KR20210127211A - 중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물(Compositions comprising amino acids for use and treatment of central nervous system injuries) - Google Patents

Abstract

중추 신경계 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, 조성물은 활성 작용제를 포함하고, 상기 활성 작용제는 아미노산인 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 및 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산을 함유한다.

Description

중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물(Compositions comprising amino acids for use and treatment of central nervous system injuries)

본 설명은 전반적으로 아미노산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 설명은 대상체에서 중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

중추 신경계(CNS)는 고위 기능을 조정하는 뇌와, 주로 뇌와 말초 사이의 통신 경로 역할을 하는 척수로 이루어져 있다. 중추 신경계 손상으로 인한 장애는 자극(insult)의 형태, 중증도 및 해부학적 위치에 따른다. CNS에 대한 자극의 초기 위치에 관계없이, 손상은 계속 진행하는 과정으로, 1차 손상이 세포체와 축삭 기능 모두에 영향을 미칠 수 있는 일련의 해로운 사건으로 이어져 지속적인 기능 장애와 장기간의 퇴행을 가져올 수 있다.

외상성 뇌 손상(TBI) 및 외상성 척수 손상(SCI)은 외부 물리적 자극이 손상을 일으킬 때 발생하며, 경증에서 중증까지 다양할 수 있다. 척수 손상은 치명적인 신경학적 결과와 제한된 치료 기회를 갖는 장애의 원인이다. 척수 손상(SCI)의 두 가지 주요 유형으로는 척수 이단 및 척수 좌상이 있다. SCI는 손상 레벨 아래에 있는 운동 또는 감각 기능의 부분적 또는 완전한 손실을 초래하며, 신체적 및 심리적 수준 모두에서 환자에게 치명적인 결과를 가져온다. 질병의 기저에 있는 병리학적 기초는 중추 신경계로부터 근육으로의 신경 충격(neuronal impulse)을 차단하는 신경 조직의 손실이다. 전 세계적으로 매년 약 250,000명 내지 500,000명(시간당 30명 내지 60명에 해당함)이 척수 손상을 입는다. 이 환자들은 일생에 걸쳐 광범위한 의료 지원을 필요로 하며, 환자당 예상되는 평생 비용은 1 내지 4백만 유로이다. SCI는 중요한 사회적 및 경제적 부담을 나타내지만, 이용 가능한 새로운 치료 옵션은 적다. 지난 30년 동안, 의료 지원의 진보로 SCI 환자의 생존율이 높아졌다. 그러나, 기초 및 중개 연구는 신경학적 결과를 실질적으로 개선하는 데 성공을 거두지 못했다.

본 설명은 대상체에서 중추 신경계 손상의 치료에 특히 효과적인 아미노산-기반 조성물을 제공한다.

본 설명에 따르면, 상기 목적은 본 개시의 필수적인 부분을 형성하는 것으로 이해되는 이어지는 청구범위에서 구체적으로 언급된 내용으로 인해 달성된다.

본 설명의 구현예는, 대상체에서 중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 활성 작용제를 포함하고, 상기 활성 작용제는 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 및 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산을 함유한다.

하나 이상의 구현예에서, 조성물의 활성 작용제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 티로신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 함유한다.

바람직한 구현예에서, 중추 신경계 손상은 뇌 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상, 탈수초 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 하나 이상의 구현예에서, 척수 손상은 좌상성 척수 손상을 포함한다.

본 개시의 추가 구현예는 대상체에서 중추 신경계 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 활성 작용제를 포함하는 조성물을 선택하는 단계로서, 상기 활성 작용제는 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 및 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산을 함유하는, 단계, 및 조성물을 투여하여 중추 신경계 손상을 치료하는 단계를 포함한다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 설명될 것이며, 여기서,
- 도 1은 본 개시의 구현예에 따른 조성물이 보충된 시험관내 분화 중인 NSC에서의 미토콘드리아 영역의 정량화를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. * = p<0.05; ** = p<0.01;
- 도 2는 본 개시의 구현예에 따른 조성물이 보충된 시험관내 분화 중인 NSC에서의 산화 대사의 정량화를 도시한다. Seahorse 세포외 플럭스 분석기는 미토콘드리아 전자 전달계의 다양한 억제제의 순차적 주입에 의한 다양한 생체에너지학 매개변수의 측정을 가능하게 한다. 로테논 및 안티마이신-A 주입은 비-미토콘드리아 OCR 및 기준선 미토콘드리아 호흡의 계산을 가능하게 한다. 올리고마이신 주입은 ATP 합성과 커플링된 호흡의 측정을 가능하게 하고, 최대 호흡은 언커플러(uncoupler) FCCP에 의해 유도된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ** = p<0.01;　*** = p<0.001;　**** = p<0.0001;
- 도 3은 본 개시의 구현예에 따른 조성물이 보충된 시험관내 분화 중인 NSC의 뉴런 성숙 패턴을 도시한다. A 및 B의 그래프는 대조군, ALPHA5 0.1%, ALPHA5 0.5% 및 ALPHA 5 1% 조건에서 10 DIV에서의 MAP2⁺ 뉴런의 정량 분석을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. * = p<0.05;　** = p<0.01;　*** = p<0.001;　**** = p<0.0001;
- 도 4는 본 개시의 구현예에 따른 조성물이 보충된 시험관내 분화 중인 NSC에서의 수상돌기 가시 성숙 및 흥분성 시냅스 마커 발현을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001; **** = p<0.0001;
- 도 5는 세 가지 다른 실험 세트(BCaa1-SCI, BCaa2-SCI, BCaa3-SCI)에서 수술 시 동물의 체중을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. SCI= 척수 손상;
- 도 6은 중증 SCI 후 대조-동물과 처리-동물에서 운동 기능 회복 분석의 결과를 도시한다. 그래프는 중증 SCI 후 조성물-처리군(삼각형으로 이어진 선) 및 대조군(사각형으로 이어진 선)의 BMS 점수를 나타낸다. 화살표는 조성물 투여 시작일(3 dpi)을 나타낸다. 손상을 입은 마우스는 멸균수 중의 보충(3개의 실험 중 n=22)을 투여받거나 멸균수(대조 마우스, 3개의 실험 중 n=25)만을 투여받았다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. * p≤0.05, ** P≤0.01, *** p≤0.001, **** p≤0.0001. BMS 바쏘 마우스 스케일(basso mouse scale); dpi = 손상 후 일수;
- 도 7은 중증 SCI 후 대조-마우스(사각형으로 이어진 선) 및 처리-마우스(삼각형으로 이어진 선)의 발목 움직임(ankle movement) 점수를 나타내는 그래프를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. ** P≤0.01, * P<0.05. BMS=바쏘 마우스 스케일; dpi = 손상 후 일수;
- 도 8은 중증 SCI 후 대조-마우스(사각형으로 이어진 선) 및 처리-마우스(삼각형으로 이어진 선)의 일일 이뇨량을 나타내는 그래프를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. dpi = 손상 후 일수;
- 도 9는 중증 SCI 후 대조-마우스 및 처리-마우스에서 신경교 흉터 반응 및 낭종 영역을 보여주는 횡단 척수 면역염색 슬라이스를 도시한다. 정량화를 위해 고려되는 영역을 예시하는 대조-마우스(A) 및 처리-마우스(B)의 특정 성상세포 마커인 GFAP 및 TO-PRO3^TM으로 면역염색된 횡단 척수 슬라이스. 대조-마우스(C) 및 처리-마우스(D)의 특정 성상세포 마커인 GFAP 및 TO-PRO3^TM으로 면역염색된 횡단 척수 슬라이스. 회색 점선 영역은 신경교 흉터 영역을 나타낸다. 흰색 점선 영역은 낭종 영역을 나타낸다. 흰색 점선 영역과 회색 점선 영역(흰색 선으로 윤곽이 표시됨)은 전체 병변 영역을 나타낸다. (E) 대조-마우스 및 처리-마우스에서 전체 병변 영역에 대한 낭종 영역의 백분율 비율을 나타내는 그래프. (F) 대조-마우스 및 처리-마우스의 전체 병변 영역에 대한 신경교 흉터 영역의 백분율 비율을 나타내는 그래프. 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다; * p≤0.05; ** p≤0.01. n = 3마리 동물이고, 동물당 8개의 슬라이스가 각 그룹에 대해 분석되었다. GFAP = 신경교 섬유질 산성 단백질;
- 도 10은 중증 SCI 후 대조-마우스 및 처리-마우스에서 전체 슬라이스 영역에 대한 신경교 흉터 영역의 백분율 비율을 나타내는 그래프를 도시한다. 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; * p≤0.05. n = 3마리 동물이고, 동물당 8개의 슬라이스가 각 그룹에 대해 분석되었다;
- 도 11은 병변주위 영역에서 처리 및 대조 동물의 척수 내 NeuN-양성 세포수를 나타내는 그래프를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n = 3마리 동물이고, 동물당 8개의 슬라이스가 각 그룹에 대해 분석되었다. ** P<0.01;
- 도 12는 처리 마우스와 대조 마우스에서 선택된 관심 영역(ROI)에 대한 Neurofilament-200에 의해 덮인 영역의 백분율 비율을 나타내는 그래프를 도시한다. 정량적 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; SCI = 척수 손상; n = 3마리 동물이고, 동물당 8개의 슬라이스가 각 그룹에 대해 분석되었다;
- 도 13: 패널 A 및 B에는 각각 처리 마우스 및 대조 마우스의 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue, LFB)로 염색된 척수 횡단 슬라이스가 도시되어 있다. LFB는, 탈수초 영역(흰색 영역)으로부터, 척수 실질 내 수초 함량의 확인을 가능하게 한다. C) 그래프는 후주(dorsal column) 전체 영역의 픽셀 중 후주 내 수초 양성 픽셀로 계산된 처리-마우스 및 대조-마우스의 척수 절편의 후주 내 수초 함량의 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n = 3마리 동물이고, 동물당 8개의 슬라이스가 각 그룹에 대해 분석되었다. ns = 유의하지 않음. SCI = 척수 손상.

하기 설명에서, 구현예의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제공된다. 구현예는 하나 이상의 특정 세부사항 없이, 또는 다른 방법, 구성요소, 재료 등과 함께 실시될 수 있다. 다른 예에서, 잘 알려진 구조, 재료, 또는 동작은 구현예의 양태를 모호하게 하는 것을 피하기 위해 상세하게 보여지거나 설명되지 않는다.

본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구현예" 또는 "구현예"에 대한 언급은 그 구현예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "일 구현예에서" 또는 "구현예에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 본원에 제공된 표제는 단지 편의를 위한 것이며 구현예의 범위 또는 의미를 해석하는 것이 아니다.

본 발명자는 놀랍게도 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌 및 라이신의 조합을 포함하는 조성물에 특정 양의 특정 카르복실산을 첨가함으로써 분화 중인 뉴런 세포에서 산화 대사를 촉진하고 증가시키는 효과가 높게 나타남을 발견하였다.

분화된 성숙 뉴런의 특징은 해당작용으로부터 더욱 산화적인 대사로의 전환이다(문헌[Zheng et al., 2016]). 본원에 개시된 조성물의 보충이 이러한 대사 전환(친산화적(pro-oxidative) 대사)를 향상시키고 신경 분화를 촉진할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 분화 중인 뇌실하대(sub-ventricular zone, SVZ)-유래 NSC에 미치는 조성물 보충의 효과를 분석하였다. 또한, 본원에 개시된 조성물이 다른 기원으로부터의 NSC에서 뉴런 세포 분화 및 성숙에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 분석을 수막에 존재하는 신경인성 방사-신경교 유사 세포로 확장하였다(문헌[Bifari et al., 2017c]).

수막 NSC 및 SVZ-유래 NSC를 이전에 설명된 바와 같이 분리하고(문헌[Bifari et al., 2017]), 각각 PDGFRß 및 CD133/Prominin-1 마커의 발현에 대해 분류하였다.

배양 후, 수막 NSC와 SVZ-유래 NSC를 신경구로서 증식시키고, 배지 조건을 변경하여 뉴런으로 분화시켰다(문헌[Bifari et al., 2009]). 0.1%에서 시작하여 0.5% 및 1%까지 농도를 증가시키며 본 출원의 구현예에 따른 조성물을 배지에 보충하였다.

본 출원의 구현예에 따른 조성물은 "결과 섹션"에 개시된 바와 같이 시험관내 뉴런 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다.

또한, 시험관내에서 얻은 매우 유망하고 놀라운 결과에 따라, 본 발명자는 완전(중증) 좌상성 척수 손상(SCI)의 전임상 동물 모델에 대한 조성물 투여의 효과도 테스트했다.

SCI는 손상 레벨 아래에 있는 운동 또는 감각 기능의 부분적 또는 완전한 손실을 초래하며, 신체적 및 심리적 수준 모두에서 환자에게 치명적인 결과를 가져온다.

본원에 개시된 조성물(활성 작용제로서 특정 양의 시트르산, 숙신산 및 말산을 포함한 트리카르복실산 회로의 기질인 3가지 카르복실산과 조합하여 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신을 포함함)은 완전 좌상성 SCI, 즉, 자발적 회복이 없고 인간에서 관찰되는 상태를 주로 반영하는 손상 후 신경 조직 손실에 대응하고 신경 재생을 촉진하는 데 매우 효과적인 것으로 나타났다. 본원에 개시된 조성물은 그러한 특정 카르복실산이 없는 유사한 아미노산 조성물보다 훨씬 더 효과적이다.

하나 이상의 구현예에서, 본원에 개시된 조성물에서 시트르산, 숙신산 및 말산의 총량과 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신의 총량의 중량비는 0.05 내지 0.3, 바람직하게는 0.1 내지 0.25에 포함된다.

하나 이상의 구현예에서, 활성 작용제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 및 티로신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.

하나 이상의 구현예에서, 조성물에 함유된 카르복실산은 시트르산, 숙신산 및 말산으로 이루어질 수 있다.

추가 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 활성 작용제는 또한 아스파르트산 및/또는 오르니틴 L-알파케토글루타레이트(OKG)를 포함할 수 있다.

구현예에 따르면, 조성물은 활성 작용제를 포함하고, 활성 작용제는 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 및 선택적으로 티로신, 뿐만 아니라 시트르산, 숙신산, 및 말산으로 이루어지며, 상기 아미노산들만이 조성물에 함유된 아미노산들이다. 시트르산, 숙신산 및 말산만이 조성물에 함유된 카르복실산들일 수 있다.

추가 구현예에서, 조성물은 활성 작용제 중량에 대해 35 중량% 내지 65 중량%, 바람직하게는 42 중량% 내지 56 중량%의 양으로 아미노산인 아이소류신, 류신 및 발린을 포함할 수 있다.

하나 이상의 구체예에서, 류신과 시트르산의 중량비는 5 내지 1, 바람직하게는 2.50 내지 3.50에 포함된다.

추가 구현예에서, 시트르산의 중량 또는 몰량은 말산 및 숙신산 각각의 중량 또는 몰량보다 크다. 바람직하게는, 시트르산의 중량 또는 몰량은 말산 + 숙신산의 전체 중량 또는 몰량보다 크다. 추가 구현예에서, 시트르산과, 말산과 숙신산의 합의 중량비는 1.0 내지 4.0, 바람직하게는 1.5 내지 2.5에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 시트르산:말산:숙신산 중량비는 10:1:1 내지 2:1.5:1.5, 바람직하게는 7:1:1 내지 1.5:1:1, 더욱 바람직하게는 5:1:1 및 3:1:1에 포함된다. 바람직한 구현예에서 시트르산:말산:숙신산 중량비는 4:1:1이다.

본 개시의 일부 구현예에 따르면, 바람직한 아이소류신:류신 몰비는 0.2 내지 0.7의 범위, 바람직하게는 0.30 내지 0.60의 범위에 포함되고/포함되거나, 바람직한 발린:류신 중량비는 0.2 내지 0.70의 범위, 바람직하게는 0.30 내지 0.65의 범위에 포함된다.

추가 구현예에서, 트레오닌:류신 몰비는 0.10 내지 0.90의 범위, 바람직하게는 0.20 내지 0.70의 범위에 포함되고/포함되거나, 라이신:류신 중량비는 0.20 내지 1.00의 범위, 바람직하게는 0.20 내지 1.00의 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.90의 범위에 포함된다.

바람직한 구현예에서, 시트르산, 말산, 숙신산의 전체 몰량과 메티오닌, 페닐알라닌, 히스티딘 및 트립토판의 전체 몰량의 비는 1.35 초과이다.

하나 이상의 구현예에서, 시트르산, 말산, 숙신산의 합과 분지쇄 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린의 합의 중량비는 0.1 내지 0.4, 바람직하게는 0.15 내지 0.35에 포함된다.

추가 구현예에서, 분지쇄 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린 + 트레오닌 및 라이신의 전체 중량은 시트르산, 말산 및 숙신산과 같은 3가지 카르복실산의 전체 중량보다 더 크다. 바람직하게는, 단일 카르복실산(시트르산, 숙신산, 또는 말산)의 중량은 단일 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌 및 라이신 각각의 중량보다 작다.

추가 구현예에서, 라이신과 트레오닌의 전체 몰량은 3가지 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산의 전체 몰량보다 크다. 바람직하게는, 3가지 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산의 전체 몰량과 라이신과 트레오닌의 전체 몰량의 비는 0.1 내지 0.7, 바람직하게는 0.15 내지 0.55에 포함된다.

하나 이상의 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 바람직하게는 비타민 B₁ 및/또는 비타민 B₆과 같은 비타민 B군에서 선택되는 비타민을 추가로 포함한다. 본 개시의 추가 구현예에서, 조성물은 탄수화물, 첨가제 및/또는 향미 물질을 포함할 수 있다.

하나 이상의 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 바람직하게는 뇌 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상, 탈수초 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 것이다. 척수 손상은 좌상성 척수 손상을 포함할 수 있다.

본 개시에 따른 조성물, 특히 활성 작용제를 제조할 때, 아미노산인 아르기닌은 피하는 것이 바람직하다. 또한, 본원에 개시된 조성물에서 피하는 것이 바람직한 추가 아미노산은 세린, 프롤린, 알라닌일 수 있다. 그러한 아미노산은 조성물 내에서 일부 농도 또는 화학량론적 비에서 역효과를 일으키거나 심지어 해로울 수 있다.

본 출원에 개시된 아미노산은 각각의 약학적으로 허용되는 유도체, 즉, 염으로 대체될 수 있다.

추가 구현예에 따르면, 아미노산 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 단백질, 비타민, 탄수화물, 천연 및 인공 감미료 및/또는 향미 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 유청 단백질, 말토덱스트린, 과당, 칼슘 카제이네이트, 어유, 수크랄로스, 수크로스 에스테르, 비타민 D3, 비타민 B군으로부터 선택될 수 있다.

경구 사용을 위해, 본 설명에 따른 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 겔, 겔화 가능한 분말, 또는 분말의 형태일 수 있다.

본원에 개시된 조성물은 8.0 g 내지 24.0 g 범위의 일당 활성 작용제의 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다.

본 개시는 또한, 활성 작용제를 포함하는 조성물을 선택하는 단계로서, 상기 활성 작용제는 아미노산인 류신, 아이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 및 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 및 말산을 함유하는 단계, 및 조성물을 투여하여 중추 신경계 손상을 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 중추 신경계 손상을 치료하는 방법을 제공한다.

조성물에 의해 제공되는 다양한 아미노산 사이의 양 및 비에 관한 추가 사양이 첨부된 청구범위에 포함되며, 이는 본 발명과 관련하여 본원에 제공된 기술적 교시의 필수적인 부분을 형성한다.

실시예

표 1은 시험관내 및 생체내에서 테스트된 "알파 5m(α5m)"으로 명명되는 아미노산-기반 조성물을 나타낸다.

[표 1]

α5m 조성물은 먼저 모든 구성 요소를 0.8 메쉬로 체질하여 준비될 수 있다. 예비 혼합물을 얻기 위해, (총량의 10 중량% 미만의 양의) 각 성분을 L-라이신 HCl의 일부와 함께 폴리에틸렌 백에 넣어 전체 조성물 중량의 10%를 얻는다. 이어서, 백을 5분 동안 수동으로 진탕시킨다. 이어서, 예비 혼합물을 나머지 성분과 함께 믹서(Planetaria)에 로딩하고, 120 rpm에서 15분 동안 혼합하여 균질한 최종 조성물을 얻는다.

방법

세포 배양 및 처리

수막 NSC, 뇌실하대(SVZ)-유래 NSC(men-Neuron 및 SVZ-Neuron)의 세포 배양물에 α5m 조성물(α5m)을 보충하였다. α5m을 특정 배양 배지에 첨가하고(0.1%, 0.5%, 1%), 이어서 배지 pH를 7.4로 조정하고, 다양한 세포 배양물에 첨가하기 전에 여과하였다. α5m을 2일 내지 3일마다 교체하며 시험관내 10일(DIV)째의 men-Neuron 및 SVZ-Neuron의 성숙까지 보충하였다.

세포 배양 면역형광

먼저, 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 유리 슬라이드에 도말하였다. 4% 파라포름알데히드(PFA, Sigma-Aldrich)에서의 고정 단계 후, 블로킹(blocking) 용액(PBS 1X 중의 3% 소 태아 혈청, 1% 소 혈청 알부민, 0.3% Triton X-100)에서 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 블로킹하였다. 후속하여, 세포를 실온에서 1.5시간 동안 1차 항체 용액(블로킹 용액 중의 특정 1차 항체)에서 인큐베이션하고, 블로킹 용액으로 2회 세척하고, 특정 2차 항체 용액(블로킹 용액 중의 특정 2차 항체)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액에서 3회 세척한 후, 슬라이드를 핵 염료인 TO-PRO3(Thermo Fisher Scientific)와 함께 10분 동안 인큐베이션하고, 공초점 현미경 정량화(Zeiss LSM 710 공초점 현미경)를 위해 유리 현미경 슬라이드에 장착하였다. 1차 항체: 성숙 뉴런을 표지하기 위한 미세소관-관련 단백질 2(MAP2 토끼, Sigma, 1:200), 미토콘드리아를 표지하기 위한 TOMM20(마우스, 1:200, Abcam). 하기 2차 항체를 사용하였다: 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 546(Molecular Probes, 1:500), 염소 항-토끼 Alexa Fluor 488(Molecular Probes, 1:500).

동물 및 수술 절차

실험 프로토콜은 1986년 11월 24일자 유럽 공동체 위원회 지침(86/609/EEC)과 이탈리아 보건부(Ministry of Heath)에 따라 승인되고 수행되었으며, 국가 동물 보호 지침을 준수하였다.

성체 암컷 C57BL/6J(7주령) 마우스를 척추추궁 절제술에 노출시켜 좌상성 손상(SCI)을 척추동물 흉부 레벨 11(T11)에 유발했다. 각각 18마리, 20마리 및 12마리의 동물로 3가지 다른 실험을 수행하였다.

모든 SCI 수술을 수행하기 전에, 모든 동물의 체중을 측정하고, 체중이 16 그램 내지 21 그램 범위인 마우스만 실험에 고려했다. 수술 당시 동물의 체중은 도 5에 나와 있다.

수행된 수술의 심각성 또는 회복 기간 동안의 합병증으로 인해 중증 SCI의 수술은 50마리 동물 중 1마리의 사망을 초래했다.

동물을 깨끗한 폴리프로필렌 케이지에 별도로 수용하고 2개의 그룹으로 나누었다: 1) 대조군-급이 그룹(CTRL, n = 22); 2) α5m-급이 그룹(α5m, n = 25), 즉, 표 1에 나타낸 아미노산 조성물을 급이한 동물 그룹.

운동 평가

중증 SCI 후 운동 기능 회복에 대한 α5m 보충의 효과를 평가하기 위해, 바쏘 마우스 스케일(BMS) 분석을 수행했다(문헌[Basso et al., 2006]). 각 마우스의 운동 수행 능력을 SCI 수술 후 첫 주 동안은 1, 3, 5, 7 dpi에서 평가하였고, 마우스를 관류하고 척수를 해부할 때인 실험 종료 시(31 dpi)까지는 주 2회(10, 14, 17, 21, 28, 31 dpi) 평가하였다. 1 dpi에서 BMS 점수가 "0"을 보인 마우스만을 분석에 포함시켰고, BMS 점수가 더 높은 마우스는 연구에서 제외시켰다.

발목 움직임 분석

이 매개변수는 적용된 처리가 발목 관절 움직임과 관련된 근육의 경직 상태의 복구를 방지하는 유익한 효과를 나타내는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 이 분석에서, 좌우 발목 관절의 움직임에 대한 점수는 그 움직임의 정도에 따라 부여되었다: "0"은 움직임 없음(경직 상태)에 해당하고, "0.5"는 불완전한 움직임에 해당하고, "1" 정상적인 움직임에 해당한다.

방광 기능 평가

동물의 이뇨량을 1 dpi부터 실험 종료 시까지 분석하였다. 방광을 수동으로 비우고 소변을 수집하여, 5 dpi까지는 하루에 2회 칭량하고, 이어서 실험 종료 시까지 하루에 1회 칭량했다.

조직 조직학 및 면역조직화학 분석

척수 고정 및 처리

동물을 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate)(2,2,2-트리클로로에탄-1,1-디올, 2 ml/kg)의 복강내 주사로 마취하고, 식염수(0.9% NaCl)에 이어 PBS 1X 중의 4% 수크로스가 첨가된 4% 파라포름알데히드(PFA, Sigma- Aldrich)로 심장내 관류시켰다. 척수를 추출하고, 4% PFA/4% 수크로스에서 밤새 후고정(post-fixing)시켰다. 이어서, 척수를 4℃에서 30% 수크로스 용액에 보관하여 조직을 동결 보호했다. 조직화학 분석을 위해, 해부된 척수(병변 부위로부터 입쪽으로 0.75 cm 및 꼬리쪽으로 0.75 cm) 1.5 cm를 OCT(Optimal Cutting Temperature) 화합물로 임베딩(embedding)하고 동결 절단했다(25 μm 두께의 폭방향 절편 또는 20 μm 두께의 길이방향 절편). 얻어진 절편을 -20℃에서 보관하고, 조직학적 및 면역조직화학 방법으로 분석하였다.

룩솔 패스트 블루 염색(도 13)

수초 함량을 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색을 통해 조직 절편에서 정량화하였다. 먼저, LFB(Sigma-Aldrich)를 95% 에탄올(EtOH, Carlo Erba) 및 1.22% 빙초산(Carlo Erba)에 용해시켜 0.1% LFB 용액을 준비하였다. 이어서, 절편을 EtOH 용액(100%, 95%, 70% 및 50%)에서 수화하고, 40℃에서 40분 동안 0.1% LFB 용액으로 염색했다. 이어서, 절편을 수돗물로 헹구어 0.05% Li2CO3 용액(Sigma-Aldrich)에서 차별화하고, EtOH 용액(50%, 70%, 95% 및 100%)에서 탈수하고, 크실렌(Carlo Erba)에서 투명화하고, 수초 함량의 광학 현미경 분석(Zeiss Axioscop2)을 위해 Entellan(Merck-Millipore)과 함께 장착하였다.

척수 조직 분석

냉동절편을 해동하고, PBS 1X로 세척하고, 블로킹 용액(PBS 1X 중의 0.25% Triton X-100, 2% 소 혈청 알부민)에서 30분 동안 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 블로킹했다. 이어서, 슬라이드를 1차 항체 용액(블로킹 용액 중의 특정 1차 항체)에서 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 블로킹 용액에서 5분 동안 6회 헹군 후, 슬라이드를 특정 2차 항체 용액(블로킹 용액 중의 특정 2차 항체)에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 블로킹 용액에서 3회 세척하고 PBS 1X에서 3회 세척한 후, 슬라이드를 핵 염료인 TO-PRO3(Thermo Fisher Scientific) 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Thermo Fisher Scientific, 1:2000)과 함께 10분 동안 인큐베이션하고, 현미경 정량화(Zeiss LSM 710 공초점 현미경)를 위해 1,4-디아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(DABCO, Sigma-Aldrich)을 사용하여 장착하였다. 사용된 1차 항체: 성상세포를 표지하기 위한 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP 염소, 1:200, Abcam)(도 9), 뉴런 세포골격의 신경세사 단백질 200 KDa를 표지하기 위한 Neurofilament-200(NF200 토끼, 1:200, Sigma)(도 12), 뉴런을 표지하기 위한 NeuN(NeuN 마우스, Chemicon, 1:200)(도 11). 사용된 2차 항체: 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 546(Molecular Probes, 1:500), 염소 항-토끼 Alexa Fluor 488(Molecular Probes, 1:500), 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor 488(Molecular Probes, 1:500), 염소 항-마우스 CY3(Amersham, 1:500), 당나귀 항-염소 Alexa Flour 488(Life-technologies, 1:500).

결과

시험관내 분석

시험관내 분화 중인 NSC 내 미토콘드리아 함량

면역형광 및 공초점 분석을 통해, MAP2 양성 뉴런 세포에서 미토콘드리아 마커인 TOMM20에 의해 덮인 영역을 평가했다.

도 1의 그래프는 α5m 보충이 0.5% 농도에서 미토콘드리아 함량을 증가시킬 수 있음을 보여주는 분화 중인 뉴런 내 MAP2+ 수상돌기당 미토콘드리아 영역(즉, TOMM20+ 영역)의 정량화를 나타낸다.

시험관내 분화 중인 NSC에서의 산화 대사

분화 중인 NSC 세포의 산화 대사는 Seahorse 기술을 이용하여 대조군 및 α5m-처리(0.5% 농도) men-Neuron 및 SVZ-Neuron의 산소 소비율(OCR)을 분석하여 평가했다.

OCR의 통계적으로 유의한 증가는 α5m 조성물이 보충된 분화 중인 뉴런에서 관찰되었고(도 2의 A), 그에 따라 도 2의 B 및 C에 도시된 바와 같은 기초 및 최대 호흡의 증가가 관찰되었다.

주목할 만하게도, ATP 생산이 2배 증가했으며(men-Neuorn: 125.1 pmol/min/ug에서 280.1 pmol/min/ug로 증가, 도 2의 D; SVZ-Neuron: 156.1 pmol/min/ug에서 523.0 pmol/min/ug로 증가), 이는 더 높은 에너지 처리를 나타낸다.

따라서, 앞서의 결과와 일치하게, 본 출원의 조성물이 보충된 세포에 대해 미토콘드리아 기능의 증가가 관찰되었다.

분화 중인 NSC 세포의 수상돌기 분지형성

Men-Neuron 및 SVZ-Neuron은 α5m 보충 후 산화 대사 및 미토콘드리아 활성의 증가를 보였다. 대조군 및 보충되는 조건에서 수막- 및 SVZ-유래 NSC 신경 성숙을 비교하기 위해, 신경구가 뉴런으로 분화하도록 유도하였고, 10 DIV에서 뉴런 마커인 MAP2에 대한 면역형광 및 공초점 분석에 의해 형태학적 변화를 분석하였다.

α5m 보충은 분화 중인 MAP2⁺ 세포의 백분율을 변경하지 않았지만, 수상돌기 분지 및 수상돌기 가시를 포함한 성숙한 뉴런 형태의 유의한 증가가 관찰되었다(도 3 및 도 4).

분지상(ramified) MAP2⁺ 세포의 형태를 분석했을 때, 0.5%-보충 men-Neuron(15.07개 분지에서 18.55개 분지로 증가, 도 3의 A)에서 세포당 평균 분지 수의 통계적 증가가 관찰되었고(즉, 2개의 접합 지점 사이에 포함된 MAP2⁺ 절편), 유사한 경향이 0.5%-보충 SVZ-Neuron(15.27개 분지에서 17.07개 분지로 증가)에서도 관찰되었다.

평균 분지 수의 증가는 α5m 조성물로 보충되었을 때 두 집단 모두에서 총 수상돌기 길이의 통계적 증가(men-Neuron: 301.6 μm에서 458.6 μm로 증가, 도 3의 B; SVZ-Neuron: 225.5 μm에서 285.2 μm로 증가)와 일치했다. 이 데이터는 α5m 보충 후 세포 복잡성의 증가, 및 수상돌기의 범위(coverage) 증가를 시사한다.

α5m 보충된 뉴런에서 뉴런 성숙의 증가를 추가로 특성화하기 위해, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 실험 조건에 대한 수상돌기 가시 수와 밀도를 평가했다. 수상돌기 가시 수는 0.5% 보충된 뉴런에서 점진적으로 증가했다(men-Neuron: MAP2+ 뉴런당 119.6개 가시에서 198.2개 가시로 증가, 도 4의 A; SVZ-Neuron: MAP2+ 뉴런당 109.2개 가시에서 152.0개 가시로 증가). Neuron Studio 소프트웨어를 사용하여 특정 가시 형태를 분석했다(문헌[Rodriguez et al., 2008]). 성숙한 뉴런의 수상돌기 가시는 기다랗고 가는 가시에서 더욱 안정적인 뭉툭한 가시 및 버섯모양 가시로 형태를 변형한다.

men-Neuron에서는 0.1% 및 0.5% 농도의 α5m 조성물에서 뭉툭한 가시의 증가가 관찰되었고(각각 36.15%에서 48.62% 및 47.56%로 증가), SVZ-Neuron에서는 0.1% 및 0.5%에서 버섯모양 가시의 분율 증가가 관찰되었다(각각 22.81%에서 28.58% 및 29.03%로 증가).

이러한 데이터는 α5m 조성물이 보충된 men-Neuron 및 SVZ-Neuron 모두에서 수상돌기 가시가 안정적인 형태(즉, 각각 뭉툭한 형태 및 버섯모양)를 획득함을 시사하며, 이는 뉴런 성숙을 향상시키는 데 있어서의 α5m 보충의 효과를 확인한다.

분화 중인 뉴런의 성숙을 확인하기 위해, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 대조군 및 α5m-보충 뉴런에서 시냅스 전후 흥분 마커인 시냅토피신(Synaptophysin) 및 PSD95의 발현을 분석함으로써 시냅스의 존재를 평가했다(문헌[Dzyubenko et al., 2016]).

시냅토피신 면역반응성 부점(immunoreactive puncta)의 수(도 4의 B)뿐만 아니라 PSD95 면역반응성 부점의 수(도 4의 C)도 대조군에 비해 보충된 뉴런에서 증가했다.

이러한 결과는 대조군과 비교하여 α5m 보충된 뉴런에서의 성숙 증가를 확인하는데, 이는 그러한 뉴런이 분화 중인 뉴런에서의 산화 대사의 향상으로 인해 더 많은 분지, 더욱 성숙한 가시 및 더 많은 시냅스 마커를 보여주기 때문이다.

생체내 분석

성체 암컷 C57BL/6J 마우스를 척추후궁 절제술에 노출시켜 좌상성 손상을 척추동물 흉부 레벨 11(T11)에 유발했다. 수행된 수술의 심각성 또는 회복 기간 동안의 합병증으로 인해 중증 SCI 수술은 50마리 동물 중 1마리의 사망을 초래했다.

α5m 조성물의 보충(음용수 중 3 g/일)을 SCI 후 3일(3 dpi)째에 실행했다. 이 치료적 접근은 대략 SCI 발병의 아급성 단계의 종료 시에 시작한다. 보충을 31일 동안 유지하였다. 처리된 동물과 대조 동물의 운동 회복 및 조직 조직학을 비교했다.

운동 평가

중증 SCI 후 운동 기능 회복에 대한 α5m 보충의 효과를 평가하기 위해, 바쏘 마우스 스케일(BMS) 분석을 수행했다. 각 마우스의 운동 수행 능력을 SCI 수술 후 첫 주 동안은 1, 3, 5, 7 dpi에서 평가하였고, 마우스를 관류하고 척수를 해부할 때인 실험 종료 시(31 dpi)까지는 주 2회(10, 14, 17, 21, 28, 31 dpi) 평가하였다. 1 dpi에서 BMS 점수가 "0"을 보인 마우스만을 분석에 포함시켰고, BMS 점수가 더 높은 마우스는 연구에서 제외시켰다.

도 6의 그래프는 중증 SCI 후 α5m 조성물 처리된 마우스(위의 삼각형으로 이어진 선) 및 대조군(아래의 사각으로 이어진 선)의 BMS 점수를 나타낸다. 화살표는 α5m 조성물 투여 시작일(3 dpi)을 나타낸다. 손상을 입은 마우스는 멸균수 중의 α5m 조성물(3개의 실험 중 n=22)을 투여받거나 멸균수(3개의 실험 중 n=25)만을 투여받았다. 처리된 마우스의 BMS는 투여 28일에 걸쳐 대조 SCI 마우스에 비해 점진적으로 유의하게 증가했다.

31 dpi에서, 처리된 마우스는 1.773±0.2434의 평균 BMS 점수에 도달한 반면, 대조 그룹은 0.92±1.772의 평균 BMS 점수에 도달했다(실험 조건의 차이는 2원 ANOVA 테스트 및 사후 Tukey 검정으로 분석되었음).

따라서, α5m 조성물로 처리된 마우스는 대조 마우스에 비해 운동 회복에서 유의한 개선을 나타냈다. 도 6에 도시된 바와 같이, 사후 분석은 14, 17, 21, 24, 28, 31 dpi에서 BMS 점수의 유의한 그룹 차이를 나타냈다.

발목 움직임 분석

'경직'은 손상으로 인한 흔한 증상으로 이해되고(문헌[Adam and Hick, 2005]), 다양한 중추 신경계 질환(예컨대 다발성 경화증, 뇌졸중, 및 뇌경색) 및 외상(SCI 및 뇌 손상을 포함함)에 의해 영향을 받은 개체의 장애의 주요 원인이다.

α5m 조성물의 보충이 근육의 경직 상태의 복구를 방지하는 효과가 있는지 확인하기 위해, 발목 관절의 움직임 정도를 평가했다. 각각의 처리된 마우스와 대조 마우스의 경직은 21 dpi에서 시작하여 실험 종료 시(31 dpi)까지 매일 평가했다(도 7).

처리된 동물의 발목 관절 유연성은 대조 동물에 비해 유의한 개선을 보였다. 31 dpi에서, 처리된 동물이 나타낸 발목 움직임은 0.6888±0.0455인 반면, 대조군의 경우 0.5939±0.0651이었다(실험 조건의 차이는 2원 ANOVA 테스트 및 사후 Tukey 검정으로 분석되었음).

따라서 α5m 조성물로 처리된 마우스는 21 dpi에서 29 dpi까지 대조 마우스에 비해 유의하게 높은 발목 움직임을 보였고, 이는 손상 후 근육 경직으로부터의 더 빠른 회복을 나타낸다.

방광 기능 평가

SCI 후 가장 흔한 결과들 중 하나는 방광 활동의 기능 장애이다. SCI에 이어, 일반적으로 신경인성 방광으로 지칭되는 방광은 경직성 방광 또는 이완성 방광을 초래하는 극적인 변화를 겪는다(문헌[Taweel WA et al., 2015]). 중증 SCI 후 α5m 조성물의 투여가 방광 기능 회복에 있어서 유익한 역할을 할 수 있는지 조사하기 위해, α5m 조성물 처리된 마우스와 대조 마우스의 일일 이뇨량을 분석했다.

실험 동안 α5m 조성물 처리된 동물과 대조 동물은 유사한 일일 이뇨량을 보였다(도 8). 31 dpi에서, 처리된 그룹은 0.6359 g±0.1073 g의 평균 일일 이뇨량를 보인 반면, 대조 그룹은 0.5889g±0.1145g을 보임으로써, 손상 후 방광 기능 회복에 있어서 α5m 조성물의 효과에 관한 증거를 제공했다.

조직 조직학

척수에 대한 외상성 자극은 기계적 손상 및 후속 조직 변성으로 이어진다. 이러한 사건은 세포막 및 축삭의 전단, 혈액-척수 장벽의 파괴, 수초 분해, 면역 세포 이행(transmigration) 및 척수 세포 사멸과 관련이 있다(문헌[Zhang et al., 2012]). α5m 조성물 처리가 손상된 조직의 재생에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해, 척수 실질 낭포(낭종) 및 신경교 흉터 형성, 뉴런 수, 수초 함량을 분석했다.

낭포 및 신경교 흉터 형성

SCI 후, 손상 부위 주변의 신경교 흉터 및 낭포 형성(문헌[Hu R et al., 2010], 문헌[Yi-Min Yuan 및 Cheng He, 2013])은 병변 영역을 제한하는 데 기여한다. 그러나, 이는 물리적 및 분자적 장벽으로 작용하는(문헌[Fehlings MG 및 Tator CH, 1999]) SCI 후 축삭 재생을 억제한다(문헌[Rooney GE et al., 2009]).

손상에 대한 신경교 세포 반응의 중요성을 고려하여, 본 출원의 발명자는 α5m 조성물의 투여가 흉터 형성 및 성상세포 반응에 대해 역할을 하는지 평가했다. 성상세포에 대한 특이적 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)을 사용한 면역형광 염색을 수행했다. 병변 부위(T11 척추뼈 레벨에서 유발된 병변)를 중심으로 하는 1.5 cm 길이의 실질 분절을 덮는 척수 횡단 절편(동물당 15개의 횡단 척수 슬라이스)을 관찰했다.

도 9는 대조군(A, C) 및 α5m 조성물 처리된 마우스(B, D)의 특정 성상세포 마커인 GFAP 및 TO-PRO3^TM으로 면역염색된 횡단 척수 슬라이스를 도시하며, 이는 정량화를 위해 고려되는 영역을 예시한다. 회색 점선 영역은 신경교 흉터 영역을 나타낸다. 흰색 점선 영역은 낭포(낭종) 영역을 나타낸다. 패널 E에 도시된 바와 같이, 본원에 개시된 조성물의 투여는 대조군(42.94%±3.249)과 비교하여 낭종 영역(21.62±2.505%)의 유의한 감소를 가져왔다. 패널 F는 α5m 투여 후 동물이 대조군(57.06%±3.294%)에 비해 유의하게 더 큰 신경교 흉터 영역(78.81%±2.232%)을 나타냈음을 도시한다.

도 10은 대조군 및 α5m 처리된 마우스에서 총 슬라이스 영역에 대한 신경교 흉터 영역의 백분율 비율을 나타내는 그래프를 도시한다. α5m 처리 후, 동물은 대조 동물(7.2%±0.7068%)에 비해 유의하게 더 작은 낭종 영역(3.55%±0.6756%)을 나타냈다.

이러한 데이터는 손상 후 신경 조직 손실에 대응하는 데 있어서 본원에 개시된 조성물의 높은 효능을 강조한다.

뉴런 함량

1차 기계적 손상으로 인한 척수 조직 변성에 이어 뉴런 세포의 추가 파괴를 결정하는 2차 자극이 뒤따른다(문헌[Zhang N. et al., 2012]).

중증 SCI 후 뉴런 함량에 대한 α5m 조성물 보충의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자는 특정 뉴런 마커인 NeuN을 사용한 면역형광 염색에 의해 병변이 있는 척수 실질 내의 뉴런 수를 평가했다. 병변 부위(T11 척추뼈 레벨에서 유발된 병변)를 중심으로 하는 1.5 cm 길이의 실질 분절을 덮는 척수 횡단 절편(동물당 15개의 횡단 척수 슬라이스)을 분석했다.

먼저, 전체 척수 슬라이스 내 NeuN-양성 세포 수를 평가했다. 놀랍게도, 분석 결과, 병변주위 영역에서 대조 그룹(224.9 ± 58.03)보다 α5m 처리된 그룹에 더 많은 뉴런이 존재하였으며(613.3 ± 24.04), 그 차이는 통계적으로 유의한 것으로 나타났다(도 11).

본 발명자는 또한 운동 뉴런이 위치한 척수 슬라이스의 복측 영역에서도 뉴런 함량의 차이가 유지되는지 평가했다. 이 경우에도, NeuN-양성 세포 수는 대조 그룹(62.66 ± 13.51)에 비해 α5m 처리된 그룹(255.8 ± 12.35)에서 유의하게 더 많았다. 그 차이는 통계적으로 유의하였고, 그에 따라 손상 후 뉴런 함량의 회복에 있어서 본원에 개시된 조성물의 효과에 관한 증거를 제공한다.

신경세사 분석

성숙한 뉴런 축삭 내 주요 구조 단백질은 신경세사(NF)이다. 이의 발현은 축삭 성장 및 뉴런 항상성 유지와 밀접한 관련이 있다(문헌[Wang H. et al., 2012]). SCI 후, 회백질 내 뉴런 손실은 신경세사 사슬과 수초 단백질의 손실을 동반한다(문헌[Qian J. et al., 2010]).

α5m 조성물-처리 SCI 마우스에서 축삭 재성장의 존재를 조사하기 위해, 본 발명자는 신경세사 단백질에 대한 특정 마커인 Neurofilament-200(NF200)을 사용한 면역형광 염색을 수행했다. 분석을 위해, 본 발명자는 병변 부위(T11 척추뼈 레벨에서 유발된 병변)를 중심으로 하는 1.5 cm 길이의 실질 영역(6개의 가로 척수 슬라이스/동물)을 덮는 척수 길이방향 절편을 고려했다. 도 12에 도시된 그래프는 α5m-처리 및 대조 마우스에서 선택된 관심 영역(ROI)에 대한 Neurofilament-200에 의해 덮인 영역의 백분율 비율을 나타낸다.

처리된 그룹은 대조 그룹(16.22±3.31%; 도 12)에 비해 NF200 함량(23.56 ± 6.441%)이 더 높은 경향을 나타낸다.

이러한 결과는 손상 후 축삭 재성장을 촉진하는 데 있어서 α5m 조성물의 능력을 보여준다.

재수초화 가능성

탈수초는 SCI 병리의 중요한 요소를 구성하며 기능 상실에 기여한다(문헌[Waxman SG et al., 1989]). 중증 SCI 후 마우스에 대한 α5m 조성물을 사용한 보충의 재수초화 가능성을 평가하기 위해, 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색을 수행했다. LFB는 도 13에 도시된 바와 같이, 탈수초 영역(흰색 영역)으로부터, 척수 실질 내 수초 함량(청색 영역)의 확인을 가능하게 한다. 병변 부위(T11 척추뼈 레벨에서 유발된 병변)를 중심으로 하는 1.5 cm 길이의 실질 분절을 덮는 척수 횡단 절편(동물당 15개의 횡단 척수 슬라이스)에 대해 분석을 수행했다. 도 13의 그래프는 α5m-처리 마우스(39.64%±0.3677) 및 대조 마우스(38.47%±0.8927)의 척수 절편의 후주 내 수초 함량의 백분율을 나타내며, 이는 총 후주 영역의 픽셀 중 후주 내 수초 양성 픽셀로 계산되었다. 31 dpi에서, α5m의 보충 투여를 받은 동물은 대조 동물과 유사한 수초 함량을 나타냈으며, 그에 따라 중증 SCI 후 α5m 조성물의 재수초화 가능성에 관한 증거를 제공했다.

본 개시에 제공된 결과는 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신과 시트르산, 숙신산 및 말산의 조합을 포함하는 본원에 개시된 아미노산 조성물이 분화 중인 뉴런에서 산화 대사를 향상시킬 수 있어, SCI 동물 모델에서 손상 후 축삭 재성장을 촉진하고 신경 조직 손실에 대응함을 보여준다.

전술한 내용으로부터, 본 개시에 따른 조성물이 대상체의 중추 신경계 손상의 치료에 어떻게 유용한지 명확하게 나타나며, 여기서 손상은 바람직하게는 뇌 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상, 탈수초성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.

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Claims (14)

1. 대상체의 중추 신경계 손상의 치료에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 활성 작용제를 포함하고, 상기 활성 작용제는 아미노산인 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 라이신, 및 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산을 함유하는, 조성물.
2. 제1항에 있어서, 시트르산, 말산, 숙신산의 총량과 류신, 이소류신, 발린, 라이신, 트레오닌의 총량의 중량비는 0.05 내지 0.3, 또는 0.1 내지 0.25에 포함되는, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시트르산, 말산, 숙신산의 총량과 류신, 이소류신, 발린의 총량의 중량비는 0.1 내지 0.4, 또는 0.15 내지 0.35에 포함되는, 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시트르산과, 말산과 숙신산의 합의 중량비는 1.0 내지 4.0, 또는 1.5 내지 2.5에 포함되는, 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시트르산:말산:숙신산 중량비는 10:1:1 내지 2:1.5:1.5, 7:1:1 내지 1.5:1:1, 또는 5:1:1 내지 3:1:1에 포함되는, 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 활성 작용제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 시스테인으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는, 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 활성 작용제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 티로신을 추가로 포함하거나, 또는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 시스테인을 추가로 포함하는, 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시트르산, 말산, 숙신산의 전체 몰량과 메티오닌, 페닐알라닌, 히스티딘 및 트립토판의 전체 몰량의 비는 1.35 초과인, 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 3가지 카르복실산인 시트르산, 숙신산, 말산의 전체 몰량과, 라이신과 트레오닌의 전체 몰량의 비는 0.10 내지 0.70, 또는 0.15 내지 0.55에 포함되는, 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시트르산의 중량 또는 몰량은 말산과 숙신산 둘 모두의 전체 중량 또는 몰량보다 높은, 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 류신과 시트르산의 중량비는 5 내지 1, 또는 2.50 내지 3.50에 포함되는, 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 비타민 B군, 비타민 B1 또는 비타민 B6에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 추가로 포함하는, 조성물.
13. 제1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 중추 신경계 손상은 뇌 손상, 척수 손상, 말초 신경 손상, 탈수초 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 척수 손상은 좌상성 척수 손상을 포함하는, 조성물.

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