WO2017015774A1 - Metodo para el tratamiento del dolor mediante la intervencion de panexinas espinales - Google Patents

Metodo para el tratamiento del dolor mediante la intervencion de panexinas espinales Download PDF

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WO2017015774A1
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panexin
10panx
rats
neuropathic
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PCT/CL2016/050042
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Luis CONSTANDIL CORDOVA
David Bravo Lopez
Alejandro HERNANDEZ KUNSTMANN
Teresa PELISSIER SERRANO
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Universidad De Santiago De Chile
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Definitions

  • IASP International Association for the Study of Pain
  • pain is an unpleasant sensory and emotional experience that is triggered by current or potential tissue damage or described in terms of such damage.
  • a series of consecutive events will occur that will be able to alert the brain that a certain body area has been damaged.
  • various molecules from the lysed cells are released locally, as well as new substances synthesized at the site of the lesion, and some of these molecules (globulins, arachidonic acid, histamine, serotonin, substance P, H + , among others) interact directly with membrane proteins expressed in free nerve endings present in virtually all tissues (Woolf CJ & Ma, Q. Nociceptors - noxious stimulus detectors.
  • the generated action potential is conducted through medium and small caliber nerve fibers ( ⁇ and C fibers, respectively) to the dorsal horn of the spinal cord. In this area they synapse with second-order neurons, which project to different nuclei of the thalamus through two different pathways, one direct to the thalamus (spinothalamic tract) and another indirect (spinoreticulothalamic tract) that includes synapse in the reticular formation of the trunk encephalic. Axons originate from the thalamus to the primary somatosensory cortex and to the insular cortex, generating the conscious sensation of damage (Basbaum AL Bustlsta, DM, Scherrer, G. & Jullus D. Cellular and molecular mechanlsm of paln. Cell. 2009: 139: 267-284).
  • This type of pain, transient and dependent on the Initial lesion, is known as acute pain.
  • this type of pain is called chronic pain and is considered pathological (Sandkühler J. Models and mechanlsms of hlperalgesla and allodynla, Physlologlcal revlews. 2009; 89: 707-758), 2009).
  • Chronic pain does not have a protective function and more than a symptom is, in itself, a pathology.
  • Chronic pain is currently a public health problem, affecting, for example, about 100 million US citizens every year, with an associated cost of USD $ 635 billion a year (IOM, 201 1).
  • IOM International Health Organization
  • various therapeutic strategies (pharmacology, surgeries, stem cells, etc.); however, these have limited effectiveness and various effects collateral
  • many of the adaptive changes that occur in the neural and glacial substrates of the nociceptive system in response to episodes of chronic pain are still unknown. This makes it essential to investigate new components of pain conduction pathways that explain chronic pain from new points of view.
  • panexin channel and any of its isoforms emerges as an interesting candidate, mainly because it has been described as a central element within the establishment of pathological neuronal plasticity in processes such as epilepsy, ischemia and neuroinflammation.
  • Panexin is a membrane glycoprotein expressed in various cell types in chordates and invertebrates, belonging to the family of cleft junctions (or gap junctions), which has 3 isoforms: panexin 1, panexin 2 and panexin 3 (Bruzzone R., Hormuzdi SG, Barbe MT, Herb A, Monyer H. Pannexins, a family of gap junction proteins expressed in brain. Proc. Nati. Acad. Sci. 2003; 100: 13644-13649).
  • panexin does not form cleft joints in vivo (Sosinsky GE, Boassa D, Dermietzel R, Duffy HS, Laind DW, MacVicar B, Naus CC, Penuela S, Scemes E, Spray DC, Thompson RJ , Zhao HB, Dahl G.
  • Pannexin channels are not gap junction hemichannels, Channels (Austin), 201 1; 5: 193-197; Locovei S, Bao L, Dahl G. Pannexin 1 in erytrocites: function without a gap. Proc. Nati. Acad. Sci.
  • This protein is expressed in a large number of tissues. Particularly interesting is its expression in the central nervous system (CNS), because it is located in all its cell types (microglia, astrocytes, oligodendrocytes and neurons) (Huang Y, Grinspan JB Abraham CK & Scherer S S. Pannexin 1 is expressed by neurons and gl ⁇ a but does not form functiuonal gap junctions Glia 2007; 55: 46-56; Ray AG Zoidl, s Weickert, P Wahle, R Dermietzel Site-specific and developmental expression of pannexin 1 in the mouse nervous system Eur. J. Neurosci. 2005 ; 21: 3277-3290).
  • CNS central nervous system
  • panexin transcripts have been found in the cerebellum, cerebral cortex, retina, interneurons of the cerebral cortex; in hippocampus, tonsil, black substance, olfactory bulb, among many other structures (Bruzzone R, Hormuzdi Sg, Barbe Mt, Herb A, Monyer H. Pannexin a family of gap junction protins expressed in brain. Proc Nati Acad Sci 2003; 100.13644- 13649; Dvoriantchikova D, Ivanov Y, Panchin VJ, Shestopalov Expression of pannexin family of protein in the retin.
  • Panexinal more widely described in the literature is the release of ATP to the extracellular medium in favor of its concentration gradient, in astrocytes and microglia (Garré JM, Retamal MA, Cassina P, Barbeito L, Bukauskas F, Saez JC, Abudara V FGF-1 nduces ATP relée from spinal astrocytes in culture and opens pannexin and connexin hemichannels. Proceedings of the National Academy of Sciencies.
  • Pannexin 1 the molecular substrate of astrocyte "hemichannels"
  • panexin is an important component in various pathological states of the brain, such as signal enhancement in hippocampal glutamatergic synapses in epilepsy, in the pathophysiology of neuronal death in ischemia, in neuroinflammation processes and dysfunctions of neuronal excitability in general (Burnstock G, Krügel U, Abbracchio MP & lles P Purinergic signalling: from normal behinho to pathologial brain function. Progress in neurobiology, 201 1; 96: 229-274; Velasquez S & Eugenin EA Role of Pannexin-1 hemichannels and purigenic receptors in teh pathogenesis of human diseases. Frontiers in physiology 2014; 5-96).
  • the present invention provides a method for treating pain in humans and animals by manipulating the panexin channel in the spinal cord. More particularly, this invention presents and claims the panexin channel as a pharmacological target and seeks to protect the concept of intervening in this target, with various blocking agents. As it has been widely described in the literature, there are an infinity of drugs that are involved in pain management, targeting specific pharmacological targets and are protected by patents. Some will be mentioned in this brief review of the state of the art.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • ibuprofen a nonsteroidal anti-inflammatory drug
  • 2- (4-isobutylphenyl) propionic whose international common name is ibuprofen, an inhibitor of the enzyme cycloxygenase II.
  • ibuprofen has many advantages over other pain relievers such as aspirin and paracetamol, but it is very poorly soluble in water and for this reason, several patents have addressed this problem.
  • US4309421 describes water-soluble complexes of ibuprofen and phospholipids suitable for parenteral administration
  • US4859704 and US4861797 describe the synthesis of alkali metal salts of ibuprofen to prepare a liquid ibuprofen formulation.
  • lidocaine protected in patent EP1291039
  • antiepileptics such as carbamazepine (protected in CA 1328219 C)
  • tricyclic antidepressants initially protected under US5086063
  • anticomiciales such as phenytoin, under the application WO 1989005641 A1.
  • GABA receptor gamma-aminobutyric acid
  • gabapentin and pregabalin are frequently used (which also interact with another pharmacological target, voltage-dependent calcium channels of type N, protected by US4024175), topiramate (Application EP1364649A1) and levetiracepam ( US4943639).
  • serotonin An important molecule in the circuitry of pain is serotonin. In pain conditions, serotonin allows modulating the hyperactivity of neurons. In this sense, the pharmacological target is the serotonin transporter and the compounds that inhibit it and are used in depressive conditions and in neuropathic pain. Of these, tricyclic antidepressants are the most effective, such as venlafaxine, bicidafine and duloxetine (US5362886).
  • NMDA membrane receptor antagonists (ketamine, nemantine) have not shown greater analgesic efficacy, probably because their side effects have represented a limiting factor.
  • NMDA membrane receptor antagonists ketamine, nemantine
  • a novel pharmacological target is the N-type calcium channels and their blockers, which produce analgesia in neuropathic pain models.
  • One of the most commonly used drugs, approved by the FDA, is the intradural ziconotide for compassionate use in patients refractory to other treatments (US6054429).
  • adrenergic a2 blockers clonidine
  • substance P substance P
  • others related to cholecystokinin, nociceptin and bradikinin adrenergic a2 blockers
  • Cannabinoid agonists, corticosteroids and neurotrophic antagonists such as tumor growth factor (NGF) also have a place.
  • NGF tumor growth factor
  • all these drugs fail to complete lasting relief.
  • the efficacy of the previously mentioned drugs is close to 70% and the remainder lacks relief. Therefore, discovering new pharmacological targets for the treatment of pain is essential.
  • panexins have not been patented either as a target or as a pharmacological strategy.
  • HIV EP2603587A1
  • cerebral ischemia WO201 1054820A1
  • WO 20131 1 1014 A2 inflammatory bowel disease
  • cancer WO2012013609A1
  • this application seeks to protect the use of in vitro panexins for the diagnosis of these neurological disorders. Finally, this application seeks to protect the intervention of panexins and their ability to form channels using various compounds capable of intervening.
  • the present invention unlike the cited application, claims the use of neuronal panexins, but not of the hippocampus but of the spinal cord; In addition, he claims the use of panexins in other marrow cell lineages. Another portentous difference is the fact that the aforementioned application claims the use of neuronal panexins in all neurological disorders where this protein is found; however, the present invention only focuses on acute and chronic pain particularly.
  • the application cited here is also directed to methods for selecting, in vitro or in vivo using an animal model, compounds useful for prevention and / or treatment, in mammals, neurological disorders by modifying the capacity to form channels of panexins but, unlike the application analyzed, this invention claims the use of spinal cord panexins in the context of acute and chronic pain in all cell lineages involved, that is, neurons, microglia, astrocytes and oligodendrocytes. This invention, therefore, constitutes a powerful novelty and the first approach to a new pain relief strategy.
  • the present invention provides a method of treating pain in mammals, which comprises administering to said individual compounds that act as an inhibitor of panexin function, including probenecid, carbenoxolone and 10panx.
  • the present invention provides a method for inhibiting the transmission of acute and chronic pain through the interaction of panexins. neuronal, microglial, astrocytic or ollgodendrocytes, with a compound that acts as an inhibitor of the activity of this channel, or as a modifier of its signaling, an inhibitor of its expression or a blocker of panexlna traffic to the plasma membrane, Including probenecld, carbenoxolone, probenecld and 10 panx.
  • the panexlna activity inhibitor can be an organic or synthetic pharmaceutical molecule, such as carbenoxolone, probenecld, flufenamic acid, mefloqulna, among others, which have been described and grouped in a recent literature review (Dahl et al., 2013 ).
  • panexlna Inhibitor compound one that interferes with the panexlna expression process, such as a sIRNA or a miRNA.
  • the panexlna Inhibitor compound can be an inhibitor of its function, by binding of anti-panexin antibodies or their fragments with the protein, generating an allosteric hindrance.
  • the panexlna function inhibitor can also be a compound that interacts or interferes with the coupling between neighboring panexlnas or in its pore, such as peptides or amino acid sequences of the panexlna structure, such as the 10panx peptide, or those that They interfere with the function of other receptors that interact with panexin, such as purlnergic receptors or the NMDA receptor.
  • Figures 1 A - 1 C show the effect of intrathecal administration (I.t) of
  • Figure 1 A and 1 B illustrates the data processing to determine the spinal cord Wind Up scores in animals injected with saline or 300 ⁇ / L 10panx.
  • the responses were provoked in animals adulterated by repetitive electrical stimulation (1 Hz) of the second and third fingers of the anterior leg (circles) and T minutes later (squares).
  • the responses were integrated and graphed against the stimulus number and the curves were normalized so that before injecting the animals, the gain of reflex in the seventh stimulus represented an increase of 100%.
  • the slopes of the regression lines of minimum squares represent the Wlnd Up scores.
  • T 15 minutes; that is, the data was taken before and 15 minutes after the It Injection of the saline solution or 10 panx.
  • SEM standard error of the average
  • Figure 1 C shows the time course of Wlnd Up activity (percentage change) after It administration of the saline solution (circles) or 300 ⁇ / L, 10panx (squares) in neuropathic rats (closed symbol) and adulterated (open symbols).
  • Figure 2A shows the time course of Wind Up activity (percentage change) after intrathecal administration of saline solution (squares) or 100 ⁇ / L Cbx (triangles up) in adulterated rats (open symbols) and neuropathic (closed symbols).
  • Figure 2B shows the time course of Wind Up activity (percentage change) after intrathecal administration of saline solution (squares) or 150 mmol / L Prb (downward triangles), in adulterated rats (open symbol) and Neuropathic (closed symbols).
  • Figures 3A-3E shows the effect of intrathecal administration of 10panx on the withdrawal threshold of neuropathic and adulterated control rats.
  • Figures 3A-3C shows the time course of changes in the mechanical nociceptive threshold (g / cm 2 ) of neuropathic rats 10 days after surgery. The surgery was performed at time 0 (down arrow).
  • FIGURES 4A-4E shows the effect of administration of carbenoxolone (Cbx) or probenecid (Prb) on the withdrawal threshold of neuropathic or adulterated control rats.
  • Figures 4A-4C shows the time course of changes in the mechanical nociceptive threshold (g / cm 2 ) of neuropathic rats 10 days after surgery. The surgery was performed at time 0 (down arrows).
  • Figure 5A-5C shows a quantification of panexin protein by a westernblot, which demonstrates the levels of panexin expression in the spinal cord.
  • the present invention provides a method of treating pain in mammals, which comprises administering to an individual suffering from pain compounds inhibitors of panexin function including carbenoxolone, probenecid and 10panx.
  • the present invention provides a method for inhibiting the transmission of acute and chronic pain through the interaction of neuronal panexins, microglial, astrocytic or ollgodendrocytes, with compounds that inhibit the activity of this channel including carbenoxolone, probenecid and 10panx.
  • panxl channels play a significant role in neuropathic pain because (9 blocking the panxl channels with 10panx, CBx or intrathecal Prb significantly decreased Wind Up activity in both neuropathic and adulterated rats; ( ii) 10 intrathecal panx, Cbx or Prb decreased mechanical hyperalgesia in neuropathic rats without affecting mechanical nociception and adulterated animals; and (iii) the panxl protein was expressed in the dorsal antenna of the lumbar spinal cord of neuropathic and adulterated rats.
  • Neuropathy was induced in 225-250 gram male Sprague-Dawley rats by using a modified rat model with controlled nerve injury from Decosterd and Woolf (Descosterd I, Woolf CJ, Spared nerve injury.
  • An animal model of persistent peripheral neuropathic pain PAIN 2006; 122: 17-21) which resulted in early, prolonged and robust changes in mechanical sensitivity and thermal response of many features that closely resemble clinical neuropathic pain.
  • 2 of the 3 terminal distal branches of the sciatic nerve were axotomized (tibial and common perineal nerves), control 1 (sural nerve) while in the model of this case, only the sural nerve was transected, controlling the tibial and common perineal nerves.
  • the animals were anesthetized with 400 mg / kg ip of 7% doral hydrate solution (w / v), After shaving the right hind leg at the level of the sciatic nerve, an incision in the skin of approximately 10 mm long was made. The subcutaneous tissue was dissected the biceps femoris muscle was released from the pelvic and vertebral heads to expose the sciatic nerve. The nervous route was then followed until its division into 3 branches: the sural, common perineal and tibial nerves. The sural nerve was cut 2 mm from its emergence and the overlapping tissues were sutured in layers.
  • the animals were daily supplied with 3 mg / kg of the analgesic ketoprofen and 5 mg / kg sc of the antimicrobial agent enrofloxacin.
  • the neural lesion described above resulted in mechanical hyperalgesia of the leg that persisted for at least 28 days.
  • Control (adulterated) rats received similar surgery without rupture of the sural nerve.
  • panxl channels of the lumbar spinal cord were challenged with the 10panx peptide (Trp-Arg-CIn-Ala-Ala-Phe-Val, Asp-Ser -Tyr), a mimetic peptide of the first extracellular loop domain of panxl (Pelegrin O, Supernant A.
  • Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1 beta relay by the ATP-gated P2X7 receptor, EMBO J 2006; 25: 5071 -82.
  • panxl channel blockade For the electrophysiological study of the effect of panxl channel blockade on C Wind Up activity, a single injection of 10 ⁇ it of 300 umol / L, 10 panx, 100 ⁇ / L Cbx and 150 ⁇ / L Prb or saline solution were administered to control adulterated neuropathic animals. Single doses of 10 panx, Cbx and Prb were adapted from the studies of_Thompson RJ, Jackson MF, Olah ME, Rungta RI, Hi ⁇ es DJ, Beazely MA, MacDonald JF, MacVicar BA, Activation of pannexin-1 hemmichannels augments aberrant bursting in the hippocampus.
  • Injections in the subarachnoid space were made by applying a brief anesthetic with isoflurane (2 minutes), by percutaneous injection between the lumbar vertebra L5 and L6, and evidenced by the smooth movement of the rat's tail resulting from mechanical stimulation when the needle penetrates the meninges of the spinal cord (Mestre C, P réellesier T, Fialip J, Wilcox G, Eschalier A, A method ro perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 1994; 32: 197-200).
  • the rats were euthanized with an overdose of doral hydrate (1 g / kg ip).
  • Reflex C was triggered in the right hind limb of anesthetized rats with 1.5% to 1.8% isoflurane in oxygen using a modified rodent facial mask on the latex diaphragm as previously described in Smith JC, Bolon B, Isoflurane leakage from non-rebreathing rodent anaesthesia circuits: comparison of emissions from conventional and modified ports. Lab Anim 2006; 40: 200-9.
  • the rectangular electrical pulses of supramaximal resistance and the duration of 2 milliseconds were applied every 10 seconds to the receptive field of the common peroneal and tibial nerve by means of 2 stainless steel needles inserted in the skin of the second and third toe of the leg (Grass S1 1 stimulator equipped with an isolated SIU 5 stimulus unit and a Grass CCU 1 A constant current unit; Astro-Med, West Warwick, RJ).
  • the reflex response evoked from fiber C was Registered muscle biceps femorls psllateral when using another for stainless steel needles.
  • Wind Up consists of a noticeable increase that It depends on the frequency of the stimulus of the integrated electromyographic response. All responses were stored on a hard disk for later analysis. The regression lines of minimum squares were fixed between the experimental points that show only the tendency of the increase (before saturation of the Wind Up in the seventh stimulus), discarding the remaining points (Origin 6.0 software; Microcal Software, Northampton, MA) as described in Constandil L, Hernández A, Pelissier T, Arriagada O, Espinoza K, Burgos H, Laurido C.
  • the stimulation current required for threshold activation of reflex C was lower in neuropathic rats than in adulterated control animals (3.8 ⁇ 2.1 mA versus 8.3 ⁇ 1.5 mA, respectively); consequently, the Wind Up series in neuropathic rats was run with electrical intensities lower than the series in adulterated control animals, according to the protocol used (2 times the current of threshold stimulus).
  • the integrated C reflex responses were expressed in terms of the percentage variation compared to their previous condition (before the It Injection of the drug or saline solution) and normalized so that the responses caused by the seventh stimulus In animals injected with saline solution it represents an increase of 100% with respect to the baseline responses obtained before applying the Wlnd Up protocol (Flg. 1 A).
  • the rats received a single 10 ⁇ It injection of 10panx, Cbx, Prb or saline solution. 10panx was administered as a solution of 10, 30, 100 or 300 ⁇ / L.
  • Rats were sacrificed with an overdose of doral hydrate (1 g / kg, intraperonent, Ip).
  • the posterior quadrants of the spinal cord, the posterior quadrants of the lumbar spinal cord (level of vertebrae L1-L3) psllateral for the lesion, taking 5 normal animals and 5 neuropathic animals were homogenized in buffer of platelet agglutination Induced by rlstocetln (RIPA) containing 50 mmol / L Tris (pH 8.0), 150 mmol NaCI, 1% sodium dodecll sulfate (SDS), 1% Igepal CA_630, 0.5% sodium deoxycolate , 1 mmol / L NaF, 10 IM / ml fenllmetllsulfonll fluoride (PMSF), 1 mmol / L Na 3 V0 4 and Protease Inhibitor cocktail.
  • rlstocetln containing 50 mmol / L Tris (
  • the gel was transferred to the pollvlnlldeno difluoride membrane (PVDF, Blorad) and blocked in 5% (w / v) dry non-fat milk and 0.05% Tween 20, overnight.
  • the membranes were washed and incubated with secondary anti-rabbit antibody (Cerdalane, Burlington, ON, Canada) conjugated to horseradish peroxldasa.
  • the immunoreaction was detected with a klt of qulmlolumlnlscencla (Amersham Blosclences / GE Healthcare, Bale d'Urfe, QC, Canada). After the X-ray films were scanned, the signal intensities in the bands were analyzed with ImageJ Software (NIH, Bethdesda, MD).
  • FIG. 2 shows that 100 ⁇ / L Cbx (A) and 150 ⁇ Prb also resulted in significant decreases in Wind Up scores in neuropathic and adulterated rats (for both drugs, * p> 0.05, 2-way ANOVA followed by post hoc Bonferroni test).
  • panxl channels are involved in the mechanisms that highlight the phenomenon of Low Wind Up spinal cord not sensitive and sensitive, in rats.
  • the transection of the sural nerve resulted in long-lasting hyperalgesia for mechanical stimulation, as evidenced by a significant reduction in the threshold of withdrawal in the experimental groups.
  • the hyperalgesia state began 3 days after the transection of the sural nerve and lasted for at least 10 days (see Figures 3A and 4A, left panel, * p ⁇ 0.05, ANOVA two-way followed by Bonferroni post hoc test).
  • the withdrawal of the paw withdrawal threshold in the adulterated groups remained unchanged throughout the 10-day trial ( Figure 3B and 4B, left panel).
  • Panxl protein expression in the lumbar spinal cord of neuropathic and control rats was characterized by western blots with antibodies available commercially and normalized to ⁇ -actlna. Panxl runs like a 48KDa band. No significant difference in expression levels for the panxl protein was observed when comparing the normalized band densities for lumbar spinal cord of neuropathic and adulterated controls, thereby, neuropathic Injuria or affects panxl genetic or posttranslational regulation.
  • Figures 5A and 5B show a quantification of the expression of panexin protein by means of a western blot that demonstrates the levels of expression of panexin in the dorsal quadrant, ipsilateral to injury, of the lumbar spinal cord (segments L1-L5).
  • the typical bands for panexin (48 KDa) and for actin ⁇ (42 KDa) are shown in the figure on the left (1).
  • the bands of the neuropathic and normal control rats are observed, ten days after the transection of the sural nerve or a simulated surgery. Values are the mean ⁇ SEM of independent samples taken from the lumbar spinal cord of four rats in each group.
  • the graph on the right (2) shows the results of the densities of the standardized bands; Comparisons of neuropathic (N) and control group (C) animal data were performed using the two-tailed Student t-test for independent NS: non-significant data (P ⁇ 0.05), compared to control animals.
  • FIGS 1 A, 2A and 2B show the effect of 3 panexin blockers on spinal painful activity. Since the central sensitization (modification of the characteristics of neurons that participate in the conduction of painful information, where they increase their sensitivity) results from neuroplastic changes in the excitability of spinal cord pain transmission neurons, it was electrophysiologically tested , using the nociceptive C reflex paradigm, if different panexin 1 blockers could inhibit pain enhancement or wind up activity in neuropathic rats.
  • Wind Up is an increase in the excitability of spinal cord neurons evoked by electrical stimuli on nerve fibers that drive painful information, type C fibers. Wind up is an indicator of the activity of transmission-related neurons from pain. When the wind up is high it means that the pain neurons are very active, indicating that the individual suffers pain. When the wind up is reduced, it means that the activity of pain neurons is decreasing and, therefore, relieving it.
  • Figures 3A-4B show how the pain of a group of animals with peripheral nerve damage is relieved by the leg pressure test.
  • the transection of the aural nerve (9) resulted in an allodynia to mechanical stimuli, that is, pain generation in the face of an innocuous stimulus, such as pressing the leg (graphic on the left). This is evidenced by a significant reduction in the paw withdrawal threshold in the experimental groups (10).
  • the alodlnla began 3 days after sectioning the sural nerve and lasted for at least 10 days (P ⁇ 0.05, 2-way ANOVA followed by the post hoc Bonferronu test). In contrast, the paw withdrawal threshold in normal animal groups remained unchanged throughout the 10-day trial period (9a).

Abstract

La presente invención proporciona un método de tratamiento del dolor en mamíferos, que comprende administrar a un individuo que sufre dolor compuestos inhibidores de la función de panexina incluyendo carbenoxolona, probenecid y 10panx. Por otra parte, la presente invención proporciona un método para inhibir la transmisión del dolor 5 agudo y crónico mediante la interacción de panexinas neuronales, microgliales, astrocitarias o de los oligodendrocitas, con compuestos inhibidores de la actividad de este canal incluyendo carbenoxolona, probenecid y 10panx.

Description

METODO PARA EL TRATAMIENTO DEL DOLOR MEDIANTE LA INTERVENCION
DE PANEXINAS ESPINALES CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona, en general, con un método de tratamiento útil para el manejo del dolor en animales y humanos y, en particular, con la intervención de panexinas neuronales, microgliales o astrocitarias de la médula espinal, como estrategia terapéutica para la prevención y/o tratamiento del dolor agudo y crónico, en animales y humanos.
ANTECEDENTES
De acuerdo con International Asociation for the Study of Pain (IASP), el dolor es una experiencia sensorial y emocional de carácter desagradable que se desencadena por un daño tisular actual o potencial o descrito en términos de dicho daño. A consecuencia de esta lesión, ocurrirán una serie de eventos consecutivos que serán capaces de alertar al cerebro de que cierta zona corporal ha sido dañada. En efecto, frente a una lesión, se liberan localmente diversas moléculas provenientes de las células lisadas, así como nuevas sustancias sintetizadas en el sitio de la lesión, y algunas de estas moléculas (globulinas, ácido araquidónico, histamina, serotonina, sustancia P, H+, entre otras) interactúan directamente con proteínas de membrana expresadas en terminaciones nerviosas libres presentes virtualmente en todos los tejidos (Woolf C. J. & Ma, Q. Nociceptors - noxious stimulus detectors. Neuron, 2007; 55:353-364). El potencial de acción generado se conduce a través de fibras nerviosas de mediano y pequeño calibre (fibras Αδ y C, respectivamente) hasta el asta dorsal de la médula espinal. En esta zona hacen sinapsis con neuronas de segundo orden, las cuales proyectan a diversos núcleos del tálamo a través de dos vías diferentes, una directa al tálamo (tracto espinotalámico) y otra indirecta (tracto espinoreticulotalámico) que incluye sinapsis en la formación reticular del tronco encefálico. Desde el tálamo se originan axones hacia la corteza somatosensorial primaria y a la corteza insular, generándose la sensación consciente del daño (Basbaum A. L. Bustlsta, D. M., Scherrer, G. & Jullus D. Cellular and molecular mechanlsm of paln. Cell. 2009:139:267-284).
El rol fisiológico de estos mecanismos es alertar al Individuo frente a un daño real o potencial de los tejidos y alejarlo del foco que genera la noxa y, una vez que el daño tlsular ha sido reparado, el dolor desaparece.
Este tipo de dolor, transitorio y dependiente de la lesión Inicial, se conoce como dolor agudo. Por otro lado, cuando el dolor se prolonga en el tiempo aún después de que la lesión que lo originó ya ha sido reparada, o el dolor se genera sin un daño tlsular aparente, o cuando un cuadro doloroso se mantiene Insidiosamente en el tiempo, este tipo de dolor se denomina dolor crónico y es considerado como patológico (Sandkühler J. Models and mechanlsms of hlperalgesla and allodynla, Physlologlcal revlews. 2009; 89:707-758), 2009). El dolor crónico no posee una función protectora y más que un síntoma es, en sí mismo, una patología. Este tipo de dolor, suele ser refractarlo a los tratamientos utilizados en el dolor agudo y presenta síntomas psicológicos asociados tales como ansiedad, agresividad y depresión (Korff M. V. & Simón G., The relatlonshlp between paln and depresslon. Brltlsh Journal of Psychlatry. 1996; 168:101 -108). En las últimas dos décadas se ha descrito que tanto los astrocltos como mlcroglla participan en la transmisión slnáptlca noclceptlva espinal, adquiriendo relevancia principalmente en la modulación de la Información noclceptlva en el estado de dolor crónico (Cao H y Zhang Y Splnal gllal actlvatlon contrlbutes to pathologlcal paln states. Neuroscl Blobehav Rev. 2008; 32:972-983; O'Callagham y Mlller, 2010).
Actualmente el dolor crónico es un problema de salud pública, por afectar por ejemplo alrededor de 100 millones de ciudadanos estadounidenses cada año, con un costo asociado de USD $ 635 mil millones al año (IOM, 201 1 ). Para enfrentarlo, existen diversas estrategias terapéuticas, (farmacología, cirugías, células madres, etc.); sin embargo, estas presentan una efectividad limitada y diversos efectos colaterales. Además, muchos de los cambios adaptatlvos que ocurren en los substratos neurales y gllales del sistema nociceptivo en respuesta a episodios de dolor crónico aún son desconocidos. Esto hace imprescindible investigar nuevos componentes de las vías de conducción del dolor que expliquen al dolor crónico desde nuevos puntos de vista. En este sentido, el canal panexina y cualquiera de sus isoformas, surge como un interesante candidato, principalmente porque ha sido descrito como un elemento central dentro de la instauración de plasticidad neuronal patológica en procesos como la epilepsia, isquemia y neuroinflamación.
Panexina es una glicoproteína de membrana expresado en diversos tipos celulares en cordados e invertebrados, perteneciente a la familia de las uniones en hendidura (o gap junctions), que presenta 3 isoformas: panexina 1 , panexina 2 y panexina 3 (Bruzzone R., Hormuzdi SG, Barbe MT, Herb A, Monyer H. Pannexins, a family of gap junction proteins expressed in brain. Proc. Nati. Acad. Sci. 2003; 100:13644-13649). Inicialmente, estas proteínas fueron clasificadas como uniones en hendidura en vertebrados, por presentar homología de secuencia y similitudes estructurales con las inexinas, las cuales funcionan como uniones en hendidura en invertebrados (Panchin Y, Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S. A uniquitous family of putative gap injuction molecules. Curr Biol, 2000. 10:473-474). Sin embargo, la evidencia disponible sugiere fuertemente que panexina no forma uniones en hendidura in vivo (Sosinsky GE, Boassa D, Dermietzel R, Duffy HS, Laind DW, MacVicar B, Naus CC, Penuela S, Scemes E, Spray DC, Thompson RJ, Zhao HB, Dahl G. Pannexin channels are not gap junction hemichannels, Channels (Austin), 201 1 ; 5:193-197; Locovei S, Bao L, Dahl G. Pannexin 1 in erytrocites: function without a gap. Proc. Nati. Acad. Sci. 2006 ; 103:7655-7659; Dahl y Locovei, 2006), sino que su rol funcional en la membrana es el de un canal iónico. Se ha predicho una conformación hexamérica, con cuatro segmentos transmembrana, dos loops extracelulares y uno intracelular; con sus extremos N y C terminales intracelulares (Boassa D., Ambrosi C, Qiu F., Dahl G., Sosinsky G. Pannexin 1 channels contain a gkycosylation site that targets the hexamer to the plasma membrane,. J. Biol. Chem. 2007; 282:31733-31743; Panchin Y , Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S. A uniquitous family of putative gap injuction molecules. Curr Biol, 2000. 10:473-474; Yen M R & Saier Jr M H Gap junctional proteins of animáis: the innexin/pannexin superfamily. Progress in biophysics and molecular biology. 2007; 94:5-14).
Esta proteína se expresa en una gran cantidad de tejidos. Particularmente interesante resulta su expresión en el sistema nervioso central (SNC), por localizarse en todos sus tipos celulares (microglia, astrocitos, oligodendrocitos y neuronas) (Huang Y, Grinspan J B Abraham C K & Scherer S S. Pannexin 1 is expressed by neurons and glía but does not form functiuonal gap junctions Glia 2007; 55:46-56; Ray A G Zoidl, s Weickert, P Wahle, R Dermietzel Site-specific and developmental expression of pannexin 1 in the mouse nervous system Eur. J. Neurosci. 2005; 21 :3277-3290). Específicamente, se han encontrado transcritos de panexina en el cerebelo, corteza cerebral, retina, interneuronas de la corteza cerebral; en hipocampo, amígdala, sustancia negra, bulbo olfatorio, entre otras muchas estructuras (Bruzzone R, Hormuzdi Sg, Barbe Mt, Herb A, Monyer H. Pannexin a family of gap junction protins expressed in brain. Proc Nati Acad Sci 2003; 100.13644-13649; Dvoriantchikova D, Ivanov Y, Panchin V J, Shestopalov Expression of pannexin family of protein in the retin. FEBS Lett 2006:580:2178-2182; Ray et al, 2005; Ray A G Zoidl, S Weickert, P Wable, R Derietzel. Site-specific and developmental expression of pannexin in the mouse nervous system Eur J. Neurosci. 2005:21 :3277-3290; Ray A G Zoidl, P Wable, R. Dermietzel Pannexin Expression on the cerebellum. Cerebellum 2006; 5:189-192; Vogt A, Hormuzdi S G, Monyer H Pannexin 1 hemichannels and purinergic receptors in the pathogenesis of human diseases. Fronteirs in physiology. 2014:5-96). Existe en la literatura abundante evidencia respecto a las funciones fisiológicas y fisiopatológicas de este canal. La función de Panexinal más ampliamente descrita en la literatura es la liberación de ATP al medio extracelular a favor de su gradiente de concentración, en astrocitos y microglias (Garré J M, Retamal M A, Cassina P, Barbeito L, Bukauskas F, Saez J C, Abudara V FGF-1 nduces ATP reléase from spinal astrocytes in culture and opens pannexin and connexin hemichannels. Proceedings of the National Academy of Sciencies. 2010:107:22659-22664; Iglesias R, Dahl G, Qiu F, Spray D C & Scemes E Pannexin 1 : the molecular substrate of astrocyte "hemichannels" The Journal of Neuroscience, 2009a: 29:7092-7097; Samuels S E, Lipitz J B, Dahl G & Muller K J, Neuroglial ATP reléase through innexin channels controls microglial cell movement to a nerve injury. The Journal of general physiology. 2010:136:425-442; Dalh G y Keane, R W Pannexin : from discovery to bedside in 1 1 +4 years? Brain Res 2012:1487:150-159; Prochnow, N Relevance of gap injunction and large pore channels in traumatic brain injury. Front Physiol 2014;1 1 :5-31 ). Además, participa en la regulación del inflamosoma (Silverman W R de Rivero Vaccari J P, Locovei S, Qiu F Carlsson SK, Scemes E, Keane R W, Dahl G. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. J Biol Chem, 2009; 284:18143-19151 ) y ha sido vinculada al complejo de muerte neuronal asociado al receptor P2X7 (Gulbransen B D, Bashashati M, Hirota S A, Giu X, Roberts J A, Mac Donald J A, Sharkey K A Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nature Medicine, 2012: 18:600-604; Weilinger NL, Maslieieva V, Bialecki J Sridharan S S, Tang P L, Thompson R J, lonotropic receptors and ion channels in ischemic neuronal death and dysfunction. Acta Pharmacol Sin 2013; 34:39-48). Adicionalmente, diversas investigaciones sugieren que panexina es un componente importante en diversos estados patológicos del cerebro, como la potenciación de la señal en las sinapsis glutamatérgicas hipocampales en epilepsia, en la fisiopatología de la muerte neuronal en isquemia, en procesos de neuroinflamación y en disfunciones de la excitabilidad neuronal en general (Burnstock G, Krügel U, Abbracchio M P & liles P Purinergic signalling: from normal behavoir to pathologial brain function. Progress in neurobiology, 201 1 ; 96:229- 274; Velasquez S & Eugenin E A Role of Pannexin-1 hemichannels and purigenic receptors in teh pathogenesis of human diseases. Frontiers in physiology 2014; 5-96). Estas funciones fisiológicas y patológicas han sido recientemente recopiladas por Isakson B E, Thompson R J, Pannexin-1 as a potentiator of ligand-gated receptor signalling Channels (Austin) 2014; 27:8-22). Estos autores plantean que Panexinal funciona como un canal amplificador de la señal de otros receptores ionotrópicos y metabotrópicos. Al acoplarse, el canal funciona como una potenciador de la actividad de dichos receptores, contribuyendo así a diversos y abundantes procesos patológicos en el SNC, muchos de ellos aún no descritos (Isakson B E, Thompson R J, Pannexin-1 as a potentiator of ligand-gated receptor signalling Channels (Austin) 2014; 27:8-22).
Existen diversas formas de manejar el dolor en la actualidad, dados por métodos que interfieren algún procesos de la señalización del dolor, desde el sitio de la lesión hasta el cerebro. En este proceso intervienen diversas moléculas, señales intra y extracelulares, células, tejidos y estructuras nerviosas y del sistema inmunológico. A estos elementos, relacionadas con la transmisión de la señal del dolor, se denominarán por simplicidad de aquí en adelante "blancos farmacológicos". Estos blancos farmacológicos específicos, en sí mismos, no están afectos a ser protegidos mediante patentes. Sin embargo, los métodos y compuestos que manipulan la actividad de estos blancos, sí. En este contexto, la presente invención proporciona un método para tratar el dolor en humanos y animales mediante la manipulación del canal panexina en la médula espinal. Más particularmente, esta invención presenta y reivindica al canal panexina como un blanco farmacológico y procura proteger el concepto de intervenir a este blanco, con diversos agentes de bloqueo. Tal como ha sido ampliamente descrito en la literatura, existen una infinidad de fármacos que intervienen en el manejo del dolor, apuntando a blancos farmacológicos específicos y están protegidos por patentes. Algunos serán mencionados en esta breve revisión del estado del arte.
Uno de los blancos farmacológicos más intervenidos en el manejo del dolor son las moléculas que se generan periféricamente, en el sitio de la lesión. Un ejemplo de estos son los medicamentos de tipo antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como ibuprofeno. Los AINEs pueden ser muy eficaces en el tratamiento del dolor muscular y óseo agudo, así como algunos tipos de síndromes de dolor crónico. De hecho, son la primera línea de elección cuando se inicia un tratamiento de este tipo de dolor. Uno de ellos es el 2-(4-isobutilfenil) propiónico, cuya denominación común internacional es ibuprofeno, un inhibidor de la enzima cicloxigenasa II. Originalmente patentado en los años 1960, el ibuprofeno tiene muchas ventajas sobre otros analgésicos tales como la aspirina y el paracetamol, pero es muy poco soluble en agua y por esta razón, diversas patentes han abordado este problema. Por ejemplo, la US4309421 describe complejos solubles en agua de ibuprofeno y fosfolípidos adecuados para la administración parenteral, mientras que las US4859704 y US4861797 describen la síntesis de sales de metal alcalino de ibuprofeno para preparar una formulación de ibuprofeno líquido.
Otras patentes abordan este problema mediante la preparación de una sal de ibuprofeno con un aminoácido como ingrediente farmacéutico activo básico, como US5200558, US4279926 y US54631 17. Sin embargo, independiente de su vía de administración y forma farmacológica, cuando se ingiere este y otros AINES por un período prolongado de tiempo o en grandes cantidades, pueden presentarse efectos colaterales nocivos en los ríñones, en la coagulación de la sangre y el en sistema gastrointestinal, úlceras en la mucosa gástrica y un aumento del riesgo cardiovascular. Además, ha demostrado baja efectividad en el tratamiento del dolor crónico. Un blanco farmacológico utilizado para manejar el dolor crónico y la actividad nociceptiva espontánea del dolor crónico, son los canales de sodio sensibles a tetrodotoxina. Anestésicos locales como la lidocaína (protegida en la patente EP1291039), antiepilépticos como la carbamacepina (protegida en CA 1328219 C), antidepresivos tricíclicos, protegidos inicialmente bajo la patente US5086063; los anticomiciales como la fenitoína, bajo la solicitud WO 1989005641 A1 .
Otro blanco farmacológico utilizado ampliamente en la actualidad, son los compuestos que modulan la actividad del receptor de GABA (ácido gama- aminobutírico), un elemento fundamental en los mecanismos de inhibición de la señal dolorosa. Entre estos compuestos, se utilizan con frecuencia la gabapentina y pregabalina (los cuales también intercatúan con otro blanco farmacológico, los canales de calcio dependientes de voltaje de tipo N, protegidos por la patente US4024175), el topiramato (Solicitud EP1364649A1 ) y el levetiracepam (US4943639).
Una molécula importante en la circuitería del dolor es la serotonina. En cuadros de dolor, la serotonina permite modular la hiperactividad de las neuronas. En este sentido, el blanco farmacológico es el transportador de serotonina y los compuestos que lo inhiben y se utilizan en cuadros depresivos y en dolor neuropático. De ente ellos, los antidepresivos tricíclicos son los más eficaces, como la venlafaxina, la bicidafine y la duloxetina (US5362886).
Los antagonistas del receptor de membrana NMDA (ketamina, nemantina) no han mostrado una mayor eficacia analgésica, seguramente porque sus efectos secundarios han representado un factor limitante. Existen algunas patentes relacionadas con su intervención en el contexto del dolor, como US5095009, WO1986003489A1 , US5051442, entre otros).
Un blanco farmacológico novedoso son los canales calcio tipo N y sus bloqueadores, los cuales producen analgesia en modelos de dolor neuropático. Uno de los fármacos más utilizados, aprobados por la FDA, es el ziconotide intradural para uso compasivo en pacientes refractarios a otros tratamientos (US6054429).
De esta forma, existen diversos blancos farmacológicos intervenidos en la literatura, como los bloqueadores de a2 adrenérgicos (clonidina), los inhibidores de la acción de la sustancia P (lanepitante y capsaicina) y otros relacionados con la colecistokinina, la nociceptina y la bradikinina. También tienen cabida los agonistas cannabinoides, los corticoides y los antagonistas de factores neurotróficos como el factor de crecimiento tumoral (NGF). Sin embargo, en su conjunto, todos estos fármacos fallan en completar un alivio duradero. La eficacia de los fármacos previamente mencionados es cercana al 70% y el remanente carece de alivio. Por lo tanto, descubrir nuevos blancos farmacológicos para el tratamiento del dolor es esencial.
La participación de panexinas en el dolor crónico no ha sido patentada ni como blanco ni como estrategia farmacológica. De hecho, no existen patentes concedidas relacionadas con la intervención, bloqueo, manipulación, modulación o modificación de la actividad de panexina en ningún contexto fisiológico, patológico o aplicación farmacológica. Sin embargo, existen diversas solicitudes de patentes que revindican la intervención de panexina como estrategia farmacológica para diversas condiciones que varían desde el HIV (EP2603587A1 ), isquemia cerebral (WO201 1054820A1 ), enfermedad inflamatoria intestinal (WO 20131 1 1014 A2), hasta el cáncer (WO2012013609A1 ), entre otras. Pero más relevante aún, es el hecho que no existen patentes ni solicitudes que reivindiquen la intervención de panexina para estrategias terapéuticas relacionadas con el control y manejo del dolor, ni compuestos específicos.
Cabe destacar a la solicitud de patente EP1516625A1 , también encontrada con los números de solicitud US20080132446, WO2005026170A2 y WO2005026170A3, perteneciente a la Universidad de Heidelberg y al Instituto Pasteur, la cual se relaciona con el uso de panexinas neuronales para la fabricación de medicamentos para la prevención y/o tratamiento de trastornos neurológicos en general y, en particular, con los trastornos neurológicos que implican a las panexinas de las células piramidales del hipocampo en mamíferos.
Adicionalmente, esta solicitud procura proteger el uso de panexinas in vitro para el diagnóstico de estos trastornos neurológicos. Finalmente, esta solicitud procura proteger la intervención de panexinas y su capacidad de formar canales utilizando diversos compuestos capaces de intervenir. Por otro lado, la presente invención, a diferencia de la solicitud citada, reivindica el uso de panexinas neuronales, pero no del hipocampo sino de la médula espinal; además, reivindica el uso de panexinas en otros linajes celulares de la médula. Otra diferencia portentosa es el hecho que la solicitud citada reivindica el uso de panexinas neuronales en todos los trastornos neurológicos donde se encuentre esta proteína; sin embargo, la presente invención sólo se enfoca en el dolor agudo y crónico particularmente. Finalmente, la solicitud aquí citada también se dirige a métodos para seleccionar, in vitro o in vivo utilizando un modelo animal, compuestos útiles para la prevención y/o tratamiento, en los mamíferos, trastornos neurológicos mediante la modificación de la capacidad formadora de canales de panexinas pero, a diferencia de la solicitud analizada, esta invención reivindica el uso de panexinas de la médula espinal en el contexto del dolor agudo y crónico en todos los linajes celulares involucrados, esto es, neuronas, microglias, astrocitos y oligodendrocitos. Esta invención, por lo tanto, constituye una novedad potente y la primera aproximación a una nueva estrategia de alivio del dolor.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método de tratamiento del dolor en mamíferos, que comprende administrar a dicho individuo compuestos que actúen como un inhibidor de la función de panexina, incluyendo probenecid, carbenoxolona y 10panx. Por otra parte la presente invención proporciona un método para inhibir la transmisión del dolor agudo y crónico mediante la interacción de panexinas neuronales, microgliales, astrocitarias o de los ollgodendrocltas, con un compuesto que actúa como un Inhibidor de la actividad de este canal, o como un modificador de su señalización, un Inhibidor de su expresión o un bloqueador del tráfico de panexlna a la membrana plasmática, Incluyendo probenecld, carbenoxolona, probenecld y 10 panx. Particularmente, el Inhibidor de la actividad de panexlna puede ser una molécula farmacéutica orgánica o sintética, como carbenoxolona, probenecld, ácido flufenámico, mefloqulna, entre otros, los cuales han sido descritos y agrupados en una reciente revisión bibliográfica (Dahl et al., 2013).
También, se entiende como compuesto Inhibidor, aquel que Interfiera en el proceso de expresión de panexlna, como un sIRNA o un miRNA. Además, el compuesto Inhibidor de panexlna puede ser un Inhibidor de su función, mediante la unión de anticuerpos antl-panexina o sus fragmentos con la proteína, generando un impedimento alostérlco. El Inhibidor de la función de panexlna también puede ser un compuesto que ¡nteractúe o interfiera con el acomplamiento entre panexlnas vecinas o en su poro, tal como péptldos o secuencias de aminoácidos mlméticos de la estructura de panexlna, como el péptldo 10panx, o aquellos que Interfieran la función de otros receptores que ¡nteractúan con panexina, como los receptores purlnérgicos o el receptor NMDA.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figuras 1 A - 1 C muestran el efecto de la administración ¡ntratecal (I.t) de
10panx o solución salina en actividad de Wlnd Up espinal en ratas neuropátlcas y adulteradas control. La Figura 1 A y 1 B ¡lustra el procesamiento de datos para determinar los puntajes de Wind Up de médula espinal en animales Inyectados I.t. con solución salina o 300 μιηοΙ/L 10panx. Las respuestas fueron provocadas en animales adulterados por estimulación eléctrica repetitiva (1 Hz) del segundo y tercer dedo de la pata anterior (círculos) y T minutos después (cuadrados). Las respuestas fueron Integradas y graflcadas contra el número del estímulo y las curvas fueron normalizadas de modo que antes de Inyectar los animales, la ganancia de reflejo en el séptimo estimulo representó un Incremento de 100%. Las pendientes de las líneas de regresión de cuadrados mínimos (líneas punteadas) representan los puntajes de Wlnd Up. Para los paneles Izquierdo y derecho, T = 15 minutos; esto es, los datos fueron tomados antes y 15 minutos después de la Inyección I.t. de la solución salina o 10 panx. Para el panel Izquierdo, los promedios de las pendientes ± error estándar del promedio (SEM) de las curvas de regresión son 15,09 ± 0,043 (círculos) y 15,59 ± 0,44 (cuadrados), la diferencia entre las pendientes no es estadísticamente significativa (n=8, p<0,05, prueba t de Student de doble cola emparejada). Los datos de las ratas neuropátlcas fueron procesadas de una forma similar a aquella de los animales adulterados. La Figura 1 C muestra el curso en el tiempo de la actividad de Wlnd Up (cambio de porcentaje) después de la administración I.t. de la solución salina (círculos) o 300 μιηοΙ/L, 10panx (cuadrados) en ratas neuropátlcas (símbolo cerrado) y adulteradas (símbolos abiertos). Los puntajes de Wlnd Up en el tiempo T son expresados como cambio porcentual de la pendiente en el tiempo T comparado a la pendiente antes de la Inyección de 10panx al tiempo 0. Los valores son promedio ± SEM, n=8 ratas por grupo. El análisis de varlanza de mediciones repetidas de dos vías (ANOVA) reveló un efecto "tiempo" (análisis ¡ntragrupo:
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= 4,16, ANOVA p = 0,0006) y un efecto "grupal" (análisis intergrupo: F1 !45=603,69, ANOVA p<0,0001 : *p<0,05 con respecto a los valores de solución salina correspondiente, Prueba de comparaciones múltiples Bonferroni).
Figuras 2A y 2B muestra el efecto de la administración ¡ntratecal de carbenoxolona (Cbx) o probenecid (Prb) en la actividad de Wlnd Up espinal en ratas de control adulteradas y neuropátlcas. Los datos fueron procesados de una forma similar a aquellos de los animales inyectados con 10panx. Los puntajes de Wlnd Up en el tiempo T son expresados como cambio porcentual de la pendiente al tiempo T comparado a la pendiente antes de la inyección de la droga (o solución salina) en el tiempo 0. Los valores son promedio ± SEM, n=8 ratas por grupo. La Figura 2A muestra el curso de tiempo de la actividad de Wind Up (cambio porcentual) después de la administración intratecal de la solución salina (cuadrados) o 100 μιηοΙ/L Cbx (triángulos hacia arriba) en ratas adulteradas (símbolos abiertos) y neuropáticos (símbolos cerrados). El análisis de varianza de dos vías (ANOVA) para mediciones repetidas reveló un efecto "tiempo" (análisis intragrupo:
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ANOVA p < 0,001 ) y un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F1 !36 = 60,09, ANOVA p < 0,0015, *p < 0,05 con respecto a los valores de la solución salina correspondiente, prueba de comparación múltiple de Bonferroni). La Figura 2B muestra el curso del tiempo de la actividad de Wind Up (cambio porcentual) después de la administración intratecal de la solución salina (cuadrados) o 150 mmol/L Prb (triángulos hacia abajo), en ratas adulteradas (símbolo abierto) y neuropáticas (símbolos cerrados). La ANOVA dos vías para mediciones repetidas revelaron un efecto "tiempo" (análisis intragrupo: F9,36 = 2,25, ANOVA p = 0,0413) y un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F1 :36 = 41 ,06, ANOVA p = 0,003; *p < 0,05 con respecto a valores de la solución salina correspondiente, prueba de comparaciones múltiple Bonferroni).
Figuras 3A-3E muestra el efecto de la administración intratecal de 10panx en el umbral de retiro de ratas de control neuropáticas y adulteradas. Las Figuras 3A-3C muestra el curso de tiempo de cambios en el umbral nociceptivo mecánico (g/cm2) de ratas neuropáticas 10 días después de la cirugía. La cirugía fue realizadas en tiempo 0 (flecha hacia abajo). El análisis de varianza de mediciones repetidas de dos vías de (ANOVA) reveló un efecto "tiempo" (análisis entre grupos: F4,10o = 85,67, ANOVA p < 0,0001 ; *p < 0,05 con respecto al umbral de retiro antes de la cirugía, pruebas de comparaciones múltiple Bonferroni) sino un efecto "grupo" (análisis intragrupos. F4Joo = 0,13, ANOVA p = 0,9688). El curso de tiempo de los cambios en el umbral nociceptivo mecánico de ratas neuropáticas después de la inyección intratecal (flecha hacia arriba) de la solución salina o 10, 30, 100 y 300 μιηοΙ/L, 10panx en el día 10 después de la cirugía. La ANOVA dos vías para mediciones repetidas reveló un efecto "tiempo" (análisis intergrupo = F8,2oo n = 32,49, ANOVA p = 0,0001 ) y un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F4,2oo = 20,42, ANOVA p=0,0001 ; *p < 0,05 con respecto a los valores de soluciones salinas correspondientes, prueba de comparaciones múltiple Bonferroni). Área bajo la curva del gráfico del panel del medio: *p < 0,05, **p > 0,01 cuando se compara a la solución salina (ANOVA 1 vía seguido de prueba de comparación múltiple Dunnet). Las Figuras 3B-3E muestra el curso del tiempo de los cambios en el umbral nociceptivo mecánico (g/cm2) de las ratas de control adulteradas luego de 10 días de la cirugía. La cirugía fue realizada en el tiempo 0 (flecha hacia abajo). La ANOVA de mediciones repetidas de dos vías no reveló ya sea un efecto "tiempo" (análisis en el grupo. F5!50 0 1 ,22 ANOVA p = 0,3152) o un efecto "grupo" (análisis entre grupos F4,5o = 1 ,42, ANOVA p = 0,2959). Los cursos de tiempo de cambio en el umbral nociceptivo mecánico de las ratas control adulteradas después de la inyección intratecal (flecha hacia arriba) de la solución salina o 10, 30, 100 y 300 μιηοΙ/L, 10 panx en el día 10 después de la cirugía. La ANOVA de mediciones repetidas de dos vías no reveló ya sea un efecto "tiempo" (análisis intragrupo: F8!80 = 0,87, ANOVA p = 0,5449) o un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F4!80 =0,12, ANOVA p=0,9702).
FIGURAS 4A - 4E muestra el efecto de la administración de carbenoxolona (Cbx) o probenecid (Prb) en el umbral de retiro de las ratas neuropáticas o adulteradas de control. Las Figuras 4A-4C muestra el curso del tiempo de los cambios en el umbral nociceptivo mecánico (g/cm2) de las ratas neuropáticas 10 días después de la cirugía. La cirugía fue realizada en el tiempo 0 (flechas hacia abajo). El análisis de varianza de mediciones repetidas en dos vías (ANOVA) reveló un efecto "tiempo" (análisis en el grupo: F4i48 = 91 ,92, ANOVA p < 0,0001 ; *p < 0,05 con respecto al umbral de retiro antes de la cirugía. Pruebas de comparaciones múltiple Bonferroni) pero no un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F2i48 = 1 ,27, ANOVA p = 0,3628). El curso de tiempo del cambio en el umbral nociceptivo mecánico de las ratas neuropáticas después de la inyección intratecal (flecha hacia abajo) de la solución salina, 100 mmol/L Cbx o 150 mmol/L Prb 10 días después de la cirugía. La ANOVA de mediciones repetidas de dos vías reveló un efecto "tiempo" (análisis entre grupos: F2i72 = 16,83, ANOVA p < 0,0009; *p > 0,05 con respecto a los valores de la solución salina correspondiente. Prueba de comparación múltiple Bonferroni). El área bajo la curva del gráfico del panel medio: *p > 0,05 comparado con la solución salina (ANOVA 1 vía seguido por prueba de comparación múltiple Bonferroni). Figuras 4D y 4E. Cursos de tiempo de cambios en el umbral nociceptivo mecánico (g/cm2) de ratas de control adulteradas 10 días después de la cirugía. La cirugía fue realizada en el tiempo 0 (flecha hacia abajo). La ANOVA de mediciones repetidas de dos vías no reveló ya sea un efecto "tiempo" (análisis en el grupo: F5!30 = 0,37, ANOVA p = 0,8625) o un efecto "grupo" (análisis entre grupos: F2,3o = 3,03, ANOVA p = 0,1234) (panel derecho). Los cursos de tiempo de los cambios en el umbral nociceptivo mecánico de las ratas control adulteradas después de la inyección intratecal (flecha hacia abajo) de 100 mmol/L Cbx 0 150 mmol/L Prb 10 días después de la cirugía. LA ANOVA de mediciones repetidas de dos vías no reveló ya sea un efecto "tiempo" (análisis intragrupo: F8!64 = 2,72, ANOVA p=0,1 19) o un efecto "grupo" (análisis intergrupo: F2i64 = 0,89, ANOVA p=0,4483)
Figura 5A-5C muestra una cuantificación de la proteína panexina mediante un westernblot, que evidencia los niveles de expresión de panexina en la médula espinal. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención proporciona un método de tratamiento del dolor en mamíferos, que comprende administrar a un individuo que sufre dolor compuestos inhibidores de la función de panexina incluyendo carbenoxolona, probenecid y 10panx. Por otra parte, la presente invención proporciona un método para inhibir la transmisión del dolor agudo y crónico mediante la interacción de panexinas neuronales, microgliales, astrocitarias o de los ollgodendrocltas, con compuestos Inhibidores de la actividad de este canal incluyendo carbenoxolona, probenecid y 10panx.
En el estudio del rol de los canales de panxl en dolor crónico, se usó un modelo de injuria de nervio escatimado de neuropatía de rata que involucra la lesión de 1 (el nervio sural) de las 3 ramas terminales del nervio ciático, dejando las otras dos ramas (nervios tibial y peroneal común) intactos. Tal modelo resultó en hiperalgesia mecánica como lo evidenció la reducción significativa del umbral de retiro de la pata a presión que estímulo perdurable por al menos 10 días. Junto con el umbral reducido de estímulo de presión observado en ratas neuropáticas, una corriente de estímulo disminuida se requirió para la activación umbral del reflejo C de regiones cutáneas (segundo y tercer dedo de la pata) el vencidario del área desnervada, que soporta resultados más tempranos mostraron que el umbral para activación eléctrica de fibras C fue significativamente reducida en ratas sometidas a injuria de nervio escatimado.
La presente invención muestra por primera vez que los canales panxl juegan un rol significativo en dolor neuropático porque (¡9 el bloqueo de los canales de panxl con 10panx, CBx o Prb intratecal disminuyo significativamente la actividad Wind Up tanto en ratas neuropáticas como adulteradas; (ii) 10 panx, Cbx o Prb intratecal disminuyeron la hiperalgesia mecánica en ratas neuropáticas sin afectar la nocicepción mecánica e animales adulterados; y (iii) la proteína panxl fue expresada en el la antena dorsal de la médula espinal lumbar de ratas neuropáticas y adulteradas. El efecto antihiperalgésico de 10panx, Cbx o Prb en el umbral de presión de la pata de ratas neuropáticas fue corta y reversible, lo que significa que la respuesta sensible se mantuvo, al menos en parte, por un mecanismo espinal que depende de panx-1 activo que fue transcientemente contraactuado por la inyección i.t. de bloqueador panxl .
El hecho que la inyección intratecal de cualquiera de los 3 bloqueadores de panxl usados inhibieron el fenómeno Wind Up en ratas normales demuestra que los canales panxl juegan un rol en los mecanismos de amplificación del dolor espinal de las respuestas mediadas por fibras C.
Ejemplo
Se indujo neuropatía en ratas macho Sprague-Dawley de 225-250 gramos al usar una modificación del modelo de rata con injuria de nervio controlado de Decosterd and Woolf (Descosterd I, Woolf CJ, Spared nerve injury. An animal model of persistent peripheral neuropathic pain. PAIN 2006; 122:17-21 ), lo que resultó en cambios tempranos, prolongados y robustos en la sensibilidad mecánica y respuesta térmica de muchas características que se asemejan de cerca el dolor neuropático clínico. 2 de las 3 ramas distales terminales del nervio ciático fueron axotomizados (nervios tibial y perineal común), el control 1 (nervio sural) mientras en el modelo de este caso, sólo el nervio sural fue transectado, controlando los nervios tibial y perineal común. Este procedimiento permitió generar un modelo de dolor neuropático en que los reflejos nociceptivos a ser registrados son preservados (por ejemplo, actividad de reflejo C) ya que el nervio sural casi no contiene fibras motoras (Peyronnard J M, Charron L. Motor and sensory neurons of the rat sural nerve: a horseradish peroxidase study. Muscle Nerve 1982;5:654-60).
Los animales fueron anestesiados con 400 mg/kg i.p. de 7% solución de hidrato doral (p/v), Después afeitada la pata trasera derecha al nivel del nervio ciático, una incisión en la piel de aproximadamente 10 mm de largo fue hecha. El tejido subcutáneo fue disectado el músculo bíceps femoris fue liberado desde las cabezas pélvica y vertebral para exponer el nervio ciático. La ruta nerviosa fue entonces seguida hasta su división en 3 ramas: los nervios sural, perineal común y tibial. El nervio sural fue cortado 2 mm desde su emergencia y los tejidos de superposición fueron suturados en capas. Durante dos días después de la cirugía, los animales fueron diariamente suministrados con 3 mg/kg del analgésico ketoprofeno y 5 mg/kg s.c. del agente antimicrobiano enrofloxacin. La lesión neural descrita antes resultó en hiperalgesia mecánica de la pata que persistió por al menos 28 días. Las ratas control (adulteradas) recibieron cirugía similar sin ruptura del nervio sural.
Para estudiar el efecto de desbloqueo del canal panxl en el mecanismo de hiperalgesia inducida por neuropatía, los canales panxl de la médula espinal lumbar fueron desafiados con el péptido 10panx (Trp-Arg-CIn-Ala-Ala-Phe-Val, Asp-Ser-Tyr), un péptido mimético del primer dominio de bucle extracelular de panxl (Pelegrin O, Supernant A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1 beta reléase by the ATP-gated P2X7 receptor, EMBO J 2006;25:5071 -82.) que parece actuar a través de una interferencia esférica con la función del canal, obtenido de Tocris (St Louis, MO). Las ratas neuropáticas y adulteradas recibieron una inyección única de 1 μΙ i.t. de 10, 30, 100 o 300 μιηοΙ/L de 10panx, mientras los grupos de control respectivos recibieron 10 μΙ de solución salina i.t.. Además, 2 drogas más descritas en la literatura como bloqueadores farmacológicos de panxl fueron también usadas: carbenoxolona (Cbx), una droga sintética que bloquea los canales panxl expresados en Xenopus oocytes (Bruzzone R., Barbe MT, Jakob NJ, Monyer H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem 2005;92:1033-43), que fueron inyectadas con una solución de 100 μιηοΙ/L; y probenecid (Prb), un agente que exhibió actividad inhibitoria contra panxl (Silverman WR, Locovel S, Dahl G, Probenecid, a gout remedy, inhibits pannexin 1 channels, Am J Physiol Cell Physiol 2008; 295-C761 -7), que fue inyectada i.t. con una solución 150 μιηοΙ/L de solución. Ambos Cbx y Prb fueron obtenidos de Sigma (St Louis, MO).
Para el estudio electrofisiológico del efecto de bloqueo de canal panxl en la actividad refleja C Wind Up, una inyección única de 10 μΙ i.t. de 300 umol/L, 10 panx, 100 μιηοΙ/L Cbx y 150 μιηοΙ/L Prb o solución salina fueron administradas a animales neuropáticos adulterados control. Dosis únicas de 10 panx, Cbx y Prb fueron adaptadas de los estudios de_Thompson R J, Jackson M F, Olah M E, Rungta R I, Hiñes D J, Beazely M A, MacDonald J F, MacVicar B A, Activation of pannexin-1 hemmichannels augments aberrant bursting in the hippocampus. Science 2008; 322- 1555-9, Bruzzone R., Barbe MT, Jakob NJ, Monyer H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem 2005;92:1033-43 y Ma W, Hui H, Pelegrin P. Supernant A. Pharmacological characterization of pannexin currents expressed in mammal cells. J. Pharmacol. Exp. Ther 2009; 328:409-18, respectivamente. Las inyecciones en el espacio subaracnoideo fueron hechas aplicando una anestesia breve con isoflurano (2 minutos), por inyección percutánea entre la vértebra lumbar L5 y L6, y evidenciada por el movimiento suave de la cola de la rata que resulta de estimulación mecánica cuando la aguja penetra las meninges de la médula espinal (Mestre C, Pélissier T, Fialip J, Wilcox G, Eschalier A, A method ro perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 1994; 32:197-200). Al término de los experimentos de comportamiento y electrofisiológicos, las ratas fueron eutanizadas con una sobredosis de hidrato doral (1 g/kg i.p.).
El reflejo C fue provocado en la extremidad posterior derecha de las ratas anestesiadas con 1 ,5% a 1 ,8% isoflurano en oxígeno usando una máscara facial de roedor modificada en el diafragma de látex como se describe previamente en Smith J C, Bolón B, Isoflurano leakage from non-rebreathing rodent anaesthesia circuits: comparison of emissions from conventional and modified ports. Lab Anim 2006; 40:200-9. En resumen, los pulsos eléctricos rectangulares de resistencia supramaxima y la duración de 2 milisegundos fue aplicada cada 10 segundos al campo receptivo del nervio peroneal y tibial común por medio de 2 agujas de acero inoxidable insertadas en la piel del segundo y tercer dedo de la pata (Grass S1 1 estimulador equipado con una unidad aislada de estímulo SIU 5 y una unidad de corriente constante Grass CCU 1 A; Astro-Med, West Warwick, RJ). La respuesta reflejo evocada de fibra C fue registrada del músculo femorls bíceps ¡psllateral al usar otro para de agujas de acero Inoxidable. Después de la amplificación (Grass P51 1 preamplificador; Astro-Med, West Warwick, Rl), las respuestas electromiograficas fueron digitalizadas en 100 KHz e integradas en una ventana de tiempo de 150 a 450 ms después del estímulo (Power- lab ML 820, ADInstruments, Castle Hill, NSW, Australia). Una vez obtenidas, respuestas de reflejo C estables, la resistencia de estímulo fue disminuida y la corriente requerida para la activación umbral del reflejo C fue determinada. Las respuestas reflejo C integradas, evocada por estímulo único con el doble de intensidad de la corriente de estímulo umbral, fueron entonces registradas. Después de ello, trenes de 15 estímulos cada uno, en 1 Hz y dos veces la intensidad umbral fueron liberados a los dedos de las patas para desarrollar actividad de Wind Up En el paradigma de reflejo C, el Wind Up consiste en un incremento notorio que depende de la frecuencia del estímulo de la respuesta electromiográfica integrada. Todas las respuestas fueron almacenadas en un disco duro para el análisis posterior. Las líneas de regresión de cuadrados mínimos fue fijada entre los puntos experimentales que muestran solo tendencia del ¡ncremento(antes de la saturación del Wind Up en el séptimo estímulo), descartando los puntos remanentes (Origin 6.0 software; Microcal Software, Northampton, MA) como se describe en Constandil L, Hernández A, Pelissier T, Arriagada O, Espinoza K, Burgos H, Laurido C. Effect of interleukin-1 beta on spinal Cord nociceptive transmission of normal and monoarthritic rats after disruption of glial función. Arthritis Res Ther 2009; 1 1 :R105. Las pendientes de las líneas de regresión representan puntajes de Wind Up (ver Fig. 1 A).
La corriente de estimulación requerida para la activación umbral del reflejo C fue menor en ratas neuropáticas que en animales adulterados de control (3,8 ± 2,1 mA versus 8,3 ± 1 ,5 mA, respectivamente); en consecuencia, las series de Wind Up en ratas neuropáticas fue corrida con intensidades eléctricas menores que las series en animales adulterados de control, conforme al protocolo usado (2 veces la corriente de estímulo umbral). Para ecuallzar la respuesta en ambos grupos, las respuestas reflejo C Integradas fueron expresadas en términos de la variación porcentual comparada con su condición previa (antes de la Inyección I.t. del fármaco o solución salina) y normalizada de modo que las respuestas provocadas por el séptimo estimulo en animales Inyectados con solución salina representa un Incremento de 100% con respecto a las respuestas básales obtenidas antes de aplicar el protocolo de Wlnd Up (Flg. 1 A). Los experimentos comenzaron con la medición del Wlnd Up basal previo a la administración I.t. 10panx, Cbx, Prb o solución salina. Luego de ello, 10 μιηοΙ/L de 300 μιηοΙ/L 10panx, 100 μιηοΙ/L Cbx, 150 μιηοΙ/L Prb o solución salina fueron Inyectados I.t. por Inyección percutánea directa en ambas ratas normales y neuropátlcas como se describe previamente en Smith J C, Bolón B, Isoflurano leakage from non-rebreathlng rodent anaesthesla clrcults: comparlson of emlsslons from conventlonal and modlfled ports. Lab Anlm 2006; 40:200-9, y la determinación del Wlnd Up fue reanudada por 20 minutos cada 30 minutos. Los puntajes de Wlnd Up obtenidos fueron graflcados como curvas de curso de tiempo.
La hlperalgesla mecánica en la extremidad posterior después de evaluada la neuropatía por medición del umbral de presión en la pata con una analgeslmetro (Ugo Baslle, Várese, Italia) como se describe originalmente en Randall I, Selltto J, A method for measurement of analgeslc actlvlty on ¡nflamed tlssue. Arch Int Pharmacodyn Ther 1957; 1 1 1 :409-19. En resumen, la prueba de comportamiento consistió en agregar una presión ¡ncremental gradualmente aplicada a la pata trasera derecha hasta que ocurrió, el retiro del reflejo de la pata. Para prevenir la Injuria de la pata trasera, un valor de corte de 570 g fue usado (Pellssler T, Infante C, Constandll L, Eslnosa J, Lapeyra CD, Hernández A. Antlnoclceptlve effect and ¡nteractlon of uncompetltlve and competltlve NMDA receptor antagonlsts upon capsalcln and paw pressure testlng ¡n normal and monoarthrltlc rats. PAIN* 2008; 134:1 13-27). La prueba de presión en la pata trasera fue realizada en ratas neuropátlcas y adulteradas antes (día 0), y los días 3, 7 y 10 después de la cirugía neuropátlca o de adulteración, respectivamente. Después de ello, en el día 10 después de la Inducción de la neuropatía, las ratas recibieron una Inyección única 10 μΙ_ I.t. de 10panx, Cbx, Prb o solución salina. El 10panx fue administrado como una solución de 10, 30, 100 o 300 μιτιοΙ/L. Cbx y Prb fueron Inyectados como soluciones 100 μιηοΙ/Ι_ y 150 μιτιοΙ/L, respectivamente, y 10 ml_ de solución salina I.t, sirvieron como control y a 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 minutos después de la Inyección I.t. La expresión de la proteína Panxl fue medida siguiendo el protocolo de Mylvaganam S, Zhang L, Wu C, Zhang Z J, Samollova M, Eubanks J, Carien PL, Poulter MO, Hlppocampal selzures alter the expresslon of the pannexln and connexln transcrlptome. J. Neurochem 2010; 1 12:92- 102. Las ratas fueron sacrificadas con una sobredosls de hidrato doral (1 g/kg, ¡ntraperlntoneal, I.p.). Para la extracción de la proteína, los cuadrantes posteriores de la médula espinal, los cuadrantes posteriores de la médula espinal lumbar (nivel de vertebras L1 -L3) ¡psllateral para la lesión, tomando 5 animales normales y 5 animales neuropátlcos, fueron homogenlzados en tampón de aglutinación de plaqueta Inducida por rlstocetln (RIPA) que contiene 50 mmol/L Tris (pH 8,0), 150 mmol NaCI, 1 % sulfato de dodecll sódico (SDS), 1 % Igepal CA_630, 0,5% deoxlcolato de sodio, 1 mmol/L NaF, 10 IM/ml fluoruro de fenllmetllsulfonll (PMSF), 1 mmol/L Na3V04 y coctel de Inhibidor de proteasa. (Hoffmann-La Roche, Mlsslssauga, ON, Canadá) en hielo. Los homogenatos fueron Incubados en hielo 30 minutos y dos veces sonlcados por 20 segundos en hielo. Las concentraciones de proteína fueron determinadas con el reactivo de ensayo de proteína de ácido nlclnconlnlco (Plerce/thermo Flsher Sclentlflc, Nepean, ON, Canadá). Las proteínas fueron separadas por electroforesls de gel sulfato-pollacrllamlda dedecll sodio (SDS-PAGE). Una cantidad de 30 Lg de cada homogenato fue cargada en cada carril. Para el western blottlng, el gel fue transferido a la membrana de difluoruro de pollvlnlldeno (PVDF, Blorad) y bloqueado en 5% (p/v) leche seca no grasa y 0,05% Tween 20, toda la noche. Las membranas fueron lavadas e Incubadas con anticuerpo secundarlo antl-conejo (Cerdalane, Burlington, ON, Canadá) conjugado con peroxldasa de rábano picante. La ¡nmunoreacclón fue detectada con un klt de qulmlolumlnlscencla (Amersham Blosclences/GE Healthcare, Bale d'Urfe, QC, Canadá). Después que las películas de rayos X fueron escaneadas, las Intensidades de la señal en las bandas fueron analizadas con ImageJ Software (NIH, Bethdesda, MD).
Todos los datos fueron expresados como promedio ± error estándar del promedio (SEM) y los análisis estadísticos fueron hechos usando Prlsm 5.0 software (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores P menores que 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. El análisis estadístico en el grupo y entre grupos de las curvas de curso de tiempo de electromlograflcas y de comportamiento fue conducido usando análisis de varlanza de mediciones repetidas dos vías (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple Bonferronl. El análisis estadístico del área bajo curva de respuesta de dosis obtenida desde la prueba de comportamiento fue realizado usando ANOVA 1 vía seguido por la prueba Dunnett. Los niveles de expresión de panxl de animales neuropátlcos y control fueron comparados por medio de la prueba t de Student despareada doble cola.
Debido a que los resultados de sensibilización central de cambios neuropátlcos en la excitabilidad de neuronas que transmiten dolor en la médula espinal, fue probada electroflsológlcamente, usando el paradigma del reflejo noclceptlvo C, si bloqueadores diferentes a panxl podrían Inhibir la actividad de Wlnd Up espinal en ratas neuropatías un forma de plasticidad en la antena dorsal espinal que se observa durante estimulación eléctrica de baja frecuencia (por ejemplo 1 Hz) de fibras C. Los resultados mostraron que la solicitud de un tren de pulsos eléctricos a los dedos de las patas, a 1 Hz, evocaba actividad de Wlnd Up en respuestas reflejas mediadas por fibra c en el músculo femorls de bíceps ¡psllateral, en ambos ratas de nervio sural transectado neuropátlcas y adulteradas. La administración i.t. de cualquiera de las drogas de bloqueo de panxl , 10panx, Cbx y Prb, fueron capaces de deprimir la actividad de Wind Up en ambas ratas neuropáticas y adulteradas. La Figura 1 B muestra que 300 μιηοΙ/L 10 panx pero no la solución salina, disminuyen significativamente los puntajes de Wind Up, en ambos grupos de animales (*p<0,05, ANOVA 2 vías seguido por prueba post hoc Bonferroni). La Figura 2 muestra que 100 μιηοΙ/L Cbx (A) y 150 μΜ Prb también resultaron en disminuciones significativas de los puntajes de Wind Up en ratas neuropáticas y adulteradas (para ambas drogas, *p>0,05, ANOVA de 2 vías seguido por prueba post hoc Bonferroni). El hecho que la inactivación farmacológica de los canales panxl condujeron a una reducción significativa de la actividad de Wind Up en médula espinal de animales neuropáticos y adulterados sustenta la noción que los canales de panxl están involucrados en los mecanismos que destacan el fenómeno de Wind Up bajo médula espinal no sensible y sensible, en ratas.
La transección del nervio sural resultó en hiperalgesia de larga duración para estimulo mecánico, como evidenció una reducción significativa del umbral de retiro de la para en los grupos experimentales. El estado de hiperalgesia comenzó 3 días después de la transección del nervio sural y duró por al menos 10 días (ver Figuras 3A y 4A, panel izquierdo, *p < 0,05, ANOVA dos vías seguido de prueba post hoc Bonferroni). Por el contrario, el retiro el umbral de retiro de la pata en los grupos adulterados permaneció sin cambio a lo largo de los 10 días de prueba (Figura 3B y 4B, panel izquierdo).
La inyección i.t. de dosis incrementada de 10panx (10, 30, 100 o 300 μιηοΙ/L 10panx), pero no la solución salina, indujo un efecto anti-hiperalgésico no dependiente de la dosis significativo en animales neuropáticos ya que ambos máximos del efecto y la duración de la respuesta antl-hlperalgéslca fueron directamente proporcional a la dosis (Figura 3A, panel medio, *p<0,05, ANOVA dos vías seguido por prueba post hoc Bonferronl). Además, el cálculo del área bajo la curva (AUC) como medida del efecto de 10panx durante el período completo de observación, también mostró que el efecto antlhlperalgéslco de 10panx se comporta de una manera dependiente de dosis (Figura 3A, panel derecho, *p<0,05, **p<0,01 , ANOVA 1 vía seguido por prueba Dunnett post hoc). El efecto antl-hlperalgéslco de 10panx I.t. fue transclente, y el umbral noclceptlvo mecánico volvió al puntaje hlperalgéslco Inicial en alrededor de 3 a 4 horas. Por el contrario, para el efecto de 10panx en la ratas neuropátlcas, la Inyección I.t. de dosis similares de 10panx para ratas adulteradas no afectó el umbral de retiro de la pata en estos animales (Figura 3B, panel derecho). De forma similar a 10panx, las Inyecciones I.t. de 100 μιηοΙ/L Cbx y 150 μιηοΙ/L Prb, pero no la solución salina, fueron capaces de Inducir efectos antlhlperalgéslcos transclentes Importantes en ratas neuropátlcas como se puede observar en las curvas de curso del tiempo (Figura 4A, panel del medio, *p<0,05, ANOVA dos vías seguido de prueba post hoc Bonferronl) y AUCs (figura 4A, panel derecho, *p<0,05, ANOVA una vía seguido por prueba post hoc Dunnett). Sin embargo, dosis similares de Cbx y Prb fueron Inefectivas en animales adulterados (Figura 4B, panel derecho). Como un todo, los resultados Indican que panxl participa en el proceso de sensibilización central que se desarrolló después de una Injuria neuropátlca.
La expresión de la proteína panxl en la medula espinal lumbar de ratas neuropátlcas y de control fue caracterizadas por western blots con anticuerpos disponibles comerclalmente y normalizada a β-actlna. Panxl corre como una banda de 48KDa. No se observó una diferencia significativa en los niveles de expresión para la proteína panxl cuando se compara las densidades de banda normalizadas para medula espinal lumbar de controles neuropatlcos y adulterados, con ello, la Injuria neuropática o afecta la regulación genética o postranslacional panxl .
Las figuras 5A y 5B muestran una cuantificación de la expresión de la proteína panexina mediante un western blot que evidencia los niveles de expresión de panexina en el cuadrante dorsal, ipsilateral a lalesión, de la médula espinal lumbar (segmentos L1 -L5). En la figura de la izquierda (1 ) se muestran las bandas típicas para panexina (48 KDa) y para la actina β (42 KDa). Se observan las bandas de las ratas de control neuropático y normales, diez días después de la transección del nervio sural o una cirugía simulada. Los valores son la media ± SEM de muestras independientes tomadas de la médula espinal lumbar de cuatro ratas en cada grupo. El gráfico de la derecha (2) muestra los resultados de las densidades de las bandas normalizadas; las comparaciones de los datos de animales neuropático (N) y grupo de control (C) realizaron mediante la prueba t Student de dos colas para datos independientes NS: no significativo (P<0,05), en comparación con los animales control.
Las figuras 1 A, 2A y 2B muestran el efecto de 3 bloqueadores de panexina en la actividad dolorosa espinal. Dado que la sensibilización central (modificación de las características de las neuronas que participan en la conducción de la información dolorosa, donde aumentan su sensibilidad) resulta de cambios neuroplásticos en la excitabilidad de las neuronas de transmisión del dolor en la médula espinal, se probó electrofisiológicamente, usando el paradigma del reflejo C nociceptivo, si diferentes bloqueadores panexina 1 podrían inhibir la actividad de la potenciación del dolor o Wind Up en ratas neuropáticas. Wind Up es un aumento de la excitabilidad de las neuronas de la médula espinal evocada por estímulos eléctricos sobre las fibras nerviosas que conducen la información dolorosa, las fibras tipo C. El wind up es un indicador de la actividad de las neuronas relacionadas con la transmisión del dolor. Cuando el wind up es alto significa que las neuronas del dolor están muy activas, indicando que el individuo padece dolor. Cuando se logra disminuir el wind up significa que se está disminuyendo la actividad de las neuronas del dolor y, por lo tanto, aliviándolo.
Los resultados mostraron que la aplicación que la aplicación de una tren de pulsos eléctricos a la pata derecha de la rata a 1 Hz evocó la actividad wind up de las fibras C mediada por respuestas reflejas motoras en el músculo bíceps femoris ipsilatral del muslo, en ratas normales y neuropáticas. La administración por vía intratecal, indicada por una flecha, (esto es, directo sobre la médula espinal) de cualquiera délos bloqueadores de panexina, como 10 panx (un péptido mimético de una secuencia de amino ácidos de una porción extracelular de la proteína, que impide su apertura por bloqueo de su poro) (3), carbenoxolona (4) o probenecid (5), logró disminuir la actividad wind up espinal tanto en ratas neuropáticas como normales. 300 mM de 10panx (6) disminuyeron significativamente la actividad wind up en ambos grupos de animales (*=P<0,05, ANOVA de 2 vías, seguido por la prueba Bonferroni post hoc), a diferencia de aquellos a los cuales se les inyectó solución salina, sin cambios. Lo mismo ocurrió al administrar 100 μΜ de carbexonolona (7) y 150 μΜ de probenecid (8), significativa disminución de la actividad wind up fue observada (*P<0,05, ANOVA de dos vías seguido de prueba Bonferroni post hoc). El hecho de que la inactivación farmacológica de los canales de panexina haya conllevado a una reducción significativa de la actividad wind-up en la médula espinal de los animales neuropáticos, demuestra que panexina está involucrada fuertemente en los mecanismos subyacentes a la sensibilización central y los cambios en la excitabilidad neuronal observados en dolor.
Las figuras 3A-4B muestran cómo se alivia el dolor de un grupo de animales con daño de nervio periférico mediante el test de presión de la pata. La transección del nervio aural (9) resultó en una alodinia a los estímulos mecánicos, esto es, generación de dolor frente a un estímulo inocua, como al presionar la pata (gráfico a la izquierda). Esto se evidencia por una reducción significativa del umbral de retirada de la pata en los grupos experimentales (10). La alodlnla comenzó 3 días después de seccionar el nervio sural y se prolongó durante al menos 10 días (P<0,05, ANOVA de 2-vías seguido por la prueba Bonferronu post hoc). Por el contrario, el umbral de retirada de la pata en los grupos de animales normales se mantuvo sin cambios durante todo el período de prueba de 10 días (9a). La inyección de dosis crecientes de 10 panx (1 1 ) (10, 30, 100 o 300 μΜ), pero no una solución salina (12), indujo una significativa disminución, dosis dependiente, de la alodinia animales neuropáticos (P<0,05, ANOVA de 2 vías seguido de prueba Bonferroni post hoc). Además, el cálculo del área bajo la curva (AUC) (13) como una medida del efecto de 10panx durante el período de observación, también mostró que el efecto de 10 panx como analgésico de una manera dependiente de la dosis (P<0,05, //P<0,01 , ANOVA de 1 vía seguido por prueba Dunnett post hoc). El efecto antihiperalgésico de 10panx fue transitorio, y el umbral nociceptivo mecánico volvió a la puntuación inicial en alrededor de 3 a 4 horas. En contraste al efecto de 10 panx en ratas neuropáticas, la inyección de dosis similares de 10 panx a ratas normales no afectó al umbral de retirada de la pata de estos animales (14). De manera similar a 10 panx, las inyecciones de 100 μΜ, de carbenoxolona (15) y 150 mM de probenecid (16) pero no la solución salina 817) fueron capaces de inducir una significativa y transitoria reversión de la alodinia mecánica ratas neuropáticas (P<0,05 de ANOVA de 2 vías seguido de prueba Benferroni post hoc) y AUC 18) (//P<0,05 Anova de 1 vía seguido por prueba Dunnett post hoc). Sin embargo, dosis similares de carbenoxolona y probenecid (19) no generaron cambios en animales normales, indicando que panexina participa en la sensibilización central que se desarrolla después de una lesión neuropática, porque al intervenirla, se genera un alivio del dolor.

Claims
REIVINDICACIONES
Método de tratamiento de dolor en mamíferos, caracterizado porque comprende administrar a dicho mamífero un compuesto inhibidor de la función de panexina que es seleccionado del grupo consistente de carbenoxolona, probenecid, 10panx, ácido flufenámico o mefloquina.
El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina es carbenoxolona, probenecid o 10panx. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina es carbenoxolona.
El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina es probenecid.
El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina es 10panx.
El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina inhibe la señalización de panexina en neuronas, microglias, astrocitos y oligodendrocitos de la médula espinal.
El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina bloquea la actividad del canal de panexina. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto inhibidor de la función de panexina es administrado por vía intratecal.
Uso de un compuesto inhibidor de la función de panexina que es seleccionado del grupo consistente de carbenoxolona, probenecid, 10panx, ácido flufenámico o mefloquina caracterizado porque sirve para preparar un medicamento útil para el tratamiento del dolor.
10. El uso de la reivindicación 9, caracterizado porque dicho dolor se selecciona de dolor agudo o crónico.
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