ES2706408T3 - Composiciones farmacéuticas que contienen sal de sodio de fosfatidilserina y curcumina - Google Patents

Abstract

Un producto farmacéutico que contiene una sal de sodio de fosfatidilserina y curcumina para usar en la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil o presenil o la demencia vascular, en el que la fosfatidilserina está en una cantidad que oscila entre 50 y 400 mg por dosis, y la curcumina está presente en una cantidad que oscila entre 50 y 1000 mg por dosis.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones farmacéuticas que contienen sal de sodio de fosfatidilserina y curcumina.

La presente invención describe y reivindica productos farmacéuticos estables a base de sal de sodio de fosfatidilserina (PS) y curcumina, que en consecuencia están desprovistos de productos de degradación, para uso en la prevención y tratamiento de trastornos asociados con el envejecimiento cerebral, y en la prevención y el tratamiento de la osteoporosis y/u osteoartritis.

Campo de la invención

El deterioro funcional del sistema nervioso central (CNS) que tiene lugar durante el procedimiento fisiológico del envejecimiento cerebral a menudo provoca un deterioro de las funciones cognitivas de las personas mayores, que pueden adoptar la forma de trastornos de la conducta con alteraciones de la memoria temporal y espacial.

Este deterioro funcional está asociado con alteraciones bioquímicas y estructurales de la composición lipídica de las membranas neuronales, y con una actividad enzimática cerebral reducida, que puede conducir a una reducción en la proporción sinapsis a neurona.

Como la fosfatidilserina (PS) es el principal fosfolípido ácido en el cerebro, la investigación científica ha estado buscando un tratamiento farmacológico para los trastornos cognitivos relacionados con la edad que consisten en fosfolípidos que pueden prevenir (y/o reconstruir parcialmente) esta deficiencia estructural y funcional del envejecimiento de las membranas neuronales.

Los estudios preclínicos y clínicos realizados en seres humanos han demostrado que, especialmente en personas mayores, la administración oral de PS puede provocar un aumento significativo en la capacidad de aprendizaje y la memoria temporal y espacial, incluso en el caso de trastornos particularmente incapacitantes como la demencia senil y enfermedad de Alzheimer (Cenacchi T. et al.; Aging Clin Exp Res; 1993; 5:123-133; Nunzi MG et al.; Adv Exp Med Biol; 1992; 318:393-8).

El deterioro fisiológico y patológico de las funciones cognitivas de las personas de edad avanzada a menudo se puede asociar con una reducción hormonal debido al deterioro normal de la funcionalidad endocrina (tal como la menopausia o la andropausia), o a la interrupción repentina de la producción de ciertas hormonas, debido a la extirpación quirúrgica del órgano secretor (tal como la ovariectomía parcial o total). Esta situación a menudo es seguida por otros trastornos tal como la osteoporosis.

El término "osteoporosis" significa una condición por la cual el esqueleto tiene un mayor riesgo de fracturas debido a una reducción en la masa y modificación de la microarquitectura ósea. La osteoporosis se define como más del 30% de pérdida ósea. Ocurre principalmente en el hueso trabecular, que está sujeto a la mayor cantidad de fracturas, y comienza con una reducción en el tono de calcio de la masa ósea (osteopenia). Los huesos más frecuentemente afectados por una reducción en el tono de calcio son las vértebras dorsolumbares, el fémur y la muñeca. A medida que avanza la osteopenia, se puede producir un colapso vertebral o una fractura del cuello del fémur.

La osteoporosis se clasifica como primaria (original) o secundaria, esto es, resultante de un evento correlacionado; sin embargo, la forma primaria representa casi todos los casos (95%).

La osteoporosis primaria comprende osteoporosis postmenopáusica y osteoporosis senil (esta última se debe a diversas causas, incluida la inmovilidad y una baja ingesta de calcio, magnesio, vitamina D y otros micronutrientes importantes).

La osteoporosis secundaria se puede clasificar como causada por inmovilización prolongada, artritis reumatoide, tumores malignos o absorción intestinal reducida de nutrientes.

Es el más generalizado de los diversos trastornos óseos, que afectan a ambos sexos, pero principalmente a mujeres postmenopáusicas; en los Estados Unidos, la mayoría de los adultos mayores de 50 años padecen osteoporosis o baja densidad ósea.

La causa es un desequilibrio entre los osteoblastos y los osteoclastos; la primera categoría de células contribuye a la formación ósea, mientras que la segunda contribuye a la reabsorción ósea, por lo que si los osteoclastos funcionan más rápidamente que los osteoblastos, el hueso se deteriora. Durante la menopausia, la producción de osteoclastos aumenta debido a la pérdida de estrógenos, lo que conduce a un aumento en las citoquinas correlacionadas con la producción de osteoclastos. En la segunda forma, la actividad de los osteoblastos disminuye con la edad.

Los tratamientos preventivos y curativos disponibles incluyen:

• administración de colecalciferol para promover la absorción intestinal de calcio,

• suplementos de calcio y magnesio,

• administración de difosfonatos que inhiben la actividad de los osteoclastos,

• terapia de reemplazo hormonal con estrógeno y progestágenos para mujeres menopáusicas y con testosterona para hombres,

• inhibición de osteoclastos con calcitonina,

• Clodronato con calcitonina subcutánea para el tratamiento del dolor por fractura.

La osteoartritis (OA) se asocia a menudo con osteoporosis en los mayores de edad; este trastorno altamente incapacitante se caracteriza por una erosión progresiva del cartílago articular debido a la degradación de la matriz articular y la pérdida de componentes celulares. El procedimiento de envejecimiento fisiológico de las superficies articulares parece implicar los mecanismos enzimáticos de la OA.

Se sabe que el desequilibrio mecánico que puede implicar a la articulación en su conjunto puede desencadenar la aparición de dicho trastorno.

Esta inestabilidad de la articulación puede ser causada sustancialmente por diferentes factores (tal como traumatismo, inflamación del sistema articular, erosión del cartílago, marcha o postura incorrecta) y puede conducir a una alteración del delicado equilibrio entre la síntesis y la degradación de la matriz extracelular, que se sintetiza principalmente por los condrocitos y sinoviocitos.

Cuando se interrumpe esta situación de homeostasis perfecta pero delicada, la degradación de la matriz supera su síntesis y comienza un procedimiento de degradación lento pero progresivo, que se compensa pobremente con el procedimiento de síntesis correspondiente, como resultado de la pérdida de condrocitos.

La carga excesiva y/o incorrecta de la articulación puede causar una respuesta de condrocitos expresada por la síntesis de las enzimas responsables de la degradación del cartílago. Las enzimas proteasas responsables de la degradación del cartílago se denominan metaloproteasas de matriz (MMP) y se sintetizan en los condrocitos cuando son estimuladas por citoquinas inflamatorias tales como la IL-1 y el TNF-a, que se producen y liberan en la cavidad articular, en la cavidad articular, especialmente al inicio de un trastorno inflamatorio. IL-1 estimula la síntesis de altos niveles de óxido nítrico (responsable de la muerte por apoptosis de los condrocitos) y también inhibe la síntesis de proteoglicanos (componentes de la matriz) por los condrocitos (Dozin B. et al., Matrix Biology, 2002, 21:449-459).

Los tratamientos curativos disponibles incluyen la administración de medicamentos esteroideos y no esteroideos en asociación con inyecciones de viscosuplementación intraarticulares.

Las composiciones farmacéuticas que contienen antioxidantes tales como la curcumina se comercializan actualmente como un tratamiento preventivo y curativo para los trastornos neurodegenerativos mencionados anteriormente y los trastornos inflamatorios en general.

La curcumina (diferuloilmetano; 1,7-bis [4-hidroxi-3-metoxifenil]-1,6-heptadieno-3,5-diona) es una molécula liposoluble y, junto con sus derivados mono- y dimetoxi conocidos como curcuminoides, se obtiene por extracción con solvente del rizoma seco y molido de la planta Curcuma longa (cúrcuma). La cúrcuma se usó históricamente en la medicina ayurvédica india para tratar una amplia variedad de trastornos, pero no fue hasta el siglo XX cuando la investigación científica identificó a la curcumina como el factor responsable de la mayor parte de su actividad biológica. La curcumina ha sido objeto de numerosos estudios preclínicos y clínicos, por lo que su poder antiinflamatorio y antioxidante está bien documentado: posee la capacidad de regular el equilibrio oxidativo de las células, interviniendo en numerosos mecanismos de diferentes maneras; en particular, inhibe una serie de factores con actividad fuertemente inflamatoria (COX 1 y 2, TNF, lipoxigenasa e interferongamma). Finalmente, su eficacia como antitumoral se ha demostrado in vitro (Bengmark S., JPEN, 2006, 30(1):45-51).

Sin embargo, su uso clínico está limitado por su biodisponibilidad muy baja después de la administración oral, debido a la baja absorción gastrointestinal causada por la lipófila de dicho ingrediente activo. Por estas razones, se han hecho muchos intentos para aumentar la biodisponibilidad de la curcumina, como combinarla con piperina (que es tóxica) o con otros aceites Curcuma longa (documento US7,736,679), o encapsularla en liposomas o fitosomas que consisten en fosfolípidos/lecitina (documento EP1991244).

Sin embargo, la disponibilidad oral de curcumina sigue siendo limitada.

La fosfatidilserina es un fosfolípido ácido con tres grupos ionizables (amino, fosfato y carboxilo) que está presente principalmente en la parte interna de la membrana plasmática; numerosos estudios han demostrado su eficacia para facilitar las actividades neuronales que dependen de la membrana celular y para normalizar la densidad de los receptores neuronales para restaurar los niveles correctos de acetilcolina y dopamina.

La PS actualmente en el mercado se basa en los procedimientos de producción y purificación (conocidos para los expertos) que implican la conversión enzimática de fosfatidilcolina (PC) y/o fosfatidiletanolamina (PE) a PS a través de una reacción de transfosfatidilación catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD), con la posterior purificación por extracción final con PS, se produce como un polvo pero se vende principalmente en forma líquida, generalmente mezclado con solventes oleosos que contienen triglicéridos para su formulación como cápsulas blandas.

Sin embargo, este fosfolípido presenta problemas considerables de estabilidad de la formulación por tres razones principales:

- la presencia de trazas de enzima PLD en la composición final de cápsulas blandas que conduce a una rápida descomposición de la PS, seguida por la formación de ácido fosfatídico (PA) y/o fosfatidilglicerol, debido a la sustitución de la serina con el glicerol presente en la cápsula (documento EP1663157);

- en presencia de radicales libres (ROS), PS puede sufrir un procedimiento de peroxidación de lípidos de los ácidos grasos poliinsaturados de la molécula (Bochkov V., Antioxidants & Redox Signaling; 2010, 12(8):1009-1058);

finalmente, la PS también puede sufrir el procedimiento oxidativo de su cabeza polar, la serina, que conduce a la acumulación de AP (Maciel E. et al., J Am Soc Mass Spectrom, 2011,22(10):1804-14).

El documento US 6,733,797 describe la combinación de un fosfoéster y un antioxidante para uso como un suplemento para mejorar la memoria y las capacidades cognitivas. La fosfatidilcolina es el fosfoéster preferido. El documento US2011/229555 describe una composición basada en curcumina para el tratamiento de trastornos neurológicos en la que este principio activo se puede incluir en liposomas de fosfolípidos. Este compuesto se debe administrar por vía parenteral. El objeto de la presente invención es una nueva composición farmacéutica que contiene una combinación de sal de sodio de PS y curcumina, porque el solicitante ha descubierto que estabiliza dicho fosfolípido al disminuir y/o detener sus procedimientos múltiples de descomposición y oxidación (descritos anteriormente), permitiendo de este modo la formulación de una combinación estable de PS/curcumina desprovista de productos de degradación para preparar composiciones farmacéuticas (y suplementos) en todas las formas farmacéuticas y no farmacéuticas actualmente conocidas para el experto (cápsulas, barras, soluciones/dispersiones para la preparación de viales).

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe y reivindica nuevos productos farmacéuticos basados en sal de sodio de PS y curcumina para su uso en la prevención y el tratamiento de los trastornos asociados con el envejecimiento cerebral descrito anteriormente, y la prevención y el tratamiento de la osteoporosis y/o la osteoartritis, según las reivindicaciones 1 o 2.

El solicitante ha descubierto que la combinación de curcumina con sal de sodio de fosfatidilserina estabiliza dicho fosfolípido de tal manera que los productos farmacéuticos que contienen dicha combinación no presentan PS en forma degradada/oxidada, o incluso los productos de degradación de PS descritos anteriormente, manteniendo de este modo todas las propiedades farmacológicas de PS sin cambios. El solicitante también ha descrito formas farmacéuticas novedosas tales como cápsulas blandas o comprimidos, soluciones y/o dispersiones, barras u otras formulaciones conocidas para el experto, que contienen la nueva combinación estable que consiste en PS/curcumina.

El objeto de la presente invención es un producto farmacéutico que contiene sal de sodio de PS y curcumina para uso en la prevención o tratamiento de

• enfermedad de Alzheimer, demencia senil y presenil, y demencia vascular;

• osteoporosis primaria y secundaria;

• osteoartritis (OA).

El solicitante ha demostrado el efecto sinérgico de la nueva combinación estable de la sal de sodio de PS/curcumina en la reducción de la producción de óxido nítrico (NO).

Estos resultados son extremadamente importantes, porque el NO está implicado en la patogénesis de:

• el daño de las células oxidativas que se produce, por ejemplo, en la reperfusión después de la isquemia;

• trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil y presenil y la demencia vascular;

• trastornos de la estructura ósea y las articulaciones, tal como la osteoporosis y la osteoartritis.

En el CNS, los patógenos, las condiciones de estrés, la edad o los trastornos neurodegenerativos pueden desencadenar una respuesta inflamatoria provocada por la activación de las células gliales (en particular las células microgliales) que, al secretar moléculas proinflamatorias, neurotransmisores y especies reactivas, tales como NO, modulan dichos procedimientos inflamatorios. En particular, se han encontrado altas concentraciones de NO en las neuronas y la glía, donde contribuye al mantenimiento y la progresión del procedimiento neuroinflamatorio debido a su capacidad particular para crear radicales libres que perjudican la integridad de la célula al someterla a estrés oxidativo (Fernandez AP et al., Curr Pharm Des, 20l0, 16(25):2837-50). Además, el NO también parece estar implicado en los procedimientos de desarrollo óseo al aumentar la diferenciación de los osteoclastos, comprometiendo de este modo la densidad mineral ósea (Ninomiya JT, Poster Session-Bone Cell Biology, 2001, 47th AM of Orthopaedic Research Society, California). Finalmente, se ha demostrado la presencia y el papel activo del NO en el tejido articular de los pacientes que sufren de OA: una alta concentración de NO inhibe la actividad mitocondrial de los condrocitos y sinoviocitos y provoca la formación de radicales libres y, por consiguiente, la muerte celular.

Las especies inflamatorias fuertemente implicadas en los procedimientos descritos incluyen citoquinas, especialmente interleucinas. Son producidos por macrófagos activados y son responsables de una serie de actividades celulares, incluida la apoptosis. En particular, se ha demostrado que en las células del sistema nervioso, las interleucinas están implicadas en la cascada inflamatoria que influye en el desarrollo y el curso de los trastornos degenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer (Kitazawa et al., J Immunol, 2011, 187, 6539-6549).

El papel de la PS en la inhibición de la enzima responsable de la síntesis de NO y la consiguiente desaceleración del procedimiento de osteoclastogénesis que causa la pérdida de hueso trabecular es bien conocida (Aramaki Y, Biochem Biophys Res Commun, 2001,280(4):982-7).

Finalmente, también se conoce la capacidad de la curcumina para inhibir la producción de NO mediante la regulación de la enzima NO sintetasa; debido a su capacidad antiinflamatoria, la curcumina ha sido probada en trastornos neurodegenerativos, OA y prevención del deterioro óseo (Kim WK,j Cell Biochem, 2011, 112(11):3159-66).

El solicitante ha descubierto ahora sorprendentemente, y posteriormente ha demostrado, el efecto sinérgico de la nueva combinación estable de sal de sodio de PS/curcumina en la reducción de la producción de óxido nítrico (NO) en las células de la microglía después de la estimulación con agentes proinflamatorios (LPS).

Este resultado fue totalmente inesperado, y en vista de las implicaciones conocidas de NO descritas anteriormente, apoya los nuevos usos terapéuticos de la composición farmacéutica que contiene la combinación estable de PS/curcumina tanto en los trastornos neurodegenerativos como en los que implican el aparato óseo.

El objeto de la presente invención es, por lo tanto, el producto farmacéutico a base de sal de sodio de PS/curcumina para uso en la prevención o tratamiento de:

• enfermedad de Alzheimer, demencia senil y presenil, y demencia vascular;

• osteoporosis primaria y secundaria;

• osteoartritis (OA).

La sal de sodio de PS utilizable en la combinación descrita se produce debido a la enzima PLD que cataliza la transfosfatidilación entre PC y serina, una reacción que puede tener lugar en un ambiente acuoso (documentos EP1231213, EP1048738) o un sistema bifásico de agua/solvente. (Documentos EP0776976, EP1890706). Sin embargo, es preferible usar una PS producida según la Patente EP1890706, en el que la PS se puede producir en presencia de un óxido de metal bivalente en un entorno de reacción de agua-alcohol, un entorno que contiene un solvente aprótico o un sistema bifásico; la preparación de PS en un sistema bifásico formado por una solución acuosa y un solvente orgánico en presencia de óxido de calcio es aún más preferible, debido a que este sistema permite la preparación de una PS con una alta concentración y un alto grado de pureza.

La curcumina (con los derivados de la misma, tales como sus ésteres que actúan como profármacos) usables en esta invención se pueden adquirir como tales (generalmente asociados con otros curcuminoides presentes en proporciones más pequeñas, tal como el complejo de curcumina), o como Biocurcumina ( BCM-95®) asociado con aceites y polímeros que aumentan su biodisponibilidad (documento US20070148263), o formulado en combinación con piperina (Shobha et al., Planta Med, 1998, 64: 353-56), u obtenido como micro o nanoemulsiones/nanodispersiones que usan lecitina y/o ácidos grasos y/o triglicéridos y opcionalmente también surfactantes, tales como Tween® 80, para estabilizar la molécula y hacerla más biodisponible.

La nueva combinación estable que constituye el objeto de la presente invención consiste en:

• sal de sodio de PS en la concentración de 50 a 400 mg por dosis de producto farmacéutico, preferiblemente de 100 a 200 mg;

• curcumina en la concentración de 50 a 1000 mg por dosis de ingrediente activo, preferiblemente de 100 a 600 mg, dependiendo de la composición inicial del ingrediente activo usado en combinación con PS.

Las formas farmacéuticas preferidas son cápsulas blandas, sobres, comprimidos, barras o soluciones/dispersiones para la preparación de viales.

Las formas farmacéuticas particularmente preferidas son cápsulas blandas y sobres; la combinación de sal de sodio de PS y curcumina se puede formular en composiciones preparadas como sabe el experto que usa, por ejemplo, excipientes lipídicos (tales como ácidos grasos, triglicéridos y/o fosfolípidos); surfactantes (tales como polisorbatos); agentes adsorbentes (tales como sorbitol y manitol); conservantes/antioxidantes (tales como el ácido ascórbico); reguladores de pH (tales como el ácido cítrico); y finalmente, las nuevas composiciones según la invención también pueden contener agentes farmacológicamente/biológicamente activos de origen natural y/o sintético, tales como vitaminas, sales minerales, agentes tónicos (tales como el ginseng y ginkgobiloba), antiinflamatorios y aminoácidos. Algunos ejemplos de formulación de la nueva combinación de PS y curcumina según la invención se exponen a continuación a modo de ejemplo, junto con los resultados del estudio in vitro.

Ejemplo 1: preparación de sobres que contienen 200 mg de PS/400 mg de curcumina

Ingredientes

Los sobres deben contener un granulado uniforme y fluido que sea agradable de tomar y estable a lo largo del tiempo.

La sílice hace que el granulado sea fluido y evita la formación de agregados; el manitol y la lecitina facilitan la dispersión del ingrediente activo en agua, mientras que la fructosa, preferiblemente con un tamaño de partícula inferior a 150 |im, permite la preparación de una mezcla uniforme de PS/curcumina con los excipientes.

Proceso de preparación: Mezcla de ingredientes.

La PS, premezclada con lecitina tamizada adecuadamente y con curcumina, se carga en un mezclador de cubos, y luego todos los excipientes restantes se añaden después del tamizado.

La atmósfera se vuelve inerte con un flujo de nitrógeno filtrado, y la mezcla se lleva a cabo durante 30 minutos. La mezcla se usa luego para rellenar sobres (de nuevo bajo flujo de nitrógeno) que se sellan por calor.

Ejemplo 2: preparación de cápsulas blandas que contienen 100 mg de PS/200 mg de curcumina Ingredientes

Ingredientes de concha

Proceso de preparación: Mezcla de ingredientes.

El turboemulsificador FRYNA VME 400 se usa para este procedimiento; la cantidad descrita de aceite vegetal se vierte primero en esta y se calienta a una temperatura homogénea de 25 °C.

Se añaden la mitad de la cantidad total de PS, curcumina y los ingredientes restantes; se cierra el aparato y se crea un vacío; luego la turbina se activa durante 15 minutos. Se añade la segunda mitad de los ingredientes y se crea el vacío nuevamente. La turbina se activa durante otros 40 minutos. La temperatura no debe superar los 40 °C.

El molino de homogeneización también se activa durante un total de 90 minutos hasta que los constituyentes activos y los ingredientes restantes se dispersan completa y uniformemente.

El molino se apaga, mientras que la turbina permanece en funcionamiento durante otros 10 minutos.

La mezcla obtenida se usa luego para rellenar las cápsulas.

Ejemplo 3:

PS/curcumina: inhibición sinérgica de la producción de NO

Este experimento se realizó para evaluar la capacidad de la combinación estable de PS/curcumina para modular la activación de la microglía in vitro en comparación con el efecto generado por la PS sola y la curcumina sola.

Materiales y métodos

La PS (sal de sodio), producida y purificada según el documento EP1890706 (ejemplo 3), se volvió a suspender en cloroformo/metanol 2: 1, se secó por evaporación y se volvió a suspender en PBS a la concentración final de 100 |iM. Para este experimento se usó curcumina pura al 95%, preparada en DMSO a la concentración final de ingrediente activo de 20 mM.

Modelo experimental

Se seleccionó un modelo de activación glial in vitro que usa la línea celular BV-2 de microglía murina para este experimento:

50,000 células/pocillo se sembraron inicialmente en placas de 96 pocillos y se cultivaron en DMEM que contenía FCS al 10%, glutamina y antibióticos a 37 °C. Si se activan con LPS (lipopolisacárido, una endotoxina de bacterias gramnegativas, normalmente se usa como estímulo proinflamatorio tanto in vitro como in vivo), estas células liberan NO al medio de cultivo; por lo tanto, el experimento implicó estimularlos con 0.1 |ig/ml de LPS durante la noche en presencia o ausencia de PS (10 y 30 |iM) o curcumina (2.5 y 5 |iM) a diferentes concentraciones.

Finalmente, para evaluar la sinergia entre los dos constituyentes activos, se probó la combinación de PS/curcumina en presencia de 0.1 |ig/ml de LPS (como se describió anteriormente):

PS 10 .^M curcumina 2.5 .^M,

y

PS 10 .^M curcumina 5 .^M.

El contenido final de NO en el medio se midió con la prueba de Griess: en resumen, se mezclaron alícuotas de medio con volúmenes iguales de reactivo de Griess (0.1% de N (1-nafil) etilendiamina diclorhidrato, 1% de sulfanilamida y HCl 0.4 M). Después de 15 minutos de reacción, la absorbancia se midió a 570 nm.

Resultados

La figura 1 muestra el efecto causado por la PS y por la curcumina (a las concentraciones mencionadas anteriormente) sobre la liberación de NO en el medio de cultivo por las células BV-2 de la microglía murina: ambas moléculas inhiben la liberación de NO en el medio de manera dependiente de la dosis, por lo que tanto la PS como la curcumina reducen la producción de NO en las células activadas por LPS, confirmando de este modo su poder antiinflamatorio descrito en la literatura y mencionado anteriormente.

La figura 2 demuestra clara e inequívocamente el efecto sinérgico provocado por la nueva combinación estable de PS/curcumina en la inhibición de la liberación de NO por la microglía activada: de hecho, la PS 10 |iM combinada con la curcumina 5 |iM inhibe el 50% de la liberación de NO en el medio de cultivo, mientras que un solo tratamiento de PS 10 |iM no supera el 10%, y un solo tratamiento de curcumina 5 |iM causa menos de 20% de inhibición.

El efecto sinérgico se debe (al menos en parte) a la estabilización de la PS.

Ejemplo 4:

Biodisponibilidad de combinaciones de PS/curcumina

La biodisponibilidad de la curcumina se determinó después de la administración oral de formulaciones que contenían extracto de Curcuma longa combinado con fosfolípidos en diversas proporciones. Los fosfolípidos usados son la fosfatidilserina (PS) y la fosfatidilcolina (PC), que comúnmente se emplean comercialmente para aumentar la absorción de curcumina.

La comparación se realizó frente a administración i.v. de la cúrcuma sola.

Formulaciones y dosis.

Las formulaciones se prepararon de la siguiente manera

Las formulaciones T2 y T3 se prepararon disolviendo la cúrcuma en etanol (500 mg de cúrcuma/75 mL de EtOH), calentando las soluciones a 60 °C y añadiendo los fosfolípidos a la solución resultante. Luego la solución se colocó bajo agitación durante 3 horas, para inducir la formación de liposomas. El solvente se extrajo al vacío. Las formulaciones se prepararon antes de cada tratamiento volviendo a suspender la mezcla de liposomas en solución reguladora de fosfato pH 7.4 (14.7 mL).

Animales y tratamiento

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley (peso corporal 225-250 g). Todos los animales se pesaron cada día de tratamiento y se controlaron a intervalos regulares para identificar cualquier reacción al tratamiento. Cada animal fue identificado por un color pulverizado en su espalda antes del experimento. Al final del experimento, los animales se sacrificaron después de la anestesia por sobredosis i.v. de pentotal sódico, Intervet. El experimento se llevó a cabo de conformidad con la legislación italiana aplicable (Legislative Decree 116/92).

Muestras de sangre

Tratamiento i.v. (T1): se tomaron muestras de sangre de la vena caudal después de 3, 10, 20, 60, 90, 120, 180 y 360 min.

Tratamientos orales (T2-T3): se tomaron muestras de sangre de la vena caudal después de 10, 30, 60, 90, 120, 180, 360 y 480 min.

Análisis farmacocinético

Se consideraron los siguientes parámetros para cada sujeto:

Cmax Concentración máxima en plasma

Cmax/D Concentración máxima en plasma normalizada a la dosis (Figura 3)

tmax Tiempo necesario para alcanzar la concentración en plasma máxima.

Resultados y conclusiones

La biodisponibilidad de la curcumina se evaluó comparando las formulaciones en liposomas de PS o PC/PS en diversas proporciones con administración i.v. Como se esperaba, la biodisponibilidad absoluta resultó ser muy baja en general, debido al metabolismo del hígado (por ejemplo, debido a la formación de conjugados).

El análisis de datos presentado en la figura 3 indica claramente que la formulación T2 tiene una biodisponibilidad excelente que, poco después de la administración, es realmente comparable con la del tratamiento i.v. La concentración en plasma permanece alta, estable y constante durante mucho tiempo, permitiendo de este modo reducir el número de administraciones diarias. La formulación T3, sin embargo, induce niveles mucho más bajos en la sangre.

Está claro que la fosfatidilserina tiene un efecto que promueve fuertemente la absorción de la cúrcuma, en una medida mucho mayor que la fosfatidilcolina.

De hecho, como la proporción total de cúrcuma: fosfolípido es de 1: 4 en ambas formulaciones orales, la mejora en la biodisponibilidad de la formulación T2 evidentemente depende no solo de la mera presencia de fosfolípidos, que se sabe que se usan para este propósito, sino también en la naturaleza del fosfolípido usado.

Ejemplo 5:

PS/curcumina: inhibición sinérgica de la liberación de IL-1 p

El experimento se llevó a cabo en dos etapas y se diseñó para evaluar el efecto sobre la liberación in vitro de IL-1 p de células BV-2 de microglía estimuladas con LPS después de la administración de PS y curcumina. La IL-1 p es una citoquina fuertemente implicada en los procedimientos inflamatorios que subyacen tanto a los trastornos osteoarticulares como a la neurodegeneración.

Materiales y métodos

Se estimularon células BV-2 de la microglía murina como se describe en el ejemplo 3 (0.1 |ig/ml de LPS durante 16 horas) y luego se trataron con PS y curcumina a la concentración de 1 |iM o 5 |iM. Los niveles de IL-1 p se determinaron mediante ensayo ELISA. El control (CTRL) fue representado por células estimuladas con LPS pero no tratadas.

La figura 4 muestra claramente que ni la PS ni la curcumina, administradas individualmente, inhiben significativamente la liberación de IL-1 p de las células BV-2 estimuladas con LPS; se produce un efecto limitado en las concentraciones más altas (5 |iM) para ambas sustancias.

En la segunda etapa del experimento, los efectos de la combinación de las dos sustancias se evaluaron en el mismo parámetro según el mismo protocolo. Para demostrar la sinergia, se decidió combinar las concentraciones que produjeron el efecto inhibidor más bajo cuando se administraron individualmente.

Los resultados se muestran en la figura 5.

La combinación de PS/curcumina inhibe de manera significativa y sinérgica la liberación de IL-1 p; la sinergia es aún más evidente en vista del hecho de que la mejor inhibición se obtuvo con las concentraciones que dieron los peores resultados en la primera parte del experimento (PS 1 |iM curcumina 1 |iM).

Ejemplo 6:

PS/curcumina: mayor liberación de tubulina pIII

El propósito del experimento fue probar el papel modulador de la PS y la curcumina en los efectos de los procedimientos neuroinflamatorios que inhiben fuertemente la diferenciación neuronal mediante la evaluación de la expresión de la proteína tubulina pIII, un indicador de diferenciación.

Materiales y métodos

El experimento se realizó de acuerdo con la legislación italiana aplicable.

Se usaron cultivos de células madre/células progenitoras neurales (NPCs) obtenidas de la zona subventricular de ratones adultos. Las NPCs se cultivaron en condiciones de diferenciación por disociación mecánica de las neuroesferas y la siembra de las células individuales en placas recubiertas con poli-ornitina y laminina en un medio de cultivo que solo contiene factor bFGF, según las técnicas más avanzadas.

Los cultivos de NPCs obtenidos de este modo se dividieron en partes alícuotas, cada una de las cuales se trató de manera diferente, de la siguiente manera:

a) exposición al medio de cultivo de células microgliales activadas con LPS, para inducir daño inflamatorio que previene o inhibe fuertemente la diferenciación;

b) tratamiento a) y PS y curcumina administrados por separado a diferentes concentraciones;

c) tratamiento a) y PS/curcumina combinados a diferentes concentraciones relativas.

El control estaba representado por las células NPCs no tratadas.

La diferenciación neuronal se evaluó después de 6 días, mediante análisis inmunocitoquímico con anticuerpos dirigidos contra el marcador específico tubulina pIII, extrapolando el % de concentración de proteína presente en el medio.

Los resultados se presentan en la figura 6. Las concentraciones se expresan en |iM.

Como se esperaba en vista de sus propiedades conocidas, en presencia de liposomas de PS sola (1 y 5 |iM) y curcumina sola (1 y 5 |iM), el porcentaje de células positivas a tubulina pIII ya estaba ligeramente elevado en la concentración más baja para ambas sustancias, pero no difirió significativamente de la observada en presencia de LPS sola. Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de PS/curcumina anuló por completo la inhibición de la diferenciación neuronal inducida por el LPS, restaurándola a los valores de control a partir de las concentraciones más bajas usadas.

Estos últimos resultados demuestran que la combinación de liposomas de PS y curcumina tiene un efecto sinérgico innegable en la restauración de la diferenciación neuronal reducida en condiciones de neuroinflamación, a diferencia de las dos sustancias usadas por separado.

En conclusión, en la presente invención, el solicitante ha demostrado:

• que las composiciones farmacéuticas que contienen la nueva combinación estable de PS/curcumina descrita en este documento tienen una biodisponibilidad muy alta después de la administración oral;

• que la nueva combinación estable de PS/curcumina tiene un efecto sinérgico en la reducción de la producción de óxido nítrico (NO);

• que la nueva combinación estable de PS/curcumina tiene un efecto sinérgico en la reducción de la liberación de IL-1p, una citoquina fuertemente implicada en los procedimientos inflamatorios;

• que la nueva combinación estable de PS/curcumina tiene un efecto sinérgico en la promoción de la diferenciación neuronal en células sometidas a estimulación neuroinflamatoria;

y, en consecuencia, describe y reivindica las composiciones farmacéuticas que contienen dicha combinación para su uso en la prevención de los trastornos asociados con el envejecimiento cerebral descrito anteriormente, y en la prevención y tratamiento de la osteoporosis y/o osteoartritis.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un producto farmacéutico que contiene una sal de sodio de fosfatidilserina y curcumina para usar en la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil o presenil o la demencia vascular, en el que la fosfatidilserina está en una cantidad que oscila entre 50 y 400 mg por dosis, y la curcumina está presente en una cantidad que oscila entre 50 y 1000 mg por dosis.

2. Un producto farmacéutico que contiene una sal de sodio de fosfatidilserina y curcumina para su uso en la prevención o el tratamiento de la osteoporosis primaria y secundaria o la osteoartritis, en el que la fosfatidilserina está presente en una cantidad que oscila entre 50 y 400 mg por dosis, y la curcumina está presente en una cantidad que oscila entre 50 y 1000 mg por dosis.

3. Un producto farmacéutico para su uso según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la fosfatidilserina está presente en una cantidad que oscila entre 100 y 200 mg por dosis, y la curcumina está presente en una cantidad que oscila entre 100 y 600 mg por dosis.

4. Un producto farmacéutico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fosfatidilserina se prepara en un sistema bifásico formado por una solución acuosa y un solvente orgánico en presencia de óxido de calcio.

5. Un producto farmacéutico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que también contiene uno o más excipientes lipídicos tales como ácidos grasos, triglicéridos y/o fosfolípidos y/o surfactantes y/o agentes adsorbentes y/o agentes conservantes/antioxidantes, y/o reguladores de pH.

6. Un producto farmacéutico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en forma de cápsulas blandas, sobres, comprimidos, barras, soluciones o dispersiones.

7. Un producto farmacéutico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 en la prevención o tratamiento de la osteoporosis primaria y secundaria.

8. Un producto farmacéutico para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 en la prevención o tratamiento de la osteoartritis.