JP4800920B2 - 神経性疾患及び損傷の治療のためのｃｄ９５リガンド／レセプター系の阻害 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳類における神経性疾患又は損傷の治療のための、特に脳損傷又は脊髄損傷の治療のための、とりわけ対麻痺の治療のための医薬品の製造のためのＣＤ９５リガンド／レセプター系の阻害剤の使用に関する。

アポトーシス性細胞死は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後の二次ダメージ及び神経機能障害に寄与する（１）。その他の神経変性モデル、例えば脳卒中（２）におけるアポトーシスプログラムの主な誘導因子は、ＴＮＦリガンド／レセプター系及びＣＤ９５リガンド／レセプター系である。腫瘍壊死因子レセプター−１（ＴＮＦ−Ｒ１、ｐ５５、ＣＤ１２０ａ）及びＣＤ９５（ＡＰＯ−１、Ｆａｓ）は、その他のデスレセプターと同様に、アポトーシスシグナルの伝達にとって重要なデスドメインの存在によって特徴づけられる（３）。三量化したリガンドによるレセプターの連結により、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）、ＭＯＲＴ−１；（４）及びカスパーゼ−８が、デス誘導シグナル複合体（ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＤＩＳＣ）へと動員される（５）。ＤＩＳＣにおけるカスパーゼ−８は自己分断により活性化され（６）、及び下流のエフェクターカスパーゼの活性化により細胞にアポトーシスを引き起こす。

カスパーゼ−１及びカスパーゼ−３の両方の活性化及び分断は、ＳＣＩ後のニューロンにおいて検出され、及びこれらの阻害は外傷後の傷害の大きさを減少させる（７）。ＳＣＩ後、ＴＮＦ、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌの発現は傷害部位において増加する（８）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＩにおけるＴＮＦ−Ｌ／Ｒ系の役割はしかし論争となっている。一方で、ＴＮＦの中和はＳＣＩ後のアポトーシス性細胞の数を有意に減少させた（９）。他方で、ＴＮＦ又はＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおいては、より多くのアポトーシス性細胞が検出され、傷害はより大きく、及び前記マウスは野生型（ｗｔ）マウスよりも悪化した機能回復を示した（１０）。ＣＤ９５の発現は頸部ＳＣＩ後の星状膠細胞、乏突起膠細胞及び小膠細胞において見出された（１１）。しかし、ＳＣＩにおけるＣＤ９５−Ｌ／Ｒ系の関わりは、ＷＯ０１／４１８０３によってＴＮＦα及びＣＤ９５Ｌ阻害剤の組み合わせの使用が、変性障害、例えばアルツハイマー、パーキンソン及び骨髄ダメージの予防又は治療のために提案されてはいるものの、まだ明らかにされていない。

ＷＯ９９／１４３３０はＴＮＦＲホモログである、ＤｃＲ３ポリペプチドを開示する。ＤｃＲ３ポリペプチド又はＤｃＲ３ポリペプチドを含有するキメラ分子は、哺乳類の細胞におけるＣＤ９５Ｌ誘導アポトーシスを阻害することが可能である。しかし、ＣＤ９５系の阻害がＳＣＩの治療に有益であることを実証するデータはない。

（４２）においては、ラットＳＣＩモデル中のＣＤ９５の発現が、ＣＤ９５に指向したモノクローナル抗体での免疫組織化学によって評価される。ＣＤ９５との免疫反応性は白質及び灰白質において（星状膠細胞、乏突起膠細胞、及びニューロンにおいて）損傷後、２週間まで検出される。著者らによればＣＤ９５陽性細胞の検出は、ＣＤ９５系の遮断がＳＣＩのための可能性ある治療上のアプローチであってもよいことを示唆する。

（４２）におけるデータは、しかし、ＣＤ９５の阻害が実際にＳＣＩの治療のために有益であるという結論を認めるものではない。ＣＤ９５の細胞発現は必要であるが、しかしＣＤ９５系を介したアポトーシスの誘導に十分ではない。例えば、（４２）によればＣＤ９５を発現する細胞の種類の１つである星状膠細胞は、ＣＤ９５媒介アポトーシスを受けやすいわけではない（４３）。このように、ＣＤ９５を単に検出するだけでは、前記系が前記細胞の死の誘導に関わっているという結論を認めるものではない。これに関して、アポトーシスに同様に関わるＴＮＦレセプターの発現が欠損（１０及び４４）しても、ＳＣＩ後のより良好な臨床的な結果は生じない。従って、ＳＣＩに対する、可能性のある治療の効能へと導く全ての結論は、機能的なデータによって支持されていることが好ましい。要約すると：（４２）は、ＣＤ９５系がＳＣＩに誘導されたダメージに関わっているという結論を認めるものではない、記載的なデータを単に示しているに過ぎない。

本出願においては、我々は初めて、ＣＤ９５系の阻害が脊髄損傷後の臨床的な結果を有意に改善する結果を認める機能的なデータを示す。従って、本出願は、ＣＤ９５系の阻害剤によるＳＣＩの治療のための最初の有効な開示である。

ＣＤ９５リガンド／レセプター（Ｌ／Ｒ）系及びＴＮＦリガンド／レセプター（Ｌ／Ｒ）系が、ＳＣＩに誘導されたダメージに関わっているかを言及するために、げっ歯類のＳＣＩモデルを使用した。背側の脊髄横断の後、ＣＤ９５、ＣＤ９５Ｌ、及びＴＮＦの発現は損傷部位において上昇した。ＣＤ９５Ｌのみでの、又はＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦの両方での治療的な中和は、ＳＣＩ後のアポトーシス性細胞死を減少させた。とりわけ重要なことに、抗ＣＤ９５Ｌ抗体、抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ抗体で、又はＣＤ９５−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスは、対照群のマウス又は抗ＴＮＦのみで処置したマウスのケースではなかった能動運動を開始することが可能であった。ＣＤ９５Ｌ活性の欠損した動物における移動動作の改善は、障害部位における再生線維の増加及び成長関連タンパク質−４３（ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−４３）の平行した調節上昇によって反映される。更に、ＣＤ９５Ｌ／Ｒ系の中和は、ミエリン塩基性タンパク質（乏突起膠細胞の生存率の間接的なマーカー）及び、ニューロンマーカー、βＩＩＩ−チューブリンの発現を増加させる。本発明において我々は初めて、ＣＤ９５Ｌの中和が、成体の損傷脊髄における軸索再生、及び損傷した動物の機能的改善を促進することを実証する。

本発明の第１の観点は、哺乳類における、例えばヒト患者における、脳損傷又は脊髄損傷、例えば脳傷害、又は部分的な又は完全な脊髄傷害、とりわけ対麻痺の治療のための医薬品の製造のためのＣＤ９５Ｌ／Ｒ系の阻害剤の使用に関する。意外にも、脊髄損傷、例えば成体被験体における傷害は、成功して治療される可能性があることが見出された。更に、本発明は特に急性の損傷の治療に有用であることが見出された。損傷、特に脊髄損傷は切断、圧迫によって、虚血状態によって、又はその他の方法によって引き起こされてよい。ＣＤ９５Ｌ／Ｒ阻害剤の投与は、改善された軸索成長、特にニューロン、小膠細胞及び／又は乏突起膠細胞の成長を含む、機能回復を生じる。特に有利な適応は、脊髄損傷後の、移動動作の再生、刺激の改善、及び／又は運動協調の回復である。

本発明の有利な実施態様においては、阻害剤はＣＤ９５リガンド（Ｆａｓリガンド；ＡＰＯ１リガンド）阻害剤である。例えば、ＣＤ９５リガンド阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＣＤ９５リガンド抗体、又は前記抗体のフラグメント；
（ｂ）可溶性ＣＤ９５レセプター分子、又は前記分子のＣＤ９５リガンド結合部；及び
（ｃ）ＦＬＩＮＴ、ＤｃＲ３から選択されたＦａｓリガンド阻害剤、又は前記ＦＬＩＮＴ又はＤｃＲ３のフラグメント
から選択されてよい。

有利には、阻害性の抗ＣＤ９５Ｌ抗体及び前記抗体の抗原結合フラグメント及び可溶性ＣＤ９５Ｒ分子又は前記分子のＣＤ９５Ｌ結合部である。適した阻害性の抗ＣＤ９５Ｌ抗体の例はＥＰ−Ａ−０８４２９４８、ＷＯ９６／２９３５０、（３８）、ＷＯ９５／１３２９３、又は（３９）に開示されているか、又は同様に前記の抗体の例から得られたキメラ抗体又はヒト化抗体（参照、例えばＷＯ９８／１００７０）でもある。更に有利には、可溶性のＣＤ９５レセプター分子、例えばＥＰ−Ａ−０５９５６５９及びＥＰ−Ａ−０９６５６３７に記載されている、膜貫通ドメインを有しない可溶性ＣＤ９５レセプター分子、又はＷＯ９９／６５９３５に記載されているＣＤ９５Ｒペプチドであり、これらは引用によって本発明に組み込まれる。

特に有利には、異種ポリペプチドドメイン、特に、例えばヒトＩｇＧ１分子からの、ヒンジ領域を含有するＦｃ免疫グロブリン分子に場合によって融合した、ＣＤ９５Ｒ分子の細胞外ドメイン（特に、ＵＳ特許明細書５８９１４３４による、成熟ＣＤ９５配列の１〜１７２アミノ酸（ＭＬＧ・・・・・ＳＲＳ））を含有するＣＤ９５Ｌ阻害剤である。細胞外ＣＤ９５ドメイン及びヒトＦｃドメインを含有する、特に有利な融合タンパク質がＷＯ９５／２７７３５に記載されていて、これは引用によって本発明に組み込まれる。

Ｆａｓリガンド阻害剤ＦＬＩＮＴ又はＤｃＲ３又はフラグメント、例えば前記ＦＬＩＮＴ又はＤｃＲ３の可溶性フラグメント、例えば異種ポリペプチド、特にＦｃ免疫グロブリン分子に場合によって融合した細胞外ドメインは、ＷＯ９９／１４３３０、ＷＯ９９／５０４１３又は（４１）に記載されていて、これは引用によって本発明に組み込まれる。ＦＬＩＮＴ及びＤｃＲ３は、ＣＤ９５リガンド及びＬＩＧＨＴ（ＴＮＦファミリーのまた別のメンバー）に結合することが可能なタンパク質である。

本発明の更なる実施態様において、阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＣＤ９５レセプター抗体、又は前記抗体のフラグメント；及び
（ｂ）阻害性のＣＤ９５リガンドフラグメント
から選択されてよいＣＤ９５Ｒ阻害剤である。

適した阻害性の抗ＣＤ９５Ｒ抗体及び阻害性のＣＤ９５Ｌフラグメントの例はＥＰ−Ａ−０８４２９４８及びＥＰ−Ａ−０８６２９１９に記載されていて、これらは引用によって本発明に組み込まれる。

本発明のまた更なる実施態様においては、阻害剤は核酸エフェクター分子である。核酸エフェクター分子はアンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、及びリボザイムから選択されてよく、これらはＣＤ９５Ｒ及び／又はＣＤ９５Ｌ遺伝子の発現を阻害することが可能である。

本発明のまた更なる実施態様においては、阻害剤は細胞内ＣＤ９５Ｒシグナル伝達に指向されてよい。そのような阻害剤の例は、ＷＯ９５／２７７３５に記載されていて、例えばインターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）の阻害剤、特に３，４−ジクロロイソクマリン、ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ＩＣＥ特異的テトラペプチド、ＣｒｍＡ又はウサルピン（ｕｓｕｒｐｉｎ）（ＷＯ００／０３０２３）である。更に、ＩＣＥに指向した核酸エフェクター分子も使用してよい。

阻害剤、又は前記阻害剤の組み合わせは、これを必要とする被験体、特にヒト患者に、特定の症状の治療のために十分な量において、適した方法によって投与される。例えば、阻害剤は薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤及び／又は佐剤と共に、薬学的な組成物として処方されてよい。治療の効能及び毒性は標準的なプロトコルに従って決定されてよい。薬学的な組成物は、全身に、例えば腹腔内に、又は静脈内に、又は局所的に、例えば脊髄腔内に、又は腰椎穿刺によって投与されてよい。有利には脊髄腔内投与である。

薬学的な組成物は有利には急性の損傷の場合に投与される。又は、本発明は非急性損傷の治療をも含み、その際、新しいダメージは、例えば切開又は切断によって導入され、及び新しく導入されたダメージをＣＤ９５Ｒ／Ｌ阻害剤治療にかける。より有利には、治療は可能な限り早く、例えば脊髄損傷の発生直後に始め、かつ十分な時間、例えば３０日間まで続ける。組成物は１回又は複数回、例えば１日１回、１日複数回、２日に１回その他で投与されてよい。

本発明のいくつかの実施態様においては、医薬品は更なる有効成分を含んでよい。更なる有効成分は、アポトーシス阻害剤、特に細胞内アポトーシス阻害剤、例えばカスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ−３又はカスパーゼ−８阻害剤、Ｂｉｄ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、又は前記阻害剤の組み合わせから選択されてよい。適した阻害剤の例は、一般的なカスパーゼ阻害剤、例えば、ＷＯ０２／０９４２６３、ＷＯ０１／１０３８３、ＷＯ０１／４２２１６、ＷＯ０１／９００７０、ＷＯ０１／９４３５１、ＷＯ０１／２１６００、ＷＯ００／６１５４２、ＷＯ９９／４７５４５、ジペプチド阻害剤（ＷＯ９９／４７１５４）、カルバマート阻害剤（ＷＯ０１／７２７０７）、置換されたアスパラギン酸アセタール（ＷＯ０１／８１３３０）、ヘテロサイクリルジカルバミド（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｄｉｃａｒｂａｍｉｄｅｓ）（ＷＯ０２／０８５８９９）、キノリン−（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）誘導体（ＵＳ２００１２６４６７）、置換された２−アミノベンズアミドカスパーゼ阻害剤（ＷＯ００／５５１１４）、置換されたα−ヒドロキシ酸カスパーゼ阻害剤（ＷＯ０１／１６０９３）、ニトロシル化による阻害（ＷＯ９８／４３６２１）；ＣＡＳＰ−１：（ＷＯ０２／０００８５３；ＣＡＳＰ−３：タンパク質阻害剤（ＷＯ０２／０６６０５０）、アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３３１０）、ニコチニル−アスパルチル−ケトン（ＷＯ０１／２７０８５）、γ−ケト酸ジペプチド誘導体（ＷＯ０２／４８１７９、ＷＯ００／３２６２０、ＷＯ００／５５１２７）、ＣＡＳＰ−８：アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３５４１）、相互作用タンパク質（ＷＯ００／３９１６０）ＣＡＳＰ−９：アンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／２２６４１）；ＣＡＳＰ２：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２４７２０）；ＣＡＳＰ−６：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２９０６６）；ＣＡＳＰ−７：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２２６４０）；ＣＡＳＰ−１２阻害剤：ＷＯ００／５９９２４、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更なる例は、ミトコンドリアの阻害剤、例えばＢｃｌ−２調節因子（ＷＯ０２／０９７０９４）；Ｂａｄ由来のＢｃｌ−２（ＷＯ９４／２７４２６）ミュータントペプチド（ＷＯ０２／２０５６８）、Ｂａｄ（ＷＯ９６／１３６１４）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＷＯ９８／０９９８０）、Ｂａｘ阻害剤タンパク質（ＷＯ９８／４０３９７）、ＢＬＫ遺伝子及び遺伝子産物（ＷＯ９９／５０４１４）、これらは引用によって本発明に組み込まれる。アポトーシスの更に適した細胞内モジュレーターは、ＣＡＳＰ９／Ａｐａｆ−１会合（ＷＯ０２／０６４１２８）のモジュレーター、Ａｐａｆ−１発現のアンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／３２９２１）、アポトーシス阻害のためのペプチド（ＷＯ９９／４３７０１）、単純ヘルペスウィルスのＲ１サブユニットを含む抗アポトーシス組成物（ＷＯ００／０７６１８）、ＭＥＫＫ１及びそのフラグメント（ＷＯ９９／４１３８５）。サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）のモジュレーター（ＷＯ０１／６４７４１）、アポトーシス阻害剤のモジュレーター（ＷＯ９７／０６１８２、ＷＯ００／７７２０１、ＷＯ０１／５９１０８、ＷＯ０２／０５３５８６）及びＨＩＡＰ２（ＷＯ００／０８１４４）であり、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更に、上記の阻害剤の全ての組み合わせを使用してよい。

更なる成分はデスリガンドレセプター系（ＣＤ９５Ｌ／Ｒ以外）、例えばＴＲＡＩＬ−Ｌ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ系（参照、ＷＯ９８／３５９８６）、ＴＲＡＭＰ−Ｒ／ＴＲＡＭＰ−Ｒ系、又はＤＲ６−Ｌ／ＤＲ６−Ｒ系（参照、ＵＳ−Ａ−６４２３４９４又はＷＯ０１／８５２０９）又はＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ系の阻害剤から選択されてよい。適した阻害剤は阻害性の抗デスリガンド又はレセプター抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は可溶性デスレセプター分子、又は前記分子のデスリガンド結合部、例えばＦｃ免疫グロブリンドメインとの融合体である。

例えば、更なる有効成分は、ＴＮＦ Ｌ／Ｒ系の阻害剤、例えば、阻害性の抗ＴＮＦ抗体又は前記抗体のフラグメント（ＷＯ９５／２０９７８、ＷＯ９６／３３２０４又はＷＯ０２／０１２５０２に記載）、異種ポリペプチドドメイン、特にＦｃ免疫グロブリンドメインに場合によって融合した可溶性のＴＮＦレセプター分子（ＷＯ９８／２４４６３に記載）、又はＴＮＦ結合タンパク質（ＷＯ９６／０３１４１に記載）から選択されてよく、これらは引用によって本発明に組み込まれる。ＴＮＦ Ｌ／Ｒ阻害剤の投与は特に痛覚過敏の減弱に適している。

ＣＤ９５Ｌ／Ｒ阻害剤とＴＮＦ Ｌ／Ｒ阻害剤との組み合わせた投与は、例えばＷＯ０１／４１８０３に開示されていて、これらは引用によって本発明に組み込まれる。

有利にはしかし、ＣＤ９５Ｌ／Ｒ阻害剤はＴＮＦ Ｌ／Ｒ阻害剤なしで投与される。この方法により、可能性のある有害な副作用の発生は減少するか、又はなくすことが可能である。というのは、ＴＮＦの阻害はいくつかのマウスモデル、例えば盲腸結紮及び穿刺において深刻な合併症を引き起こしたからである（４０）。

更なる有効成分のその他の例は、グリア性瘢痕の形成を阻害する化合物、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣである。

投与される阻害剤の用量は勿論、治療される被験体、被験体の重量、損傷のタイプ及び重傷度、投与の方法、及び処方する医師の判断に依存する。抗ＣＤ９５Ｒ又はＬ抗体、又は可溶性のＣＤ９５Ｒタンパク質、例えばＣＤ９５−Ｆｃ融合タンパク質の投与のためには、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの１日量が適する。

本発明は以下の図及び実施例によって更に説明される。
図１ アポトーシス性細胞死はＳＣＩ後３日目にピークを迎え、抗ＣＤ９５Ｌ抗体での処置によって有意に減少する
（Ａ）アポトーシス性細胞死を、ｗｔＣ５７ＢＬ／６動物の、偽手術した動物において、及び胸部ＳＣＩ後、１日目、３日目、及び１４日目に、ＴＵＮＥＬ染色によって評価した（１群当たりｎ＝４）。（Ｂ）ＣＤ９５Ｌ陽性細胞カウント；（Ｃ）ＣＤ９５陽性細胞カウント；（Ｄ）ＴＮＦ陽性細胞の数。偽手術した動物において、及びＳＣＩ後、１日目、３日目、及び１４日目（１群当たり、ｎ＝４マウス）に、互いに２００μｍ離れた、２０μｍ厚さの骨髄切片３個において細胞をカウントした。（Ｅ）ＳＣＩを受けさせたＷｔ動物を、抗ＣＤ９５Ｌ、抗ＴＮＦ、又は抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦのいずれかで、又はコントロールとして食塩水又はＩｇＧでｉ．ｐ．処置した（１群当たりｎ＝４）。３日間の生存期間後、アポトーシス性細胞をＴＵＮＥＬによって染色し、及び互いに２００μｍ離れた３個の２０μｍ切片においてカウントした。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示される。有意性はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用い、抗体処置した動物中のアポトーシス性細胞の数と、対照群中のとを比較することによって決定した（^＊＊ｐ≦０．０１）。

図２ ＳＣＩ後の機能回復はＣＤ９５Ｌ、又はＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦの遮断を有する動物において改善される
動物を、抗ＣＤ９５Ｌ（黒丸）で、又は抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ抗体（白ひし形）のどちらか、又はコントロールとして食塩水（黒三角）又はＩｇＧ（白四角）で処置した（１群当たりｎ＝１１）。実験の第２セットにおいて、動物を抗ＴＮＦ抗体（白六角形）又はコントロールとして食塩水（黒三角）で処置した。全ての挙動的な試験を二重盲検法において実施した。動物を損傷後１、２、３及び４週間目に、次のタスクにおいて試験した：（Ａ）ＢＢＢ（このために、動物を更にＳＣＩ後１日目に試験した）；（Ｂ）グリッドウォーク（ｇｒｉｄ ｗａｌｋ）；（Ｃ）水泳動作；（Ｄ）ローターロッドにおける維持時間；（Ｅ）「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ」による機械刺激に対する反応。試験した全てのタスクに対して、２つの対照群の間にも、２つの処置群の間にも、調査した全ての時間点において有意差はなかった。データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示する。抗ＣＤ９５Ｌ処置群及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置群と、食塩水群とを比較するｐ値のみをグラフに示す；処置群とＩｇＧ群とを比較するｐ値を図Ｓ１に示す；（^＊ｐ≦０．０５；^＊＊ｐ≦０．０１ Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）。

図３ ＳＣＩ後の抗ＣＤ９５Ｌ、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物における皮質脊髄路（ＣＳＴ）の再生
ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）を、ＳＣＩ後２週間の、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物、抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物、食塩水、及びＩｇＧ処置動物の感覚運動皮質（座標：ブレグマ−１．５；１；１）中に注入した（１群当たり、ｎ＝４〜５）。（Ａ）損傷後４週間目に、傷害の中心から最も尾側へと延びる再生線維の距離を３個の連続的な脊髄切片において決定した。ラベルした線維は食塩水処置動物及びＩｇＧ処置動物においては傷害部位から、２５０±１１．５μｍだけ前方へ退縮する。抗体処置動物における、傷害の中心への平均距離は著しく短い（９５±６２μｍ）。（Ｂ）それぞれの群の代表的なＢＤＡラベル化した皮質脊髄線維の例。傷害の中心は垂線によって示す。ＣＳＴは食塩水処置対照動物及びＩｇＧ処置対照動物においては傷害部位から退縮する（上パネル）が、その一方で、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物においては、横断したＣＳＴから発芽する多数の異所性線維が背側の白質及び傷害瘢痕中へと成長する（下パネル）。（Ｃ）枠領域をより大きく拡大すると、抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物においては傷害部位に対して吻側に再生発芽及びシナプスボタンを示し（右コマ）、又は食塩水処置動物においては対応する領域に再生発芽がないことを示す（左コマ）。スケールバー、２０μｍ；枠領域、１０μｍ。

図４ 抗ＣＤ９５Ｌ、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物における減少した二次ダメージ及び高まった再生
動物にＳＣＩを受けさせ、及び抗ＣＤ９５Ｌのみで、又は抗ＴＮＦ抗体と共に、又はコントロールとして食塩水又はＩｇＧで処置した。４週間の生存期間後、次のタンパク質をウェスタンブロット法（１群当たりｎ＝３）によって検出した。アクチンをそれぞれのレーンにおける等しいタンパク質負荷（２０μｇ）のためのコントロールとして使用した。（Ａ）抗体処置動物及び対照処置動物におけるニューロンマーカーの発現レベルの分析、βＩＩＩ−チューブリンタンパク質、タウ（Ｔａｕ）−５タンパク質及びタウ−１タンパク質のための、５０ｋＤａの特異的バンドとして示された；（Ｂ）ＭＢＰのための２２ｋＤａバンド；（Ｃ）ＧＦＡＰのための５０ｋＤａバンド；（Ｄ）ＧＡＰ−４３のための４３ｋＤａバンド。Ｓ．Ｏ．＝偽手術した；Ｅ１５＝１５日胚。

図５ 抗ＣＤ９５Ｌ処置群、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置群対ＩｇＧ処置群におけるマウスの挙動試験データの統計学的解析
全ての試験に対して、ＩｇＧ群に対する、抗ＣＤ９５Ｌ処置群及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置群を比較するｐ値を示す（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）；全ての試験に対して、^＊ｐ≦０．０５；^＊＊ｐ≦０．０１、ＮＳ＝有意でない。

図６ ＳＣＩ後の機能回復がＣＤ９５−ＦＣ融合タンパク質の投与によって改善される
動物をＣＤ９５−Ｆｃ（黒三角）、又はコントロールとして食塩水（黒四角）のどちらかで処置した。ＢＢＢタスクにおいて、動物を損傷後１、２、３及び４週間目に試験した。

表１：水泳スコア
動物の水泳動作を次の特徴をスコア付けすることにより評価した；後肢運動、後肢−前肢協調、尾の位置、足の位置、矢状面及び冠状面バランス。

実施例１：抗ＣＤ９５Ｌ抗体でのＳＣＩの治療
１．材料及び方法
１．１ 脊髄損傷モデル
脊髄損傷をＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにあるメス野生型（ｗｔ）マウスにおいて実施し、全てのマウスは齢（平均７５日）及び重量（平均２４ｇ）を合わせた。ケタミン及びロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）（１５０ｍｇ／各体重量ｋｇ）のｉ．ｐ．注入によって深い麻酔に達する。椎骨レベルＴｈ８／９の椎弓切除を、脊髄を露出するために実施する。背側の脊髄を鋭い虹彩切除術鋏（ＦＳＴ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）で対称的に傷害させ、腹側の索中の線維のみが完全な３分の２切断が生じた。筋肉と皮膚を別々に縫合後、マウスをケージに戻す前にヒーティングブロック（３７℃）において回復させた。

動物を術後に抗生物質（ゲンタマイシン、０．２ｍｇ／ｍｌで５ｍｌ／ｋｇ）で、１日１回、７日間処置した。全てのマウスは１２時間明暗周期におかれ、及び水及び餌を任意にとった。前記マウスの膀胱を１日１回、自律性膀胱機能の回復まで用手的に圧迫した。

動物にＳＣＩを受けさせ、及び異なる生存期間（１、３、及び１４日）の後、前記動物を深い麻酔にかけ、及び心臓内灌流によって殺した。

抗体治療のために、抗ＣＤ９５Ｌ抗体（ＭＦＬ３；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のみを、又は抗ＴＮＦ抗体Ｖ１ｑ（３２）と一緒で、それぞれ５０μｇ使用した。抗体を傷害３０分後に、かつ３日間まで毎日（生存期間３日間、１群当たりｎ＝４）、又は損傷２時間前に、４週間まで、１週間に２回（生存期間４週間、１群当たりｎ＝１１）、二重盲検方においてｉ．ｐ．注入した。加えて、マウスに食塩水及びラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）をコントロールとして注入した。実験の第２シリーズにおいてマウスを抗ＴＮＦ抗体のみで、又はコントロールとして食塩水でｉ．ｐ．処置した。３日間又は４週間の生存期間の後、マウスを深い麻酔にかけ、及び心臓内灌流、又は断頭によって死亡させた。

１．２ 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化ＵＴＰニックエンドラベル化（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＵＴＰ Ｎｉｃｋ Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ）
縦のクリオスタット脊髄切片（２０μｍ）を末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ビオチン化ＵＴＰニックエンドラベル化（ＴＵＮＥＬ）技術（３３）に従って処置した。４℃で一晩１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を有するＰＢＳ中でのインキュベーションによってタンパク質を核から除いた。内因性ペルオキシダーゼを室温で５分間２％Ｈ_２Ｏ_２で切片を覆うことで不活性化した。切片を０．３５ｍＭビオチン化ｄＵＴＰ、ＴｄＴバッファー１０ユニット、２ｍＭＣｏＣｌ_２、１ｍＭ ｄＡＴＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、３７℃の湿室中で６０分間インキュベーションした。室温で１５分間ＴｒｉｓＥＤＴＡバッファーへとスライドを移すことで反応を停止させた。切片を更にアビジンビオチン複合体（ＡＢＣ）系（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及び引き続きジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ）インキュベーションを使用して処理した。ＤＮＡ３′−ＯＨ末端を不十分な量しか含有しない正常な核は、この技術では染まらない。ネクローシス形態及びＤＮＡ末端の検出可能な濃度を有する細胞は、アポトーシス性核に比べてより拡散したラベル化を示す。コントロールとして、切片を、酵素又はヌクレオチドのどちらかの非存在下においてインキュベートした。４マウス／群において、互いに２００μｍ離れた３個の連続した切片におけるアポトーシス性細胞を、処置を知らない人物によってカウントした。全てのデータを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。有意性をＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて測った。

１．３ 免疫組織化学及び免疫蛍光
未処置マウスからの、縦のクリオスタット脊髄切片（２０μｍ）を免疫組織化学及び免疫蛍光のために処理した。１、３又は１４日間の生存期間の後で、切片をＣＤ９５Ｌ、ＣＤ９５に対する一次抗体（Ｍ２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びＴＮＦ−αに対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ９５及びＴＮＦ−αタンパク質の免疫活性をジアミノベンジジン（Ａｌｅｘｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって視覚化した。ＣＤ９５のみが偽手術した動物の脊髄において検出可能で、その一方で、前記タンパク質の全てがマウス胸腺及びマウスＣＤ９５Ｌでトランスフェクションした腫瘍からの切片において検出可能であった。これらの３つのタンパク質のいずれも、一次抗体又はアイソタイプコントロールＩｇＧなしで実施されたコントロール染色において検出されなかった。二重免疫蛍光は前記の一次抗体、及びニューロンマーカー（ＮｅｕＮ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、リンパ球マーカー（ＣＤ３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、星状膠細胞マーカー（ＧＦＡＰ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、乏突起膠細胞マーカー（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｍａｒｋｅｒ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及び小膠細胞マーカー（ＣＤ１１ｂ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に実施した。免疫活性をモノクローナル又はポリクローナルＣｙ３ラベル化二次抗体及びＦＩＴＣラベル化二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で視覚化した。脊髄中におけるＭＦＬ３抗体の分布を試験するために、ビオチン化したＭＦＬ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。抗体をＳＣＩの２時間前にｉ．ｐ．注入し、及び３時間、６時間又は２４時間の生存期間の後に、縦の脊髄切片をストレプトアビジン−ローダミン染色（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）処理した。

１．４皮質脊髄路（ＣＳＴ）の前方追跡
脊髄傷害の２週間後、何匹かの動物（１群当たりｎ＝５）を深い麻酔にかけ、及び定位枠に入れた。頭皮を切開し、及び感覚運動皮質に穴を開けた。食塩水中のビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の１０％溶液 １μｌの圧力注射を、感覚運動皮質（座標：ブレグマ１．５；１；１）の両側に行った。注射の２週間後、遊離の浮遊脊髄切片（５０μｍ）を以前に説明したようにＢＤＡ染色処置した（３４）。傷害部位の唯一の明らかな基準点は傷害中心であった。従って、我々は最も尾側の芽から傷害中心への距離を定量化した（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ、Ｓｃｉｏｎ．ｃｏｍｐ）。傷害中心を越えた距離を正の距離及び、そうでなければ負の距離としてスコア付けした。

１．５ ウェスタンブロット
１群当たり３匹の動物の、傷害部位からの脊髄組織（傷害に対して吻側及び尾側両方を、１ｍｍ）をＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｎａ−デオキシコラート、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、プロテアーゼ阻害剤１ｍＭ ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン それぞれ１μｇ／ｍｌで補った）中において溶解し、及び音波処理した。以下のモノクローナル抗体を使用した：マウス抗チューブリン（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウスタウＡｂ−２（Ｃｌｏｎｅ ＴＡＵ−５、１：２５００、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、マウス抗タウ−１（１：２５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ラット抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、１：８０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウス抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、１：２５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及びマウス抗成長関連タンパク質−４３（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−４３）（ＧＡＰ−４３、１：２５００、Ｓｉｇｍａ）。結合した抗体を抗マウス又は抗ラットホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（１：５０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ）どちらか、及び高感度化学発光（Ｎａｌｇｅｎｅ）で検出した。個々の動物からの組織を別々に分析した。アルカリホスファターゼ処理のために、タンパク質溶解物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤で３時間３７℃でインキュベートし、次にアルカリフォスファターゼ０．２５Ｕ／タンパク質 μｇを添加した。

１．６細胞培養
Ｅ１５マウスの海馬を解剖し、トリプシン処理し、及び物理的に解離させた。細胞を次にＨＢＳＳ中において洗浄し、及び３０００００個の細胞を最小必須培地（ＭＥＭ）及び１０％非働化ウマ血清を含有する、６ｃｍペトリ皿中のポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）ガラスカバースリップの上においた。細胞を３６．５℃で４時間、５％ＣＯ_２中に維持した。カバースリップを次にＢ−２７及びＮ２補給を含有するＭＥＭへと移した。８日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）後、培養した海馬ニューロンを軸索切断（Ｌａｓｅｒ Ｐａｌｍ）にかけ、及びすぐに２４時間、抗ＣＤ９５Ｌ １０μｇ／ｍｌ又はＩｇＧ １０μｇ／ｍｌで処置するか、又は未処置のままにした。

細胞を次にＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中で固定し、洗浄し、及びＧＡＰ−４３抗体（ＧＡＰ−４３、１：２５０、Ｓｉｇｍａ）で染色した。免疫反応性をモノクローナルローダミンラベル化二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で視覚化した。アポトーシス性核を視覚化するために、ＤＡＰＩ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）を二次抗体に付加した。

１．７挙動試験
全ての挙動試験を二重盲検法において実施した。動物を損傷後１、２、３及び４週間目に試験した。ＢＢＢスコアのために、動物を更にＳＣＩ後１日目に試験した。動物を試験の間ビデオカメラでモニターし、及び前記動物の動作を４分の１スピードでデジタルカメラから評価した。

ＢＢＢ移動運動スコア（ＢＢＢ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｓｃｏｒｅ）
動物の全体的な移動動作を、わずかに修正したＢＢＢ移動運動評価スケールを用いて評価した（３５）。マウスを長さ１ｍ及び幅６ｃｍのプレキシガラス走路においた。後肢運動の観察を容易にするために、傾斜ミラー（角度６０゜）の上に走路を置いた。各動物は走路を３回渡らなくてはならなかった。試験セッションごとに、処置を知らない二名の観察者が、動物にポイントを別々に割り当てた。後肢移動運動を０（観察可能な後肢運動がない）から２１ポイントまでスコア付けした。回復している運動の特徴の連続が、もともとのスコアに記載されたものと同じでない場合にはスケールを修正した。マウスは、その回復の初期にその尾を持ち上げるので（すでに１０ポイントのスコア）、尾の位置に対して更なる０．５ポイントを与えた。

グリッドウォーク試験
下行性運動制御における欠損を、円形の金属バーの間に不規則に割り当てたすき間（０．５〜２ｃｍ）を有する、長さ１ｍの走路を通り抜ける能力を評価することで検査した（３６）。決まった１０個のバーの区域をこの分析のために選択した。固定したバー距離への慣れを妨げるため、この区域内のバーを試験セッションごとに変えた。各動物はこの区域を３回渡らなくてはならない。足の置き間違いの数をカウントすることによって分析を実施した：動物が後肢重量のサポートを有しない場合には、１バー当たり２エラーとなり、全部で２０エラーとなる。

水泳スコア
肢から脊髄までの、皮膚の及び自己受容インプットなしでの移動動作に関する情報を得るために、我々は水泳試験を使用した。長さ１ｍ及び幅６ｃｍのタンク中でマウスを泳がせ、前記タンクの端では前記マウスは水からでて島（４５゜又は６０゜スロープを有する）へと登ることが可能である。水泳及び登りのために使用した時間は動物の動作の程度を反射しない。というのは、前記時間はタンクを渡るという動物の動機付けによって大いに影響され、前記時間は訓練や各動作の終わりに報酬を与えることでは標準化され得ないからである。従って、我々は次の特徴をスコア付けすることによって水泳動作を評価した：後肢運動、後肢−前肢協調、尾の位置、足の位置、矢状面及び冠状面バランス。各動物はタンクを２回渡らなくてはならず、及び試験セッションごとにポイントが割り当てられた。

ローターロッド試験（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）
運動協調及び技能学習を試験するために、ローターロッド試験を実施した。動物をプラスティックローラー（直径５ｃｍ、長さ１０ｃｍ及び地上４０ｃｍ上）の上に置き、前記ローラーを２０秒間加速（４〜７ｒ．ｐ．ｍ）した。各動物のための３回の試験において、維持時間を１８０秒まで記録した。

機械的アロディニア試験
動物の侵害受容挙動を評価するために、我々は「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒ」試験を機械的アロディニアのために実施した。動物を丸い穴のある金属性シリンダー中に、「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ」を実施するために置いた。傷害に隣接した皮節における、「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ」（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、サイズ２．３６（０．０２３ｇ）、２．４４（０．０２８ｇ）、及び２．８３（０．０６８ｇ））での機械刺激に対する反応のためにマウスを試験した。アロディニア反応を二重盲検法において０〜３でスコア付けし、及び平均値を試験の各時間点に対して決定した。スコア付けを以下のように実施した；０−反応なし；１−一過的な屈曲；２−揺れる；３−逃げる。
１．８ 統計学的解析
細胞数の差をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によって検査した。２つの処置及び２つの対照群の異なるタスクの結果の値を、統計学的に相互に、各時間点において、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）検定を使用して比較した。前記の結果の値の進展を別々に、ＢＢＢタスク、ローターロッドタスク及びグリッドウォークタスクのために各群において、その時間における結果の値の直線回帰の傾きによって示した。異なる群の傾きを比較するためにＦ検定を使用した。改善を示さない動物はこのパラメトリック回帰においては除外しなくてはならなかった。全ての動物を含めるために、我々はＫｏｚｉｏｌのノンパラメトリック方法（３７）を、群の間の進展曲線の完全なセットを比較するために使用した。異なるタスク（ＢＢＢスコア、水泳スコア及びグリッドウォーク試験）の結果の値と、傷害の中心への距離との従属性を説明するために、ゼロでない相関の存在下における統計学的検定と共に、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用した。統計学的な有意性は０．０５の水準で評価し、及び統計学的検定方法のｐ値によって示した。全ての解析をＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ のプログラムパッケージＡＤＡＭによって実施した。

２．結果
脊髄の、背側の３分の２をｗｔマウスにおいて横断し、及びアポトーシス性細胞死の程度及び時間的な速度論を検査した。ＴＵＮＥＬ染色によって評価した死細胞は傷害部位において既にＳＣＩ後１日目で検出され、３日目に最高レベルに達し、２週間目でかろうじて検出可能なまでになった（図１Ａ）。重要なことに、ＣＤ９５Ｌ発現速度論はアポトーシス性細胞死に平行した（図１Ｂ）。ＣＤ９５は損傷してない脊髄においても既に検出可能であったが、しかし更なるＣＤ９５陽性細胞はＳＣＩ後に見出された（図１Ｃ）。ＴＮＦの発現は１日目で上昇し、３日目にピークを迎え、及び２週間目には変化しないままだった（図１Ｄ）。ＳＣＩ誘導死へのＣＤ９５Ｌ／Ｒ系及びＴＮＦ Ｌ／Ｒ系の寄与を分析するために、我々はＣＤ９５Ｌ及び／又はＴＮＦの活性を中和した。中和する抗体の組織浸透は、ｉ．ｐ．注入後既に３時間目、及び６時間目、及び２４時間目に損傷した脊髄中のビオチン化抗体の検出によって確認された（データ掲載せず）。従って、抗ＣＤ９５Ｌ及び／又は抗ＴＮＦ抗体（各５０μｇ）を二重盲検法においてｉ．ｐ．注入した。更に、マウスに食塩水及びラットＩｇＧ（５０μｇ）をコントロールとして注入した。３日間の生存期間の後に、多数のＴＵＮＥＬ陽性細胞を食塩水処置動物及びＩｇＧ処置動物の傷害部位において検出した（図１Ｅ）。ＴＮＦの急性の中和は細胞死を有意には減少しなかった（図１Ｅ）。重要なことに、ＣＤ９５Ｌのみの、又はＴＮＦと共にでの中和は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を有意に減少した（図１Ｅ）。

ＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦの中和の長期の結果を調べるために、損傷したマウスの移動動作及び機械刺激に対する反応を試験した。このために、動物をＣＤ９５Ｌに対する中和抗体のみで、又はＴＮＦと共に、又は食塩水又はラットＩｇＧで、１週間に２回４週間まで処置した（１群当たり、ｎ＝１１）。全ての挙動試験を二重盲検法において実施した。動物を損傷前、及び損傷後１日目（ＢＢＢ移動運動試験のためだけ）、１、２、３及び４週間目に評価した。試験した全てのタスクに対して、２つの対照群間にも、又は２つの処置群間にも、検査した時間点の全てに対して、統計学的な有意差を見出すことはなかった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和）。

第１に、我々はＢＢＢ移動運動スコアにより、自発的な表面にでた移動運動の複数の観点を定量化した（１２）。損傷後１日目、全ての動物は完全に対麻痺であり、及びＢＢＢスコアは０であった（スコア３に達した２匹の動物を除く；図２Ａ）。対照群の動物は検査した時間を通して能動運動の回復を示さないか又は有意ではなかった（Ｋｏｚｉｏｌ検定）。最も顕著には、ＣＤ９５Ｌ、又はＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦの両方を遮断したマウスにおいて検査された、各時間点における、臨床的な進展及び移動動作は、対照群における動物よりも有意に良好であった（図２Ａ）。従って、２つの処置群の完全な移動運動の回復は、直線回帰解析の傾きによって評価したところ、対照群における回復よりも有意に良好であった（図２Ａ）。

ＢＢＢスコアの制限の１つは、ＢＢＢスコアは脊髄中の反射路（即ち中心パターン発生器）によって制御されたステレオタイプ型運動に主に焦点をおいていることである（１３）。従って、背側の脊髄運動路（皮質脊髄路又は赤核脊髄路）の統合性を反映する更なる試験を実施した。肢の運動の随意的な観点に焦点をおいた試験の１つは、グリッドウォーク試験である。下行性運動制御の欠損は、水平な、はしご状グリッド上に後肢を正確に制御し、置くことの能力を評価することによって検査した。再度、随意運動の有意な回復を示す唯一の動物は、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物であった（図２Ｂ）。

肢から脊髄への、皮膚の及び自己受容インプットのない移動動作に関する情報を得るために、我々は水泳試験を使用した。我々は以下の特徴を０〜１０までスコア付けすることによって水泳動作を評価した：後肢運動、後肢−前肢協調、尾の位置、足の位置、矢状面及び冠状面バランス（表１）。再度、抗ＣＤ９５Ｌ抗体、又は抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ抗体で処置したマウスは、試験した全ての時間点において水泳スコアの有意な上昇を、食塩水処置動物及びＩｇＧ処置動物と比較して示した（図２Ｃ）。

運動協調及び技能学習を試験するために、ローターロッド試験を実施した（１４）。４〜７ｒ．ｐ．ｍで加速されたプラスティックローラーにおける維持時間を記録した。コントロールマウスと比較すると、ＳＣＩ後２週間目及び３週間目の抗ＣＤ９５Ｌ処置動物で、及びＳＣＩ後１、３及び４週間目の抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物における、ローターロッドにおける時間は有意に長かった（図２Ｄ）。

抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物の促進された随意運動は、損傷した軸索の増加した再生能力を示す。しかし、これは諸刃の剣である可能性があり、というのは、異所性発芽は痛覚過敏を引き起こす可能性があるからである（１５）。ＴＮＦの中和は慢性的な狭窄損傷を有するマウスにおける痛覚過敏を減弱する（１６）。ＣＤ９５Ｌのみの、又はＴＮＦと共にでの中和の影響を、損傷動物の、普通なら非侵害受容である刺激に対する反応において試験するために、我々は「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験」を使用した（１７）。このために、マウスを「ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ」による低い閾値の機械刺激に対する反応に関して試験した。アロディニアの反応を、刺激に対する反応の大きさに応じて０〜３でスコア付けした。手術前には、全ての動物は０のアロディニアスコアを有した。損傷後の全ての時間点において、コントロールマウスに比較して、二重処置したマウスだけがアロディニア挙動の有意な減少を示した（図２Ｅ）。従って、治療に抗ＴＮＦ抗体を付加することの可能性ある利点は、痛覚過敏を減弱することであってよい。

以前に観察された移動動作におけるＴＮＦの中和の「プラセボ様」効果を確認するために、実験の第２セットを実施した。このために、動物に抗ＴＮＦ抗体のみを、又は食塩水を注入した。予想通り、ＢＢＢ（図２Ａ）及びグリッドウォーク（図２Ｂ）によって評価した、運動タスクにおける差異は有意でなかった。しかし、抗ＴＮＦ処置動物のローターロッド動作は、食塩水処置マウスに比較して有意に良好であった（図２Ｄ）。これに関して、脳損傷したＴＮＦノックアウトマウスはｗｔマウスよりも、ローターロッド試験において有意に障害が少なく、及び記憶保持における深刻な欠損が有意に少なかった（１８）。これまでの報告と一致して、食塩水処置動物でなく抗ＴＮＦ処置動物のみが、検査した時間を通じてアロディニア反応の有意な減少を示した（直線回帰解析、データ掲載せず）。

これまでに試験した動物の数匹において（１群当たり４〜５匹）、背側の皮質脊髄路（ＣＳＴ）の統合性を、感覚運動皮質へのビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）の注入によって評価した（１９）。食塩水又はＩｇＧを得たマウスにおいては、横断したＣＳＴ線維は傷害部位から〜２５０μｍ（±１１．５μｍ）だけ退縮した（図３Ａ）。切断した軸索から隣接する組織へと延びる少数の芽のみが検出されたが、しかし前記芽は傷害範囲中へは成長しなかった。重要なことに、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物又は抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物においては、多数の異所性線維が、傷害部位に対して吻側の横断したＣＳＴから発芽した（図３Ｂ）。前記再生線維は背側の白質及び傷害瘢痕中へ成長した。わずかな線維は傷害中心を横切りさえした。他の研究と比較して横切る線維が比較的少ない（２０）のは、損傷の大きさに関係している。本発明では、ＣＳＴの背側の成分の全ての横断を生じる、脊髄の３分の２を切断した。従って、大きな脊髄傷害は不十分な再生的成長と相関する（２０）。抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物の傷害部位におけるＣＳＴ線維の大きい拡大像は、シナプスボタンと一致した形態を示し、機能的な接続がこれらの再生線維によって形成されることを示唆する（図３Ｂ）。

興味深いことに、ＢＤＡ追跡動物の数は少ないにも関わらず、データから、線維再生はグリッドウォーク動作におけるスコア（Ｒ＝０．６６；ｐ≦０．０５；Ｐｅａｒｓｏｎ相関）と相関していることが明らかであった。前記スコアは随意運動を反映し、及び従って、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物の機能的な改善は、反射運動をもたらす担当にある、残りの腹側路（網様体脊髄路及び前庭脊髄路）のせいではありえない。

動物の臨床的な回復の背後にある分子的機構を明らかにするために、変性、再生又は炎症のための様々なマーカーの発現を評価した。タンパク質を、移動動作のために前もって試験した動物（１群当たり、ｎ＝３）の脊髄から抽出した。

我々は、ＣＤ９５Ｌの中和がアポトーシスを減少させることを知っている。しかし、どの細胞の種類が救われるのか？ニューロン及び小膠細胞はＣＤ９５Ｌ及びＣＤ９５の両方を発現し、星状膠細胞は、ＴＮＦ及びＣＤ９５を発現し、その一方で浸潤するリンパ球はＣＤ９５Ｌを発現する（データ掲載せず）。星状膠細胞とは対照的に、乏突起膠細胞はＣＤ９５誘導アポトーシスを受けやすい（２１）。ＣＤ９５はニューロン及び小膠細胞にも発現されているので、救われた細胞は、ニューロン、小膠細胞又は乏突起膠細胞のいずれかである。

この問題を扱うために、ニューロンの細胞骨核タンパク質、βＩＩＩ−チューブリンの発現を評価した（２２）。βＩＩＩ−チューブリンのレベルは、軸索の再生の間に増加することが示された（２３）。これに応じて、対照群でなく、抗ＣＤ９５Ｌ又は抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦで処置された動物において、βＩＩＩ−チューブリン発現は著しく上昇した（図４Ａ）。

更に、我々はニューロンの微少管結合タンパク質、タウの発現を検査した。予想通りタウの総量は、タウ５抗体により評価して、処置された群の両方においてより高かった（図４Ａ）。最も重要なことに、非リン酸化タウ（Ｓｅｒ１９９及び２０２）の割合は処置された群においてより高かった（図４Ａ）。更に、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物において、タウのためのもう１つのバンドが検出された（矢印）。前記バンドが、タウの変性又は脱リン酸化のせいであるかを決定するために、我々は溶解物をアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で処理した。ＡＰでの処理は、上側のバンドを下にシフトさせた（データ掲載せず）。従って、我々はＣＤ９５Ｌの中和はタウの脱リン酸化を容易にすることを結論づける。脱リン酸化タウは微少管（ＭＴ）構造を安定化させ、従って軸索成長を可能にする（２４）。

乏突起膠細胞はＳＣＩ後にアポトーシスを経ることが報告されている（２５）。乏突起膠細胞が失われると、初期の外傷を生き残った軸索の脱髄が生じる。更に、ＣＤ９５Ｌ／Ｒ系は、複数の硬化症において脱髄の主要なトリガーであることが仮定されてきた（２６）。従って、抗ＣＤ９５Ｌでの処置は、脊髄損傷後の乏突起膠細胞死を減少させ、従って軸索の脱髄を減少させるということを推測したくなる。この問題を扱うために、我々はミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のレベルを評価した。前記タンパク質は乏突起膠細胞によって作られ、及び前記タンパク質の存在は乏突起膠細胞の生存率の非直接的なパラメーターとして役に立ってもよい（２７）。抗ＣＤ９５Ｌのみで、又は抗ＴＮＦと共に処置した動物においては、ＭＢＰレベルはコントロールマウスと比較して上昇した（図４Ｂ）。

再生は炎症反応を妨げることで容易になる可能性もある。炎症反応の増幅は、ＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦによって、その他の系における場合と同様に行われる可能性がある（２８）。ＳＣＩ後、反応性星状膠細胞は傷害部位に侵入してアストログリア性瘢痕を生じる。瘢痕は軸索再生のための機械的な障害物となる（２９）。ＣＤ９５Ｌの阻害はＳＣＩ後の瘢痕形成を減少させる可能性がある。従って、我々は反応性星状膠細胞のためのマーカー、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のレベルを評価した。ＧＦＡＰの発現レベルは処置群と対照群との間で相違しない（図４Ｃ）。

ＣＤ９５Ｌの中和は、損傷した軸索の再生の可能性を直接的に上昇させる可能性がある。これを試験するために、我々は成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）の発現レベルを検査した。ＧＡＰ−４３の発現は胸部のＳＣＩ後、再生する可能性のある軸索においてのみ上昇することが示された（３０）。更に、ＧＡＰ−４３及び、更なる主要な成長円錐タンパク質ＣＡＰ−２３の共発現は、ＳＣＩ後のＤＲＧ軸索の再生を６０倍上昇させた（３１）。抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物においては、ＧＡＰ−４３発現は対照群に比較して上昇した（図４Ｄ）。

まとめると、第１に我々は移動運動試験によって、ＣＤ９５Ｌの中和はＳＣＩ後の機能回復を促進することを示した。ステレオタイプ型の反射運動に主に焦点をあてるＢＢＢスコアの他に、我々は傷害によって影響される背側の脊髄路の統合性を反映する試験をも実施した。これらはグリッドウォーク試験及び水泳試験である。我々は、肢から脊髄への、皮膚の及び自己受容インプットがない移動運動の複数の観点を定量化するために、動物の水泳動作に応じた水泳スコアを開発した。全ての試験において、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物の機能回復は、２つの対照群の動物よりも有意に良好であった。抗ＴＮＦのみで処置された動物は有意な機能回復を示さなかったが、しかし処置に抗ＴＮＦ抗体を加えると、機械的なアロディニアは減弱された。

第２に、ＢＤＡ追跡試験は、抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物においてのみ、損傷した軸索の再生能力を上昇させることを示した。更に、傷害部位におけるシナプスボタンの形成によって実証されたように、前記再生線維は機能的な接続を形成する。このように、ＣＤ９５Ｌの中和は軸索の可塑性を促進して、脊髄回路の機能的な再造形を生じる可能性がある。軸索再生は傷害の瘢痕に対するＣＤ９５Ｌの効果がないにも関わらず生じる。移動運動回復及び上昇した再生は、乏突起膠細胞の生存率と同様に、ニューロンマーカーβＩＩＩ−チューブリンの上昇によって反映される。従って、ＣＤ９５Ｌの中和はニューロンを保護し、及び脱髄も阻害する。更に、ＧＡＰ−４３発現は抗ＣＤ９５Ｌ処置動物及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物において上昇し、ＣＤ９５Ｌの中和が損傷した軸索の再生の可能性を直接的に上昇させてよいことを示す。またＧＡＰ−４３も上昇してよく、というのは乏突起膠細胞の生存率の維持は軸索の脱髄を妨げ、及び軸索に再生する可能性を与えるからである。

脊髄及び脳の外傷は、４０歳よりも若い人口における死と恒久的な障害とのケースの大部分を占める。社会のための結果は悲惨であり、静かな疫病（ｓｉｌｅｎｔ ｅｐｉｄｅｍｙ）と新造語が作られてきた。最近では、脊髄傷害を修復することを目的とする戦略は、神経保護、促進した再生、又は脱髄の治療のどれかに焦点をあてている。脊髄損傷の複雑性を考えると、ダメージの様々な原因を標的とする複数の介入を必要とされる。我々は、ＳＣＩ後、ＣＤ９５Ｌの中和が３つのレベルにおいて働くことを実証した：前記中和はニューロンを保護し、脱髄を阻害し、及び再生を促進し、及び従ってヒトの脊髄外傷のための新しい治療を提供する可能性がある。

実施例２：ＣＤ９５−Ｆｃ融合タンパク質での脊髄損傷の治療
我々は、ＣＤ９５−Ｆｃ融合タンパク質（例えばＷＯ９５／２７７３５に開示されている）は、半側切断によるＳＣＩ後に治療的な効果を発揮することが可能かを試験した。試験動物（ｎ＝６）をそれぞれ、腹腔内に３日ごとにＣＤ９５−Ｆｃ ２５ｍｇ／ｋｇでもって７回治療した。対照動物（ｎ＝６）は食塩水で処置した。確かに、ＣＤ９５−Ｆｃの繰り返した投与は脊髄半側切断後の４週間のマウスの後肢麻痺を有意に減弱した。結果を図６において示す。ＣＤ９５−Ｆｃ処置マウスが平均１１のＢＢＢスコアにまで後肢運動を回復した。このスコアは、総重量サポート及びほぼ後肢の足底の配置に相当する。食塩水処置マウスは対照的に１．５の平均スコアを有し、これは２つの関節での後肢のわずかな運動能力、しかし通常は後肢を移動運動のために使用することの不能性に相応する。

ＣＤ９５−Ｆｃでの治療は顎部脊髄半側切断後の後肢運動の機能回復を効果的に改善した。ここでマウスにおいて実証された後肢運動の進展は、ＳＣＩ後の麻痺に苦しむヒトに関して、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の劇的な改善及び減少した健康管理の必要性に相応する。

図１は、アポトーシス性細胞死はＳＣＩ後３日目にピークを迎え、抗ＣＤ９５Ｌ抗体での処置によって有意に減少することを示す 図２は、ＳＣＩ後の機能回復はＣＤ９５Ｌ、又はＣＤ９５Ｌ及びＴＮＦの遮断を有する動物において改善されることを示す。 図３は、ＳＣＩ後の抗ＣＤ９５Ｌ、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物における皮質脊髄路（ＣＳＴ）の再生を示す。 図４は、抗ＣＤ９５Ｌ、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置動物における減少した二次ダメージ及び高まった再生を示す。 図５は、抗ＣＤ９５Ｌ処置群、及び抗ＣＤ９５Ｌ／抗ＴＮＦ処置群対ＩｇＧ処置群におけるマウスの挙動試験データの統計学的解析を示す。 図６は、ＳＣＩ後の機能回復がＣＤ９５Ｌ−ＦＣ融合タンパク質の投与によって改善されることを示す。

Claims (14)

1. ＴＮＦ Ｌ／Ｒ阻害剤なしで投与される、脳損傷又は脊髄損傷の治療のための医薬品の製造のための、ＣＤ９５リガンド／レセプター系の阻害剤の使用であって、阻害剤は、
   （ａ）阻害性の抗ＣＤ９５リガンド抗体、又は前記抗体のフラグメント；
   （ｂ）可溶性のＣＤ９５レセプター分子、又は前記分子のＣＤ９５リガンド結合部
   から選択される使用。
2. 部分的な又は完全な脊髄傷害の治療のための請求項１記載の使用。
3. 対麻痺の治療のための請求項１又は２記載の使用。
4. 移動動作の再生、刺激に対する反応の改善、及び／又は運動協調の回復のための請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
5. 成体被験体における脳損傷又は脊髄損傷の治療のための請求項１から４までのいずれか１項記載の使用。
6. ヒトの治療のための請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
7. ＣＤ９５リガンド／レセプター系の阻害剤は、異種ポリペプチドドメインに場合によって融合したＣＤ９５レセプター分子の細胞外ドメインである、請求項１記載の使用。
8. ＣＤ９５リガンド／レセプター系の阻害剤は、Ｆｃ免疫グロブリン分子に融合したＣＤ９５レセプター分子の細胞外ドメインである、請求項７記載の使用。
9. 医薬品は、有効成分として少なくとも１つのＣＤ９５リガンド／レセプター系の阻害剤を、薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤、及び／又は佐剤と共に含む、請求項１から８までのいずれか１項記載の使用。
10. 医薬品は全身に投与される、請求項１から９までのいずれか１項記載の使用。
11. 医薬品は局所的に投与される、請求項１から１０までのいずれか１項記載の使用。
12. 医薬品は脊髄腔内に投与される、請求項１から１１までのいずれか１項記載の使用。
13. 急性の損傷の治療のための、請求項１から１２までのいずれか１項記載の使用。
14. 新しいダメージの導入後の非急性損傷の治療のための、請求項１から１２までのいずれか１項記載の使用。

Images