ES2301966T3 - Inhibicion del sistema ligando/receptor cd95 para el tratamiento de trastornos y lesiones neurologicos. - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de (a) un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo, (b) una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal, en donde dicho medicamento no comprende un inhibidor del ligando/receptor de TNF.

Description

Inhibición del sistema ligando/receptor CD95 para el tratamiento de trastornos y lesiones neurológicos.

La presente invención se refiere al uso de un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de un anticuerpo de ligando inhibidor anti-CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo y/o una molécula receptora CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos o lesiones neurológicos en un mamífero, particularmente para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal, más particularmente para el tratamiento de la paraplejia.

La muerte celular apoptótica contribuye al deterioro secundario y disfunción neurológica subsiguientes a lesión en la médula espinal (SCI) (1). Los inductores principales del programa apoptótico en otros modelos neurodegenerativos, tales como el derrame cerebral (2), son los sistemas ligando/receptor de TNF y CD95. El receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNF-R1, p55, CD120a) y CD95 (APO-1, Fas), al igual que otros receptores de muerte, se caracterizan por la presencia de un dominio de muerte que es crucial para la transducción de la señal apoptótica (3). La ligación de receptores por ligandos trimerizados conduce al reclutamiento de la proteína adaptadora FADD (dominio de muerte asociado a Fas, MORT1; (4) y caspasa-8 en un complejo de señalización inductor de muerte (DISC) (5)). La caspasa-8 en el DISC se activa por autoescisión (6), y somete la célula a la apoptosis por activación de caspasas efectoras situadas aguas abajo.

La activación y escisión tanto de caspasa-1 como de caspasa-3 fueron detectadas en neuronas subsiguientemente a SCI, y su inhibición reduce el tamaño post-traumático de la lesión (7). Después de la SCI, la expresión de TNF, CD95 y CD95L se incrementa en el sitio de lesión (8). Sin embargo, el papel del sistema TNF-L/R en la SCI in vivo es controvertido. Por una parte, la neutralización de TNF reducía significativamente el número de células apoptóticas subsiguiente a la SCI (9). Por otra parte, en ratones que carecen de TNF o TNF-R1 pudieron identificarse más células apoptóticas, las lesiones eran mayores, y exhibían peor recuperación funcional que los ratones de tipo salvaje (wt) (10). Se encontró expresión de CD95 en astrocitos, oligodendrocitos, y microglía subsiguientes a SCI cervical (11). Sin embargo, la implantación del sistema CD95-L/R en SCI sigue pendiente de esclarecimiento, aun cuando el documento WO 01/41803 sugiere el uso de combinaciones de inhibidores de TNF\alpha y CD95L para la prevención o el tratamiento de trastornos degenerativos, v.g. Alzheimer, Parkinson y lesiones de la médula espinal.

El documento WO 99/14330 describe el polipéptido DcR3, un homólogo de TNFR. El polipéptido DcR3 o una molécula quimérica que comprende el polipéptido DcR3 es capaz de inhibir la apoptosis inducida por CD95L en células de mamífero. Sin embargo, no hay dato alguno que demuestre que una inhibición del sistema CD95 es beneficiosa para el tratamiento de la SCI.

WO 01/41803 A1 está dirigido al uso de una combinación de inhibidores de TNF-\alpha e inhibidores de CD95L para la prevención o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

WO 00/58466 A3 se refiere a análogos de FLINT que son resistentes a la proteólisis in vivo e in vitro en la posición del aminoácido 218 del FLINT mayor y a usos clínicos y terapéuticos de los mismos.

Herr et al. (The EMBO Journal, vol. 16, No. 20, 15 de octubre de 1997, páginas 6200-6208) describen el uso de CD95L antisentido así como de FADD dominante negativo para inhibición de las ceramidas y la apoptosis celular inducida por estrés.

Pérez y White (The Journal of Cell Biology, vol. 141, no. 5, 1 de julio de 1998, páginas 1255-1266) se refieren al papel del homólogo de adenovirus Bcl-2 de E1B19K como inhibidor de la apoptosis inducida entre otras cosas por FADD y TNF-\alpha.

En Bradbury et al. (Nature, vol. 146, 11 de abril de 2002, páginas 636-640) se encontró que la enzima condroitinasa ABC actúa como inhibidor de la formación de escaras gliales y promueve la recuperación funcional después de lesión en la médula espinal.

En (42), la expresión de CD95 en un modelo SCI de rata se evalúa por inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD95. La inmunorreactividad con CD95 se detecta en la materia blanca y la materia gris (en astrocitos, oligodendrocitos y neuronas) hasta 2 semanas después de la lesión. De acuerdo con los autores, la detección de células CD95-positivas sugiere que el bloqueo del sistema CD95 podría ser un enfoque terapéutico verosímil para la SCI.

Sin embargo, los datos contenidos en (42) no llevan a la conclusión de que una inhibición del CD95 sea de hecho beneficiosa para el tratamiento de la SCI. La expresión celular del CD95 es necesaria pero no suficiente para la inducción de la apoptosis en el sistema CD95. Por ejemplo, los astrocitos, uno de los tipos de células que de acuerdo con (42) expresan CD95, no son sensibles a la apoptosis mediada por CD95 (43). Así pues, la mera detección de CD95 no permite llegar a la conclusión de que este sistema esté implicado en la inducción de la muerte de estas células. A tenor de estas líneas, la falta de expresión del receptor TNF (10 y 44), que está implicado también en la apoptosis, no da como resultado un mejor desenlace clínico subsiguiente a la SCI. Por consiguiente, cualquier conclusión extraída respecto a la eficacia de un tratamiento potencial contra SCI tiene que estar respaldada por datos funcionales. Como resumen: (42) presenta meramente datos descriptivos que no permiten llegar a la conclusión de que el sistema CD95 esté implicado en el deterioro inducido por SCI.

En la presente solicitud, se muestran por primera vez datos funcionales que permiten llegar a la conclusión de que la inhibición del sistema CD95 mejora significativamente el desenlace clínico después de lesión de la médula espinal. Por tanto, la presente solicitud es la primera descripción que hace posible el tratamiento de SCI por inhibidores del sistema CD95.

Para abordar si el sistema CD95 y el sistema TNF-ligando/receptor (L/R) están involucrados en el deterioro inducido por SCI, se utilizó un modelo de SCI en roedores. Después de transección dorsal de la médula espinal, la expresión de CD95, CD95L y TNF aumentaba en el sitio de la lesión. La monitorización terapéutica de CD95L solo o simultáneamente de CD95L y TNF reducía la muerte celular apoptótica después de SCI. Y como hecho más importante, los ratones tratados con anticuerpos anti-CD95L, anticuerpos anti-CD95L/anti-TNF o con proteínas de fusión CD95-Fc eran capaces de iniciar movimientos activos, lo que no sucedía en el caso de los ratones de grupos de control o tratados con anti-TNF solo. La mejora en la eficiencia locomotora en los animales carentes de actividad de CD95L se reflejaba por un aumento en las fibras regeneradoras en el sitio de la lesión y una regulación creciente paralela de la proteína 43 asociada al crecimiento. Además, la neutralización del sistema CD95L/R aumentaba la expresión de la proteína básica mielina, un marcador indirecto de la viabilidad de oligodendrocitos, y del marcador neuronal, \betaIII-tubulina. Los autores de la presente invención demuestran aquí por primera vez que la neutralización de CD95L promueve la regeneración axonal en la médula espinal lesionada de los adultos y la mejora funcional de los animales lesionados.

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de inhibidores del sistema CD95L/R para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lesión cerebral o de la médula espinal, v.g. lesiones cerebrales o lesiones parciales o completas de la médula espinal, particularmente paraplejia en un mamífero, v.g. en un paciente humano. Sorprendentemente, se encontró que pueden tratarse con éxito lesiones de la médula espinal, v.g. lesiones en individuos adultos. Adicionalmente, se ha encontrado que la invención es particularmente útil para el tratamiento de lesiones agudas. La lesión, particularmente la lesión de la médula espinal, puede estar causada por un corte o una compresión, por una condición isquémica o por otros medios. La administración de inhibidores de CD95L/R conduce a una recuperación funcional que comprende un crecimiento mejorado de los axones, particularmente un crecimiento de neuronas, microglía y/u oligodendrocitos. Indicaciones especialmente preferidas son la regeneración de la eficiencia locomotora, la mejora de la estimulación y/o la recuperación de la coordinación de movimientos después de lesión de la médula espinal.

El inhibidor es un inhibidor del ligando CD95 (ligando Fas; ligando APO1) seleccionado de

(a)

un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo;

(b)

una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma.

Se prefieren anticuerpos inhibidores anti-CD95L y fragmentos de fijación de antígeno de los mismos y moléculas CD95R solubles o porciones de fijación de CD95L de las mismas. Ejemplos de anticuerpos inhibidores anti-CD95L adecuados se describen en los documentos EP-A-0 842 948, WO 96/21350, (38), WO 95/13293 o (39) así como anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de los mismos, véase, v.g. WO 98/10070. Son adicionalmente preferidas moléculas receptoras de CD95 solubles, v.g. una molécula receptora CD95 soluble sin dominio transmembranal como se describe en los documentos EP-A-0 595 659 y EP-A-0 965 637 o péptidos CD95R como se describen en WO 99/65935.

Es especialmente preferido un inhibidor de CD95L que comprende un dominio extracelular de la molécula CD95R (particularmente los aminoácidos 1 a 172 (MLG ... SRS) o la secuencia CD95 madura de acuerdo con la patente U.S. 5.891.434) fusionada opcionalmente a un dominio de polipéptido heterólogo, particularmente una molécula de inmunoglobulina Fc que incluye la región bisagra v.g. de la molécula IgG1 humana. Una proteína de fusión particularmente preferida que comprende un dominio CD95 extracelular y un dominio Fc humano se describe en WO 95/27735.

El inhibidor del ligando Fas FLINT o DcR3 o un fragmento, v.g. fragmento soluble del mismo, por ejemplo el dominio extracelular fusionado opcionalmente a un polipéptido heterólogo, particularmente una molécula de inmunoglobulina Fc se describe en WO 99/14330, WO 99/50413 o (41). FLINT y DcR3 son proteínas que son capaces de fijar el ligando CD95 y LIGHT, otro miembro de la familia TNF.

Adicionalmente, se contempla como inhibidor una molécula efectora de ácido nucleico. La molécula efectora de ácido nucleico puede seleccionarse de moléculas antisentido, moléculas RNAi y ribozimas que son capaces de inhibir la expresión del gen CD95R y/o CD95L.

Adicionalmente, se contempla un inhibidor que puede estar dirigido contra la transducción de señales CD95R intracelulares. Ejemplos de tales inhibidores se describen en WO 95/27735, v.g. un inhibidor de la enzima convertidora de interleuquina 1\beta (ICE), particularmente 3,4-dicloroisocumarina, YVAD-CHO, un tetrapéptido específico de ICE, CrmA o usurpina (WO 00/03023). Adicionalmente, pueden utilizarse moléculas efectoras de ácido nucleico dirigidas contra ICE.

El inhibidor o una combinación de los inhibidores anteriores se administra a un individuo que se encuentra en necesidad de ello, particularmente un paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de la afección específica por medios adecuados. Por ejemplo, el inhibidor puede formularse como una composición farmacéutica junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse de acuerdo con protocolos estándar. La composición farmacéutica puede administrarse sistémicamente, v.g. por vías intraperitoneal, intravenosa, o local, v.g. por vía intratecal o por punción lumbar. Se prefiere una administración intratecal.

La composición farmacéutica se administra preferiblemente en el caso de lesiones agudas. Alternativamente, la invención abarca un tratamiento de lesiones no agudas, en el cual se introduce una nueva lesión, v.g. por una incisión o un corte y el deterioro recién introducido se somete a un tratamiento con inhibidor CD95 RL. Más preferiblemente, el tratamiento se inicia lo más pronto posible, v.g. inmediatamente después de la producción de la lesión de la médula espinal, y se continúa durante un tiempo suficiente, v.g. hasta 30 días. La composición puede administrarse una sola vez o varias veces, v.g. una sola vez al día, varias veces al día, en días alternos, etc.

En algunas realizaciones de la presente invención, el medicamento puede comprender un ingrediente activo adicional. El ingrediente activo adicional puede seleccionarse de inhibidores de la apoptosis, particularmente inhibidores de la apoptosis intracelular, v.g. inhibidores de las caspasas tales como inhibidores de la caspasa 3 o la caspasa 8, inhibidores Bid, inhibidores Bax o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de inhibidores adecuados son los inhibidores de las caspasas en general, véanse los documentos WO 02/094263, WO 01/10383, WO 01/42216, WO 01/90070, WO 01/94351, WO 01/21600, WO 00/61542, WO 99/47545, inhibidores dipeptídicos (WO 99/47154), inhibidores de carbamatos (WO 01/72707), acetales de ácido aspártico sustituidos (WO 01/81330), heterociclildicarbamidas (WO 02/085899), derivados de quinolina-(di-, tri-, tetrapéptido) (US 200126467), inhibidores de la 2-aminobenzamida-caspasa sustituidos (WO 00/55114), inhibidores de la \alpha-hidroxiácido-caspasa sustituidos (WO 01/16093); inhibición por nitrosilación (WO 98/43621); CASP-1: (WO 02/000853; CASP-3: inhibidores de proteínas (WO 02/066050), moléculas antisentido (WO 01/53310), nicotinil-aspartil-cetonas (WO 01/27085), derivados de dipéptidos de \gamma-cetoácidos (WO 02/48179, WO 00/32620, WO 00/55127), CASP-8: moléculas antisentido (WO 01/53541), proteínas interactivas (WO 00/39160) CASP-9: moduladores antisentido (WO 02/22641); CASP2: moléculas antisentido (WO 02/24720); CASP-6: moléculas antisentido (WO 02/29066); CASP-7: moléculas antisentido (WO 02/22640); inhibidores de CASP-12: WO 00/59924. Ejemplos adicionales son inhibidores mitocondriales tales como el factor modulador BcI-2 (WO 02/097094); péptidos mutantes de BcI-2 (WO 94/27426) derivados de Bad (WO 02/20568), Bad (WO 96/13614), agonista de muerte del dominio interactivo BH3 (WO 98/09980), proteínas inhibidoras Bax (WO 98/40397), genes y productos génicos BLK (WO 99/50414). Otros moduladores intracelulares adecuados de apoptosis son moduladores de asociación CASP9/Apaf-1 (WO 02/064128), moduladores antisentido de la expresión de Apaf-1 (WO 02/32921), péptidos para inhibición de la apoptosis (WO 99/43701), composiciones anti-apoptóticas que comprenden la subunidad R1 del virus del Herpes Símplex (WO 00/07618), MEKK1 y fragmentos de la misma (WO 99/41385), moduladores de Survivin (WO 01/64741), moduladores de inhibidores de apoptosis (WO 97/06182, WO 00/77201, WO 01/59108, WO 02/053586) y HIAP2 (WO 00/08144). Adicionalmente, puede utilizarse cualquier combinación de los inhibidores anteriores.

El ingrediente adicional puede seleccionarse también de inhibidores de sistemas receptores de ligandos de muerte (distintos de CD95 L/R) tales como el sistema TRAIL-L/TRAIL-R (véase el documento WO 98/35986), el sistema TRAMP-R/TRAMP-R o el sistema DR6-L/R6-R (véanse los documentos US-A-6.423.494 o WO 01/85209). Los inhibidores adecuados son anticuerpos de ligandos o receptores inhibidores anti-muerte o fragmentos de fijación de antígeno de los mismos o moléculas solubles receptoras de muerte o porciones de fijación de ligandos de muerte de las mismas, v.g. fusiones con dominios Fc de inmunoglobulina.

Una administración combinada de inhibidores CD95L/R e inhibidores TNF L/R se describe por ejemplo en el documento WO 01/41803.

Preferiblemente, el inhibidor CD95L/R se administra sin inhibidor TNF L/R. De este modo, puede reducirse o eliminarse la aparición de efectos secundarios potencialmente perjudiciales, dado que una inhibición de TNF causaba de hecho complicaciones graves en varios modelos de ratón, v.g. ligación fecal y punción (40).

Ejemplos adicionales de otros ingredientes activos son compuestos que inhiben la formación de escaras gliales, tales como la condroitinasa ABC.

La dosis del inhibidor administrada dependerá por supuesto del individuo a tratar, del peso del individuo, el tipo y la gravedad de la lesión, el modo de administración y el criterio del médico que prescribe el tratamiento. Para la administración de anticuerpos anti-CD95R o L o proteínas CD95R solubles, v.g. proteínas de fusión CD95-Fc, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100 mg/kg.

La presente invención se ilustra adicionalmente por las Figuras y Ejemplos siguientes.

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Fig. 1

La muerte celular apoptótica alcanza un pico a los tres días después de la SCI y disminuye significativamente por tratamiento con anticuerpo anti-CD95L

(A) Se evaluó la muerte celular apoptótica por tinción TUNEL en animales operados falsamente y al cabo de 1, 3 y 14 días después de SCI torácica en animales C57BL/6 de tipo salvaje (wt)(n = 4 por grupo). (B) Recuentos de células CD95L-positivas; (C) recuentos de células CD95-positivas; (D) número de células TNF-positivas. Las células se sometieron a recuento en tres secciones de médula espinal de 20 \mum de espesor separadas a una distancia de 200 \mum unas de otras en animales operados falsamente y 1, 3 y 14 días después de la SCI (n = 4 ratones por grupo). (E) Los animales de tipo salvaje (wt)sometidos a SCI se trataron por vía intraperitoneal con anti-CD95L, anti-TNF, o anti-CD95L/anti-TNF o con solución salina o IgG como control (n = 4 por grupo). Después de un tiempo de supervivencia de 3 días, las células apoptóticas se tiñeron por TUNEL y se sometieron a recuento en tres secciones de 20 \mum separadas 200 \mum unas de otras. Los datos se presentan como valor medio \pm el error estándar del valor medio. La significación se determinó por comparación del número de células apoptóticas en los animales tratados con anticuerpos con los grupos de control, utilizando el Ensayo de Sumas de Rangos Wilcoxon (**p \leq 0,01).

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Fig. 2

La recuperación funcional después de la SCI aumenta en los animales que tienen un bloqueo de CD95L o CD95L y TNF

Los animales se trataron con anticuerpos anti-CD95L (círculos negros) o anti-CD95L/anti-TNF (rombos blancos), o con solución salina (triángulos negros) o IgG (cuadrados blancos) como control (n = 11 por grupo). En una segunda serie de experimentos, se trataron los animales con anticuerpo anti-TNF (hexágonos blancos) o solución salina (triángulos negros) como control. Todos los ensayos conductuales se realizaron en la modalidad doble ciego. Los animales se ensayaron al cabo de 1, 2, 3 y 4 semanas después de la lesión en las tareas siguientes: (A) BBB (para esto, los animales se ensayaron adicionalmente el día 1 después de la SCI); (B) andadura sobre rejilla; (C) eficiencia de natación; (D) tiempo de mantenimiento sobre la barra rotativa; (E) reacción a la estimulación mecánica por "pelos de von Frey". Para todas las tareas ensayadas, no se producía diferencia significativa alguna entre los dos grupos de control, ni entre los dos grupos tratados en cualquiera de los momentos estudiados. Los datos se presentan como valor medio \pm el error estándar del valor medio. Únicamente se muestran en los gráficos valores p de comparación de los grupos tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF con el grupo de solución salina; los valores p de comparación de los grupos tratados con el grupo de IgG se dan en la Fig. S1; (* p \leq 0,05; ** p \leq 0,01, Ensayo de Suma de Rangos de
Wilcoxon).

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Fig. 3

Regeneración del tracto corticoespinal (CST) en animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF después de la SCI

Se inyectó biotina-dextrano-amina (BDA) en la corteza sensorial-motora (coordenadas: Bregma-1.5; 1; 1) de los animales tratados con anti-CD95L, anti-CD95L/anti-TNF, solución salina, e IgG, dos semanas después de la SCI (n = 4-5 por grupo). (A) A las cuatro semanas después de la lesión, se determinó la distancia desde el epicentro de la lesión a las fibras en regeneración que se extendían más en dirección caudal en tres secciones consecutivas de la médula espinal. Las fibras marcadas anterógradamente se retraen del sitio de la lesión en los animales tratados con solución salina e IgG en 250 \pm 11,5 \mum. La distancia media al epicentro de la lesión en los animales tratados con anticuerpos es notablemente menor (95 \pm 62 \mum). (B) Ejemplos de fibras corticoespinales marcadas con BDA en representantes de cada grupo. El epicentro de la lesión se indica por una línea vertical. La CST se retrae del sitio de la lesión en los animales de control tratados con solución salina e IgG (paneles superiores), mientras que numerosas fibras ectópicas que brotan del CST transseccionado crecen en la materia blanca dorsal y la escara de lesión en los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF (paneles inferiores). (C) Una mayor ampliación de las regiones de marco muestra producción regenerativa de brotes y botones sinápticos rostrales respecto al sitio de la lesión en los animales tratados con anti-CD95L/anti-TNF (recuadro derecho), o la ausencia de brotes regenerativos en la región correspondiente en los animales tratados con solución salina (recuadro izquierdo). Barra de escala, 20 \mum; regiones de marco,
10 \mum.

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Fig. 4

Deterioro secundario reducido y regeneración mejorada en los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF

Se sometieron los animales a SCI y se trataron con anti-CD95L solo o junto con anticuerpo anti-TNF, o con solución salina o IgG como control. Después de un tiempo de supervivencia de 4 semanas, se detectaron las proteínas indicadas por análisis de transferencia Western (n = 3 por grupo). Se utilizó actina como control para carga igual de proteínas (20 \mug) en cada pista. (A) Análisis de los niveles de expresión de marcadores neuronales en los animales tratados con anticuerpo y control, representados como las bandas específicas de 50 kDa para las proteínas \betaIII-tubulina, Tau-5 y Tau-1; (B) banda de 22 kDa para MBP; (C) banda de 50 kDa para GFAP; (D) banda de 43 kDa para GAP-43. S.O. = operado falsamente; E15 = día 15 del embrión.

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Fig. 5

Análisis estadístico de los datos de ensayo conductual para ratones en los grupos tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF frente al grupo tratado con IgG

Se muestran los valores p de comparación de los grupos tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF con el grupo IgG para cada ensayo (Ensayo de Suma de Rangos Wilcoxon); * p \leq 0,05; ** p \leq 0,01 para todos los ensayos, NS - no significativo.

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Fig. 6

La recuperación funcional después de SCI se mejora por administración de la proteína de fusión CD95-FC

Los animales se trataron con CD95Fc (triángulos negros) o con solución salina (cuadrados negros) como control. Los animales se ensayaron al cabo de una, dos, tres y cuatro semanas después de la lesión en la tarea BBB.

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Tabla 1

Registro de natación

Se evaluó el comportamiento de natación de los animales registrando las características siguientes: movimientos de los miembros posteriores, coordinación miembro posterior-miembro anterior, posición de la cola, posición de las zarpas, equilibrio sagital y coronal.

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Ejemplo 1 Tratamiento de SCI con un anticuerpo anti-CD95L 1. Materiales y Métodos 1.1 Modelo de lesión en la médula espinal

Se realizó una lesión en la médula espinal en ratones hembra de tipo salvaje (wt) sobre un entorno de C57BL/6, emparejados todos ellos en edad (valor medio 75 días) y peso (valor medio 24 g). Se realizó una anestesia profunda por inyección i.p. de Ketamina y Rompun (150 mg/kg de peso corporal cada uno). Se efectuó laminectomía al nivel vertebral Th8/9 con objeto de dejar al descubierto la médula espinal. Se lesionó la médula espinal dorsal simétricamente con tijeras finas de iridectomía (FST, Heidelberg), dando como resultado un corte de dos tercios que dejaba únicamente intactas las fibras en el funículo ventral. Después de la suturación de los músculos y la piel por separado, se dejó que los ratones se recuperaran en el bloque de calentamiento (37ºC) antes de devolverlos a las jaulas.

Los animales se trataron post-operativamente con antibióticos (Gentamicina, 5 ml/kg a 0,2 mg/ml) una sola vez al día durante 7 días. Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y recibieron agua y comida a discreción. Sus vejigas se exprimieron manualmente una vez al día hasta restablecimiento de la función autónoma de la vejiga.

Los animales se sometieron a SCI, y después de tiempos de supervivencia diferentes (1, 3, y 14 días) se anestesiaron profundamente y se sacrificaron por perfusión intracardial.

Para el tratamiento con anticuerpos, se utilizaron o bien el anticuerpo anti-CD95L (MFL3; Pharmingen, Alemania) solo, o junto con anticuerpo anti-TNF V1q (32) 50 \mug de cada uno. Los anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal 30 minutos después de la lesión y cada día durante hasta 3 días (tiempo de supervivencia 3 días, n = 4 por grupo) o 2 h antes de la lesión dos veces por semana hasta 4 semanas (tiempo de supervivencia 4 semanas, n = 11 por grupo), en la modalidad doble ciego. Adicionalmente, se inyectaron ratones con solución salina e IgG de rata (Sigma) con control. En una segunda serie de experimentos, los ratones se trataron por vía intraperitoneal con anticuerpo anti-TNF solo o solución salina como control. Después de tiempos de supervivencia de 3 días o 4 semanas, los ratones se anestesiaron profundamente y se sacrificaron por perfusión intracardial o decapitación.

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1.2 Marcación del extremo de la mella con UTP biotinilado mediada por desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL)

Se procesaron secciones criostáticas longitudinales de la médula espinal (20 \mum) de acuerdo con la técnica de marcación del extremo de la mella con UTP biotinilado mediado por desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT) (TUNEL) (33). Los núcleos se despojaron de proteínas por incubación en PBS con 1% Triton X-100 a 4ºC durante una noche. Se desactivó la peroxidasa endógena por recubrimiento de las secciones con H_{2}O_{2} al 2% durante 5 min a la temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con dUTP biotinilado 0,35 mM, 10 unidades de tampón TdT, CoCl_{2} 2 mM, dATP 1 mM (Roche, Suiza), en una cámara de humedad a 37ºC durante 60 min. La reacción se terminó por transferencia de los portaobjetos a tampón Tris-EDTA a la temperatura ambiente durante 15 min. Las secciones se procesaron ulteriormente utilizando el complejo avidina-biotina (ABC) (Vector Laboratories) e incubación subsiguiente con diamino-bencidina (DAB, Sigma). Los núcleos normales, que contenían solamente una cantidad insignificante de extremos 3'-OH de DNA, no se teñían con esta técnica. Las células con morfología necrótica y concentraciones detectables de extremos DNA exhibían una marcación más difusa comparadas con los núcleos apoptóticos. Como control, se incubaron secciones en ausencia de la enzima o del nucleótido. Las células apoptóticas se sometieron a recuento en tres secciones consecutivas separadas 200 \mum unas de otras en 4 ratones/grupo por una persona ciega respecto al tratamiento. Todos los datos se proporcionan como valor medio \pm el error estándar del valor medio. La significación se midió utilizando el ensayo Wilcoxon.

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1.3 Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Se procesaron secciones criostáticas longitudinales de la médula espinal (20 \mum) de ratones sin tratar para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Después de un tiempo de supervivencia de 1, 3 ó 14 días, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra CD95L, CD95 (M20, Santa Cruz) y TNF-\alpha (Sigma). La inmunorreactividad de las proteínas CD95L, CD95 y TNF-\alpha se visualizó por diaminobenzidina (Alexis, Alemania). Únicamente era detectable CD95 en las médulas espinales de los animales operados falsamente, si bien todas ellas eran detectables en el timo de los ratones y en secciones de tumores transfectados con CD95L murina. Ninguna de estas tres proteínas podía detectarse en las tinciones de control realizadas sin el primer anticuerpo o la IgG isotipo de control. Se realizó una inmunofluorescencia doble con anticuerpos primarios previos, y el marcador neuronal (NeuN, Chemicon), linfocítico (CD3, Chemicon), de astrocitos (GFAP, Chemicon), de oligodendrocitos (marcador oligodendrocítico, Chemicon), y microglial (CD11b, Serotec). Las inmunorreactividades se visualizaron con un anticuerpo secundario mono- o policlonal marcado con Cy3 y FITC (Dianova, Hamburgo, Alemania). Para ensayar la distribución del anticuerpo MFL3 en la médula espinal, se utilizó anticuerpo MFL3 biotinilado (Pharmingen, Alemania). El anticuerpo se inyectó por vía intraperitoneal 2 horas antes de la SCI, y después de tiempos de supervivencia de 3, 6 ó 24 h, se procesaron las secciones longitudinales de la médula espinal en cuanto a tinción con estreptavidina-rodamina (Dianova, Alemania).

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1.4 Seguimiento anterógrado del tracto corticoespinal (CST)

Dos semanas después de la lesión de la médula espinal, algunos de los animales (n = 5 por grupo) se anestesiaron profundamente y se colocaron en el bastidor estereotáctico. Se practicó una incisión en el cuero cabelludo y se taladraron orificios en la corteza sensorimotora. Se realizaron inyecciones a presión de 1 \mul de una solución al 10% de dextrano biotinilado-amina (BDA, Molecular Probes, Eugene, OR) en solución salina, bilateralmente en la corteza sensorimotora (coordenadas: Bregma-1,5; 1; 1). Dos semanas después de la inyección, se procesaron secciones flotantes libres de la médula espinal (50 \mum) respecto a tinción con BDA, como se ha descrito previamente (34). El único punto de referencia claro en el sitio de lesión era el epicentro de la lesión. Por esta razón, se cuantificó la distancia desde el brote más próximo a la cola respecto al epicentro de la lesión (Scion Image, Scion. comp). La distancia más allá del epicentro de la lesión se registró como distancia positiva, y en caso contrario como distancia negativa.

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1.5 Transferencia Western

El tejido de la médula espinal del sitio de la lesión (1 mm tanto rostral como caudal respecto a la lesión) de 3 animales por grupo se lisó en tampón RIPA (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, desoxicolato de sodio 0,5%; NP-40 1%, Tris-HCl 50 mM de pH 7,4, complementado con los inhibidores de proteasas PMSF 1 mM, aprotinina, leupeptina y pepstatina 1 \mug/ml de cada una), y se trataron por ultrasonidos. Se utilizaron los anticuerpos monoclonales siguientes: anti-tubulina de ratón (1:2000, Chemicon), tau Ab-2 de ratón (clon TAU-5, 1:2500, Neomarkers), anti-tau-1 de ratón (1:2500, Chemicon), proteína básica anti-mielina de rata (MBP, 1:8000, Chemicon), proteína ácida fibrilar anti-glial de ratón (GFAP, 1:2500, Chemicon), y proteína-43 asociada a anti-crecimiento de ratón (GAP-43, 1:2500, Sigma). Los anticuerpos fijados se detectaron con conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-ratón o anti-rata (1:5000, Amersham) y quimioluminiscencia incrementada (Nalgene). El tejido de los animales individuales se analizó por separado. Para el tratamiento con fosfatasa alcalina, se incubaron los lisados de proteínas con Tris 50 mM de pH 8,5, EDTA 0,1 mM y el inhibidor de proteasas 3 h a 37ºC, añadiéndose después 0,25 U de fosfatasa alcalina/\mug de proteína.

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1.6 Cultivo de células

Los hipocampos de ratones E15 se diseccionaron, tripsinizaron y disociaron físicamente. Las células se lavaron luego en HBSS, y se extendieron 300.000 células sobre cubreobjetos de vidrio con poli-L-lisina (PLL) en cápsulas de Petri de 6 cm que contenían medio esencial mínimo (MEM) y 10% de suero de caballo desactivado. Las células se mantuvieron en 5% de CO_{2} a 36,5ºC durante 4 h. Los cubreobjetos se transfirieron luego al MEM que contenía suplemento B-27 y N2. Después de 8 días in vitro (DIV), se sometieron las neuronas cultivadas del hipocampo a axotomía (Laser Palm), y se trataron inmediatamente con 10 \mug/ml de anti-CD95L, o 10 \mug/ml de IgG durante 24 h, o se dejaron sin tratar.

Las células se fijaron luego en PFA al 4% en PBS, se lavaron, y se tiñeron con anticuerpo GAP-43 (GAP-43, 1:250, Sigma). La inmunorreactividad se visualizó con un anticuerpo secundario monoclonal marcado con rodamina (Dianova, Hamburgo, Alemania). Con objeto de visualizar los núcleos apoptóticos, se añadió DAPI (1:1000, Sigma) al anticuerpo secundario.

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1.7 Ensayo conductual

Todos los ensayos conductuales se realizaron en la modalidad doble ciego. Los animales se ensayaron al cabo de 1, 2, 3 y 4 semanas después de la lesión. Para el registro de BBB, los animales se ensayaron adicionalmente el día uno después de la SCI. Los animales se monitorizaron con videocámara mientras se ensayaban, y su eficiencia se evaluó a partir de vídeos digitalizados a una velocidad de un cuarto.

Registro locomotor BBB

Se evaluó la eficiencia locomotora global de los animales utilizando la escala de evaluación locomotora BBB con ligeras modificaciones (35). Los ratones se pusieron sobre una pista de plexiglás de 1 m de longitud y 6 cm de anchura. Se dispuso la pista encima de un espejo inclinado (ángulo de 60º), a fin de facilitar la observación de los movimientos de los miembros posteriores. Cada animal tenía que cruzar la pista 3 veces. En cada sesión de ensayo, se asignaron puntos a los animales independientemente por dos observadores ciegos respecto al tratamiento. La locomoción del miembro posterior se registró desde 0 (para ausencia total de movimiento observable del miembro posterior) hasta 21 puntos. La escala se modificó si la secuencia de recuperación de las características motoras no era la misma que se describe en el registro original. Dado que los ratones levantan sus colas al principio de su recuperación (ya para el registro de 10 puntos), se asignaron 0,5 puntos adicionales para la posición de la cola.

Ensayo de andadura sobre rejilla

Se examinaron los déficits en el control motor descendente por evaluación de la capacidad para navegar a través de una pista de 1 m de longitud con lagunas asignadas irregularmente (0,5-2 cm) entre barras metálicas redondas (36). Se eligió para el análisis un sector definido de 10 barras. A fin de impedir la habituación a una distancia de barras fija, las barras de este sector se cambiaron para cada sesión de ensayo. Cada animal tenía que cruzar este sector tres veces. El análisis se realizó por recuento del número de errores en la colocación de los pies; si el animal no tenía soporte del peso en los miembros posteriores, el mismo cometería dos errores por barra, dando como resultado un total de 20 errores.

Registro de natación

Con objeto de obtener información acerca de la eficiencia locomotora en ausencia del aportación cutánea y propioceptiva de los miembros a la médula espinal, se utilizó un ensayo de natación. Se dejaron nadar los ratones en un tanque de 1 m de longitud y 6 cm de anchura en cuyo extremo los mismos podían salir del agua trepando a una isla (con pendiente de 45º o 60º). El tiempo utilizado para la natación y el trepado no reflejaba el grado de eficiencia de los animales, dado que el mismo se veía muy influenciado por la motivación de los animales para cruzar el tanque, que no podía normalizarse por entrenamiento u ofrecimiento de una recompensa al final de cada realización. Por esta razón, se evaluó la eficiencia de natación por registro de las características siguientes: movimientos de las extremidades posteriores, coordinación miembro posterior-miembro anterior, posición de la cola, posición de la zarpa, y equilibrio sagital y coronal. Cada animal tenía de cruzar el tanque dos veces y se le asignaron puntos en cada sesión de
prueba.

Ensayo Rotarod

Para ensayar un aprendizaje de coordinación y destreza motora, se realizó el ensayo Rotarod. Los animales se pusieron sobre un cilindro de plástico (5 cm de diámetro, 10 cm de longitud y 40 cm por encima del suelo), que se aceleraba durante 20 s (desde 4 a 7 rpm). Se registró el tiempo de mantenimiento durante hasta 180 s, en tres pruebas para cada animal.

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Ensayo de alodinia mecánica

Para evaluar el comportamiento nociceptivo de los animales, se realizó un ensayo de "pelos de von Frey" para alodinia mecánica. Los animales se introdujeron en un cilindro metálico con orificios redondos a fin de introducir "pelos de von Frey". Se ensayaron los ratones en cuanto a respuestas a la estimulación mecánica con "pelos de von Frey" (Stoelting, tamaños 2,36 (0,023 g), 2,44 (0,028 g) y 2,83 (0,068 g)) en dermátomos adyacentes a la lesión. Las respuestas alodínicas se registraron de 0 a 3 en modalidad doble ciega y se determinaron los valores medios para cada momento del ensayo. El registro se realizó como sigue: 0 - ausencia de respuesta; 1 - flexión transitoria; 2 - sacudida; 3 - escape.

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1.8 Análisis estadístico

Se ensayaron las diferencias en los números de células por el Ensayo de Suma de Rangos Wilcoxon. Los valores resultantes de las diferentes tareas de los dos grupos de tratamientos y los dos de control se compararon estadísticamente unos contra otros en cada momento utilizando el ensayo de Suma de Rangos Wilcoxon (Mann-Whitney U). La evolución de estos valores resultantes se describió por separado en cada grupo para las tareas BBB, de barra giratoria y andadura sobre rejilla, por la pendiente de la regresión lineal del valor resultante frente al tiempo. Se utilizó un ensayo F para comparar las pendientes de los diferentes grupos. Los animales que no exhibían mejora alguna tuvieron que excluirse en esta regresión paramétrica. Para incluir todos los animales, se utilizó el procedimiento no paramétrico de Koziol (37) a fin de comparar las series completas de curvas de evolución entre los grupos. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para describir la dependencia entre el valor resultante de las diferentes tareas (registro BBB, registro de natación y ensayo de andadura sobre rejilla) y la distancia al epicentro de la lesión, junto con un ensayo estadístico respecto a la presencia de una correlación distinta de cero. Se evaluó la significación estadística al nivel de 0,05 y se registró por el valor p de los procedimientos estadísticos de ensayo. Todos los análisis se realizaron con el paquete de programas ADAM de la Unidad de Bioestadística del Centro de Investigación del Cáncer de
Alemania.

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2. Resultados

Se transeccionaron los dos tercios dorsales de la médula espinal en ratones wt y se examinaron el alcance y la cinética temporal de muerte celular apoptótica. Se detectaron células muertas, como se evaluó por tinción TUNEL, en el sitio de lesión ya el día 1 después de la SCI, alcanzando niveles máximos al cabo de tres días para ser apenas detectables a las dos semanas (Fig. 1A). Es importante que la cinética de expresión de CD95L era paralela a la muerte celular apoptótica (Fig. 1B). CD95 era ya detectable en la médula espinal no lesionada, pero se encontraron células CD95-positivas adicionales después de la SCI (Fig. 1C). La expresión de TNF aumentaba el día 1, alcanzaba un máximo el día 3 y se mantenía inalterada al cabo de dos semanas (Fig. 1D). Para analizar minuciosamente la contribución de los sistemas de CD95 y TNF-L/R a la muerte inducida por SCI, los autores neutralizaron la actividad de CD95L y/o TNF. La penetración tisular de los anticuerpos neutralizantes se confirmó por la detección de un anticuerpo biotinilado en la médula espinal lesionada ya al cabo de 3 h, y a las 6 h y 24 h después de inyección i.p. (datos no presentados). Después de ello, se inyectaron por vía i.p. los anticuerpos anti-CD95L y/o anti-TNF (50 \mug de cada uno) en modalidad doble ciega. Adicionalmente, se inyectaron los ratones con solución salina e IgG de rata (50 \mug) como control. Después de un tiempo de supervivencia de 3 días, se detectaron numerosas células TUNEL-positivas en el sitio de lesión de los animales tratados con solución salina e IgG (Fig. 1E). La neutralización aguda de TNF no reducía significativamente la muerte celular (Fig. 1E). Es importante que la neutralización de CD95L solo o junto con TNF, reducía significativamente el número de células TUNEL-positivas (Fig. 1E).

Para investigar las consecuencias a largo plazo de la neutralización de CD95L y TNF, se ensayaron la eficiencia locomotora y la reacción frente a la estimulación mecánica de los ratones lesionados. Para esto, se trataron los animales con anticuerpos neutralizantes contra CD95L solo o junto con TNF, o con solución salina o IgG de rata dos veces por semana hasta 4 semanas (n = 11 por grupo). Todos los ensayos conductuales se realizaron en modalidad doble ciega. Los animales se evaluaron antes, y un día después (solamente para el ensayo locomotor BBB), 1, 2, 3 y 4 semanas después de la lesión. Para todas las tareas ensayadas no se encontró diferencia significativa alguna entre los dos grupos de control, o entre los dos grupos tratados, para ninguno de los momentos puntuales estudiados (Suma de Rangos Wilcoxon).

Primeramente, se cuantificaron aspectos múltiples de locomoción espontánea sobre el suelo por el registro locomotor BBB (12). Un día después de la lesión, todos los animales estaban completamente parapléjicos y tenían registro BBB 0 (excepto dos animales que alcanzaban registro 3; Fig. 2A). Los animales en los grupos de control exhibían una recuperación nula o sólo insignificante de movimientos activos a lo largo del periodo de tiempo estudiado (ensayo Koziol). Es muy notable que la evolución clínica y la eficiencia locomotora en cada momento puntual ensayado en los ratones en los que se bloquearon CD95L, o a la vez CD95L y TNF, eran significativamente mejores que en los animales de control (Fig. 2A). De acuerdo con ello, la recuperación locomotora absoluta de los dos grupos de tratamiento, tal como se evaluaba por la pendiente del análisis de regresión lineal, era significativamente mejor que en los grupos de control (Fig. 2A).

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Una de las limitaciones del registro BBB es que el mismo está enfocado principalmente en los movimientos estereotipados controlados por caminos reflejos en la médula espinal (es decir, el generador de patrón central) (13). Por esta razón, se realizaron ensayos adicionales que reflejan la integridad de los tractos motores espinales dorsales (tracto cortico- o rubroespinal). Uno de los ensayos que está enfocado en aspectos voluntarios de los movimientos de los miembros, es el ensayo de andadura sobre rejilla. Los déficits en el control motor descendente se examinaron por evaluación de la capacidad para controlar con precisión y poner las patas posteriores sobre una rejilla horizontal, semejante a una escalera. De nuevo, los únicos animales que exhibían una recuperación significativa de los movimientos voluntarios eran los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF (Fig. 2B).

Con objeto de obtener información acerca de la eficiencia locomotora en ausencia del aportación cutánea y propioceptiva de los miembros a la médula espinal, se utilizó un ensayo de natación. Se evaluó la eficiencia natatoria por registro desde 0 a 10 de las características siguientes: movimientos de los miembros posteriores, coordinación miembro posterior-miembro anterior, posición de la cola, posición de la zarpa, equilibrio sagital y coronal (Tabla 1). Una vez más, los ratones tratados con anticuerpos anti-CD95L o anti-CD95L/anti-TNF, exhibían un aumento significativo en el registro natatorio para cada momento puntual ensayado en comparación con los animales tratados con solución salina e IgG (Fig. 2C).

Para ensayar el aprendizaje de coordinación y destreza motora, se realizó el ensayo Rotarod (14). Se registró el tiempo de mantenimiento sobre un cilindro rotativo de plástico que se aceleraba desde 4 a 7 rpm. El tiempo sobre la barra rotativa de los animales tratados con anti-CD95L era significativamente más largo al cabo de 2 y 3 semanas después de SCI, y en los animales tratados con anti-CD95L/anti-TNF al cabo de 1, 3 y 4 semanas después de SCI, cuando se comparaban con ratones de control (Fig. 2D).

Los movimientos voluntarios mejorados de los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF indican una capacidad regenerativa incrementada de los axones lesionados. Sin embargo, esto puede ser un arma de dos filos, dado que un crecimiento aberrante puede dar lugar a hiperalgesia (15). La neutralización de TNF atenúa la hiperalgesia en los ratones con lesión de constricción crónica (16). Para ensayar la influencia de la neutralización de CD95L solo o junto con TNF en la reacción de los animales lesionados frente a otros estímulos no-nociceptivos, se utilizó el "ensayo de von Frey" (17). Para esto, se ensayaron los ratones respecto a las respuestas a estimulación mecánica de umbral bajo mediante "pelos de von Frey". Las respuestas alodínicas se registraron de 0 a 3 dependiendo de la intensidad de la reacción al estímulo. Antes de la operación, todos los animales tenían un registro alodínico de 0. En cada momento puntual posterior a la lesión, únicamente los ratones con doble tratamiento exhibían una disminución significativa en el comportamiento alodínico cuando se comparaban con ratones de control (Fig. 2E). Así pues, una posible ventaja de la adición del anticuerpo anti-TNF al tratamiento podría ser atenuar la hiperalgesia.

Para confirmar el efecto "símil-placebo" de la neutralización del TNF en la eficiencia locomotora observada previamente, se realizó una segunda serie de experimentos. Para esto, los animales se inyectaron con el anticuerpo anti-TNF solo o con solución salina. Como era de esperar, las diferencias en las tareas motoras tal como se evaluaban por BBB (Fig. 2A) y andadura sobre rejilla (Fig. 2B) no eran significativas. Sin embargo, la eficiencia sobre la barra rotativa de los animales tratados con anti-TNF era significativamente mejor en comparación con los ratones tratados con solución salina (Fig. 2D). En este sentido, los ratones con lesión cerebral silenciados en TNF estaban significativamente menos deteriorados en el ensayo Rotarod y tenían déficits significativamente menos severos en retención de memoria que los ratones wt (18). De acuerdo con informes anteriores, únicamente los animales tratados con anti-TNF, pero no los tratados con solución salina, exhibían una disminución significativa de la reacción alodínica a todo lo largo del periodo de tiempo estudiado (análisis de regresión lineal, datos no presentados).

La integridad del tracto corticoespinal dorsal (CST) en algunos de los animales tratados previamente (4-5 por grupo), se evaluó por inyección de biotina-dextrano-amina (BDA) en la corteza sensorial-motosa (19). En los ratones que recibieron solución salina o IgG, las fibras CST transeccionadas se retraían del sitio de la lesión en \sim250 \mum (\pm 11,5 \mum) (Fig. 3A). Únicamente se detectaban el pequeño número de brotes que se extendían desde los axones cortados al tejido adyacente, pero no crecían hacia el interior del área de lesión. Significativamente, en los animales tratados con anti-CD95L o anti-CD95L/anti-TNF, brotaban numerosas fibras ectópicas desde el CST transeccionado en dirección rostral hacia el sitio de la lesión (Fig. 3B). Estas fibras regeneradoras crecían hacia el interior de la materia blanca dorsal y la cicatriz de la lesión. Un pequeño número de fibras cruzaban incluso el epicentro de la lesión. El número relativamente bajo de fibras de cruzamiento comparado con otros estudios (20) está relacionado con el tamaño de la lesión. En este caso, los autores de la invención cortaron dos tercios de la médula espinal, lo que conduce a la transección del componente dorsal entero del CST. De acuerdo con ello, las lesiones grandes de la médula espinal están correlacionadas con un crecimiento regenerativo pobre (20). Las vistas con gran aumento de fibras CST en el sitio de la lesión de los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF demostraban una morfología consistente con botones sinápticos, lo que sugería que estas fibras regeneradoras forman conexiones funcionales con
(Fig. 3B).

Es interesante que, a pesar del bajo número de animales seguidos por BDA, era evidente por los datos que la regeneración de fibras estaba correlacionada con el registro en la eficiencia de la andadura sobre rejilla (R = 0,66; p \leq 0,05; correlación de Pearson). Este registro refleja movimientos voluntarios, y por consiguiente, la mejora funcional de los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF no puede ser debida a tractos ventrales disponibles (tractos retículo- y vestíbulo-espinales) que son los encargados de producir movimientos reflejos.

Para descifrar los mecanismos moleculares subyacentes en la recuperación clínica de los animales, se evaluó la expresión de diversos marcadores para degeneración, regeneración o inflamación. Se extrajeron proteínas de las médulas espinales de animales (n = 3 por grupo) ensayados previamente con respecto a eficiencia locomotora.

Se sabe que la neutralización de CD95L disminuye la apoptosis. Ahora bien, ¿qué tipos de células se recuperan? Las neuronas y la microglía expresan tanto CD95L como CD95, los astrocitos expresan TNF y CD95, mientras que los linfocitos infiltrantes expresan CD95L (datos no presentados). En contraste con los astrocitos, los oligodendrocitos son sensibles a la apoptosis inducida por CD95 (21). Dado que CD95 se expresa también en neuronas y en microglía, las células recuperadas deben ser neuronas, microglía u oligodendrocitos.

Para abordar esta cuestión, se evaluó la expresión de una proteína neuronal citoesquelética, \betaIII-tubulina (22). Se ha demostrado que el nivel de \betaIII-tubulina aumenta durante la regeneración axonal (23). En conformidad con ello, en los animales tratados con anti-CD95L o anti-CD95L/anti-TNF, pero no en los grupos de control, la expresión de la \betaIII-tubulina aumentaba notablemente (Fig. 4A).

Ulteriormente, se examinó la expresión de Tau, una proteína asociada a los microtúbulos neuronales. Como era de esperar, la cantidad total de Tau, tal como se evaluaba por el anticuerpo Tau5, era mayor en ambos grupos tratados (Fig. 4A). Es muy importante que la proporción de Tau no fosforilada (Ser 199 y 202) era mayor en los grupos tratados (Fig. 4A). Además, en los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF, se detectaba una banda adicional para Tau (flechas). Para determinar si esta banda era debida a degradación o desfosforilación de Tau, se trataron los lisados con fosfatasa alcalina (AP). El tratamiento con AP desplazaba hacia abajo las bandas superiores (datos no presentados). Así pues, los autores de la invención deducen que la neutralización de CD95L facilita la desfosforilación de Tau. La Tau desfosforilada estabiliza las estructuras de microtúbulos (MT), permitiendo con ello el crecimiento axonal (24).

Se ha comunicado que los oligodendrocitos sufren apoptosis después de la SCI (25). La pérdida de oligodendrocitos da como resultado la desmielinación de axones que podrían haber sobrevivido al traumatismo inicial. Además, se ha postulado que el sistema CD95-L/R es un desencadenante principal de la desmielinación en la esclerosis múltiple (26). Por esta razón, se ve incentivada la especulación de que el tratamiento con anti-CD95L disminuye la muerte de los oligodendrocitos y, por tanto, la desmielinación axonal subsiguiente a la lesión de la médula espinal. Para abordar esta cuestión, se evaluaron los niveles de la proteína básica Mielina (MBP). Esta proteína es producida por los oligodendrocitos y su presencia puede servir como parámetro indirecto de la viabilidad de los oligodendrocitos (27). En los animales tratados con anti-CD95L solo o junto con anti-TNF, los niveles de MBP aumentaban en comparación con ratones de control (Fig. 4B).

La regeneración puede facilitarse también por interferencia con la respuesta inflamatoria. La amplificación de la reacción inflamatoria puede ser impulsada por CD95L y TNF, como sucede en otros sistemas (28). Después de la SCI, los astrocitos reactivos invaden el sitio de lesión para producir la escara astrogial. La escara se convierten en un obstáculo mecánico para la regeneración axonal (29). La inhibición de CD95L podría reducir la formación de escara después de la SCI. Por esta razón, se evaluaron los niveles del marcador para astrocitos reactivos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los niveles de expresión de GFAP no diferían entre los grupos tratados y de control
(Fig. 4C).

La neutralización de CD95L podría aumentar también directamente el potencial de regeneración de los axones lesionados. Para comprobar esto, se examinaron los niveles de expresión de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP-43). Se ha demostrado que la expresión de GAP-43 aumenta después de SCI torácica únicamente en los axones que pueden regenerarse (30). Además, la co-expresión de GAP-43 y CAP-23, otra proteína cónica de crecimiento importante [sic], conduce a un aumento de 60 veces en la regeneración de los axones DRG después de la SCI (31). En los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF, la expresión de GAP-43 aumentaba cuando se comparaba con los grupos de control (Fig. 4D).

En suma, se ha demostrado por primera vez con ensayos locomotores que la neutralización de CD95L promueve la recuperación funcional después de SCI. Aparte del registro BBB que está enfocado principalmente en movimientos reflejos estereotipados, se han realizado también ensayos que reflejan la integridad de los tractos espinales dorsales que se ven afectados por la lesión. Estos son el ensayo de andadura sobre rejilla y el ensayo de natación. Se ha desarrollado una escala de natación de acuerdo con la eficiencia natatoria de los animales a fin de cuantificar los aspectos múltiples de la locomoción en ausencia de aportación cutánea y propioceptiva desde las extremidades a la médula espinal. En cada ensayo, la recuperación funcional de los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF era significativamente mejor que en los dos grupos de control. Los animales tratados con anti-TNF solo no exhibían una recuperación funcional significativa, pero la adición del anticuerpo anti-TNF al tratamiento atenuaba la alodinia mecánica.

En segundo lugar, el estudio de seguimiento BDA indicaba una capacidad regeneradora incrementada de los axones lesionados únicamente en los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF. Además, estas fibras regeneradoras formaban conexiones funcionales, como se demostró por la formación de botones sinápticos en el sitio de la lesión. Así pues, la neutralización de CD95L es probable que mejore la plasticidad axonal, conduciendo a la remodelación funcional de la circuitería de la médula espinal. La regeneración axonal se producía a pesar de la ausencia de efecto de CD95L sobre la escara de la lesión. La recuperación locomotora y la regeneración incrementada se reflejaban por un aumento del marcador neuronal \betaIII-tubulina, así como por un aumento en la viabilidad de los oligodendrocitos. Por esta razón, la neutralización de CD95L protege las neuronas e inhibe a la vez la desmielinación. Además, la expresión de GAP-43 aumentaba en los animales tratados con anti-CD95L y anti-CD95L/anti-TNF, lo que indicaba que la neutralización de CD95L podría aumentar directamente el potencial regenerador de los axones lesionados. Asimismo, GAP-43 puede aumentar debido a que el mantenimiento de la viabilidad de los oligodendrocitos impide la desmielización axonal y proporciona a los axones la posibilidad de regenerarse.

El traumatismo espinal y cerebral explica la mayoría de casos de muerte e incapacidades permanentes en la población inferior a la edad de 40 años. Las consecuencias para la sociedad son devastadoras, habiéndose designado como la epidemia silenciosa. Actualmente, las estrategias que apuntan a la reparación de las lesiones de la médula espinal se enfocan en neuroprotección, regeneración mejorada, o tratamiento de la desmielinación. Dada la complejidad de la lesión de la médula espinal, podrían requerirse intervenciones múltiples direccionadas a las diferentes fuentes de deterioro. Los autores de la presente invención han demostrado que después de la SCI, la neutralización de CD95L actúa a tres niveles: protege las neuronas, inhibe la desmielinación, y promueve la regeneración y, por tanto, puede ofrecer una nueva terapia para los traumatismos espinales humanos.

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Ejemplo 2 Tratamiento de la lesión de la médula espinal con un proteína de fusión CD95-Fc

Se ensayó si una proteína de fusión CD95-Fc (v.g. como la descrita en el documento WO95/27735) es capaz de ejercer un efecto terapéutico subsiguiente a la SCI por hemisección. Los animales de ensayo (n = 6) se trataron siete veces por vía intraperitoneal con 25 mg/kg de CD95-Fc cada tres días, respectivamente. Los animales de control (n = 6) se trataron con solución salina. De hecho, la administración repetida de CD95-Fc atenuaba significativamente la parálisis de los miembros posteriores de los ratones cuatro semanas después de la administración espinal. Los resultados se muestran en Fig. 6. Los ratones tratados con CD95-Fc recuperaban la motilidad de los miembros posteriores para un registro BBB de 11 por término medio. Este registro corresponde a un soporte total del peso y una colocación sobre la mayor parte de la planta de los miembros posteriores. En contraste, los ratones tratados con solución salina, tenían un registro medio de 1,5 que corresponde a una capacidad ligera de movimiento de los miembros posteriores en dos articulaciones, pero por lo demás una incapacidad de utilizar los miembros posteriores para
locomoción.

El tratamiento con CD95-Fc mejoraba eficazmente la recuperación funcional del movimiento de los miembros posteriores después de hemisección espinal cervical. Un progreso de la motilidad de los miembros posteriores como el demostrado en esta memoria en los ratones podría corresponderse a una mejora espectacular en la calidad de vida y una necesidad reducida de atención sanitario cuando se correlaciona con humanos que sufren parálisis subsiguiente a SCI.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Referencias

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Claims (15)

1. Uso de un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de

(a)

un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo,

(b)

una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma,

\quad

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal, en donde dicho medicamento no comprende un inhibidor del ligando/receptor de TNF.

2. El uso de la reivindicación 1, para el tratamiento de lesiones parciales o completas de la médula espinal.

3. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2 para el tratamiento de la paraplejia.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la regeneración de la eficiencia locomotora, la mejora de las reacciones para la estimulación y/o la recuperación de la coordinación de movimientos.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal en personas adultas.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para el tratamiento de humanos.

7. El uso de las reivindicaciones 1-6, en donde el inhibidor del ligando CD95 es un dominio extracelular de la molécula receptora CD95.

8. El uso de la reivindicación 1-7, en donde el inhibidor del ligando CD95 es un dominio extracelular de la molécula receptora CD95 fusionada a un dominio polipeptídico.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde el inhibidor del ligando CD95 es un dominio extracelular de la molécula receptora CD95 fusionada a una molécula de inmunoglobulina Fc.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el medicamento comprende el al menos un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de la reivindicación 1(a) y (b) como el ingrediente activo junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el medicamento se administra por vía sistémica.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el medicamento se administra por vía local.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el medicamento se administra por vía intratecal.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para el tratamiento de lesiones agudas.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para el tratamiento de lesiones no agudas después de introducción de una nueva lesión.