신을 함유한다. 그와 같은 부형제에는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아카시아 고무, 및 분산 또는 습윤제 예컨대 자연 발생 인지질 (예컨대 레시틴), 알킬렌 옥시드의 지방산과의 축합 생성물 (예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드의 장쇄 지방족 알콜과의 축합 생성물 (예컨대 헵타데카에틸렌 옥시세탄올), 에틸렌 옥시드의 지방산 및 헥시톨로부터 유래하는 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노-올레에이트), 또는 에틸렌 옥시드의 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래하는 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)가 포함된다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스, 아스파탐 또는 사카린을 함유할 수도 있다. 제제는 삼투압에 대하여 조정될 수 있다.

오일 현탁액은 아라키스(arachis) 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일에, 또는 액체 파라핀과 같은 무기 오일에 릴랙신을 현탁하는 것에 의해 제제화될 수 있다. 오일 현탁액은 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 감미제는 맛좋은 경구용 제제를 제공하기 위하여 첨가될 수 있다. 이러한 제제들은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 본 개시내용의 분산성 분말 및 과립은 분산제, 현탁화제 및/또는 습윤제, 및 하나 이상의 보존제와의 혼합물로서의 릴랙신으로부터 제제화될 수 있다. 적합한 분산 또는 습윤제, 및 현탁화제는 상기에 개시된 것들로 예시된다. 추가적인 부형제, 예컨대 감미제, 향미제 및 착색제가 존재할 수도 있다.

본 개시내용의 제약 제제는 수-중-유 에멀젼의 형태일 수도 있다. 오일 상은 식물성 오일 예컨대 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 무기 오일 예컨대 액체 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제에는 자연-발생 고무, 예컨대 아카시아 고무 및 트라가칸트 고무, 자연 발생 인지질, 예컨대 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래하는 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노-올레에이트, 및 이러한 부분 에스테르의 에틸렌 옥시드와의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트가 포함된다.

릴랙신 제제의 투여 및 투여 계획

본 개시내용의 방법에서 사용되는 제약상 활성인 릴랙신 또는 제약상 유효한 릴랙신 효능제를 함유하는 제제는 비제한적으로 정맥내, 피하, 근육내, 설하, 비내, 대뇌내, 대뇌뇌실내, 국소, 경구, 유리체내 및 흡입을 통한 것을 포함하여, 어떠한 통상적으로 허용가능한 방식으로도 투여될 수 있다. 투여는 약물의 약동학 및 기타 특성, 그리고 환자의 건강 상태에 따라 달라지게 된다. 일반적인 지침은 하기에 제시되어 있다.

본 개시내용의 방법은 부종과 연관된 액체 축적을 감소시킨다. 또한, 본 개시내용의 방법은 신장기원 요붕증 (NDI)에 걸린 환자에서 만성적인 묽은 소변 배설을 감소시킨다. 이를 완수하는 데에 적당한 단독, 또는 또 다른 작용제 또는 약물과의 조합으로써의 릴랙신의 양은 치료 유효 용량인 것으로 생각된다. 이와 같은 사용에 효과적인 투여 일정 및 양, 즉 "투여 계획(dosing regimen)"은 질환 또는 병태의 단계, 질환 또는 병태의 중증도, 부정적인 부작용의 중증도, 일반적인 환자 건강 상태, 환자의 물리적 상태, 연령 등을 포함한 다양한 인자들에 따라 달라지게 된다. 환자를 위한 투여량 계획을 산정함에 있어서는, 투여 양식 역시 고려된다. 투여량 계획은 또한 약동학, 즉 흡수 속도, 생체이용률, 대사, 제거 등도 고려되어야 한다. 이러한 원리를 바탕으로, 릴랙신은 상기 장애에 걸린 개체에서 부종 및/또는 NDI를 치료하는 데에 사용될 수 있다.

본 개시내용은 또한 약제가 특히 병에 걸린 개체를 치료하기 위하여 제조되는, 부종 및/또는 NDI 치료용 의약의 제조에서의 릴랙신의 용도를 제공한다. 추가적으로 고려되는 것은 환자가 이전에 (예컨대 수시간 전에, 1일 이상 전에 등) 다른 약물을 사용하여 치료된 적이 있는, 부종 및/또는 NDI 치료용 의약의 제조에서의 릴랙신의 용도이다. 일 실시양태에서, 상기 다른 약물은 여전히 환자의 생체내에서 활성이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 다른 약물은 환자의 생체내에서 더 이상 활성이 아니다.

최신 기술은 임상의가 각 개별 환자에 대하여 릴랙신의 투여량 계획을 결정하는 것을 허용하고 있다. 예시적인 예로서, 릴랙신에 대하여 하기에 제공되는 지침이 본 개시내용의 방법을 실시할 때 투여되는 제약 활성 릴랙신을 함유하는 제제의 투여량 계획, 즉 투여 일정 및 투여량 수준을 결정하는 길잡이로 사용될 수 있다. 일반적인 지침으로서, 제약상 활성인 H1, H2 및/또는 H3 인간 릴랙신 (예컨대 합성, 재조합, 유사체, 효능제 등)의 1일 투여량은 통상적으로 1일당 대상체 체중 kg당 약 1 내지 1000 ㎍ 범위의 양인 것으로 예상된다. 일 실시양태에서, 릴랙신의 투여량은 10, 30, 100 및 250 ㎍/kg/일이다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 투여량은 약 1, 3, 10, 30, 75 또는 100 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 초래한다. 바람직한 일 실시양태에서, 제약상 유효한 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 30 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제약상 유효한 릴랙신 또는 그의 효능제는 약 10 내지 약 250 ㎍/kg/일로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신의 투여는 약 0.5 내지 약 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 300 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 10 ng/ml의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 가장 바람직하게는, 릴랙신의 투여는 10 ng/ml 이상의 혈청 릴랙신 농도를 유지하도록 계속된다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 이러한 혈청 릴랙신 농도를 초래하는 투여를 포함한다. 이러한 릴랙신 농도는 비제한적으로 대뇌 부종, 안구 부종, 폐 부종, 복수, 유전성 혈관부종, 말초 부종, 및 전신성 부종을 포함한 부종과 연관된 액체 축적을 개선 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 이러한 릴랙신 농도는 NDI에서의 만성적인 묽은 소변 배설을 개선 또는 감소시킬 수 있다. 대상체에 따라, 릴랙신 투여는 특정 시간 기간 동안만큼, 또는 대상체에서 안정성을 달성하는 데에 필요한 동안만큼 유지된다. 예를 들면, 릴랙신 치료 기간은 바람직하게는 환자에 따라 약 4시간 내지 약 96시간, 더욱 바람직하게는 8시간 내지 약 72시간의 범위, 그리고 필요한 만큼의 1회 이상 임의적 반복 치료로 유지된다.

릴랙신 제제의 단일 또는 다중 투여는 부종 및/또는 NDI로 고통받는 환자에게 필요하며 허용되는 만큼의 투여량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 제제는 병태를 효과적으로 개선하기에 충분한 양의 릴랙신을 제공해야 한다. 릴랙신의 정맥내 피하 투여를 위한 통상적인 제약 제제는 구체적인 요법에 따라 달라지게 된다. 예를 들면, 릴랙신은 단일요법 (즉 다른 동시 의약이 없음)을 통하여, 또는 또 다른 의약과의 조합 요법으로써 환자에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 릴랙신은 단일요법으로 매일 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 릴랙신은 또 다른 약물과의 조합 요법으로 매일 환자에게 투여된다. 특히, 환자에게 투여되는 릴랙신의 투여량 및 빈도는 연령, 질병의 정도, 약물 내성, 및 동시 의약 및 상태에 따라 달라질 수 있다.

일부 실시양태에서, 릴랙신은 1 mg/ml 용액 (5 ml 유리 바이알 내의 3.5 ml)으로 제공된다. 릴랙신용 희석제와 동일한 위약도 동일한 바이알에 제공된다. 릴랙신 또는 위약은 피기백(piggyback) 구성으로 일반 염수와 조합된 시린지 펌프를 사용하여 작은 부피로 환자에게 정맥내 또는 피하 투여될 수 있다. 릴랙신 제제를 투여하는 데에는, 릴랙신과 함께 사용하도록 시험 및 승인된 상용성 튜브 및 3-웨이식 마개(3-way stopcock)가 사용된다. 용량은 중량 기준으로 투여되며, 예컨대 주입 펌프에 의해 전달되는 릴랙신 약물의 속도를 조정함으로써, 각 환자에 대하여 조정된다.

[ 실시예 ]

하기의 구체적인 실시예들은 본 개시내용의 예시를 위한 것으로써, 청구범위의 영역을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

실시예 1

릴랙신은 자궁경부에서 아쿠아포린 -3 및 아쿠아포린 -5를 조절한다

릴랙신은 아쿠아포린 (AQP)을 조절함으로써, 자궁경부 물 함량 및 콜라겐 섬유 분산을 증가시킨다. 릴랙신 녹아웃 (Rln -/-) 마우스의 자궁경부에서는 임신 말기에 aqp3의 유전자 발현이 상당히 감소되었다 (도 1A). AQP3 단백질은 마우스 자궁경부의 기저측 상피에 위치되어 있었는데, Rln -/- 마우스에서는 이 영역에서 면역반응성-AQP3의 감소가 존재하였다 (도 1B). 2차 연구에서는, 임신한 Rln -/- 마우스를 릴랙신으로 처리하였다. 이는 위약 대조군에 비해 자궁경부 aqp3의 상당한 증가 및 aqp5 유전자 발현의 감소를 초래하였다 (도 3). 릴랙신으로 처리된 임신한 Rln -/- 마우스는 위약 대조군에 비해 기저측 상피에서 더 고도의 면역반응성 AQP3을 가졌으며, 상피의 정점 층에서 더 낮은 면역반응성 AQP5를 가졌다 (도 4). 또한, 릴랙신 처리는 자궁경부 습윤 중량 및 기질 ECM 내의 콜라겐 분산을 상당히 증가시켰다. 이러한 발견은 릴랙신이 아쿠아포린 유전자 및 단백질 발현을 조절함으로써, 생식 조직에서 물 균형을 조절할 수 있다는 것을 보여주었다.

유전자 및 단백질 발현	릴랙신 처리	염수 처리	기능적 중요성
aqp3 및 AQP3	더 높음	효과 없음	자궁경부 상피 세포로부터 기질로의 물 유출을 가능케 함
aqp5 및 AQP5	더 낮음	효과 없음	내강으로부터 자궁경부 상피 세포로의 물 유입을 가능케 함

더 구체적으로, 릴랙신 유전자 녹아웃 마우스는 임신 말기에 더 고도의 자궁경부 콜라겐 밀도를 갖지만, 이는 감소된 MMP로 인한 것은 아니다. 여기에서, 본 발명자들은 자궁경부 수화를 증가시키고 콜라겐 섬유 분산을 야기하는 자궁경부 기질로의 물 보충을 수반하는 대안적인 릴랙신 작용 기작을 제안한다. 상기에서 언급한 연구는 릴랙신이 아쿠아포린 (AQP)을 조절한다는 가설을 시험하였다. 더욱 상세하게 말하자면, 각 임신 (pc) 14.5, 16.5, 18.5 및 19일차, 그리고 분만후 1일차에 릴랙신 야생형 및 릴랙신 녹-아웃 마우스로부터 자궁경부를 수집하여, 정량 PCR 분석에 의해 유전자형들 간의 aqp3 및 aqp5 유전자 발현을, 그리고 면역조직화학에 의해 단백질 발현을 비교하였다. 상기에서 언급한 2차 연구에서, 릴랙신 녹-아웃 마우스에, pc 12.5일차에 알제트(Alzet) 삼투 미니펌프를 이식하여, 재조합 H2 인간 릴랙신 (0.05 ㎍/시간; 코르테라, 인크(Corthera, Inc) 사) 또는 0.9% 염수 중 어느 하나를 주입하였다. 주입 4 또는 6일 후, 자궁경부를 수집하였다. 릴랙신 처리는 위약 대조군에 비해 자궁경부 aqp3의 상당한 증가 및 aqp5 유전자 발현의 감소를 야기하였다. 또한, 릴랙신 처리는 자궁경부 습윤 중량의 6-배 증가 및 릴랙신 수용체 RXFP1 발현의 감소를 야기하였다. 이러한 새로운 발견은 릴랙신이 상피의 기저측 영역에서 AQP3을 상향-조절함으로써, 내강으로부터 기질로의 물 유입을 유지한다는 것을 암시한다 (도 4). 릴랙신은 또한 AQP5를 하향-조절함으로써, 정점 영역으로부터 내강으로의 물 손실을 방지할 수 있다 (도 4). 이러한 데이터는 릴랙신이 AQP를 조절하는 것에 의해 자궁경부 수화를 촉진한다는 것을 암시한다. 이는 ECM에서 콜라겐 피브릴 분산을 야기함으로써, 자궁경부 성숙을 촉진할 수 있다.

실시예 2

릴랙신은 신장에서 아쿠아포린 -2 및 아쿠아포린 -4를 조절한다

릴랙신-결핍 마우스는 비정상적으로 높은 혈장 삼투압을 보고하는데, 이는 혈액 중 전해질, 우레아 및 기타 이온들 농도의 척도이다. 해당 동물에서의 높은 혈장 삼투압은 신세뇨관에서의 소변 농축 기작이 손상되었을 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, 릴랙신을 사용하여 동물들을 처리할 경우, 역전이 발생하여 혈장 삼투압이 감소된다. 본 발명자들은 릴랙신이 뇌의 "갈증 인식" 센터를 변경하여 아르기닌 바소프레신 (AVP) 방출을 자극하고, 그것은 이후 집합관에서 그의 V2 수용체에 작용함으로써, AQP2를 통한 물 투과성을 증가시키는 것으로 생각한다. 본 발명자들은 마우스 및 래트의 신장에서 RXFP1 릴랙신 수용체가 실제로 발현된다는 것을 발견하였다 (도 7). 이와 같은 RXFP1의 발현은 물 투과성을 담당하는 신장의 영역, 즉 마우스의 유두 및 래트의 내부 수질에서 관찰되었다 (도 7). 이러한 데이터는 릴랙신이 AVP와 관계없이 작용할 수 있으며, 신장 자체에 대하여 직접적인 삼투조절 효과를 가진다는 것을 암시한다. 다른 가능성은 릴랙신이 AVP와 상승적으로 작용하여 그의 물-보존 능력을 강화하는 것이다.

유전자 발현	릴랙신 처리	염수 처리	기능적 중요성
aqp2	더 높음	효과 없음	신세뇨관 여과액으로부터 집합관 세포로의 물 이동을 촉진함
aqp4	더 높음	효과 없음	집합관 세포로부터 혈액으로의 물 이동을 촉진하여 혈장 삼투압을 낮춤

마우스 및 래트에서의 릴랙신 처리는 신장에서의 AQP2의 발현을 증가시켰다 (도 8). 도 8A는 염수 (VEH) 대조군과 비교하여, 14일 동안 릴랙신을 사용하여 처리된 수컷 Rln +/+ 마우스 신장에서의 aqp2 유전자 발현의 증가를 도시하는 것으로, 여기에서 β-액틴은 표준화 대조군이다. 도 8B는 5일 동안 릴랙신을 사용하여 처리된 수컷 Rln -/- 마우스에서의 aqp2 유전자 발현의 증가를 도시한다. 이와 같은 발견은 신장에서의 릴랙신과 아쿠아포린 사이의 조절 연결점을 제공한다. 결과적으로, 본 발명자들은 신장에서의 물-보존 기작이 아쿠아포린 (AQP)을 매개하는 릴랙신의 직접적인 작용은 물론, 뇌로부터의 AVP 방출에 대한 간접적인 작용에도 의존할 수 있다는 것을 제안한다.

래트에서의 5일 동안의 릴랙신을 사용한 처리는 수컷 래트 신장의 수질 영역 (유두를 포함함)에서의 aqp2 유전자 발현을 증가시켰다 (도 8C). 이와 같은 발견은 포유동물에서 릴랙신이 신장 내에서 작용하여, AQP2 발현을 증가시키고, 신세뇨관 여과액으로부터 다시 혈액으로의 물 분자의 이동을 조절할 수 있다는 추론을 뒷받침한다.

임신한 래트에서의 래트 릴랙신에 대한 모노클로날 항체 (MCA1)를 사용한 처리는 신장의 수질 영역에서의 aqp2 유전자 발현을 감소시켰다 (도 9). 이와 같은 발견은 내인생 릴랙신이 신장에서 아쿠아포린을 조절하는 데에 역할을 한다는 생각을 뒷받침한다. 결과적으로, 본 발명자들은 신장에서의 임신-관련 물-보존 기작이 아쿠아포린을 매개하는 릴랙신의 직접적인 작용에 따를 수 있다는 것을 제안한다.

릴랙신은 신장에서 AQP4를 증가시킨다. 본 발명자들은 먼저 도 10A에 도시되어 있는 바와 같은 Rln -/- 마우스 신장의 유두 영역에서 aqp4 유전자 발현이 상당히 감소되었음을 제시하였다. 도 10B 및 10C는 수컷 Rln -/- 마우스에서의 5일 또는 14일 중 어느 하나 동안의 릴랙신을 사용한 처리가 유두에서의 aqp4 유전자 발현을 증가시켰다는 것을 나타낸다. 이와 같은 발견은 포유동물에서 릴랙신이 신장 내에서 작용하여, AQP4 발현을 증가시키고, 신세뇨관 여과액으로부터 다시 혈액으로의 물 분자의 이동을 조절한다는 새로운 추론을 뒷받침한다.

수컷 래트에서의 5일 동안의 릴랙신을 사용한 처리는 신장의 수질 영역 (유두를 포함함)에서의 aqp4 유전자 발현을 증가시켰다 (도 11). 이와 같은 발견은 상이한 포유동물들에서 릴랙신이 신장 내에서 작용하여, AQP4 발현을 증가시킨다는 새로운 생각을 뒷받침한다.

실시예 3

신장의 집합관 세포에 대한 릴랙신의 작용

신장에서의 물-보존 기작은 아쿠아포린 (AQP)은 물론 AVP를 사용한 릴랙신-매개 상호작용에 의존하는 것일 수 있다. AVP-결핍 브래틀보로(Brattleboro) 래트 모델이 신장 집합관에서 AQP2 기능을 조절함에 있어서의 릴랙신 대 AVP의 기여를 평가하는 데에 사용될 수 있다.

상기 모델에서는, 체중, 물 및 식품 소비량, 대변 및 소변 배출량이 매일 기록되었다. 소변 샘플은 분광광도측정법 (싱크론(Synchron) CX5CE 델타; 베캠 코울터(Beckman Coulter))에 의해 전해질 및 우레아에 대하여 분석되었다. 삼투압은 빙점 강하에 의해 측정되었다 (삼투압측정기).

유전자 및 단백질 분석을 위하여, 9쌍의 신장을 피질과 내부 수질로 해부하였다. 3쌍의 신장은 절반으로 절단한 후, 면역조직화학용으로 폴리에스테르 왁스에 매립하기 위하여 PLP (파라포름알데히드/리신/페리오데이트)에 고정하였다. 정량 PCR (q-PCR)을 사용하여 유전자 발현을 측정하고, 상이한 신장 영역 및 2개 마우스 종 간에 비교를 수행하였다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석 및 면역조직화학에 의해 측정되었다. 또한, 삼투압측정기 및 RIA에 의해 혈장 삼투압 및 AVP 농도도 각각 측정하였다.

릴랙신은 집합관에서의 물 투과성을 증가시킴으로써, 해당 래트가 그의 소변을 농축하는 것을 가능케 하고, 그에 따라 과도한 물 손실을 감소시킬 것으로 예상되었다. 릴랙신 처리가 신장에서 AQP2 발현을 증가시킨다는 본 발명자들의 발견 (상기)은 릴랙신-결핍 동물에서의 비정상적으로 높은 혈장 삼투압이 집합관 내에서의 AQP2 발현 또는 AQP2 소포 전위의 결함과 관련된 것일 수 있다는 것을 암시한다.

내부 수질 집합관 (IMCD) 세포는 AQP2의 AVP-비의존 조절에서의 릴랙신의 역할을 입증하기 위한 모델을 제공한다. 10% BSA를 함유하는 DMEM/F12 배지를 사용하는 IV형 콜라겐-코팅 페트리 접시에 IMCD 세포를 시딩(seeding)하였다. 융합(confluence)시까지 4일 동안 세포를 성장시키고, 시딩 후 5일차에 처리하였다. 릴랙신 처리에 대하여 반응하여 나타나는 cAMP 농도 및 PKA 활성의 측정을 위하여, 인간 H2 릴랙신 (농도 0.1 pM - 1 μM)을 함유하는 배지에서 45분 동안 IMCD 세포를 인큐베이션하였다. PKA 억제에 적용되는 세포는 H2 릴랙신 인큐베이션 전에 10 μM H-89 (PKA 억제제)를 사용하여 60분 동안 예비-인큐베이션하였다. 이와 같은 농도의 H-89는 IMCD 세포에서 AQP2 인산화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 처리후, 세포를 용해 완충제 내에서 급속 냉동시켰다. 시중에서 입수가능한 키트 (미국 소재 카이만 케미칼(Cayman Chemical))를 사용하여 cAMP 함량 및 PKA 활성을 측정하였다. IMCD 세포에서의 Rxfp1 및 aqp2 유전자 발현을 측정하는 데에는 표준 분자 생물학 접근법이 사용될 수 있었다. AQP2의 세포내 배치를 평가하기 위하여, 처리 후 IMCD 세포를 4% PFA에 고정한 다음, 항-AQP2 항체 및 염소 항-토끼 IgG 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 2차 항체를 사용하여 인큐베이션함으로써, AQP2 단백질을 가시화하였다. 각 실험은 각 개별 샘플에 대하여 3벌로 3회 반복하였다 (n = 9). 정점측 세포 막에서의 AQP2-함유 소포의 해당 작용 부위로의 전위는 세포 주변에서의 더 큰 형광에 의해 검출될 수 있었다.

실시예 4

릴랙신 , 바소프레신 , 및 신장에서의 AQP2 의 조절

릴랙신은 바소프레신과 관계없이 신장에서 작용하여 AQP2 및 농축된 소변의 생성을 조절할 수 있다. 방법 및 분석에 대해서는 실시예 2 (상기)를 참조하라. 동종접합성 (di/di) 브래틀보로 래트는 그의 AVP를 생성하는 능력의 부재에 의해 야기되는 중증의 신장기원 요붕증 (NDI)을 가진다. 그들은 다량의 묽은 소변을 배설하며, 그와 같은 물 손실을 대체하기 위하여 대량으로 음용한다. 그들은 AVP를 가지지 않기 때문에, 집합관에 상당한 AQP2 감소가 존재한다. AVP를 사용한 이러한 동물의 처리는 정점측 막으로의 AQP2 전위를 증가시킴으로써 그들이 해당 소변을 농축하는 것을 가능케 한다. 그러나, 문헌상의 기록은 브래틀보로 래트가 특히 식품 박탈 후에는, AVP 없이도 그의 소변을 농축할 수 있다는 것을 암시하고 있다. 릴랙신이 AVP와 관계없이 AQP2를 조절할 수 있는 것이라면, 브래틀보로 래트에서의 릴랙신 처리는 AQP2 발현을 증가시키고, 그들이 해당 소변을 농축하는 것을 가능케 할 수 있는 것으로 기대될 수 있다. 이와 같은 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 릴랙신 및 대조군 (염수)에 대한 주입 기간을 나타내는 도 5에 개괄되어 있는 실험 프로토콜을 사용하였다. 구체적으로, 브래틀보로 래트 (3-4개월령의 6 ♀ 및 6 ♂)를 래트-전용 대사 케이지에서 식품 및 물과 함께 2회의 24시간 기간 동안 길렀다. 그들에게 알제트 삼투 미니펌프를 이식하여, 4 ㎍/시간의 인간 H2 릴랙신 또는 염수 중 어느 하나를 72시간 동안 전달하였다. 이와 같은 주입 속도는 롱 에반스(Long Evans) 래트에서, GFR 및 ERPF를 증가시키고 혈장 삼투압을 감소시켰다. 이 연구를 위한 대조군은 연령을 맞춘 롱-에반스 래트였다. 도 5에 나타낸 시점에, 체중, 물 및 식품 소비량, 대변 및 소변 배출량을 측정하였다. 소변 샘플을 분광광도측정법에 의해 전해질 및 우레아에 대하여 분석하였다. 삼투압은 빙점 강하에 의해 측정되었다. 릴랙신에 반응하여 나타나는 소변 배출량 및 혈장 삼투압의 감소는 신장 소변 농축 기작의 개선을 표시하게 될 것이다. 증가된 AQP2 발현은 아쿠아포린에 대한 릴랙신의 작용이 바소프레신과 관계없다는 것을 암시하게 될 것이다.

실시예 5

마우스에서 릴랙신은 대뇌 부종을 감소시킨다

혈관성 뇌 부종은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 세포 치밀 이음부에 파열이 존재하는 경우에 발생한다. 그것은 다량의 혈장 단백질 및 액체의 신경 조직의 세포외 공간으로의 진입, 및 뇌에서의 과도한 물 축적으로 이어진다. AQP4-매개 세포통과 물 이동은 혈관성 뇌 부종에서의 액체 제거에 중요하다 (문헌 [Papadopoulos et al . (2004) FASEB Journal 18:1291-1293]). 따라서, 뇌 AQP4 상향-조절의 증가는 혈관성 뇌 부종에서 새로운 치료 선택사항이 될 수 있다. 릴랙신-처리된 동물의 신장에서의 증가된 AQP4 발현 (상기한 실시예 2 참조)으로 볼 때, 본 발명자들은 릴랙신 처리가 뇌에서의 AQP4 발현도 증가시킬 수 있을 것으로 생각하였다. 이와 같은 가설을 시험하기 위하여, 수컷 래트에 알제트 삼투 미니펌프 및 뇌 주입 캐뉼라를 이식하고, 50-500 ng의 인간 H2 릴랙신 또는 염수를 24 또는 72시간 동안 전달하였다. 이러한 릴랙신의 용량 및 주입 속도는 래트에서 음용 거동 및 혈장 바소프레신을 증가시켰다. 뇌 피질, 뇌 줄기 및 소뇌로부터 뇌 조직을 수득하여, 정량 PCR, 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 AQP4 유전자 및 단백질 발현을 분석하였다.

마우스 및 래트에서의 릴랙신 처리는 신장의 수질 영역 (유두를 포함함)에서 AQP4의 발현을 증가시켰다 (도 10 및 11). 여기에서, 본 발명자들은 릴랙신이 뇌 내에서 작용하여 AQP4 발현을 증가시킴으로써, 대뇌 부종을 감소시킨다는 것을 제안한다. AQP4가 결핍된 마우스 (Aqp4-/-)에서는, 야생형 마우스에 비해 물 중독 및 국소적 대뇌 허혈에 이어지는 뇌 팽창이 감소된다 (문헌 [Manley et al . (2000) Nature Medicine 6:159-163]). 신장에서 나타난 것과 유사한 방식으로 릴랙신이 AQP4를 상향-조절하는 경우, 본 발명자들은 혈관성 부종 동물 모델에서의 릴랙신 처리가 뇌에서의 AQP4 발현을 증가시키고, 뇌 실질로부터의 부종 액체의 제거를 촉진할 것이라고 예상하였다 (문헌 [Papadopoulos et al .] (상기)). 이와 같은 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 등장성 액체를 뇌 실질에 주입하여, 혈관성 부종을 생성시킬 수 있었다. 구체적으로, 마취된 래트를 입체정위 틀(sterotaxic frame)에 지지하고, 기밀 250 μL 시린지에 결합된 보로실리케이트 유리 미세바늘 (팁 직경 약 100 ㎛)을 뇌 실질에 삽입하였다. 0.9% 염수 또는 릴랙신을 함유하는 등장성 액체를 0.5 ㎕/분의 속도로 1-6시간 동안 주입하였다. Aqp4-/- 마우스에서는, 1시간 이내에 뇌 실질 물 함량에 상당한 증가가 존재하였다 (문헌 [Papadopoulos et al .] (상기)). 주입 기간 종료시, 래트를 안락사시킨 후, 대뇌 피질, 뇌 줄기 및 소뇌에서의 물 함량 및 AQP4 발현의 분석을 위하여 뇌를 수집하였다. 릴랙신으로 처리된 래트에서 AQP4 발현을 증가시키는 것이 발견될 경우, 그것은 실질에서의 물 축적을 방지함으로써 혈관성 부종을 감소시킬 가능성도 가지게 된다.

당업자들에게는, 본 개시내용의 영역 및 기술사상에서 벗어나지 않고도, 본 개시내용의 다양한 변경 및 변종들이 떠오를 것이다. 본 개시내용이 구체적이고 바람직한 실시양태와 관련되어 기술되었다 할지라도, 청구범위가 그와 같은 구체적인 실시양태로 과도하게 제한되지는 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 실제로는, 당업자에 의해 이해되는 기술된 본 개시 수행 양식의 다양한 변경들은 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다.

Claims (20)

1. 제약상 활성인 릴랙신을 포함하는, 신장기원 요붕증 (NDI)의 치료가 필요한 대상체에서 신장기원 요붕증을 치료하기 위한 제약 제제.
2. 제1항에 있어서, 릴랙신이 인간 대상체에서 만성적인 묽은 소변 배설을 감소시키는 데 효과적인 양으로 인간 대상체에게 투여되는 것인 제약 제제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신의 투여가 배뇨 빈도의 감소, 24시간 소변 부피의 감소, 후속하는 소변 삼투압 측정치, 및/또는 환자의 강한 갈증의 경감으로 이어지는 것인 제약 제제.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 인간 대상체에서 1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여되는 것인 제약 제제.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 인간 대상체에서 10 ng/ml의 혈청 농도를 유지하도록 투여되는 것인 제약 제제.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 3 ㎍/kg/일 내지 150 ㎍/kg/일 범위의 피하 주입 속도로 투여되는 것인 제약 제제.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 30 ㎍/kg/일 범위의 피하 주입 속도로 투여되는 것인 제약 제제.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 간헐적인 피하 주입 또는 펌프에 의해 만성적으로 투여될 수 있는 것인 제약 제제.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 24시간 이상 동안 연속적으로 투여될 수 있는 것인 제약 제제.
10. 제9항에 있어서, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, NDI와 연관된 묽은 소변 배설의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 24시간 이내에 측정가능할 수 있는 것인 제약 제제.
11. 제9항에 있어서, 위약을 사용한 치료와 비교할 때, 인간 대상체에서의 NDI와 연관된 묽은 소변 배설의 감소가 릴랙신을 사용한 치료의 개시 후 4 내지 6시간에 측정가능할 수 있는 것인 제약 제제.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 인간 대상체의 신장 조직에서 아쿠아포린의 발현 및 세포 배치를 변경시키는 데 효과적인 양으로 인간 대상체에게 투여되는 것인 제약 제제.
13. 제12항에 있어서, 아쿠아포린이 아쿠아포린-2 (AQP2), 아쿠아포린-3 (AQP3), 및/또는 아쿠아포린-4 (AQP4)인 제약 제제.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 릴랙신이 H2 릴랙신인 제약 제제.
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