ES2968691T3 - Hidrobromuro de eletriptán para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora - Google Patents
Hidrobromuro de eletriptán para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención describe el uso de hidrobromuro de eletriptán en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y la mejora de la función locomotora. A pesar de los grandes esfuerzos realizados para intentar mejorar la recuperación limitada tras una lesión, sólo un enfoque terapéutico combinatorio de múltiples objetivos debería ser eficaz para la complejidad de la naturaleza de la lesión de la médula espinal. Aprovechando una plataforma de descubrimiento de fármacos para larvas de pez cebra, en el presente documento se identifica que Eletriptan Hbr tiene propiedades de recuperación locomotora en un modelo proregenerativo y se ha confirmado que tiene un efecto conservador en un modelo de contusión (profibrótica) de roedores. Este enfoque permitió identificar una nueva indicación terapéutica prometedora para Eletriptan Hbr, que asociada con una estrategia terapéutica combinatoria y enfoques de ingeniería innovadores, muestra un gran potencial para la recuperación de lesiones de la médula espinal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Hidrobromuro de eletriptán para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende hidrobromuro de eletriptán para su uso como un medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora.
Antecedentes de la técnica
Conduciendo a disfunción motora, sensorial y autonómica, la lesión de la médula espinal (SCI) causa un traumatismo neurológico que afecta a millones de personas en todo el mundo, volviéndose urgente desarrollar estrategias efectivas de reparación de la médula espinal para uso clínico1. La fisiopatología de la SCI se puede dividir en mecanismos primarios y secundarios de lesión. La lesión primaria ocurre debido a la disrupción mecánica de los tejidos de la médula espinal que induce alteraciones en axones, vasos sanguíneos y membranas celulares, llevando a una pérdida inmediata de tejido neural y desmielinización2-4 Después de que ocurra el traumatismo inicial, la lesión secundaria ocurre debido a varios mecanismos, a saber, la disrupción de la barrera hematoespinal (BSCB) que conduce a la infiltración de células inflamatorias, la liberación de citocinas inflamatorias y la liberación desproporcionada de neurotransmisores excitatorios que conducen a excitotoxicidad e isquemia2356. Por lo tanto, el daño secundario es multifactorial y se caracteriza por la presencia de inflamación que puede causar gliosis reactiva, edema, cicatrización glial/axonal y cavidad central5-7.
Una lesión de SCI madura muestra tres compartimentos principales de tejido: un núcleo de la lesión/cicatrización fibrótica con tejido no neural, una cicatrización astrocítica que rodea el núcleo de la lesión y un área circundante con tejido neural preservado que es funcional pero reactivo8. De hecho, la cicatrización de SCI conduce a respuestas reparativas (que son esenciales para prevenir la propagación del daño celular) y respuestas perjudiciales (que limitan el regeneración y la reparación del tejido) que cambian con el tiempo y están definidas por la ubicación espacial con respecto a la lesión9101112. De hecho, después de la lesión, los astrocitos reactivos no solo forman una cicatrización glial que limita la expansión de la lesión, confinando la inflamación al epicentro de la lesión, sino que también limitan e inhiben la regeneración axonal913. Además, la microglía/macrófagos permiten la plasticidad fenotípica y también producen factores citotóxicos que causan una respuesta proinflamatoria prolongada y exagerada que empeora el daño de la lesión (es decir, el daño secundario)914. Además, los oligodendrocitos y las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) pueden morir por apoptosis o necrosis, pero también logran la diferenciación y la remielinización91516. Por lo tanto, dado el complejo entrelazamiento entre múltiples tipos de células, el microambiente intracelular y extracelular, la abolición completa de uno de estos tipos de células o respuestas no es efectiva para la reparación de SCI91718. Se necesitan estrategias terapéuticas combinadas y dependientes del tiempo para preservar las propiedades beneficiosas de la cicatrización de SCI, mejorando sus respuestas reparativas, al mismo tiempo que se enfocan en los aspectos negativos91119.
Las opciones de tratamiento, ya sean estándar o experimentales, han tenido un éxito limitado en proporcionar a los pacientes gravemente afectados una buena recuperación neurológica y funcional. Ghosh y Pearse (2015) sugieren que las vías glutaminérgicas, NA, DA y 5-HT están involucradas en la iniciación y regulación de la locomoción y que el trabajo experimental proporciona evidencia de la contribución de 5-HT en la regulación del ritmo y coordinación de movimientos a través del generador de patrones central. Experimentos con el agonista no selectivo del receptor 5-HT quipazina muestran una inducción de movimientos tipo locomotores en presencia de los antagonistas selectivos de 5-HT2 SB204741 y SB242084. Ghosh y Pearse no divulgan Eletriptán, un agonista del receptor 5-HT 1B/1D, utilizado solo sin antagonistas de 5-HT2, en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y la mejora de la función locomotora. Eletriptán es un fármaco de la clase de los triptanes, divulgado por primera vez en el documento WO92/06973 (Pfizer) como agonista del receptor 5-HT 1B/1D para el tratamiento de la migraña y para la prevención de la recurrencia de migraña. El documento WO92/06973 no divulga el uso de Eletriptán en lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora.
El documento US2013274235A1 divulga composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades degenerativas de las neuronas motoras mediante la administración de un agente que aumenta la expresión de IGF-II y/o guanina desaminasa, siendo el hidrobromuro de eletriptán uno de los agentes seleccionados. Las enfermedades degenerativas de las neuronas motoras somáticas, en el ámbito de este documento, se seleccionan del grupo que consiste en: esclerosis lateral amiotrófica (ELA), parálisis bulbar progresiva, atrofia muscular espinal y bulbar, parálisis pseudobulbar, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular progresiva (PMA), atrofia muscular espinal y síndrome pospoliomielítico. Enfermedades no degenerativas de las neuronas motoras, como la lesión de la médula espinal y la mejora de la función locomotora, no se mencionan en el grupo cerrado de enfermedades del documento referido. Además, en el presente documento no hay indicios que apunten al uso del hidrobromuro de eletriptán en la terapia de otras enfermedades de las neuronas motoras que no sean las mencionadas anteriormente.
Documento de Zhang, Bei y otros. "Reducing age-dependent monocyte-derived macrophage activation contributes to the therapeutic efficacy of NADPH oxidase inhibition in spinal cord injury". Brain, Behaviour, and Immunity 76, (2019) 139-150, divulga un tratamiento para lesiones de la médula espinal dependientes de la edad que resulta en efectos neuroprotectores al bloquear la neuroinflamación excesiva a través de la mediación de la oxidasa de NAPDH en la producción de especies reactivas de oxígeno de macrófagos derivados de monocitos, mejorando así la recuperación locomotora y anatómica. Este documento no menciona el tratamiento de lesiones de la médula espinal que no dependen de la edad, como las lesiones resultantes de traumatismo e inflamación. Además, dicho documento tampoco menciona el uso de hidrobromuro de eletriptán en dicha terapia.
Resumen
La presente se refiere a una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora.
En una primera forma de realización, la presente invención divulga una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal.
En una segunda forma de realización, se divulga una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de la función locomotora tras una lesión de la médula espinal.
La tercera forma de realización se refiere a una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento, en la terapia de la función locomotora tras una lesión de la médula espinal, donde la lesión de la médula espinal está en fase subaguda.
La cuarta forma de realización se refiere a una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal en la modulación de la inflamación asociada con la lesión de la médula espinal.
Una quinta forma de realización divulga una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal en la protección contra la fuga microvascular en el tejido de la médula espinal.
En una sexta forma de realización, se divulga una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal en la reducción de hemorragias asociadas con la lesión de la médula espinal.
En una séptima forma de realización, se divulga una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal, en donde la administración de dicha composición farmacéutica se da a un sujeto 1 hora después de la lesión.
En una octava forma de realización, se divulga una composición farmacéutica para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal, en donde el sujeto es un vertebrado de sangre caliente, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.
Divulgación/Descripción Detallada
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal y mejora de la función locomotora.
Como se utiliza en este documento, lesión de la médula espinal (SCI) se refiere al daño en cualquier parte de la médula espinal o nervios resultante de un traumatismo (e.g., un accidente automovilístico) o de una enfermedad o degeneración (por ejemplo, cáncer), que causa cambios temporales o permanentes en su función. Los síntomas pueden incluir pérdida parcial o completa de la función motora, sensorial o autonómica en las partes del cuerpo servidas por la médula espinal por debajo del nivel de la lesión. La lesión de la médula espinal más grave afecta los sistemas que regulan el control intestinal o de la vejiga, la respiración, la frecuencia cardíaca y la presión arterial. La mayoría de los pacientes con lesión de la médula espinal experimentan dolor crónico.
Como se utiliza en este documento, los términos "sujeto", "huésped" y "paciente" se utilizan indistintamente. Como se utiliza en este documento, un sujeto es preferiblemente un mamífero, como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, ratones, etc.) o un primate (por ejemplo, monos y humanos), más preferiblemente un humano.
Como se utiliza en este documento, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agente (por ejemplo, una cantidad de una composición farmacéutica que comprende Eletriptán Hbr para su uso en la invención) que proporciona al menos un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de la enfermedad o trastorno objetivo, cuando se administra a un sujeto que padece dicha enfermedad o trastorno. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva con respecto a un agente para su uso en la invención significa esa cantidad de agente solo, o cuando se combina con otras terapias, que proporciona al menos un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de la enfermedad o trastorno.
"Administrar" se refiere a la introducción física de un agente en un sujeto, utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de entrega conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las rutas de administración ejemplares para los compuestos divulgados en este documento incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, espinal u otras rutas parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en este documento, significa modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye inyecciones y infusiones intravenosas, intramusculares, intratecales, intralesionales, intracapsulares, intradérmicas, intraperitoneales, subcutáneas, subcapsulares, subaracnoideas, intraspinales, epidurales e intrasternales, así como electroporaciónin vivo.
En algunas formas de realización, el compuesto se administra a través de una ruta no parenteral, e.g., oralmente. Otras rutas no parenterales incluyen una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasalmente, sublingualmente o tópicamente. La administración también puede realizarse, por ejemplo, una vez, varias veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
Una estrategia valiosa para acelerar el descubrimiento de nuevos tratamientos para uso clínico es el proceso de encontrar nuevos usos para medicamentos existentes, es decir, una estrategia de reposicionamiento de fármacos20. De hecho, los medicamentos que originalmente demostraron tener un efecto terapéutico en una enfermedad podrían ser potencialmente eficaces en otra y, como los medicamentos ya han pasado por pruebas preclínicas y clínicas, esta estrategia permite tiempos de desarrollo más cortos, menores costos, menores riesgos y tasas de éxito más altas2021. Los peces cebra están emergiendo como un modelo vertebrado particularmente versátil para cribados de fármacos directos y rentables2022-24.
Para lograr los resultados divulgados en este documento, los inventores utilizaron una plataforma de cribado de fármacos en larvas de pez cebra previamente desarrollada en su laboratorio para identificar nuevas moléculas con propiedades terapéuticas para la indicación de SCI e identificaron el Eletriptán Hbr con propiedades de recuperación motora.
El Eletriptán Hbr es un fármaco aprobado por la FDA con afinidad altamente selectiva por el subtipo de receptor 5-hidroxitriptamina 1 B/D (5-HT1<b>/1<d>)y F(5-H<t>1<f>)para el tratamiento de las crisis de migraña2526 y, se divulga en este documento por primera vez una nueva posible indicación terapéutica para el uso de esta molécula. Se siguió una estrategia de reposicionamiento, aprovechando la larva de pez cebra (modelo prorregenerativo) como una plataforma de cribado de fármacosin vivopara identificar el Eletriptán Hbr y luego confirmamos la conservación del efecto terapéutico en un modelo de contusión en ratones (modelo profibrótico) demostrando su capacidad para mejorar la reparación funcional de la médula espinal.
Métodos
Declaración de ética
Todos los experimentos que involucran animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea (Directiva 2010/63/UE), la ley portuguesa sobre el cuidado de los animales (DL 113/2013) y fueron aprobados por el Comité Interno del Instituto de Medicina Molecular (ORBEA) y el Comité Portugués de Ética Animal (DGAV). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y para disminuir el sufrimiento de los animales utilizados en la presente divulgación.
Animales
Modelo de SCI en pez cebra:
Tg(mnxt:GFPml2), abreviado como hb9:GFP, se mantuvieron y criaron en condiciones constantes, siguiendo las directrices estándar para el cuidado y mantenimiento de los peces27. Larvas de pez cebra se utilizaron en el cribado fenotípico para SCI.
Modelo de SCI en ratón:
Se utilizaron ratones hembra adultos C57BL/6J (8-10 semanas de edad; Charles River) en este estudio. Los ratones se alojaron de tres a cuatro por jaula y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con comida y aguaad libitumdurante la duración del estudio.
Un cribado fenotípico para SCI
Se utilizó un cribado fenotípico en larvas de pez cebra para cribar un grupo de compuestos de una biblioteca de pequeñas moléculas (PHARMAKON 1600 - MicroSource Discovery Systems, Inc., EE.UU.) como se describió anteriormente por Diana et al. 201928. En resumen, se permitió que las larvas de pez cebra se desarrollaran en EM con 1 |jM de azul de metileno hasta los 5 días posteriores a la fertilización (dpf). A los 5 dpf, se transectaron las médulas espinales de las larvas de pez cebra a nivel del poro anal (Diana et al. 2019). A 1 dpi, las larvas se distribuyeron aleatoriamente en placas de 6 pozos que contenían EM 10 mM de HEPES y se expusieron durante 24 horas a los compuestos químicos añadidos al medio. A 2 dpi, se realizó una evaluación del comportamiento utilizando DanioVision™ (Noldus Information Technology, Países Bajos), un sistema automatizado de seguimiento para larvas de pez cebra. Se permitió que las larvas nadaran libremente en una placa de 96 pozos (1 larva/pozo) con EM 10 mM de HEPES y su actividad de nado se rastreó durante 90 minutos, bajo ciclos de luz-oscuridad de 10 minutos (es decir, 3 ciclos de luz y 3 ciclos de oscuridad). Los datos de seguimiento adquiridos se analizaron utilizando el software Ethovision X.T. 10 (Noldus, Wageningen, Países Bajos) y solo se analizó la actividad de nado obtenida en los 3 períodos de oscuridad29.
Lesión por Contusión de la Médula Espinal y Cuidados Postoperatorios
Se realizó una lesión de tipo contusión moderada-severa en ratones hembras adultas C57BL/6 (10-12 semanas) con un impactador Infinite Horizon (PSI)30. Todas las cirugías se realizaron en condiciones asépticas. Brevemente, bajo anestesia profunda con Ketamina y Xilazina (120 mg/kg y 16 mg/kg respectivamente, i.p.), los ratones recibieron una laminectomía dorsal a nivel de la 9a vértebra torácica (T9). Después de asegurar los procesos laterales de la 8a vértebra torácica (T8) y la 10a vértebra torácica (T10) con una punta de impactador de acero inoxidable, se aplicó un impacto controlado de fuerza definida de 75 kdynes en la médula espinal expuesta2830. Luego, el músculo y la piel se cerraron con suturas absorbibles de ácido poliglicólico (PGA) de 4.0 (Safil, G1048213). En este estudio, se excluyeron los ratones cuando el valor de desplazamiento real estaba fuera del intervalo de 500-700 pm o si la fuerza real después del impacto era >2SD 75 Kdynes. Inmediatamente después de la lesión, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 0,5 ml de solución salina estéril y luego diariamente durante 5 días. Durante este experimento, los ratones se sometieron a la expresión suave de la vejiga dos veces al día hasta que pudieran orinar por sí mismos. El peso se monitoreó diariamente hasta los 15 días posteriores a la lesión (dpi) y luego semanalmente durante la duración del estudio y se proporcionó un suplemento dietético de pellets de alto contenido calórico (Supreme Mini-Treats™ S05478 y S05472), ya que típicamente se observó una pérdida de peso del 10 % en este modelo de SCI tras la lesión.
Tratamiento farmacológico en el modelo de SCI en ratón
La dosis de Eletriptán Hbr (Sigma-Aldrich, PZ0011) utilizada fue equivalente a la dosis de mercado humana31 y todas las dosis de tratamiento se asignaron utilizando un sistema codificado para mantener las mediciones con doble ocultación. Este código solo se reveló al final de todas las pruebas de comportamiento. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en cada grupo experimental (SCI Vehículo y SCI Eletriptán Hbr). El vehículo y el Eletriptán Hbr se administraron mediante inyección intraperitoneal (i.p.), comenzando 1 hora después de la lesión (hpi) y luego diariamente hasta los 15 dpi.
Evaluación de la Escala Basso para Ratones(BMS)
La locomoción en campo abierto se evaluó con el sistema de puntuación de BMS3032. El campo abierto utilizado era una plataforma redonda con 85 cm de diámetro y 30,5 cm de altura, ubicada en una sala de pruebas tranquila con iluminación normal. Los ratones se habituaron a la plataforma de prueba durante 5 minutos diarios durante 2 semanas antes de la cirugía. La prueba BMS (puntuación y subpuntuación de BMS) se realizó como se describió anteriormente2830. Brevemente, los ratones se evaluaron antes de la cirugía, para obtener valores de locomoción preoperatoria de referencia, donde se espera un valor máximo de puntuación de BMS. Para determinar la recuperación funcional después del tratamiento, la puntuación de BMS de cada ratón se evaluó a 1, 3, 7, 14 dpi y luego semanalmente hasta el final de los experimentos. La evaluación de la puntuación y subpuntuación de BMS siempre fue realizada por dos evaluadores que desconocían los grupos de tratamiento y calificaron la locomoción de las extremidades traseras durante 4 minutos por ratón. Si las puntuaciones diferían entre los evaluadores, la puntuación final tomada era el promedio de ambas puntuaciones.
Ensayo de evaporación de acetona
Se utilizó un ensayo de evaporación de acetona para medir la sensibilidad a un estímulo frío tras una lesión33. Primero, los ratones se acostumbraron a la plataforma con una malla de alambre durante 4 minutos y luego se aplicó una gota de 50 pl de acetona en la superficie plantar de la pata trasera utilizando una jeringa de 1 ml. Se realizaron cinco ensayos en cada pata trasera con un intervalo de 2 minutos entre ellos. En cada ensayo, se midió con un cronómetro y se registró el tiempo que el ratón pasaba moviendo o lamiendo la pata trasera durante 60 segundos, para su análisis 34
Perfusión y procesamiento de tejidos
Al final de las pruebas de comportamiento, se realizó una perfusión transcardíaca en los ratones con una solución de NaCl al 0,9 %, seguida de paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 0,1 M con un pH de 7,4. Después de un enjuague durante la noche en PBS, las médulas espinales se crioprotegieron durante 3 días en sacarosa al 30 % y luego se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek, EE.UU.) en bloques desde 3 mm rostral al epicentro de la lesión hasta 3 mm caudal (6 mm en total). Luego, cada bloque se cortó en secciones transversales (10 |jm) con un criostato, se montaron en portaobjetos en 10 conjuntos alternos y se almacenaron a -20 °C hasta su uso cuando se necesitaron35,36.
Inmunohistoquímica
Para la inmunohistoquímica en secciones, se eliminó el OCT de las secciones criostáticas utilizando PBS (30 minutos). Las secciones se lavaron con PBS-Tritón X-100 al 0,5 % y se bloquearon en solución de bloqueo (suero de cabra al 5 % en PBS con 0,1 % de Tritón X-100) durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, las secciones de la médula espinal se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios anti-GFAP (1:500; ThermoFisher Scientific, 13-0300), anti-PDGFRp (1:200; Abcam, ab32570), anti-CD31 /PECAM-1 (1:100; RD Systems, AF3628), anti-F4/80 (1:500; Abcam, ab6640) y anti-P2Y12 (1:500; AnaSpec AS-55043A), se lavaron en PBS-Tritón X-100 al 0,1 %, PBS y se volvieron a incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpos secundarios AlexaFluor 568 (1:500; ThermoFisher Scientific, A11011 o A11057), AlexaFluor 488 (1:500; ThermoFisher Scientific, A11006 o A11008). Para la cuantificación de microglía activada, las secciones se tiñeron con DAPI. Luego, las secciones se lavaron en PBS y se montaron en un medio de montaje fluorescente con DABCO.
Tinción de FluoroMyelin verde y análisis de conservación de materia blanca.
Para cuantificar la desmielinización, un conjunto de secciones espaciadas a una distancia de 100 jm y que abarcaban todo el bloque se tiñó con FluoroMyelin™ verde (ThermoFisher Scientific, F34651) durante 1 hora. Se adquirieron composiciones de imágenes en Z-stack en un microscopio de fluorescencia invertido motorizado de campo amplio (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss Microlmaging) con un aumento de 10x. Se utilizó el software Fiji para medir el área de sección transversal de la conservación de materia blanca (WMA, por sus siglas en inglés) y el área de sección transversal total de la sección de tejido (TCA, por sus siglas en inglés), y luego se calculó el área de sección transversal proporcional (WMA/TCA) desde 1100 jm rostral al epicentro de la lesión hasta 1100 jm caudal. El epicentro se identificó como la sección de tejido con la menor área de materia blanca teñida de verde fluorescente en el borde, que se identificó como la sección con el menor valor de WMA/TCA. El análisis de las lesiones se realizó mediante secciones codificadas y por un investigador que desconocía los grupos de tratamiento o resultados36. Cuantificación de la cicatrización fibrótica
Un conjunto de secciones se tiñó con anti-PDGFRp y anti-GFAP para delinear el borde del área de cicatrización fibrótica. Se adquirieron composiciones de imágenes en Z-stack en un microscopio de fluorescencia invertido motorizado de campo amplio (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss Microlmaging) con un aumento de 20x. Se utilizó el software Fiji para delinear manualmente y calcular el área de PDGFRp+ y el área de sección transversal total y después cuantificar el porcentaje de área de cicatrización fibrótica por área de sección transversal total. Las extensiones rostral y caudal de la lesión fibrótica se determinaron mediante inspección. La longitud de la lesión fibrótica y la extensión de la expresión de PDGFRp+ se calcularon multiplicando el número de secciones que contenían tejido con un núcleo fibroso o una regulación positiva de la expresión de PDGFRp+ (respectivamente) por la distancia entre cada sección (100 jm).
Cuantificación de microglía activada
Para cuantificar la microglía activada, un conjunto de secciones de la médula espinal se tiñó con anti-P2Y12 (un marcador específico de microglía) y anti-F4/80 (un marcador de macrófagos general) y se contratiñó con DAPI. Se adquirieron composiciones de imágenes en Z-stack en un microscopio de fluorescencia invertido motorizado de campo amplio (Zeiss Cell Observer, Carl Zeiss Microlmaging) con un aumento de 20*. El número de células se cuantificó utilizando un software personalizado Multichannel Cell counter4TIFF que calculaba el número de células F4/80+ y P2Y12+ después de establecer manualmente un valor de umbral y parámetros.
Análisis estadístico
Todas las representaciones gráficas y el análisis de datos del modelo de SCI en larvas de pez cebra se realizaron utilizando el software Prism 8 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Las pruebas estadísticas utilizadas fueron bilaterales. Las comparaciones de medias entre los diferentes grupos del estudio de SCI en pez cebra se realizaron utilizando la prueba t de Student para datos independientes con corrección de Welch. El análisis de datos del modelo de SCI en ratones se realizó utilizando el análisis de varianza (ANOVA) de dos vías o el análisis de varianza de dos vías con medidas repetidas seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni utilizando SigmaPlot 14. Se consideró significativo un valor de P < 0,05. Todos los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Resultados
Eletriptán Hbr rescata las deficiencias locomotoras en un modelo de lesión medular transectada en larvas de pez cebra.
Para acelerar el descubrimiento de posibles nuevos tratamientos para la lesión de la médula espinal (SCI), utilizamos un ensayo fenotípico que permitió el cribado de un grupo de compuestos químicos de una biblioteca de pequeñas moléculas aprobadas por la FDA. En este cribado basado en fenotipos, administramos con ocultación los compuestos químicos (25 j M) a 1 día después de la lesión (dpi) y realizamos la evaluación conductual 24 horas después (es decir, a 2 dpi) como se describió anteriormente por Chapela D. et al. en 2019. Las pequeñas moléculas se seleccionaron con ocultación en primer lugar, si había una mejora estadísticamente significativa en la distancia total recorrida y/o en los parámetros del ángulo de giro, que se eligieron como indicadores de la función locomotora. Luego, redujimos la selección a través de criterios de exclusión definidos (patentados o con indicación terapéutica reportada para SCI; con toxicidad importante reportada o si no puede cruzar la barrera hematoencefálica). Cabe destacar que Eletriptán Hbr fue uno de los candidatos más prometedores identificados a través de esta plataforma de descubrimiento de fármacos. Eletriptán Hbr es conocido como un fármaco triptán de segunda generación para el tratamiento de las crisis de migraña con o sin aura en adultos humanos y, curiosamente, mostró rescate de las deficiencias locomotoras en este modelo de lesión medular transectada en larvas de pez cebra (Figura 1 A, A'), convirtiéndose en un candidato terapéutico prometedor para SCI que debe probarse en un modelo de SCI en mamíferos.
Eletriptán Hbr mejora la función motora de ratones con lesión de tipo contusión en T9
Para validar el efecto terapéutico de Eletriptán Hbr para la indicación de SCI en un modelo no regenerativo, se decidió probar su eficacia en un modelo de SCI en roedor. Por lo tanto, se realizó una lesión de tipo contusión en ratones hembra C57BL/6, utilizando un impactador Infinite Horizon (IH) y la prueba de Escala de Basso para Ratones (BMS) para evaluar el rendimiento locomotor de los animales después de la lesión. Primero, los ratones se habituaron a la plataforma de campo abierto y después de 15 días se lesionaron con una contusión moderadasevera en T9 (75 kdyne) (Figura 2A). Inmediatamente después de la lesión y tras los criterios de exclusión biomecánica, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en cada grupo experimental (SCI Vehículo y SCI Eletriptán Hbr). Las dosis de tratamiento (Vehículo o Eletriptán Hbr) se administraron mediante inyección intraperitoneal (i.p.), comenzando 1 hora después de la lesión (1 hpi) y luego diariamente hasta 15 dpi (Figura 2A). No hubo diferencias en la fuerza de lesión o el desplazamiento aplicado por el impactador IH entre los grupos experimentales SCI Vehículo y SCI Eletriptán Hbr (Figura 4). Para la evaluación de la recuperación locomotora tras la lesión, se midieron las puntuaciones y subpuntuaciones de BMS durante 42 días (Figura 3B-B'). Los promedios de las puntuaciones de BMS en los ratones tratados con Eletriptán Hbr y en los tratados con Vehículo aumentaron después de 1 dpi y alcanzaron un punto máximo entre 28-35 dpi y 21-28 dpi, respectivamente. Las puntuaciones de BMS en los ratones tratados con Eletriptán Hbr fueron consistentemente pero no significativamente más altas en el tiempo en comparación con los ratones tratados con Vehículo (Figura 3B). Notablemente, uno de los trece ratones tratados con Eletriptán Hbr alcanzó una puntuación de BMS de 6 (es decir, mostró pisadas plantares frecuentes con cierta coordinación entre las extremidades delanteras y traseras) y los doce restantes alcanzaron una puntuación de BMS de 5 (es decir, mostraron pisadas plantares frecuentes o consistentes) a 42 dpi. En el mismo punto temporal, las puntuaciones de BMS de los ratones tratados con Vehículo fueron de 4-5, con tres animales de nueve que solo lograron una pisada plantar ocasional. Además, el 85 % de los ratones tratados con Eletriptán Hbr también mostraron pisadas plantares frecuentes con colocación paralela de ambas patas traseras en el contacto inicial y el 23 % mostraron una colocación paralela de al menos una de las patas traseras en el despegue.
Los promedios de subpuntuaciones de BMS fueron consistentemente más altos en los ratones tratados con Eletriptán Hbr que en los tratados con Vehículo desde 7 hasta 42 dpi, volviéndose significativamente más altos desde 35 dpi (Figura 3B') hasta 42 dpi (Figura 3B'). A 42 dpi, ocho de los nueve ratones tratados con Vehículo mostraron una inestabilidad severa del tronco como inclinación, balanceo o casi colapso de las extremidades traseras y solo un animal adquirió una estabilidad leve del tronco. Además, los ratones tratados con Eletriptán Hbr mostraron menos eventos que bloquean el movimiento de caminar, como espasmos y caídas, y el 46 % de los animales de este grupo experimental adquirió una estabilidad leve del tronco (Figura 3C).
Adicionalmente, también evaluamos el estado de disfunción de la vejiga, que es un efecto común observado después de una SCI337. Durante la expresión manual de la vejiga, atribuimos una puntuación de 0 (vejiga normal sin orina, es decir, animales con capacidad de vaciado propia) a 3 (vejiga grande con una gran cantidad de orina retenida). Los ratones tratados con Eletriptán Hbr mostraron volúmenes estadísticamente significativos menores de orina retenida (es decir, puntuaciones menores) a 1 dpi, sin embargo, este efecto se perdió después de este punto temporal, sin diferencias entre los grupos experimentales hasta el final del estudio (Figura 3D).
La alodinia al frío se define como la hipersensibilidad, una respuesta dolorosa a un estímulo frío normalmente no nocivo que comúnmente se asocia con SCI33. En este estudio, la sensibilidad a un estímulo frío se evaluó utilizando la prueba de evaporación de acetona a 14 dpi y 42 dpi, cuantificando el número de episodios y la duración de las respuestas nociceptivas desencadenadas por el enfriamiento por evaporación. El promedio de los ratones tratados con Eletriptán Hbr mostró consistentemente, pero no significativamente, una disminución del tiempo de reacción acumulado y un menor número de episodios de hipersensibilidad al frío en comparación con los ratones tratados con Vehículo (Figura 3E, E').
Eletriptán Hbr parece prevenir la desmielinización cerca de las extensiones terminales de la lesión
Para analizar el efecto de Eletriptán Hbr en el estado de desmielinización tras la lesión, se comparó el área de sustancia blanca preservada por área total de corte transversal entre los grupos experimentales (SCI+ Eletriptán Hbr y SCI+Vehículo), utilizando una tinción fluorescente de mielina FluoroMyelin™ verde (Figura 5A). Los promedios de sustancia blanca preservada por área total de corte transversal en los ratones tratados con Eletriptán Hbr no fueron significativamente pero consistentemente más altos que en los tratados con Vehículo en el epicentro de la lesión y también a lo largo de 700 pm rostral y caudalmente desde el epicentro de la lesión (Figura 5B).
La extensión de los niveles aumentados de expresión de PDGFR-p se reduce por el tratamiento con Eletriptán Hbr El compartimento fibrótico de la cicatrización está constituido por un subconjunto de células perivasculares PDGFRp+ que crea un núcleo de células similares a fibroblastos y una densa deposición de moléculas de matriz extracelular37. Además, como se demostró recientemente que la reducción de la cicatrización derivada de los pericitos promueve la recuperación funcional tras una lesión medular en ratones37, se decidió analizar el efecto de Eletriptán Hbr en el estado de la cicatrización fibrótica evaluando el área y la longitud de la cicatrización fibrótica. Para este análisis, se realizó una doble inmunohistoquímica con GFAP, que permitió delinear el límite glial de la cicatrización, y con el marcador de pericitos PDGFRp para etiquetar el elemento fibrótico de la cicatrización (Figura 6A-C, 6A'- C', 6A''- C''). Con este enfoque, fue posible delinear el compartimento de la cicatrización fibrótica, midiendo su área en el epicentro de la lesión y definiendo la extensión, en longitud, del núcleo de la lesión PDGFRp+ así como la extensión de niveles aumentados de inmunotinción PDGFRp+ en comparación con los niveles de tinción PDGFRp+ en ratones de control. En el epicentro de la lesión, no hubo diferencias estadísticamente significativas en el área del núcleo de la lesión fibrótica entre los ratones tratados con Eletriptán-Hbr y los tratados con Vehículo a 42 dpi. Aunque no hubo diferencias estadísticamente significativas en la extensión del núcleo de la lesión PDGFRp+ entre los grupos de tratamiento con Vehículo y Eletriptán Hbr, hubo una reducción estadísticamente significativa en la extensión de niveles aumentados de inmunotinción PDGFRp+ en ratones tratados con Eletriptán Hbr en comparación con ratones tratados con Vehículo (Figura 6D-F).
El tratamiento con Eletriptán Hbr reduce la extensión del tejido con números anormales de células PDGFRp+ asociadas con la vasculature
Para inferir si los niveles aumentados de PDGFRp+ detectados en las extremidades de las extensiones de la lesión estaban asociados con vasos sanguíneos, decidimos realizar una doble inmunohistoquímica utilizando un marcador de pericitos PDGFRp y un marcador de células endoteliales CD31 (PECAM-1) (Figura 7). En secciones a 1000 pm del epicentro, la expresión aumentada de PDGFRp detectada en ratones tratados con Vehículo y que se redujo en ratones tratados con Eletriptán Hbr, estaba asociada con células endoteliales CD31+ (Figura 7A-C''').
La microglía se ve afectada por Eletriptán Hbr
Se sabe que la microglía es crucial para la reparación de SCI. Sin microglía, se potencian la desmielinización y los infiltrados patológicos de MDM, se interrumpe la formación de la cicatrización glial y se agravan las deficiencias motoras38. En este contexto, se decidió evaluar el efecto de Eletriptán Hbr en el estado de la microglía tras la lesión realizando una doble inmunohistoquímica con P2Y12 (un marcador de microglía) y F4/80 (un marcador de macrófagos general). La microglía P2Y12+ mostró una morfología ramificada con procesos largos en ratones de control, mientras que en ratones tratados con Vehículo, la microglía mostró procesos más cortos que se detectaron escasamente en el epicentro de la lesión (Figura 8A-C''). En ratones tratados con Vehículo, se detectó poca microglía P2Y12+ en el epicentro de la lesión y, cuando estaba presente, la microglía se observaba principalmente en racimos en los márgenes de la lesión o en la sustancia blanca preservada con una forma ameboide (Figura 8B, B''; 8C, C''). Los ratones tratados con Eletriptán Hbr también mostraron microglía en racimos con una forma ameboide y procesos más cortos en los márgenes de la lesión o en la sustancia blanca preservada, pero en algunas secciones, cerca del epicentro o en el epicentro, también se observaron procesos más largos y ramificados; característica que no se observó en ratones tratados con Vehículo (Figura 8B, B''; 8C, C''). En secciones a 1000 pm del epicentro, la microglía P2Y12+ estaba presente en toda la materia gris y blanca, mostrando una morfología con algunos procesos más cortos y una forma más reactiva (principalmente en el lado dorsal de la médula espinal) en la materia gris tanto en ratones tratados con Vehículo como en ratones tratados con Eletriptán Hbr en comparación con los animales de control (Figura 8A, A'; 8B, B''; 8C, C''). No hubo diferencias estadísticamente significativas en el número de células microgliales P2Y12+ F4/80+ (microglía activada) pero este número fue consistentemente más alto en ratones tratados con Eletriptán Hbr a 400 pm rostral y caudalmente al epicentro (Figura 8D).
La lesión de la médula espinal (SCI) tiene una naturaleza muy compleja. Es bien sabido que el mejor sistema para investigar el potencial de compuestos que interferirán con procesos fisiológicos complejos es evaluar su efectoin vivoy la larva de pez cebra se ha convertido en un modelo vertebrado particularmente versátil para los cribados de fármacos fenotípicosinvivo2022.
En este documento se identifica por primera vez un compuesto prometedor con propiedades de rescate de SCI, de una biblioteca de pequeñas moléculas aprobadas por la FDA utilizando un cribado fenotípico en larvas de pez cebrain vivo(es decir, utilizando un modelo proregenerativo) que se estableció previamente en nuestro laboratorio28.
Luego, validamos y evaluamos la conservación del efecto terapéutico de este compuesto en un modeloin vivode contusión (profibrótico) de SCI en ratones.
Desde nuestra plataforma de descubrimiento de fármacos en pez cebra previamente validada, seleccionamos Eletriptán Hbr como uno de los candidatos más prometedores con potencial de recuperación de la médula espinal que rescata las deficiencias motoras tanto en los parámetros de distancia total recorrida como en el ángulo de giro. Es importante destacar que las mejoras manifestadas en los parámetros de distancia total y ángulo de giro no solo mostraron que Eletriptán Hbr rescata la capacidad de nado de las larvas con SCI, sino que también pareció mejorar el control de la dirección motora, respectivamente.
Después de la selección de Eletriptán Hbr con este enfoque de pez cebra, este compuesto se administró diariamente durante la fase aguda y subaguda de la lesión, comenzando 1 hora después de la lesión (hpi) y luego diariamente hasta 15 días después de la lesión (dpi), en un modelo de ratón con contusión en T9. Por lo tanto, no solo se confirma que Eletriptán Hbr tiene un efecto conservado en la mejora del comportamiento locomotor en un modelo profibrótico, sino que también fue posible evaluar su efecto en el estado de desmielinización, la formación de cicatrización fibrótica y en el proceso inflamatorio a 42 dpi. Es importante destacar que este punto temporal constituye una fase crónica en roedores, donde estaban presentes la astrogliosis reactiva y la inflamación impulsada por macrófagos/microglía9
Es notable que Eletriptán Hbr mejoró significativamente el rendimiento locomotor en la evaluación BMS y demostró mejorar la estabilidad del tronco de los ratones y reducir el número de eventos severos. Además, la administración de Eletriptán Hbr disminuyó consistentemente pero no significativamente el tiempo de reacción acumulado y redujo el número de episodios de hipersensibilidad al frío en la prueba de evaporación de acetona, mostrando que quizás este compuesto podría disminuir la alodinia al frío en el contexto de SCI. De hecho, a pesar de utilizarse en varios estudios para medir la sensibilidad al frío, la prueba de evaporación de acetona tiene varias limitaciones, a saber, la dificultad para asegurar que se aplique consistentemente la cantidad exacta de acetona en cada ocasión variando el estímulo frío3339. Este método es simple de realizar pero solo cuantifica la magnitud de las respuestas en lugar de medir la temperatura mínima de frío que promueve una respuesta39.
A veces en humanos, la extensión de las deficiencias funcionales no siempre se correlaciona con la extensión del daño tisular. De hecho, un tipo de lesión por contusión a menudo conduce a la pérdida completa de la movilidad y sensibilidad a pesar de la presencia de tejido preservado en la lesión40. Aunque no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de tratamiento, Eletriptán Hbr mostró promover una mayor preservación de la mielina de manera consistente cerca de las extensiones terminales de la lesión.
Tras una SCI, se forma una cicatrización fibrótica que es inhibidora para la regeneración axonal y, al mismo tiempo, limita la infiltración de células inmunitarias en el parénquima de la médula espinal41. Es importante destacar que la inhibición moderada de la cicatrización derivada de los pericitos no solo preserva la curación de heridas y reduce la inflamación y la astrogliosis reactiva, sino que también permite la regeneración axonal y mejora la recuperación funcional37.
Es interesante destacar que en este documento se divulga que Eletriptán Hbr redujo significativamente la extensión de niveles aumentados de inmunotinción PDGFRp+ pero no el área o extensión del núcleo de la lesión fibrótica PDGFRp+ en el epicentro de la lesión.
Como se divulga en la presente invención, los niveles aumentados de PDGFRp+ detectados en las extremidades de las extensiones de la lesión estaban asociados a los vasos sanguíneos, lo que sugiere que Eletriptán Hbr redujo la extensión del tejido lesionado con un aumento en el número de células PDGFRp+, específicamente las PDGFRp+ asociadas con células CD31+ y probablemente tiene un efecto sobre el estado isquémico.
En respuesta a una lesión, la microglía se activa y permite la regeneración de axones cortados a través de la liberación de factores neurotróficos y la eliminación de restos38. Sin embargo, la secreción de citocinas inflamatorias y la producción de radicales libres también podrían promover neurotoxicidad38.
Debido al papel crucial de la microglía en la reparación y recuperación de SCI, los inventores decidieron investigar el efecto de Eletriptán Hbr en el proceso inflamatorio. Curiosamente, los ratones tratados con Eletriptán Hbr mostraron tener microglía con una morfología más similar a la característica de una microglía moderadamente activada, mostrando hipertrofia con procesos más cortos38. De hecho, aunque se observó microglía con forma ameboide en racimos, algunos ratones mostraron procesos más largos y ramificados en secciones de la médula espinal cerca del epicentro de la lesión. Esto no se observó en ratones tratados con Vehículo, donde solo se detectó microglía fuertemente activada con morfología ameboide, lo cual es característico de una respuesta inflamatoria molecular robusta9.
Eletriptán Hbr es un agonista del receptor de serotonina con alta afinidad por los receptores 5-HT1B, 5-HT1D y 5-HT1F, conocido por su eficacia clínica significativa en el tratamiento de la migraña25. Es notable que en este documento se divulga, por primera vez, una nueva indicación para Eletriptán Hbr, mostrando sus propiedades de recuperación locomotora en dos modelos animales de SCI diferentes (un modelo proregenerativo transectado y un modelo profibrótico contusionado). En última instancia, Eletriptán Hbr en una terapia combinada con otras moléculas y asociada con enfoques de ingeniería e intervenciones específicas dependientes del tiempo tiene un gran potencial en el contexto de SCI.
Varias características se describen a continuación que pueden utilizarse de forma independiente entre sí o con cualquier combinación de las otras características. Sin embargo, cada característica individual puede no abordar ninguno de los problemas discutidos anteriormente o puede abordar solo uno de los problemas discutidos anteriormente. Algunos de los problemas discutidos anteriormente podrían no ser completamente abordados por ninguna de las características descritas en este documento. Aunque se proporcionan encabezados, la información relacionada con un encabezado particular, pero que no se encuentra en la sección con ese encabezado, también puede encontrarse en otra parte de la descripción.
Descripción breve de las figuras
Para facilitar la comprensión de esta invención, se adjuntan figuras en el anexo que representan las formas preferidas de implementación, que sin embargo no pretenden limitar la técnica divulgada en este documento.
La Figura 1 muestra el rescate de las deficiencias locomotoras por Eletriptán Hbr. Rendimiento locomotor representado a partir de la distancia total recorrida (A) y el ángulo de giro (B) en larvas de pez cebra transectadas tratadas con Eletriptán Hbr, seleccionado de la biblioteca de compuestos químicos aprobados por la FDA, en comparación con larvas lesionadas tratadas con vehículo (n = 16 larvas). Se presenta la media ± s.e.m. *p < 0,05, ***p < 0,001, prueba t de Student con corrección de Welch.
La Figura 2 ilustra el diseño experimental de la eficacia del tratamiento con Eletriptán Hbr durante 15 días en un modelo de roedor con SCI, mostrando la recuperación locomotora de ratones con SCI con 15 días de tratamiento tras una lesión de tipo contusión en T9.
La Figura 3 muestra, siguiendo el diseño experimental de la figura 2 - (B) Puntuaciones de BMS de ratones tratados con Eletriptán Hbr comparados con ratones tratados con Vehículo desde 1 hasta 42 dpi. n = 9 para SCI Vehículo y n = 14 para SCI Eletriptán Hbr (n=13 para SCI Eletriptán Hbr después de 21 dpi) (B') Subpuntuaciones de BMS de ratones tratados con Eletriptán Hbr comparados con ratones tratados con Vehículo desde 1 hasta 42 dpi. Se presenta la media ± s.e.m. *p < 0,05, ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de corrección post-hoc de Bonferroni. (C) Porcentaje (%) de animales (42 dpi) de ratones tratados con Vehículo y ratones tratados con Eletriptán Hbr con deficiencias en el rendimiento locomotor como espasmos, caídas y eventos de escoliosis, así como con la capacidad de recuperar una estabilidad leve del tronco, que se observaron durante la prueba BMS. n = 9 para SCI Vehículo y n = 13 para SCI Eletriptán Hbr (D) Evaluación de la función de la vejiga atribuyendo una puntuación a la cantidad de orina recogida durante la expresión manual de la vejiga. Se presenta la media ± s.e.m. *p<0,05, ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de corrección post-hoc de Bonferroni. n = 9 para SCI Vehículo y n = 14 para SCI Eletriptán Hbr (n=13 para SCI Eletriptán Hbr después de 21 dpi) (E) Tiempo de reacción acumulado de respuestas nociceptivas desencadenadas por el enfriamiento por evaporación de acetona (E') Número de episodios de hipersensibilidad al frío. (E-E') n = 8 para SCI Vehículo y n = 11 para SCI Eletriptán Hbr a 14 dpi y n = 9 para<s>C<i>+ Vehículo y n = 13 para SCI Eletriptán Hbr a 42 dpi.
La Figura 4 ilustra la fuerza de impacto y el desplazamiento entre los grupos experimentales. (A) Fuerza de impacto (kdyne) aplicada sobre la médula espinal durante la SCI (ns - no significativo, prueba t de Student con corrección de Welch). (B) Desplazamiento (pm) de la punta del impactador después del contacto con la médula espinal durante la SCI (ns - no significativo, prueba t de Student con corrección de Welch). n=9 para ratones tratados con Vehículo y n=14 para ratones tratados con Eletriptán Hbr.
La Figura 5 muestra la preservación de la materia blanca en ratones tratados con Vehículo y ratones tratados con Eletriptán Hbr a los 42 días después de la lesión. (A) Secciones representativas de la médula espinal de ratones tratados con Vehículo comparados con ratones tratados con Eletriptán Hbr teñidas con FluoroMyelin verde. (B) Área de la materia blanca por área total de corte transversal desde el epicentro hasta 1100 pm en los lados rostral y caudal en ratones tratados con Vehículo y en ratones tratados con Eletriptán Hbr. ANOV<a>de dos vías seguido de corrección post hoc de Bonferroni. n = 8 para SCI Vehículo y n = 12 para SCI Eletriptán Hbr. La Figura 6 muestra la evaluación de la cicatrización fibrótica a 42 dpi. (A-C'') Imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones de la médula espinal que muestran astrocitos GFAP+ (verde) (A'-C'), pericitos/fibroblastos PDGFRp+ (magenta) (A''-C'') y el canal de fusión (A-C) en el epicentro de la lesión y a 1000 pm rostral y caudalmente al epicentro en ratones de control, ratones tratados con vehículo y ratones tratados con Eletriptán Hbr, respectivamente. Las cabezas de flecha blancas muestran la expresión de PDGFRp en el lado dorsal de la médula espinal a 1000 pm rostral y caudalmente al epicentro. (D-F) Representaciones gráficas del porcentaje del área del núcleo de la lesión fibrótica por área total de corte transversal (D), longitud de la lesión fibrótica (E) y la extensión (en longitud) del tejido lesionado donde es visible una sobreexpresión de PDGFRp (F) en ratones tratados con Vehículo (n = 8) y en ratones tratados con Eletriptán Hbr (n = 12). *p < 0,05, prueba t de Student con corrección de Welch. Barra de escala: 150 |jm.
La Figura 7 muestra células PDGFRp+ asociadas con la vasculatura en una sección de médula espinal de un ratón tratado con Vehículo a 1000 jm del epicentro. (A) Imagen representativa de inmunofluorescencia de una sección de la médula espinal mostrando pericitos/fibroblastos PDGFRp+ (verde), células endoteliales CD31 (magenta) y el canal de fusión con DAPI a 42 dpi. (B'-B'” ) Imágenes ampliadas de la sección de la médula espinal del área ROI B. (C'-C'” ) Imágenes ampliadas de la sección de la médula espinal del área ROI C. Las cabezas de flecha blancas muestran la presencia de PDGFRp+ asociadas a células CD31+. Barra de escala: 150 jm (A) y 100 jm (B'-C''').
La Figura 8 muestra la respuesta inflamatoria a 42 dpi. (A-C'') Imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones de la médula espinal que muestran macrófagos F4/80+ (verde) (A'-C'), microglía P2Y12+ (magenta) (A''-C'') y el canal de fusión (A-C) en el epicentro de la lesión, a 400 y 1100 jm rostral y caudalmente al epicentro en ratones de control, ratones tratados con vehículo y ratones tratados con Eletriptán Hbr, respectivamente. Las cabezas de flecha blancas muestran la expresión de F4/80 y los marcos semiblancos muestran la expresión de P2Y12 en el lado dorsal de la médula espinal a 1100 jm rostral y caudalmente al epicentro. (D) Conteos de células microgliales activadas P2Y12+ F4/80+. n = 8 para SCI Vehículo y n = 12 para SCI Eletriptán Hbr. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de Bonferroni. Barra de escala: 150 jm
Las formas adecuadas de administración de composiciones farmacéuticas que comprenden Eletriptán Hbr incluyen formas administradas por vía oral y formas administradas por vía parenteral, que incluyen inhalación, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa y administración intradérmica.
Las composiciones farmacéuticas de la invención para uso en administración oral pueden proporcionarse en forma de comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina blanda y/o gránulos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender Eletriptán Hbr mezclado con uno o más diluyentes inertes, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen almidón, celulosa, sacarosa, lactosa y sílice.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden además comprender una o más sustancias además de diluyentes, como lubricantes, agentes colorantes, recubrimientos o barnices.
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Claims (12)
1. Una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal.
2. Una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según la reivindicación 1, que comprende Hidrobromuro de Eletriptán mezclado con uno o más diluyentes inertes seleccionados entre almidón, celulosa, sacarosa, lactosa y sílice.
3. Una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según la reivindicación 1 o 2 , que además comprende una o más sustancias seleccionadas entre lubricantes, agentes colorantes, recubrimientos o barnices.
4. Una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según las reivindicaciones 1 a 3 en la forma adecuada para administrarse oralmente, y mediante administración parenteral, que incluye inhalación, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa y administración intradérmica.
5. Una composición farmacéutica que comprende Hidrobromuro de Eletriptán para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según la reivindicación 4, que se presenta en forma de comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina blanda y/o gránulos para administración oral.
6. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento en la terapia de la función locomotora de lesión de la médula espinal según la reivindicación 1 , en donde la terapia de lesiones de la médula espinal es de la función locomotora de lesión de la médula espinal.
7. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, en donde la lesión de la médula espinal está en fase aguda o subaguda.
8. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 -3 para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la modulación de la inflamación asociada con la lesión de la médula espinal.
9. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 -3 para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la protección contra la fuga de microvasculatura en el tejido de la médula espinal.
10. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 -3 para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la reducción de hemorragias asociadas a la lesión de la médula espinal.
11. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 o 10, en donde la administración de dicha composición se realiza a un sujeto 1 hora después de la lesión.
12. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como medicamento en la terapia de lesiones de la médula espinal según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 u 11 , en donde dicha composición debe administrarse, en donde el sujeto es un vertebrado de sangre caliente, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un sujeto humano.
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