CN114793420A - 用于治疗脊髓损伤和改善运动功能的依来曲普坦氢溴酸盐 - Google Patents

Abstract

本发明公开了依来曲普坦氢溴酸盐在治疗脊髓损伤和改善运动功能中的用途。尽管在试图改善损伤后的有限恢复方面做了大量努力，但是应该只有多靶标组合治疗方法对于脊髓损伤性质的复杂性是有效的。利用幼体斑马鱼药物发现平台，本文确定了依来曲普坦Hbr在促再生模型中具有运动恢复特性，并且已经证实其对啮齿动物(促纤维化)挫伤模型具有保守作用。该方法允许确定有前景的依来曲普坦Hbr的新治疗适应症，其与组合治疗策略和创新工程方法相关，显示用于脊髓损伤恢复的巨大潜力。

Description

用于治疗脊髓损伤和改善运动功能的依来曲普坦氢溴酸盐

技术领域

本发明涉及依来曲普坦氢溴酸盐在治疗脊髓损伤和改善运动功能中的用途。

背景技术

脊髓损伤(SCI)导致运动、感官和自主机能障碍，引起影响全世界数百万人的神经学创伤，因此迫切需要开发用于临床使用的有效的脊髓修复策略¹。SCI的病理生理学可以分为原发性和继发性损伤机制。原发性损伤由于脊髓组织的机械破坏而发生，其诱导轴突、血管和细胞膜的改变，导致直接的神经组织损失和脱髓鞘^2-4。在初始创伤发生之后，继发性损伤由于几种机制而发生，即，导致炎症细胞浸润的血液脊髓屏障(BSCB)破坏、炎症细胞因子的释放以及导致兴奋性毒性和缺血的兴奋性神经递质的不成比例的释放^2,3,5,6。因此，继发性损伤是多因素的，并且其特征在于存在可以引起反应性神经胶质增生、水肿、神经胶质/轴突瘢痕形成和中心空洞(central cavitation)的炎症^5-7。

成熟SCI病变显示三个主要组织隔室：具有非神经组织的病变核心/纤维化瘢痕、病变核心周围的星形细胞瘢痕和具有功能性但反应性的未受损神经组织(spared neuraltissue)的周围区域⁸。实际上，SCI瘢痕导致修复反应(其对于防止细胞损伤的扩散是必需的)和有害反应(其限制再生长和组织修复)，其随时间变化并且由关于病变的空间位置定义^9,10,11,12。事实上，在损伤之后，反应性星形胶质细胞不仅形成限制病变延伸的神经胶质瘢痕，将炎症限制在病变中心，还限制和抑制轴突再生^9,13。此外，小神经胶质细胞/巨噬细胞能够实现表型可塑性，并且还产生引起延长的且过度的促炎反应的细胞毒性因子，该促炎反应使病变损伤(即继发性损伤)恶化^9,14。另外，少突胶质细胞和少突胶质前体细胞(OPC)可以通过凋亡或坏死而死亡，但也可以实现分化和髓鞘再生^9,15,16。因此，鉴于多种不同细胞类型、细胞内和细胞外微环境之间的复杂相互作用，完全消除这些细胞类型或反应中的一种对于SCI修复是无效的^9,17,18。需要组合的治疗和时间依赖性策略以保持SCI瘢痕的有益特性，改善其修复反应，同时针对负面方面(negative facet)^9,11,19。

治疗方案(标准护理或实验方案)在向严重患病患者提供良好神经和功能恢复方面取得的成功有限。Ghosh和Pearse(2015)提出谷氨酰胺能、NA、DA和5-HT通路参与运动的启动和调节，并且提出实验工作提供了5-HT在通过中枢模式发生器调节运动的节律和协调中的贡献的证据。用非选择性5-HT受体激动剂喹哌嗪的实验显示在选择性5-HT2拮抗剂SB204741和SB242084的存在下诱导运动样运动。Ghosh和Pearse未公开依来曲普坦(一种5-HT 1B/1D受体激动剂)在任何5-HT2拮抗剂不存在的情况下单独用于治疗脊髓损伤和改善运动功能。

依来曲普坦是一种曲普坦类药物，首次在WO92/06973(辉瑞公司(Pfizer))中作为5-HT 1B/1D受体激动剂公开，用于治疗偏头痛以及用于预防偏头痛复发。WO92/06973未公开依来曲普坦在脊髓损伤和改善运动功能中的用途。

发明概述

一方面，本发明涉及依来曲普坦氢溴酸盐在治疗脊髓损伤和改善运动功能中的用途。

实施方案1.本专利申请公开了依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于治疗脊髓损伤。

实施方案2.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于改善脊髓损伤之后的运动功能。

实施方案3.用于根据实施方案1所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期或亚急性期。

实施方案4.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于调节与脊髓损伤有关的炎症。

实施方案5.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于保护脊髓组织中的脉管系统渗漏。

实施方案6.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于减少出血。

实施方案7.用于根据实施方案6所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述出血与脊髓损伤有关。

实施方案8.用于根据实施方案7所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期。

实施方案9.一种在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物。

实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中给予依来曲普坦氢溴酸盐在损伤之后1小时开始。

实施方案11.根据实施方案9-10所述的方法，其中所述受试者是温血脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。

发明详述

本发明涉及依来曲普坦氢溴酸盐在治疗脊髓损伤和改善运动功能中的用途。

如本文所使用，脊髓损伤(SCI)是指由创伤(例如汽车碰撞)或由疾病或退化(例如癌症)引起的对脊髓或神经的任何部分的损伤，这导致其功能的暂时或永久改变—症状可以包括由在损伤平面以下的脊髓所服务的身体的部分中的运动功能、感官或自主功能的部分或完全丧失。最严重的脊髓损伤影响调节肠或膀胱控制、呼吸、心率和血压的系统。大多数具有脊髓损伤的患者经历慢性疼痛。

如本文所使用，术语“受试者”、“宿主”和“患者”可互换使用。如本文所使用，受试者优选地是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)，最优选人。

如本文所使用，“治疗有效量”是指当给予患有目标疾病或障碍的受试者时，在目标疾病或障碍的治疗或管理中提供至少一种治疗益处的药剂的量(例如，用于本发明的依来曲普坦Hbr的量)。此外，关于用于本发明的药剂的治疗有效量是指在疾病或障碍的治疗或管理中单独或当与其他疗法组合时提供至少一种治疗益处的药剂的量。

“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将药剂物理引入受试者。本文所公开的化合物的示例性给药途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、椎管或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部给予之外的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、鞘内、病灶内、囊内、皮内、腹膜内、皮下、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，化合物经由非肠胃外途径给药，例如口服给药。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜给药途径，例如，鼻内、舌下或局部给药。给药也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行。

加速发现用于临床用途的新治疗剂的一个有价值的策略是发现现有药物的新用途的过程，即药物再利用策略²⁰。事实上，最初被证明在一种疾病中具有治疗效果的药物可能在另一种疾病中是潜在地有效的，并且由于药物已经经历了临床前和临床测试，该策略允许更短的开发时间、更低的成本、更低的风险和更高的成功率^20,21。

斑马鱼正在成为用于直接且成本有效的药物筛选的特别通用的脊椎动物模型^20,22-24。为了获得本文所公开的结果，发明人使用先前在其实验室开发的幼体斑马鱼药物筛选平台以确定具有用于SCI适应症的治疗特性的新分子，并确定了具有运动恢复特性的依来曲普坦Hbr。依来曲普坦Hbr是FDA批准的用于偏头痛急性治疗的对5-羟色胺1-受体亚型B/D(5-HT1_B/1_D)和F(5-HT1_F)具有高选择性亲和力的药物^25,26，并且本文首次公开了该分子用于新的可能的治疗适应症的用途。按照再利用策略，利用斑马鱼幼体(促再生模型)作为体内药物筛选平台来确定依来曲普坦Hbr，然后我们通过显示其改善脊髓功能修复的能力来证实在小鼠挫伤(促纤维化)模型中治疗效果的保守性。

方法

伦理声明

涉及动物的所有实验均根据欧洲共同体指南(指令2010/63/EU)、葡萄牙动物护理法(DL 113/2013)进行，并由医学研究所分子内部委员会(Instituto de MedicinaMolecular Internal Committee)(ORBEA)和葡萄牙动物伦理委员会(Portuguese AnimalEthics Committee)(DGAV)批准。进行所有努力以使所使用的动物的数量最小化并减少本公开内容中所使用的动物的痛苦。

动物

斑马鱼SCI模型：

Tg(mnx1:GFP^ml2)，缩写为hb9:GFP，通过按照用于鱼类护理和维持方案的标准指南，在恒定条件下维持和繁殖²⁷。将斑马鱼幼体用于SCI的基于表型的筛选中。

小鼠SCI模型：

在本研究中使用成年雌性C57BL/6J小鼠(8-10周龄；Charles River公司)。每笼饲养三至四只小鼠，并在研究期间维持12小时亮/暗循环，随意进食和饮水。

SCI的基于表型的筛选

如先前由Diana等人2019²⁸所描述的，使用幼体斑马鱼基于表型的筛选以筛选来自小分子库(PHARMAKON 1600-MicroSource Discovery Systems公司，美国)的化合物库。简言之，使斑马鱼幼体在含有1μM亚甲基蓝的EM中发育，直至受精后5天(dpf)。在5dpf时，斑马鱼幼体脊髓在肛孔的平面处被横切(Diana等人，2019)。在1dpi时，将幼体随机分配到含有EM+10mM HEPES的6孔板中，并在24小时期间暴露于添加到培养基中的化合物。在2dpi时，使用DanioVision^TM(Noldus Information Technology，Netherlands)，一种斑马鱼幼体的自动跟踪系统进行行为评估。允许幼体在含有EM+10mM HEPES的96孔板(1个幼体/孔)中自由游动，并在10分钟亮-暗循环(即3个亮循环和3个暗循环)下跟踪它们的游动活动持续90分钟。使用Ethovision X.T.10软件(Noldus,Wageningen,Netherlands)分析获得的跟踪数据，并且仅分析在3个暗周期中获得的游动活动²⁹。

挫伤脊髓损伤和术后护理

用Infinite Horizon冲击器(PSI)对成年C57BL/6雌性小鼠(10-12周)进行中度-重度挫伤型损伤³⁰。所有手术均在无菌条件下进行。简言之，在用氯胺酮和赛拉嗪(分别为120mg/kg和16mg/kg，腹腔内注射)的深度麻醉下，小鼠在第9胸椎(T9)平面接受背侧椎板切除术。在用不锈钢冲击器尖端固定第8胸椎(T8)和第10胸椎(T10)的外侧突之后，将75千达因(kdyne)的受控力限定的冲击传递到暴露的脊髓^28,30。然后，用4.0聚乙醇酸(PGA)吸收性缝线(Safil，G1048213)缝合肌肉和皮肤。在本研究中，当实际位移值在区间500-700μm之外或者如果冲击之后的实际力>2SD 75千达因时，将小鼠排除在外。损伤之后立即用0,5ml的无菌盐水皮下注射小鼠，并且然后每天注射，持续5天。在该实验期间，小鼠每天经历两次温和的膀胱挤压(expression)，直到它们自己排尿。每天监测体重，直到损伤后15天(dpi)，随后在研究期间每周监测体重，并且提供高热量颗粒饲料(pellet)(Supreme Mini-Treats^TMS05478和S05472)作为膳食补充剂，因为在该SCI模型中在损伤时通常观察到10％的体重减轻。

小鼠SCI模型中的药物治疗

所使用的依来曲普坦Hbr(Sigma-Aldrich，PZ0011)剂量等同于人类市场剂量³¹，并且使用编码系统将所有治疗剂量等分以维持双盲测量。该编码仅在所有行为测试结束时公开。将小鼠随机分配至每个实验组(SCI+溶媒和SCI+依来曲普坦Hbr)。在损伤之后1小时(hpi)开始经由腹膜内注射(i.p.)给予溶媒和依来曲普坦Hbr，并且然后每天给予直至15dpi。

Basso小鼠量表(BMS)评估

用BMS评级系统评估旷场运动^30,32。所使用的旷场是直径为85cm且高为30,5cm的圆形平台，其位于具有正常照明的安静测试室中。使小鼠在手术之前2周每天适应测试平台5分钟。如先前所描述的进行BMS测试(BMS评分和分项评分)^28,30。简言之，在手术之前测试小鼠，以获得基线手术前运动值，其中预期最大BMS评分值。为了确定治疗之后的功能恢复，在1、3、7、14dpi时评价每只小鼠的BMS评分，并且然后每周评价直到实验结束。BMS评分和分项评分的评价总是由对治疗组不知情两个评价者进行，并对每只小鼠的后肢运动进行4分钟的评分。如果评价者之间的评分不同，则最终评分取两个评分的平均值。

丙酮蒸发试验

使用丙酮蒸发试验以测量在损伤时对冷刺激的敏感性³³。首先，使小鼠适应具有金属丝网的平台4分钟，然后使用1ml注射器将一滴50μl的丙酮施加到后爪足底表面。对每只后爪进行五次试验，其中试验之间间隔2分钟。在每次试验中，使用计时器测量轻拂或舔后爪60秒所花费的时间并记录用于分析³⁴。

灌注和组织处理

在行为测试结束时，用0,9％NaCl，随后用pH 7,4的0,1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛(PFA)经心脏灌注小鼠。在PBS中冲洗过夜之后，将脊髓在30％蔗糖中冷冻保护3天，然后在最佳切割温度(OCT)混合物(Sakura Finetek，USA)中以从3mm嘴侧至损伤中心至3mm尾侧(总共6mm)的块的形式冷冻。然后，在低温恒温器上将每个块切割成横切片(10μm)，以10个交替组固定在载玻片上，并在-20℃下储存直至需要³⁵。

免疫组织化学

对于切片中的免疫组织化学，使用PBS从冷冻切片中去除OCT(30分钟)。用0.5％PBS-Triton X-100洗涤切片，并在室温下在封闭溶液(含有0.1％Triton X-100的PBS中的5％山羊血清)中封闭2小时。然后，将脊髓切片与抗-GFAP(1:500；ThermoFisherScientific，13-0300)、抗-PDGFRβ(1:200；Abcam，ab32570)、抗-CD31/PECAM-1(1:100；RDSystems，AF3628)、抗-F4/80(1:500；Abcam，ab6640)和抗-P2Y12(1:500；AnaSpec AS-55043A)一抗在4℃下孵育过夜，在0.1％PBS-Triton X-100、PBS中洗涤，并且在4℃下与AlexaFluor568(1:500；ThermoFisher Scientific，A11011或A11057)、AlexaFluor488(1:500；ThermoFisher Scientific，A11006或A11008)二抗再孵育过夜。对于活化的小神经胶质细胞定量，用DAPI复染切片。然后将切片在PBS中洗涤并用DABCO固定在荧光固定介质上。

FluoroMyelin green染色和白质保留分析

为了定量脱髓鞘，将一组间隔100μm并跨越整个块的切片用FluoroMyelin^TM Green(ThermoFisher Scientific，F34651)染色1小时。在电动倒置宽视野荧光显微镜(ZeissCell Observer，Carl Zeiss MicroImaging)中以10x放大倍率获得Z-堆叠组合。使用Fiji软件测量白质保留的截面面积(WMA)和组织切片的总截面面积(TCA)，然后计算从1100μm嘴侧至损伤中心至1100μm尾侧的截面面积比(WMA/TCA)。中心被确定为在边缘中具有荧光绿染色的白质的最小面积的组织切片，所述组织切片被确定为具有最小WMA/TCA的切片。通过编码的切片并且由不知晓治疗或结果组的研究者进行病变的分析³⁶。

纤维化瘢痕定量

将一组切片用抗-PDGFRβ和抗-GFAP染色以勾画纤维化瘢痕区域的边界。在电动倒置宽视野荧光显微镜(Zeiss Cell Observer，Carl Zeiss MicroImaging)中以20x放大倍率获得Z-堆叠组合。使用Fiji软件手动勾画并计算PDGFRβ⁺面积和总截面面积，之后定量每个总截面面积的纤维化瘢痕面积的百分比。通过检查确定纤维化病变的嘴侧和尾侧范围。(分别)通过将含有具有纤维化核心的组织的切片的数目或含有具有PDGFRβ⁺表达上调的组织的切片的数目乘以每个切片之间的距离(100μm)计算纤维化病变长度和PDGFRβ⁺表达的延长。

活化的小神经胶质细胞定量

为了定量活化的小神经胶质细胞，将一组脊髓切片用抗-P2Y12(小神经胶质细胞特异性标志物)和抗-F4/80(泛巨噬细胞标志物)染色并用DAPI复染。在电动倒置宽视野荧光显微镜(Zeiss Cell Observer，Carl Zeiss MicroImaging)中以20x放大倍率获得Z-堆叠组合。使用定制的多通道细胞计数器4TIFF软件定量细胞的数目，该软件在手动设定阈值和参数之后计算F4/80⁺和P2Y12⁺细胞的数目。

统计分析

使用Prism 8软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA)进行来自幼体斑马鱼SCI模型的所有图形表示和数据分析。所使用的统计检验是双尾的。使用Welch校正的非配对学生t检验进行来自斑马鱼SCI研究的不同组之间的平均比较。使用双因素方差分析(ANOVA)或重复测量双因素方差分析，随后使用SigmaPlot 14进行Bonferroni事后检验，进行来自小鼠SCI模型的数据分析。P值<0.05被认为是显著的。所有数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。

结果

依来曲普坦Hbr在斑马鱼幼体横切脊髓损伤模型中挽救运动损害。

为了加速对脊髓损伤(SCI)的潜在新治疗剂的发现，我们使用能够实现从FDA批准的小分子库中筛选化合物库的表型分析。在该基于表型的筛选中，我们在损伤后1天(dpi)盲给予化合物(25μM)，并且我们在24小时后(即在2dpi时)进行行为评估，如先前由ChapelaD.等人2019所描述的。如果被选择为运动功能的指标的总移动距离和/或转角参数存在统计学上显著的改进，则首先盲选择小分子。然后，我们通过所限定的排除标准缩小选择范围(专利保护的或报告的SCI治疗适应症；主要报告的毒性或如果不能穿过血脑屏障)。值得注意的是，依来曲普坦Hbr是通过该药物发现平台确定的最有前景的候选物之一。依来曲普坦Hbr被认为是第二代曲普坦类药物，用于成人的有或无先兆的偏头痛的急性治疗，并且有趣地，在该斑马鱼幼体横切脊髓损伤模型中显示挽救运动损害(图1A，A’)，成为在哺乳动物SCI模型中待测试的有前景的SCI治疗候选物。

依来曲普坦Hbr改善具有T9挫伤型损伤的小鼠的运动功能。

为了在非再生模型中验证依来曲普坦Hbr对SCI适应症的治疗效果，决定在SCI啮齿动物模型中测试其功效。因此，使用Infinite Horizon(IH)冲击器在C57BL/6雌性小鼠中进行挫伤型损伤，并使用Basso小鼠量表(BMS)测试³²评价动物在损伤之后的运动性能。首先，使小鼠适应旷场平台，并且在15天之后，它们被中度-重度T9挫伤(75千达因)损伤(图2A)。损伤之后立即并根据生物力学排除标准，将小鼠随机分配至每个实验组(SCI+溶媒和SCI+依来曲普坦Hbr)。从损伤后1小时(1hpi)开始，经由腹膜内(i.p.)注射给予治疗剂量(溶媒或依来曲普坦Hbr)，然后每天给予直至15dpi(图2A)。在SCI+溶媒和SCI+依来曲普坦Hbr实验组之间，IH冲击器施加的损伤力或位移没有差异(图4)。为了评价损伤后的运动恢复，持续42天测量BMS评分和分项评分(图3B-B’)。依来曲普坦Hbr治疗的小鼠和溶媒治疗的小鼠中的BMS评分的平均值在1dpi之后增加，并且分别达到28-35dpi和21-28dpi之间的平台。与溶媒治疗的小鼠相比，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中的BMS评分随时间退役持续地但不显著地更高(图3B)。值得注意的是，在42dpi时，十三只依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中的一只获得的BMS评分为6(即显示频繁的足底踏步，伴随一些前-后肢协调)，并且其余十二只获得的BMS评分为5(即显示频繁或持续的足底踏步)。在相同的时间点，溶媒治疗的小鼠的BMS评分是4-5，其中九只动物中的三只仅实现偶尔的足底踏步。此外，85％的依来曲普坦Hbr治疗的小鼠也显示频繁的足底踏步，其中在最初接触时平行放置两只后肢爪，并且23％显示在抬起时平行放置至少一只后肢爪。

在从7至42dpi时，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中的平均BMS分项评分始终高于溶媒治疗的小鼠，从35dpi(图3B’)至42dpi(图3B’)变得显著更高。

在42dpi时，九只溶媒治疗的小鼠中的八只显示严重的躯干不稳定性，诸如后肢倾斜、蹒跚或接近瘫倒，并且仅一只动物获得轻度躯干稳定性。此外，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠显示更少的阻断行走运动的事件，诸如痉挛和臀部下垂，并且来自该实验组的46％的动物获得轻度躯干稳定性(图3C)。

另外，我们还评价了膀胱机能障碍状态，这是SCI之后观察到的常见效应^3,37。在人工膀胱挤压期间，我们将评分归为从0(无尿的正常膀胱，即自身具有排泄能力的动物)至3(保留大量尿的大膀胱)。依来曲普坦Hbr治疗的小鼠在1dpi时显示统计学上显著更小体积的保留尿(即更小的分数)，然而在该时间点之后该效应丧失，直至研究结束时，在实验组之间没有差异(图3D)。

冷异常性疼痛(cold allodynia)被定义为超敏反应，一种通常与SCI相关的对正常无害冷刺激的疼痛反应³³。在该研究中，使用丙酮蒸发测试在14dpi和42dpi时通过量化由蒸发冷却引发的疼痛反应的发作次数和持续时间来评价对冷刺激的敏感性。与溶媒治疗的小鼠相比，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠的平均值显示累积反应时间的持续但不显著的减少和冷超敏反应的更低的发作次数(图3E，E’)。

依来曲普坦Hbr可能在病变的末端范围附近预防脱髓鞘

为了分析依来曲普坦Hbr对损伤后脱髓鞘状态的影响，使用FluoroMyelin^TM Green荧光髓磷脂染色比较实验组(SCI+依来曲普坦Hbr和SCI+溶媒)之间的保留的白质面积/总截面面积(图5A)。在病变中心处以及距病变中心的嘴侧和尾侧超过700μm，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中保留的白质/总截面面积的平均值不显著但连续地高于用溶媒治疗的小鼠(图5B)。

通过依来曲普坦Hbr治疗降低增加的PDGFR-β表达水平的延伸

瘢痕的纤维化隔室由PDGFRβ⁺血管周细胞的亚群构成，其产生成纤维细胞样细胞的核心和细胞外基质分子的致密沉积³⁷。另外，由于最近表明减少周细胞来源的瘢痕形成促进小鼠中脊髓损伤后的功能恢复³⁷，决定通过评估纤维化瘢痕的面积和长度来分析依来曲普坦Hbr对纤维化瘢痕状态的影响。

对于该分析，用GFAP进行双重免疫组织化学，其允许勾画瘢痕的神经胶质限制性边界，并且用周细胞标志物PDGFRβ标记瘢痕的纤维化要素(图6A-C，6A’-C’，6A”-C”)。用该方法，可以勾画纤维化瘢痕隔室，通过与假手术(sham)小鼠中的PDGFRβ⁺染色水平比较，测量其在病变中心的面积并定义PDGFRβ⁺病变核心的长度延伸以及增加的PDGFRβ⁺免疫染色水平的延伸。在病变中心，在42dpi时，在依来曲普坦-Hbr治疗的小鼠与溶媒治疗的小鼠之间的纤维化病变核心的面积没有统计学上的显著差异。尽管溶媒与依来曲普坦Hbr治疗组之间的PDGFRβ⁺病变核心的延伸没有统计学显著差异，但与溶媒治疗的小鼠相比，用依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中增加的PDGFRβ⁺免疫染色水平的延伸存在统计学显著降低(图6D-F)。

依来曲普坦Hbr治疗减少了具有与脉管系统相关的异常数目的PDGFRβ⁺细胞的组 织的延伸

为了推断在病变范围末端检测到的PDGFRβ⁺水平增加是否与血管相关，我们决定使用周细胞标志物PDGFRβ⁺和内皮细胞标志物CD31(PECAM-1)进行双重免疫组织化学(图7)。在距中心1000μm的切片中，在溶媒治疗的小鼠中检测到的PDGFRβ的增加的表达以及在依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中检测到的PDGFRβ的减少的表达与CD31⁺内皮细胞相关(图7A-C”’)。

小神经胶质细胞受依来曲普坦Hbr影响

已知小神经胶质细胞对SCI修复至关重要。在没有小神经胶质细胞的情况下，脱髓鞘和病理性MDM浸润增强，胶质瘢痕形成被破坏并且运动损害加重³⁸。在该上下文中，决定通过用P2Y12(小神经胶质细胞标志物)和F4/80(泛巨噬细胞标志物)进行双重免疫组织化学来评价依来曲普坦Hbr对损伤后小神经胶质细胞状态的作用。P2Y12⁺小神经胶质细胞在假手术小鼠中显示具有长突起的分枝形态，而在溶媒治疗的小鼠中，小神经胶质细胞显示在病变中心处稀疏地检测到的更短的突起(图8A-C”)。在用溶媒治疗的小鼠中，在病变中心处检测到很少的P2Y12⁺小神经胶质细胞，并且当存在时，小神经胶质细胞主要在病变边缘处成簇观察到或在具有变形虫样形状(amoeboid shape)的保留的白质中观察到(图8B，B”；8C，C”)。依来曲普坦Hbr治疗的小鼠也显示成簇的小神经胶质细胞，具有变形虫样形状，并且在病变边缘处或在保留的白质中具有更短的突起，但是在一些切片中，在靠近中心或在中心处，还观察到更长的分枝突起；这是在溶媒治疗的小鼠中未观察到的特征(图8B，B”；8C，C”)。在距中心1000μm的切片中，P2Y12⁺小神经胶质细胞存在于整个灰质和白质中，与假手术动物相比，在溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠两者中在灰质中显示具有一些更短的突起和更具反应性的形状的形态(主要在脊髓背侧)(图8A，A’；8B，B”；8C，C”)。P2Y12⁺F4/80⁺(活化的小神经胶质细胞)细胞的数目不存在统计学显著差异，但是在依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中，在中心的嘴侧和尾侧400μm处，该数目始终更高(图8D)。

脊髓损伤(SCI)具有非常复杂的性质。众所周知，用于研究将干扰复杂生理学过程的化合物的潜力的最佳系统是评价它们的体内作用，并且斑马鱼幼体已经成为用于体内表型药物筛选的特别通用的脊椎动物模型^20,22。

本文首次从FDA批准的小分子文库中使用先前在我们的实验室中建立的基于体内幼体斑马鱼表型的筛选(即使用促再生模型)确定了具有SCI挽救特性的有前景的化合物²⁸。然后，我们在SCI的体内小鼠挫伤(促纤维化)模型中验证和评价了该化合物的治疗效果的保守性。

我们从我们先前验证的斑马鱼药物发现平台选择依来曲普坦Hbr作为具有脊髓恢复潜力的最有前景的候选物之一，其挽救总移动距离和转角参数两方面的运动损害。重要地，总距离和转角参数显示的改进不仅表明依来曲普坦Hbr挽救SCI幼体的游动能力，而且似乎分别改善运动方向控制。

在用该斑马鱼方法选择依来曲普坦Hbr之后，在T9挫伤小鼠模型中，在急性和亚急性损伤期期间，从损伤后1小时(hpi)开始每天给予该化合物，然后每天给予直到损伤后15天(dpi)。因此，不仅证实了依来曲普坦Hbr在促纤维化模型中对运动行为的改善具有保守的作用，还可以在42dpi时评价其对脱髓鞘状态、纤维化瘢痕形成以及对炎症过程的作用。重要地，该时间点构成啮齿动物的慢性期时间，其中存在反应性星形胶质细胞增生和巨噬细胞/小神经胶质细胞驱动的炎症。

值得注意的是，依来曲普坦Hbr显著改善了BMS评估中的运动性能，并且显示了改善小鼠躯干稳定性和减少严重事件的数目。此外，在丙酮蒸发测试中，依来曲普坦Hbr的给予连续地但不显著地降低了累积反应时间并降低了冷超敏反应的发作次数，这表明该化合物可能可以减少SCI环境中的冷异常性疼痛。实际上，尽管在若干研究中用于测量冷敏感性，但是丙酮蒸发测试具有若干限制，即，难以确保在每次改变冷刺激时连续地施加精确量的丙酮^33,39。该方法执行简单，但它仅量化反应的量级而不是测量促进反应的最小冷温度³⁹。

有时在人类中，功能损害的程度并不总是与组织损伤延伸相关。实际上，挫伤类型的损伤经常导致完全的运动和感觉丧失，尽管在损伤处存在未受损组织⁴⁰。尽管治疗组之间不存在统计学显著差异，但依来曲普坦Hbr显示在靠近病变的末端范围促进连续地更高的髓鞘保留。

SCI之后，形成抑制轴突再生长的纤维化瘢痕，同时限制免疫细胞浸润到脊髓实质中⁴¹。重要地，周细胞来源的瘢痕形成的中度抑制不仅保护伤口愈合并减少炎症和反应性星形胶质细胞增生，而且能够实现轴突再生并改善功能恢复³⁷。

有趣地，本文公开了依来曲普坦Hbr显著降低了增加的PDGFRβ⁺免疫染色水平的延伸，但不降低PDGFRβ⁺纤维化病变核心面积或病变中心处的延伸。

如本专利申请所公开的，在病变范围的末端检测到的增加的PDGFRβ⁺水平与血管相关，表明依来曲普坦Hbr降低了具有增加数目的PDGFRβ⁺细胞的病变组织的范围，即PDGFRβ⁺与CD31⁺细胞相关，并且可能对缺血状态具有作用。

作为对损伤的反应，小神经胶质细胞被激活并通过释放神经营养因子和去除碎片使切断的轴突再生。然而，炎症细胞因子的分泌和自由基的产生也可以促进神经毒性³⁸。

由于小神经胶质细胞对SCI修复和恢复的关键作用，发明人决定研究依来曲普坦Hbr对炎症过程的作用。有趣地，用依来曲普坦Hbr治疗的小鼠显示的小神经胶质细胞的形态与中度活化的小神经胶质细胞的一个特征更相似，显示具有更短突起的肥大。实际上，尽管观察到小神经胶质细胞具有成簇的变形虫样形状，但一些小鼠在靠近病变中心的脊髓切片中显示更长的分枝突起。这在溶媒治疗的小鼠中未观察到，在溶媒治疗的小鼠中仅检测到具有变形虫样形态的强烈活化的小神经胶质细胞，这是强分子炎症反应的特征⁹。

依来曲普坦Hbr是对5-HT1B、5-HT1D和5-HT1F受体具有高亲和力的血清素受体激动剂，已知其在治疗偏头痛中具有显著的临床功效²⁵。值得注意的是，本文首次公开了依来曲普坦Hbr的新适应症，其在SCI的两种不同(横切促再生和挫伤促纤维化)动物模型中显示其运动恢复特性。最后，依来曲普坦Hbr在与其他分子的组合治疗中以及连同工程方法和特异性时间依赖性干预在SCI的环境中具有巨大的潜力。

下文描述了若干特征，其各自可以彼此独立地或与其他特征的任何组合一起使用。然而，任何单独的特征可能不能解决以上所讨论的任何问题，或者可能仅解决以上所讨论的问题之一。以上所讨论的一些问题可能未被本文所描述的任何特征完全解决。尽管提供了标题，但是与具体标题相关但是在具有该标题的部分中未找到的信息，也可以在说明书中的其他地方找到。

附图简述

为了更容易地理解本申请，在附件中附上代表实施的优选形式的附图，然而这些附图并不旨在限制本文所公开的技术。

图1显示依来曲普坦Hbr对运动损害的挽救。与溶媒治疗的损伤幼体(n＝16条幼体)相比，在用从FDA批准的化合物文库中挑选的依来曲普坦Hbr治疗的横切斑马鱼幼体中由总移动距离(A)和转角(B)描绘运动性能。提供了平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。*p<0.05，***p<0.001，用Welch校正的学生t-检验。

图2显示了在SCI啮齿动物模型中15天的依来曲普坦Hbr治疗的功效的实验设计，显示SCI小鼠在T9挫伤型损伤后治疗15天的运动恢复。

图3显示，按照图2的实验设计-(B)与溶媒治疗的小鼠相比，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠从1至42dpi的BMS评分。对于SCI+溶媒，n＝9，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝14(对于21dpi之后的SCI+依来曲普坦Hbr，n＝13)。(B’)与溶媒治疗的小鼠相比，依来曲普坦Hbr治疗的小鼠从1至42dpi的BMS分项评分。提供了平均值±s.e.m.。*p<0.05，双因素重复测量ANOVA，随后进行Bonferroni事后校正。(C)在BMS测试期间观察到的来自溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠的动物(42dpi)的百分比(％)，该动物具有运动性能损害，诸如痉挛、臀部下垂和脊柱侧凸事件，以及恢复轻度躯干稳定性的能力。对于SCI+溶媒，n＝9，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝13。(D)膀胱功能的评价，归因于人工膀胱挤压期间收集的尿量的评分。提供了平均值±s.e.m.。*p<0.05，双因素重复测量ANOVA，随后进行Bonferroni事后校正。对于SCI+溶媒，n＝9，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝14(对于21dpi之后的SCI+依来曲普坦Hbr，n＝13)。(E)由丙酮蒸发冷却引发的疼痛性反应的累积反应时间。(E’)冷超敏反应的发作次数。(E-E’)在14dpi时，对于SCI+溶媒，n＝8，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝11，并且在42dpi时，对于SCI+溶媒，n＝9，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝13。

图4显示了实验组之间的冲击力和位移。(A)SCI期间对脊髓施加的冲击力(千达因)(ns-不显著，Welch校正的学生t检验)。(B)SCI期间冲击器尖端与脊髓接触之后的位移(μm)(ns-不显著，Welch校正的学生t检验)。对于溶媒治疗的小鼠，n＝9，并且对于依来曲普坦Hbr治疗的小鼠，n＝14。

图5显示了在损伤后42天时，溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中的白质保留。(A)与用FluoroMyelin green染色的依来曲普坦Hbr治疗的小鼠相比，溶媒治疗的小鼠的代表性脊髓切片。(B)在溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中，从中心到嘴侧和尾侧上1100μm的白质面积/总截面面积。双因素ANOVA，随后Bonferroni事后校正。对于SCI+溶媒，n＝8，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝12。

图6显示了在42dpi时纤维化瘢痕的评价。(A-C”)脊髓切片的免疫荧光代表性图像，分别显示假手术小鼠、溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中病变中心处和嘴侧和尾侧距中心1000μm处的GFAP⁺星形胶质细胞(绿色)(A’-C’)、PDGFRβ⁺周细胞/成纤维细胞(品红色)(A”-C”)和融合通道(A-C)。白色箭头显示在脊髓背侧在嘴侧和尾侧距中心1000μm处的PDGFRβ表达。(D-F)在溶媒治疗的小鼠(n＝8)和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠(n＝12)中的纤维化病变核心面积/总截面面积的百分比(D)、纤维化病变长度(E)和可见PDGFRβ表达上调的病变组织的(长度)延伸(F)的图示。*p<0.05，Welch校正的学生t检验。比例尺：150μm。

图7显示了在距中心1000μm处的溶媒-脊髓切片中与脉管系统相关的PDGFRβ⁺细胞。(A)脊髓切片的免疫荧光代表性图像，其显示在42dpi时在DAPI情况下的PDGFRβ⁺周细胞/成纤维细胞(绿色)、CD31⁺内皮细胞(品红色)和融合通道。(B’-B”’)ROI区域B的脊髓切片图像的放大。(C’-C”’)ROI区域C的脊髓切片图像的放大。白色箭头显示与CD31⁺细胞相关的PDGFRβ⁺的存在。比例尺：150μm(A)和100μm(B’-C”’)。

图8显示了42dpi时的炎症反应。(A-C”)脊髓切片的免疫荧光代表性图像，分别显示假手术小鼠、溶媒治疗的小鼠和依来曲普坦Hbr治疗的小鼠中的病变中心处、嘴侧和尾侧距中心400和1100μm处的F4/80⁺巨噬细胞(绿色)(A’-C’)、P2Y12⁺小神经胶质细胞(品红色)(A”-C”)和融合通道(A-C)。白色箭头显示F4/80表达，并且白色半幅照片显示在脊髓背侧在嘴侧和尾侧距中心1100μm处的P2Y12表达。(D)P2Y12⁺F4/80⁺活化的小神经胶质细胞的计数。对于SCI+溶媒，n＝8，并且对于SCI+依来曲普坦Hbr，n＝12。使用单因素ANOVA，随后进行Bonferroni事后检验进行统计分析。比例尺：150μm。

具体实施方式

现在，将详细描述本申请的优选实施方案，然而，这些并不旨在限制本申请的范围。

实施方案1.本专利申请公开了依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于治疗脊髓损伤。

实施方案2.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于改善脊髓损伤之后的运动功能。

实施方案3.用于根据实施方案1所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期。

实施方案4.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于调节与脊髓损伤有关的炎症。

实施方案5.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于保护脊柱血液屏障中血管的渗漏。

实施方案6.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于减少出血。

实施方案7.用于根据实施方案6所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述出血与脊髓损伤有关。

实施方案8.用于根据实施方案7所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期。

实施方案9.一种在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物。

实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中给予依来曲普坦氢溴酸盐在损伤之后1小时开始。

实施方案11.根据实施方案9-10所述的方法，其中所述受试者是温血脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。

包含依来曲普坦Hbr的药物组合物的合适的单位给药形式包括，作为非限制性实例，口服给药的形式和经由肠胃外途径给药的形式，其非限制性实例包括吸入、皮下给药、肌内给药、静脉内给药和皮内给药。

在一些实施方案中，用于口服给药的药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、硬明胶胶囊、软明胶胶囊和/或颗粒剂的形式。在这样的药物组合物的一些实施方案中，将本公开的化合物和/或本公开的化合物的药学上可接受的盐与一种或多种惰性稀释剂混合，该惰性稀释剂的非限制性实例包括淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖和二氧化硅。在一些实施方案中，这样的药物组合物可以进一步包含除了稀释剂以外的一种或多种物质，诸如(作为非限制性实例)，润滑剂、着色剂、包衣剂、或涂膜剂(varnish)。

在本说明书中，已经参考许多可以随实施而变化的具体细节描述本发明的实施方案。因此，本发明内容的唯一且排他的指标，以及申请人意图作为本发明的指标，是本申请所产生的权利要求的集合，其以这种权利要求所产生的具体形式，包括任何随后的修正。本文中对包含在这些权利要求中的术语明确阐述的任何定义应支配在如权利要求中所使用的这些术语的含义。因此，权利要求中未明确叙述的限制、要素、特性、特征、优点或属性不应以任何方式限制此权利要求的范围。因此，说明书和附图被认为是说明性的而不是限制性的。

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Claims (11)

1.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于治疗脊髓损伤。

2.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于改善脊髓损伤后的运动功能。

3.用于根据权利要求1所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期或亚急性期。

4.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于调节与脊髓损伤有关的炎症。

5.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于保护脊髓组织中的脉管系统渗漏。

6.依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其用于减少出血。

7.用于根据权利要求6所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述出血与脊髓损伤有关。

8.用于根据权利要求7所述的用途的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物，其中所述脊髓损伤处于急性期。

9.一种在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的依来曲普坦氢溴酸盐或其药物组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中给予依来曲普坦氢溴酸盐在损伤之后1小时开始。

11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其中所述受试者是温血脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。

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