BR112017024304B1

BR112017024304B1 - Processo para a preparação de um extrato de cérebro animal

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Publication number: BR112017024304B1
Application number: BR112017024304-0A
Authority: BR
Inventors: Josep Escaich Ferrer; Daniel MARTÍNEZ PUIG; Pere Dalmau Castanares; Ramón Ruhí Roura; Joaquima Guix Salichs; Josep RIBAS MAYNOU; Artur ALFOCEA EGÜÉN; Antonio García Pedrosa; Purificación MORALES GARCÍA; Pere León Martín; Marta BADIAS EROLES
Original assignee: Bioiberica, S.A.
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2022-04-05
Also published as: US20180140638A1; JP2018524286A; US10729728B2; ES2750308T3; EP3095451A1; BR112017024304A2; EP3095451B1; WO2016188684A1; JP6942061B2

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL. A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um extrato de cérebro animal. Ela também se refere ao extrato de cérebro obtenível de acordo com o dito processo e ao uso do mesmo como um medicamento, em particular para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios do sistema nervoso central. Ela também se refere a composições que compreendem este extrato e a seu uso para a preparação destas composições.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da preparação de extratos de materiais biológicos e o uso dos mesmos na prevenção e/ou tratamento de doenças e distúrbios neurodegenerativos do sistema nervoso central.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] Doenças neurodegenerativas são um grupo de doenças de causa desconhecida que afetam o sistema nervoso e cuja característica comum é o curso progressivo dos sintomas, refletindo a desintegração gradual de uma parte ou partes do sistema nervoso. Entre as doenças neurodegenerativas que afetam as pessoas, estão doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, epilepsia, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, doença de Parkinson, doença de Huntington ou acidente vascular cerebral.

[0003] As doenças neurodegenerativas não têm um tratamento etiológico e as intervenções terapêuticas são sintomáticas, em alguns casos, e paliativas em todos eles. Elas causam inaptidão e um alto sofrimento físico e psicológico entre os afligidos e seus familiares.

[0004] As repercussões socioeconômicas são muito importantes, uma vez que ao próprio processo da doença deve ser adicionado o impacto psicológico, a perda da qualidade de vida, a incapacidade de trabalho, a perda das habilidades sociais, o cansaço físico e mental dos profissionais de saúde destes pacientes e o custo econômico alto envolvido no cuidado social e médico de todas estas pessoas.

[0005] Alguns fármacos foram descritos na técnica anterior para prevenir e/ou tratar essas doenças. Por exemplo, para o tratamento de sintomas brandos a moderado dos inibidores de colesterase de doença de Alzheimer são usados, como galantamina, rivastigmina e donepezil, e para o tratamento de sintomas moderados a severos desta doença, memantina é usada, que é antagonista do N-metil-D-aspartato. Estas medicações podem causar efeitos colaterais como vertigem, dores de cabeça, constipação, náusea, vômito, perda de peso ou fraqueza muscular.

[0006] Descreveu-se também o uso de composições nutracêuticas e dietéticas compreendendo componentes neurológicos como adjuvantes para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas ou para fortalecer a saúde do sistema nervoso. Entre os componentes neurológicos estão, por exemplo, glicerofosfolipídios como fosfatidilcolina (PC), fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI); esfingofosfolipídios como esfingomielinas e ceramidas; esfingoglicolipídios como gangliosídeos, cerebrosídeos e sulfatídeos.

[0007] Neste aspecto, diferentes processos foram descritos para obter tais componentes neurológicos com graus diferentes de pureza ou como misturas dos mesmos de materiais biológicos como, por exemplo, órgãos de vários animais, leite, nozes, cereais ou fungos.

[0008] Na patente britânica GB1256755, um extrato de mitocôndrias cerebrais é descrito, o qual é adequado para o tratamento ou prevenção de distúrbios do cérebro, especialmente aqueles que afetam o grau de consciência e edema cerebral. O extrato é obtido por uma sequência de centrifugações em velocidades diferentes de um cérebro homogeneizado em uma solução aquosa compreendendo manitol e EDTA, e que é ajustado para um pH de 7,4.

[0009] No pedido de patente japonês JP-A-1016795 são descritos extratos de cérebro bovino preparados a partir da extração com sulfato de amônio aquoso. Com este processo, são obtidas frações de proteína, fosfolipídios e de esfingolipídios. No pedido de patente russo RUA-1994012010, é descrito um processo para a extração de nervone cerebroside de um cérebro porcino. A extração é executada com acetona, o filtrado é precipitado com etanol e o produto final é purificado com lavagem em acetona.

[0010] No pedido de patente chinês CN-A-85102590, é descrito um processo para obter um extrato de gangliosídeos cerebrais em que uma resina adsorvente é usada para a separação do produto ativo. No pedido de patente chinês CN-A- 1522752, é descrito o uso deste extrato para o tratamento de distúrbios neurológicos do cérebro. No pedido de patente chinês CN-A-1596733, é descrito um processo para a preparação de um extrato de cérebro bovino ou porcino que compreende a moagem dos cérebros, o tratamento dos mesmos com uma combinação de enzimas, hidrólise com ácido clorídrico, neutralização e liofilização. De acordo com a descrição, este extrato é adequado para melhorar o estado nutricional do corpo e a regulação do funcionamento do cérebro.

[0011] No pedido de patente chinês CN-A-1771992, é descrito um extrato de cérebro de um mamífero que compreende polipeptídeos, lisina, ácido glutâmico e açúcar.

[0012] De acordo com a descrição, o extrato é adequado para regular e melhorar o metabolismo de cérebro, como também para o tratamento de doenças vasculares.

[0013] Na patente espanhola ES540861, é descrito um método para a extração dos gangliosídeos que compreende a homogeneização do cérebro de um animal porcino, bovino ou ovino em uma solução de metanol e água na presença de um tensoativo, purificação através de uma coluna e uma dessalinização final do extrato através de uma coluna.

[0014] No pedido de patente internacional WO-A-2010/007620, é descrito um extrato de cérebro porcino que inclui uma mistura de peptídeos e proteínas com um peso molecular de pelo menos 5000 Da. Descreve-se também seu uso como protetor das células do músculo e neurônios contra hipoxia e apoptose.

[0015] No artigo Jittiwat et al., Porcine Brain Extract Attenuates Memory Impairments Induces by Focal Cerebral Ischemia, Am. J. Applied Sci., 2009, 6(9), 1662-1668, é descrito um extrato cerebral porcino, que compreende uma mistura dos aminoácidos ácido aspártico e ácido glutâmico, e seu uso como neuroprotetor. No artigo Thukham-Mee et al., Neuroprotective Effect against Alzheimer’s Disease of Porcine Brain Extract, Am. J. Applied Sci., 2012, 9(5), 700-708, é descrito o uso do mesmo extrato como suplemento dietético ou adjuvante contra a doença de Alzheimer e outros prejuízos cognitivos devido ao envelhecimento.

[0016] No pedido de patente internacional WO-A-2006/114790, são descritas misturas de lipídios polares que são obtidos a partir de materiais diferentes do cérebro.

[0017] Estas misturas contêm PC, PE, PS, PI e esfingofosfolipídios como esfingomielina, e é descrito seu uso como suplemento alimentício.

[0018] No pedido de patente europeu EP-A-2309854, é descrito um processo para a preparação de esfingomielina de pureza alta, que compreende a extração da fração de lipídios totais a partir de um material biológico com uma mistura de um hidrocarboneto alifático e uma cetona hidrossolúvel para obter uma fração insolúvel contendo esfingomielina, que é purificada através de tratamento com uma fosfolipase.

[0019] Extratos de lipídios obtidos de diferentes fontes naturais, vegetal e animal, também estão comercialmente disponíveis.

[0020] A empresa Avanti Polar Lipids, Inc. comercializa, entre outros produtos, vários extratos naturais de ovo, coração, cérebro, fígado, soja, levedura e de E. coli. Entre eles, há um extrato de cérebro de lipídios completo que é obtido através da extração com uma mistura de clorofórmio e metanol e que contém 26% em peso de PC, 10,6% em peso de PS, 1,6% em peso de PI, 16,7% em peso de PE, 2,8% em peso de ácido fosfatídico e 58,7% em peso de compostos não identificados. Também, um extrato de lipídios polares de cérebro que é obtido do extrato de lipídios completo através de precipitação com acetona e extração do precipitado obtido com dimetil éter. De acordo com a informação técnica, este contém 12,6% em peso de PC, 18,5% em peso de PS, 33,1% em peso de PE, 4,1% em peso de PI, 0,8% em peso de ácido fosfatídico e 30,9% em peso de compostos não identificados.

[0021] Apesar das soluções descritas na técnica anterior, continua uma necessidade por fornecer um novo processo, facilmente implementável em uma escala industrial, para a preparação de extratos com combinações específicas de componentes neurológicos a serem usados na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e para fortalecer a saúde do sistema nervoso. OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0022] O objetivo da presente invenção é um processo para a preparação de um extrato de cérebro animal.

[0023] Outro aspecto da invenção é um extrato de cérebro obtenível de acordo com o dito processo.

[0024] Outro aspecto da invenção é uma composição que compreende este extrato.

[0025] Outro aspecto da invenção é este extrato para uso como um medicamento.

[0026] Outro aspecto da invenção é o uso deste extrato para a preparação de composições.

FIGURAS FIGURA 1

[0027] Na figura 1 é mostrado um esquema de uma modalidade preferida do processo da invenção.

FIGURA 2

[0028] Na figura 2.1, são mostrados os resultados que correspondem à alternação espontânea no teste de labirinto Y exibidos na TABELA V do Exemplo 3A. Com este teste, a memória de funcionamento espacial é avaliada. Na abscissa, estão os grupos de tratamento e nas ordenadas está representada a porcentagem de valor médio de alternação (*** p < 0,001 vs. grupo de controle tratado com veículo e Sc-A β; ### p < 0,001 vs. o grupo tratado com veículo e Aβ25-35; teste de Dunnett).

[0029] Na figura 2.2, são mostrados os resultados que correspondem à alternação espontânea no teste de labirinto Y exibido na TABELA VI do Exemplo 3A. Com este teste, a memória de funcionamento espacial é avaliada. Na abscissa estão os grupos de tratamento e nas ordenadas está representado o valor médio da diferença vis-à-vis o grupo de controle tratado com veículo e Sc- A_ (grupo 1) da porcentagem de alternação para o grupo tratado com veículo e Aβ25-35 (grupo 2), o grupo tratado com o extrato da invenção (grupo 3), o grupo tratado com um extrato que compreende DHA (grupo 8), e o grupo tratado com o extrato da invenção e o extrato que compreendem DHA (grupo 11). As diferenças entre os grupos 2 e 3 não são significativas, enquanto os grupos 8 e 11 são significativamente diferentes um do outro e vis-à-vis os outros dois grupos (** p < 0,01 vs. o grupo tratado com veículo e Aβ25-35; ## p < 0,01 vs. o grupo tratado com veículo e A_25-35 e com o grupo 8; teste de Tukey).

FIGURA 3

[0030] Na figura 3, estão mostrados os resultados correspondentes ao teste de evitação passiva conforme exibido na TABELA VIII do Exemplo 3A. Com este teste, a memória a longo prazo contextual é avaliada. Na abscissa estão os grupos de tratamento e nas ordenadas está o valor médio do tempo de latência durante a etapa (Figura 3.1) e o tempo de latência de fuga (Figura 3.2), ambos expressos em segundos (* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. o grupo de controle tratado com veículo e Sc- Aβ25-35; # p < 0,05, ### p < 0,001 vs. o grupo tratado com veículo e Aβ25-35; teste de Dunnett).

FIGURA 4

[0031] Na figura 4, estão mostrados os resultados que correspondem ao ensaio de peroxidação de lipídio exibido na TABELA IX do Exemplo 3A. Nas ordenadas estão representados os grupos de tratamento e na abscissa o valor médio de equivalentes de CHP por peso de tecido molhado (ECHP) (** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. o grupo de controle tratado com veículo e Sc.A_; ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. O grupo tratado com veículo e Aβ25-35; teste de Dunnett).

FIGURA 5

[0032] Na figura 5 são mostrados os resultados que correspondem ao ensaio de citocinas pró-inflamatórias exibidos na TABELA XI do Exemplo 3B. Nas ordenadas estão representados os grupos de tratamento, e na abscissa o valor médio expresso em pg/ml para cada uma das citocinas IL1β (figura 5.1), IL6 (Figura 5.2) e TNFα (Figura 5.3) (***p < 0,001 vs. o grupo de controle tratado com veículo e Sc-Aβ_; ## p <0,01, ### p < 0,001 vs. o grupo tratado com veículo e Aβ25-35; teste de Dunnett). O resultado do grupo de controle 1 é considerado como base 100 e os outros grupos se referem a este.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] O objetivo da presente invenção é um processo para a preparação de um extrato de cérebro animal, que compreende:

[0034] submeter os cérebros picados a uma extração com uma mistura de etanol:água ou com uma mistura de clorofórmio:metanol e separar a fração líquida, referida como L1,

[0035] destilar o solvente da fração líquida L1 e precipitar com acetona para obter a fração sólida, referida como S2,

[0036] saponificar a fração sólida S2, descartar os produtos solúveis em acetona resultantes da saponificação e obter a fração sólida, referida como S3.

[0037] Os autores da presente invenção desenvolveram um novo processo para a preparação de um extrato de cérebro, em particular de um animal porcino, para sua simplicidade e facilidade para implementação industrial. Este extrato é adequado para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios do sistema nervoso central, uma vez que é capaz de prevenir os déficits da memória de funcionamento e da memória a longo prazo, e também fornecer atividade neuroprotetora visto que reduz os níveis de peroxidação de lipídios e de citocinas pró-inflamatórias.

[0038] Na descrição presente, como também nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma", "a" ou "o" incluem a referência plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0039] No contexto da invenção, o termo "lipídios não polares" refere-se àqueles compostos de lipídio insolúvel em água e solúvel em acetona, como, por exemplo, colesterol.

[0040] No contexto da invenção, o termo "lipídios polares complexos" refere-se a compostos de lipídio que incluem em sua estrutura uma ligação de amida com uma metade de ácido graxo, como, por exemplo, esfingomielinas, gangliosídeos, ceramidas e sulfatídeos.

[0041] No contexto da invenção, o termo "fosfolipídio" refere-se àqueles compostos de lipídio que incluem em sua estrutura a glicerina fosfatada e metades de ácido graxo ligadas por grupos éster, por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina.

PROCESSO

[0042] O processo da invenção para a preparação do extrato de cérebro animal é um processo simples que permite a obtenção de um extrato que tem um perfil específico de lipídios polares complexos que fornecem propriedades neuroprotetoras notáveis, como debatido abaixo.

[0043] No processo da invenção, os cérebros de mamíferos são empregados como material bruto, preferivelmente de origem porcina, bovina ou ovina e mais preferivelmente de origem porcina.

[0044] No processo da invenção, são usados cérebros picados. Os cérebros podem ser triturados por métodos bem conhecidos ao versado.

EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS POLARES COMPLEXOS E DE FOSFOLIPÍDIOS

[0045] No processo da invenção, uma extração dos cérebros picados é executada empregando uma mistura de etanol:água, em geral em uma razão compreendido entre 80:20 e 60:40 expressa por (v/v), preferivelmente entre 75:25 e 65:35 e mais preferivelmente 70:30. Alternativamente, a extração é realizada usando uma mistura de clorofórmio:metanol em uma razão compreendida entre 70:30 e 60:40, mais preferivelmente entre 68:42 e 65:45 e mais preferivelmente 66:33. A dita extração é, em geral, executada sob agitação em uma temperatura compreendida entre 40°C e 70°C, preferivelmente entre 50°C e 65°C e mais preferivelmente entre 55°C e 60°C, durante um tempo mínimo de 4h, preferivelmente por um mínimo de 6h e mais preferivelmente por um mínimo de 8 h. Nesta extração, o resíduo sólido é descartado e o processo da invenção continua com a fração líquida, que é referida como L1.

[0046] Este processo de extração com a mistura de etanol:água ou clorofórmio:metanol pode ser repetido várias vezes. Neste caso, os sobrenadantes das várias extrações são agrupados antes de continuar com o processo. Preferivelmente, a dita extração é executada pelo menos duas vezes.

[0047] O processo da invenção continua com a fração líquida L1.

EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS NÃO POLARES

[0048] Em uma modalidade preferida, o processo da invenção compreende uma etapa anterior de remoção de gordura dos cérebros através de extração com um solvente selecionado a partir de acetona, hexano e um fluido supercrítico, como anidrido carbônico, em condições supercríticas. Preferivelmente acetona, é usada.

[0049] Na dita etapa, os cérebros são desengordurados antes da extração com a mistura de etanol:água ou clorofórmio:metanol, por meio de uma extração dos cérebros picados com um dos solventes supracitados. Tal extração permite a remoção substancial de colesterol e lipídios não polares.

[0050] O processo da invenção preferivelmente compreende uma etapa que consiste em submeter os cérebros picados a uma extração com acetona. Após tal extração, a fração líquida, que substancialmente compreende colesterol e lipídios não polares, foi descartada, e o processo da invenção continua com a fração sólida com gordura removida.

[0051] Dentro do contexto da invenção, a remoção substancial de colesterol significa que o seu teor não excede a 10% em peso com relação ao peso seco dos cérebros picados e desengordurados, preferivelmente 5% e com mais preferência 1%.

[0052] Usualmente, a extração dos cérebros picados com o solvente é repetida várias vezes até o teor de água da fase líquida ser menor que 5% em peso.

[0053] Os cérebros picados e desengordurados são escoados e secados, em geral, sob vácuo em uma temperatura compreendida entre 30°C e 80°C, preferivelmente entre 40°C e 70°C, mais preferivelmente entre 50°C e 65°C e ainda mais preferivelmente a 60°C.

[0054] Deste modo, a fração sólida com gordura removida é obtida como um produto em pó que é incorporado no processo da invenção. DESTILAÇÃO DO SOLVENTE E PRECIPITAÇÃO COM ACETONA

[0055] O processo da invenção compreende a destilação do solvente ou solventes da fração líquida L1 e precipitação com acetona para obter a fração sólida S2.

[0056] O solvente vem da extração realizada na etapa do processo da invenção empregando etanol:água ou clorofórmio:metanol.

[0057] A destilação do solvente ou solventes pode ser realizada por processos bem conhecidos pelo versado na técnica, por exemplo, sob vácuo e em uma temperatura compreendida entre 50°C e 65°C, preferivelmente a 60°C.

[0058] Na precipitação com acetona, um volume de acetona de 3 a 5 vezes é, em geral, usado, e preferivelmente 4 vezes.

[0059] A adição de acetona à solução aquosa obtida após a destilação de etanol resulta na precipitação dos lipídios polares complexos e fosfolipídios em forma de fração sólida S4. Após a decantação e a remoção da fração líquida, o sólido obtido pode ser lavado com acetona várias vezes. Em geral, são empregados 2 a 4 volumes de acetona no sólido, preferivelmente 3 volumes, e é mantido sob agitação aproximadamente durante um tempo compreendido entre 20 min e 1 h, preferivelmente 30 min, em temperatura ambiente. Em cada lavagem com acetona, o sobrenadante é descartado e a fração sólida que contém os lipídios polares complexos e fosfolipídios é mantida. Preferivelmente, a dita fração sólida é secada sob vácuo a uma temperatura compreendida entre 30°C e 80°C, preferivelmente entre 40°C e 70°C, mais preferivelmente entre 50°C e 65°C e ainda mais preferivelmente a 60°C. Desse modo, um sólido é obtido em forma de produto em pó, referido como fração sólida S2, a qual é submetido à saponificação.

[0060] O processo da invenção continua com a fração sólida S2, preferivelmente seca.

SAPONIFICAÇÃO

[0061] A fração sólida S2 é saponificada. Preferivelmente, a saponificação é realizada com esta fração suspensa em água.

[0062] O resultado da saponificação da fração sólida S2 é uma mistura que compreende os lipídios polares complexos que substancialmente constituem o extrato da invenção e também os compostos da saponificação dos fosfolipídios que são encontrados na dita fração sólida, entre eles os ácidos graxos, possivelmente na forma de sabões.

[0063] A saponificação da dita fração sólida pode ser realizada por processos padrões bem conhecidos, como, por exemplo, suspendendo a dita fração em uma solução aquosa de um hidróxido de álcali, preferivelmente hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, mais preferivelmente hidróxido de potássio, a uma concentração compreendida entre 0,3 M e 3 M, mais preferivelmente entre 0,4 M e 1 M e mais preferivelmente 0,5 M, em uma temperatura compreendida entre 30°C e 80°C, preferivelmente entre 40°C e 70°C, mais preferivelmente entre 50°C e 65°C e ainda mais preferivelmente a 60°C, e durante um período de tempo compreendido entre 3 h e 12 h, preferivelmente entre 5h e 10 h, mais preferivelmente entre 7 h e 9 h e ainda mais preferivelmente 8 h. A saponificação desta fração pode ser também realizada usando enzimas, como lipases. Neste caso, a saponificação é preferivelmente realizada em uma temperatura compreendida entre 50°C e 60°C, preferivelmente a 55°C, e a um pH compreendido entre 5,5 e 6,5, preferivelmente em pH 6.

[0064] Preferivelmente, a saponificação é realizada através de tratamento com uma solução aquosa de um hidróxido de álcali.

[0065] Uma vez a fração sólida S2 é saponificada, o processo continua com o isolamento do extrato da invenção.

ISOLAMENTO DO EXTRATO DE CÉREBRO

[0066] O isolamento do extrato de cérebro da invenção da mistura de reação de saponificação pode ser realizado por métodos padrão bem conhecidos ao versado na técnica. Por exemplo, pode ser isolado com a acidificação da mistura de reação obtida após a saponificação, precipitação com acetona e separação do sólido obtido, referido como fração sólida S3, que é o extrato objeto da invenção.

[0067] A acidificação pode ser executada usando um ácido mineral, como ácido clorídrico concentrado, para um valor de pH compreendido entre 1 e 3, preferivelmente 2.

[0068] A precipitação com acetona é realizada na suspensão de ácido obtida após a acidificação. Usualmente, a precipitação da acetona de lipídios polares complexos é acrescentada em uma proporção de 3 a 5 volumes de acetona com relação ao volume da suspensão de ácido, preferivelmente 4 volumes.

[0069] Após a precipitação com acetona, a mistura obtida pode ser decantada para descartar o sobrenadante, compreendendo os compostos da saponificação de fosfolipídios, incluindo ácidos graxos. Após decantação e remoção da fração líquida, o sólido obtido pode ser lavado com acetona várias vezes. Em geral, 2 a 4 volumes de acetona são empregados no sólido, preferivelmente 3 volumes, e é mantido sob agitação durante um tempo aproximadamente compreendido entre 20 minutos e 1 hora, preferivelmente 30 minutos, em temperatura ambiente. Em cada lavagem com acetona, o sobrenadante é descartado e a fração sólida, que contém os lipídios polares complexos que substancialmente constituem o extrato da invenção, é retida.

[0070] O processo da invenção preferivelmente ainda compreende uma etapa de lavagem para remover os sais que estão na fração sólida S3, no caso em que a saponificação tenha sido realizada com um hidróxido de álcali. Esta etapa não é necessária no caso de usar uma saponificação enzimática.

[0071] A remoção dos sais da dita fração sólida pode ser executada com a lavagem da dita fração sólida com uma mistura de etanol:água ou acetona:água em uma razão de 80:20 (v/v) entre os dois solventes, até a concentração do ânion do ácido usado na acidificação ser menor que 1%, no caso de o ácido clorídrico ter sido empregado como um agente acidificante na etapa 5) a lavagem é continuada até que a concentração de íon de cloreto seja inferior a 1%.

[0072] Após a possível remoção dos sais, o processo da invenção preferivelmente inclui uma etapa de secagem da fração sólida lavada. Esta etapa de secagem é, em geral, realizada sob vácuo em uma temperatura compreendida entre 30°C e 80°C, preferivelmente entre 40°C e 70°C, mais preferivelmente entre 50°C e 65°C e ainda mais preferivelmente a 60°C.

[0073] Desse modo, um extrato de cérebro é obtido por ter uma composição com um teor de fosfolipídios e triacilglicerídeos inferior a 10%, preferivelmente inferior a 6% e mais preferivelmente inferior a 1% e que é constituído substancialmente por lipídios polares complexos como esfingomielinas, gangliosídeos, ceramidas e sulfatídeos.

[0074] O teor de esfingomielinas é, em geral, compreendido entre 28% e 43% em peso com relação ao peso total do extrato. Dentro do grupo de esfingomielinas, estão inclusas também as dihidroesfingomielinas. O teor de gangliosídeos é, em geral, compreendido entre 34% e 46% em peso com relação ao peso total do extrato. Dentro do grupo de gangliosídeos, estão incluídos os seguintes gangliosídeos:GM1 (monosialotetra-hexosilgangliosídeo), GM2, GM3 (monosialodihexosilgangliosídeo) e GD1. O teor de ceramidas é, em geral, compreendido entre 12% e 19% em peso com relação ao peso total do extrato. Dentro do grupo de ceramidas, estão incluídas as seguintes: ceramidas, di- hidroceramidas, glicosilceramidas e lactosilceramidas. O teor de sulfatídeos é, em geral, compreendido entre 2% e 8% em peso com relação ao peso total do extrato. O extrato contém uma baixa porcentagem de fosfolipídios (por exemplo fosfatidilcolinas, fosfatidilcolina-plasmalogêneos e lisofosfatidiletanol- plasmalogêneos) e triacilglicerídeos que é usualmente inferior a 10%, preferivelmente inferior a 6% e mais preferivelmente inferior a 1% em peso com relação ao peso total do extrato. A soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[0075] Em uma modalidade preferida, o extrato da invenção é obtido por um processo que compreende uma etapa de saponificação que é executada através de tratamento com uma solução aquosa de um hidróxido de álcali. Nesta modalidade preferida, o extrato tem um teor de esfingomielinas compreendido entre 30% e 43% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 32% e 40% e mais preferivelmente entre 33% e 39%. Dentro do grupo de esfingomielinas, estão inclusas também as di-hidroesfingomielinas. O teor de gangliosídeos é compreendido entre 36% e 46% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 38% e 44% e mais preferivelmente entre 39% e 43%. Dentro do grupo de gangliosídeos estão incluídos os seguintes gangliosídeos: GM1 (monosialotetrahexosilgangliosídeo), GM2, GM3 (monosialodi-hexosilgangliosídeo) e GD1. O teor de ceramidas é, em geral, compreendido entre 13% e 19% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 14% e 18% e mais preferivelmente entre 15 e 17%. Dentro do grupo de ceramidas estão incluídas as seguintes: ceramidas, dihidroceramidas, glicosilceramidas e lactosilceramidas. O teor de sulfatídeos é, em geral, compreendido entre 2% e 8% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 3% e 7% e mais preferivelmente entre 4% e 6,5%. O extrato contém uma baixa porcentagem de fosfolipídios (por exemplo fosfatidilcolinas, fosfatidilcolinaplasmalogêneos e lisofosfatidiletanol- plasmalogêneos) e triacilglicerídeos, que são usualmente inferiores a 3%, preferivelmente inferiores a 2% e mais preferivelmente inferiores a 1% em peso com relação ao peso total do extrato. A soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[0076] Em outra modalidade, o extrato da invenção é obtido por um processo que compreende uma etapa de saponificação que é executada através de tratamento enzimático. Nesta modalidade preferida, o extrato tem um teor de esfingomielinas compreendido entre 28% e 41% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 32% e 39% e mais preferivelmente entre 33% e 37%. Dentro do grupo de esfingomielinas, estão inclusas também as di- hidroesfingomielinas. O teor de gangliosídeos é compreendido entre 34% e 44% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 36% e 42% e mais preferivelmente entre 39% e 41%. Dentro do grupo de gangliosídeos, estão incluídos os seguintes gangliosídeos: GM1 (monosialotetra-hexosilgangliosídeo), GM2, GM3 (monosialodi-hexosilgangliosídeo) e GD1. O teor de ceramidas é, em geral, compreendido entre 12% e 18% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 14% e 17% e mais preferivelmente entre 15 e 16%. Dentro do grupo de ceramidas estão incluídas as seguintes: ceramidas, di- hidroceramidas, glicosilceramidas e lactosilceramidas. O teor de sulfatídeos é, em geral, compreendido entre 2% e 7% em peso com relação ao peso total do extrato, preferivelmente entre 3% e 6% e mais preferivelmente entre 4% e 5%. O extrato contém uma baixa porcentagem de fosfolipídios (por exemplo fosfatidilcolinas, fosfatidilcolinaplasmalogêneos e plasmalogêneos de lisofosfatidiletanol) e triacilglicerídeos que é usualmente inferior a 10%, preferivelmente inferior a 8% e mais preferivelmente inferior a 6% em peso com relação ao peso total do extrato. A soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[0077] Outro aspecto da invenção é um extrato de cérebro obtenível de acordo com o processo da invenção. Preferivelmente, o extrato é obtenível de acordo com o processo da invenção que inclui uma etapa de saponificação com um hidróxido de álcali.

COMPOSIÇÃO

[0078] Outro aspecto da invenção é uma composição que compreende o extrato da invenção e pelo menos um veículo ou excipiente.

[0079] A composição da invenção pode ser uma composição farmacêutica, uma preparação alimentícia, uma preparação alimentícia funcional ou um suplemento alimentício.

[0080] Uma composição farmacêutica é uma composição que compreende uma substância ativa com atividade farmacológica, neste caso o extrato da invenção, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0081] Uma preparação alimentícia é uma composição intencionada para consumo humano que é composta de uma matriz como leite, preparações de leite, iogurte, queijo, sucos, sopas, cereais, macarrão, pães, bebidas ou lanches.

[0082] Uma preparação alimentícia funcional é uma composição intencionada para consumo humano que compreende componentes que fornecem benefícios à saúde, por exemplo, ácidos ômega-3, estanóis, esteróis, pré-bióticos, probióticos, antioxidantes, vitaminas e minerais. Dentro deste grupo estão também inclusos aqueles alimentos para propósitos médicos especiais, isto é, alimentos especialmente processados ou formulados intencionados para o controle dietético de pacientes, incluindo lactentes, sob supervisão médica, isto é, projetados para satisfazer toda ou parte das necessidades alimentares de qualquer paciente cuja capacidade para ingerir, digerir, absorver, metabolizar ou excretar o alimento usual, ou certos nutrientes ou metabólitos dos mesmos, está limitada ou ruim, ou está prejudicada, ou daqueles pacientes que precisam de outros nutrientes clinicamente determinados, cujo controle dietético não pode ser alcançado apenas modificando a dieta normal.

[0083] Um suplemento alimentício é uma composição alimentícia cujo propósito é suplementar a dieta normal e consiste em fontes concentradas de nutrientes ou outras substâncias com um efeito nutricional ou fisiológico, sob a forma única ou combinada, comercializada como formas de dose, a saber cápsulas, tabletes, pílulas e outras formas similares, sachês de pós, ampolas de líquidos, garrafas com conta-gotas e outras formas similares de líquidos e pós que devem ser levados em porções unitárias pequenas; em que entre os nutrientes estão as seguintes substâncias: vitaminas, minerais, fontes de extratos botânicos ou extratos de animais (terrestres ou marinhos).

[0084] O veículo ou excipiente que é incluído na composição depende do tipo de composição.

[0085] Quando for uma composição farmacêutica ou um suplemento alimentício, a composição inclui um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, os quais podem ser selecionados daqueles descritos, por exemplo, no manual R.C. Rowe et al, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4- edição, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]. A seleção dos mesmos depende do tipo de composição farmacêutica a ser preparada. A preparação dos tipos diferentes de formas de dosagem farmacêutica é bem conhecida ao versado na técnica e uma descrição está disponível, por exemplo, no manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20- edição, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].

[0086] Preferivelmente, a composição da invenção compreende pelo menos um componente ativo adicional adequado para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e/ou do sistema nervoso central ou para o fortalecimento da saúde do sistema nervoso. Os componentes ativos adicionais podem ser selecionados, por exemplo, do grupo que consiste em ácidos ômega-3, como ácido docosaxanoico (DHA), ácido eicosapentanoico (EPA), extratos contendo os mesmos e misturas dos mesmos, na forma de ácidos ou como triglicerídeos, selênio, genisteína, vitamina C, vitamina E, vitaminas do grupo B, folato ou ácidos graxos de cadeia média.

[0087] Mais preferivelmente, a composição da invenção compreende um extrato de ácidos ômega-3 em forma de triglicerídeos que compreendem DHA e EPA. Mais preferivelmente, o dito extrato compreende entre 40% e 60% em peso de DHA, ainda mais preferivelmente 50% em peso de DHA. Em uma modalidade particularmente preferida, a composição compreende extrato de ácidos ômega- 3 em forma de triglicerídeos que compreendem 50% em peso de DHA, 20% de EPA e os ácidos ácido linolênico (C18:3n3), ácido estearidônico (C18:4n3), C20:4n3, C21:5n3 e n3 ácido docosapentanoico (C22:5n3).

[0088] Outro aspecto da invenção é o uso do extrato de cérebro para a preparação de uma composição selecionada do grupo que consiste em uma composição farmacêutica, um suplemento alimentício, uma preparação alimentícia e uma preparação alimentícia funcional.

USO DO EXTRATO DE CÉREBRO

[0089] Outro aspecto da invenção é o extrato de cérebro obtenível de acordo com o processo da invenção para uso como um medicamento, preferivelmente para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e/ou do sistema nervoso central, e para o fortalecimento da saúde do sistema nervoso. Entre as doenças neurodegenerativas, preferivelmente estão demência, doença de Alzheimer, demência vascular, ataxia de Friedreich, epilepsia, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, doença de Parkinson, doença de Huntington ou acidente vascular cerebral, mais preferivelmente doença de Alzheimer.

[0090] O extrato de cérebro da invenção pode ser administrado oralmente ou parenteralmente. A dose a ser administrada depende do peso do paciente, mas, em geral, a dose diária é compreendida entre 500 mg e 5 g.

[0091] O extrato de cérebro da invenção é obtido por meio de um processo que pode ser facilmente implementado em uma escala industrial, sem a necessidade de purificações prolongadas e tediosas, e também tem propriedades neuroprotetoras significativas.

[0092] Os testes executados em um modelo de camundongo com o extrato de cérebro da invenção, e que são expostos na seção de Exemplos, confirmam a conclusão que, surpreendentemente, a administração oral deste extrato previne os déficits na memória de funcionamento espacial, como também os déficits na memória a longo prazo, e ele também tem uma atividade neuroprotetora em reduzir os níveis de peroxidação de lipídios nos tecidos hipocampais, uma consequência da tensão oxidativa, e reduzir os níveis de citocinas inflamatórias. Observou-se também que os tratamentos diferentes não tiveram nenhum efeito no ganho de peso dos animais. É também observado que a combinação do extrato da invenção com um extrato que compreende DHA e EPA tem um efeito sinergístico nos testes de alternação espontânea, de modo que esta combinação pode ser apropriada para prevenir déficits de memória de funcionamento espaciais.

[0093] A invenção compreende as seguintes modalidades:

[0094] Processo para preparar um extrato de cérebro animal, caracterizado em que compreende:

[0095] submeter os cérebros picados a uma extração com uma mistura de etanol:água ou com uma mistura de clorofórmio:metanol e separar a fração líquida, referida como L1,

[0096] destilar o solvente da fração líquida L1 e precipitar com acetona para obter a fração sólida, referida como S2,

[0097] saponificar a fração sólida S2, descartar os produtos solúveis em acetona resultantes da saponificação e obter a fração sólida, referida como S3.

[0098] Processo de acordo com a modalidade 1, caracterizado em que o cérebro é de origem porcina.

[0099] Processo de acordo com a modalidade 1 ou 2, caracterizado em que a mistura de etanol:água está em uma razão compreendida entre 80:20 e 60:40 expressa em (v/v).

[00100] Processo de acordo com a modalidade 3, caracterizado em que a mistura de etanol:água está em uma razão de 70:30 (v/v).

[00101] Processo de acordo com a modalidade 1 ou 2, caracterizado em que a mistura de clorofórmio:metanol está em uma razão compreendida entre 70:30 e 60:40 expressa em (v/v).

[00102] Processo de acordo com a modalidade 5, caracterizado em que a mistura de clorofórmio:metanol está em uma razão 66:33 expressa em (v/v).

[00103] Processo de acordo com quaisquer das modalidades 1 a 6, caracterizado em que compreende uma etapa anterior de remoção de gordura dos cérebros através de extração com um solvente selecionado de acetona, hexano e anidrido carbônico em condições supercríticas.

[00104] Processo de acordo com a modalidade 7, caracterizado em que a etapa anterior de remoção de gordura dos cérebros é realizada com acetona.

[00105] Processo de acordo com quaisquer das modalidades 1 a 8, caracterizado em que a saponificação é realizada através de tratamento com uma solução aquosa de um hidróxido de álcali.

[00106] Processo de acordo com a modalidade 9, caracterizado em que adicionalmente compreende uma etapa de lavar a fração sólida S3.

[00107] Processo de acordo com quaisquer das modalidades 1 a 10, caracterizado em que adicionalmente compreende uma etapa de secar a fração sólida S3.

[00108] Extrato de cérebro obtenível de acordo com o processo de quaisquer das modalidades 1 a 11.

[00109] Extrato de acordo com a modalidade 12, caracterizado em que o teor de esfingomielinas é compreendido entre 28% e 43% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de gangliosídeos é compreendido entre 34% e 46% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de ceramidas é compreendido entre 12% e 19% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de sulfatídeos é compreendido entre 2% e 8% em peso com relação ao peso total do extrato e o teor de fosfolipídios e triacilglicerídeos é inferior a 10%, e a soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[00110] Extrato de acordo com a modalidade 12, caracterizado em que o teor de esfingomielinas é compreendido entre 30% e 43% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de gangliosídeos é compreendido entre 36% e 46% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de ceramidas é compreendido entre 13% e 19% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de sulfatídeos é compreendido entre 2% e 8% em peso com relação ao peso total do extrato e o teor de fosfolipídios e triacilglicerídeos é inferior a 3%, e a soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[00111] Extrato de acordo com a modalidade 12, caracterizado em que o teor de esfingomielinas é compreendido entre 28% e 41% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de gangliosídeos é compreendido entre 34% e 44% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de ceramidas é compreendido entre 12% e 18% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de sulfatídeos é compreendido entre 2% e 7% em peso com relação ao peso total do extrato e o teor de fosfolipídios e triacilglicerídeos é inferior a 10%, e a soma das porcentagens dos componentes do extrato é 100%.

[00112] Composição caracterizada em que compreende o extrato de quaisquer das modalidades 12 a 15 e pelo menos um veículo ou excipiente.

[00113] Composição de acordo com a modalidade 16, caracterizada em que é uma composição farmacêutica, uma preparação alimentícia, uma preparação alimentícia funcional ou um suplemento alimentício.

[00114] Composição de acordo com a modalidade 16 ou 17, caracterizada em que compreende pelo menos um componente ativo adicional adequado para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e/ou do sistema nervoso central ou para o fortalecimento da saúde do sistema nervoso.

[00115] Composição de acordo com a modalidade 18, caracterizada em que o componente ativo adicional compreende um extrato de ácidos ômega-3 na forma de triglicerídeos.

[00116] Composição de acordo com a modalidade 19, caracterizada em que o componente ativo adicional compreende DHA e EPA.

[00117] Extrato de cérebro de quaisquer das modalidades 12 a 15 para uso como medicamento.

[00118] Extrato de cérebro para uso de acordo com a modalidade 21 para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e/ou do sistema nervoso central e para o fortalecimento da saúde do sistema nervoso.

[00119] Extrato de cérebro para uso de acordo com a modalidade 22 para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas selecionadas do grupo que consiste em demência, doença de Alzheimer, demência vascular, ataxia de Friedreich, epilepsia, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, doença de Parkinson, doença de Huntington ou acidente vascular cerebral.

[00120] Extrato de cérebro para uso de acordo com a modalidade 23 para a prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer.

[00121] Uso do extrato de cérebro de acordo com quaisquer de modalidades 12 a 15 para preparar uma composição farmacêutica, uma preparação alimentícia, uma preparação alimentícia funcional ou um suplemento alimentício.

[00122] Em seguida, alguns exemplos são incluídos para ilustrar a presente invenção, mas eles não devem ser considerados como uma limitação da mesma. EXEMPLOS

EXEMPLO 1: PROCESSO PARA PREPARAR O EXTRATO COM SAPONIFICAÇÃO ALCALINA

[00123] Cérebros de porco congelados foram picados e transferidos para o reator para a remoção de gordura. Acetona foi adicionada na quantidade requerida para alcançar uma porcentagem de acetona mais alta que 90%. Após uma hora sob agitação em temperatura ambiente, a suspensão foi deixada repousar por decantação. O sobrenadante foi removido por sugação. Esta operação foi repetida até que o teor de água da fase líquida fosse menos que 5%. O produto foi escoado e secado sob vácuo em uma temperatura de 60°C. Um produto em pó foi obtido (fração sólida com gordura removida).

[00124] O produto em pó obtido na etapa anterior foi ressuspenso em uma solução de etanol:água em uma razão de volume 70:30 (v/v) e em uma proporção 7:1 com relação ao peso de sólido. Permitiu-se agitar em uma temperatura compreendida entre 55°C e 60°C durante um período mínimo de 8 h. Subsequentemente, a agitação foi interrompida e deixada repousar por decantação. O líquido de sobrenadante foi separado através de decantação e enviado a outro reator.

[00125] O sólido que permanece no reator inicial foi submetido a uma segunda ressuspensão na mesma proporção e permitiu-se agitar novamente por pelo menos 4 h em uma temperatura compreendida entre 55°C e 60°C. Subsequentemente, a agitação foi interrompida e foi deixada repousar por decantação. O líquido de sobrenadante foi separado através de decantação e foi enviado ao reator que contém o sobrenadante da primeira extração. Os sobrenadantes combinados constituíram a fração líquida L1.

[00126] Após destilar o etanol, a solução aquosa foi precipitada adicionando, sob agitação, 4 volumes de acetona com relação ao volume inicial.

[00127] Ela foi deixada repousar por decantação e o sobrenadante foi removido. No sólido obtido, foram acrescentados aproximadamente 3 volumes de acetona ao sólido e agitados por pelo menos 30 min. Foi decantado e o sobrenadante foi novamente removido. O produto foi escoado e secado sob vácuo em uma temperatura de 60°C. Desse modo, a fração sólida S2 foi obtida.

[00128] O produto sólido obtido foi ressuspenso em uma solução aquosa de 0,5 M de hidróxido de potássio em uma temperatura de 60°C por 8 h. A suspensão foi neutralizada com ácido clorídrico concentrado a um valor de pH de 2.

[00129] O produto foi precipitado com 4 volumes de acetona com relação ao volume inicial. Foi decantado e o sobrenadante, contendo os ácidos graxos da saponificação do extrato, foi removido.

[00130] Foram adicionados aproximadamente 3 volumes de acetona ao sólido e agitados por pelo menos 30 min. Foi decantado e o sobrenadante foi removido. A fração sólida S3 foi obtida.

[00131] Lavagens foram realizadas com uma solução de etanol: água em uma taxa 80:20 (v/v) até que a concentração de cloreto no sobrenadante fosse inferior a 1%.

[00132] O produto foi escoado e secado sob vácuo em uma temperatura de aproximadamente 60°C.

[00133] O produto foi analisado por HPLC, usando um método com base no método descrito em Castro-Perez et al., Comprehensive LCMS E lipidomic analysis using a shotgun approach and its application to biomarker detection and identification in osteoarthritis patients, J. Proteome Res., 2010, 9(5), 2377-89 (doi: 10.1021/pr901094j). Errata em: J. Proteome Res., 2011, 10(7), 3303-8. A composição do extrato obtido em diferentes bateladas expressa em % em peso é mostrada na Tabela I:

[00134] O extrato obtido com o processo da invenção tem o teor através de grupos de produto como mostrado em Tabela II: TABELA II

[00135] Pode ser observado que o extrato da invenção tem um teor alto de esfingomielinas, gangliosídeos e ceramidas e baixo teor de sulfatídeos. A presença de fosfolipídios e triacilglicerídeos é significativamente baixa.

EXEMPLO 2: PROCESSO PARA PREPARAR O EXTRATO COM SAPONIFICAÇÃO ENZIMÁTICA

[00136] O processo descrito no Exemplo 1 foi substancialmente repetido, mas a etapa de saponificação foi realizada usando a enzima Lecitase Ultra (Novozymes), em vez de usar hidróxido de potássio.

[00137] A fração sólida S2 foi ressuspensa em água em uma proporção de 1/60 (p/v) sólido/água. O pH foi reajustado em 6 e aquecida a 55°C, e assim uma suspensão homogênea foi obtida. A enzima Lecitase Ultra foi adicionada a esta suspensão sob agitação, a uma taxa de 0,2L de enzima por kg da fração sólida S2.

[00138] A suspensão foi mantida sob agitação e à temperatura de 55°C por 6 h. O pH foi controlado para manter o mesmo a um valor de 6.

[00139] Após 6 h, a suspensão foi aquecida para 75°C e mantida nesta temperatura por uma hora. Subsequentemente, o pH foi diminuído para 2 mediante a adição de ácido clorídrico.

[00140] O produto foi precipitado em 4 volumes de acetona com relação ao volume inicial. Foi decantado e o sobrenadante, contendo os ácidos graxos da saponificação do extrato, foi removido.

[00141] Foram adicionados aproximadamente 3 volumes de acetona ao sólido e agitado por pelo menos 30 min. Foi decantado e o sobrenadante foi removido. A fração sólida S3 foi obtida.

[00142] O produto foi escoado e secado sob vácuo em uma temperatura de aproximadamente 60°C.

[00143] Um extrato foi obtido com uma composição substancialmente análoga à do Exemplo 1, exceto que o teor de fosfolipídios e triacilglicerídeos é mais alto, como mostrado na Tabela III:

EXEMPLO 3: ENSAIO DO EXTRATO DE CÉREBRO EM UM MODELO DE CAMUNDONGO

[00144] O extrato de cérebro da invenção foi submetido a vários testes usando um modelo de camundongo com o propósito de determinar seu efeito protetor em relação a doenças neurodegenerativas, usando para este propósito as respostas derivadas do comportamento animal e a análise de marcadores bioquímicos derivada da toxicidade de peptídeo β-amiloide (peroxidação de lipídios e níveis de citocinas pró-inflamatórias).

ESTUDO DAS VARIAÇÕES NO COMPORTAMENTO E NA ATIVIDADE NEUROPROTETORA CONTRA PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDIOS COMPOSTOS E EXTRATOS

[00145] Neste estudo, usou-se um extrato de cérebro obtido de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, solubilizado em água bidestilada.

[00146] Um extrato concentrado de DHA e EPA foi também usado, contendo 50% em peso de DHA e 20% em peso de EPA na forma de triglicerídeos, solubilizado em óleo de gergelim.

[00147] Nos grupos de controle, o óleo de gergelim foi usado como o veículo.

[00148] O peptídeo _-amiloide, A_25-35, Registro CAS No. 131602-53-4, e o peptídeo _-amiloide aleatório, Sc-A_, foram obtidos da empresa Polypeptides (França).

ANIMAIS

[00149] 116 camundongos suíços machos, 5 semanas de idade e pesando de 30 a 35 g foram usados, obtidos da empresa Janvier (França). Os animais de cada grupo foram alojados em gaiolas separadas com acesso livre ao alimento e à água, exceto durante os experimentos comportamentais.

GRUPOS DE TRATAMENTO

[00150] Com os 116 animais, foram constituídos 11 grupos, como mostrado na TABELA IV: ****************

[00151] Entre o dia 1 e o dia 17, os extratos foram administrados oralmente através de gavagem oral uma vez ao dia.

[00152] No dia 8, o pepídeo amiloide Sc-A ou o pepídeo amiloide oligomérico Aβ25-35 foi intracérebroventricularmente injetado (ICV) para provocar toxicidade associada ao pepídeo-amiloide. A preparação dos pepídeos e a injeção dos mesmos foram executadas de acordo com o método descrito em Maurice et al., Amnesia induced in mice by centrally administrered beta-amyloid peptides involves cholinergic dys- function, Brain Res., 1996, 706(2), 181-93.

[00153] No dia 15 (7 dias após a injeção dos peptideos), o teste de alternação espontânea no labirinto Y foi realizado, para avaliar a me- m6ria de funcionamento espacial.

[00154] No dia 17, o teste de evitação passiva foi realizado, para avaliar a memória contextual a longo prazo, com treinamento no dia 16 e sessão de retenc;ao no dia 17.

[00155] Após a sessão de teste para evitar de forma passiva, os animais foram sacrificados no dia 17. As amostras de sangue de cada animal foram colhidas. O hipocampo e o córtex frontal foram disseca- dos, congelados em nitrogênio líquido e depois armazenados a -80'C.

[00156] Os hipocampos foram usados para determinar os niveis de peroxidação de lipidio por meio de um método colorimetrico, utilizando-se de 2 a 6 animais por grupo.

[00157] As outras estruturas do cérebro foram mantidas a -80'C durante 3 meses para possíveis ensaios bioquímicos adicionais.

TESTE DE ALTERNAÇÃO ESPONTANEA

[00158] No dia 7, todos os animais foram testados para desempenho de alternação espontânea no labirinto Y, um índice de memória de funcionamento espacial.

[00159] O labirinto Y foi feito de PVC cinza. Cada braço tinha 40 cm de comprimento, 13 cm de altura, 3 cm de largura ao fundo e 10 cm de largura no topo, e eles convergiam a um angulo igual. Cada animal foi colocado ao término de um braço e foi deixado mover-se livremente através do labirinto durante 8 min. As entradas dos braços, incluindo possíveis retornos no mesmo braço, foram verificadas visualmente. Uma alternação foi definida como uma entrada em todos os três braços em ocasioes sucessivas. 0 número máximo de alternações, portanto, o número total de entradas de braço menos 2, e a porcentagem de alternação foi calculada como (No de alternações atuais/No maximo de alternações ) x 100. Os parametros incluam a porcentagem de alternação (índice de memória) e o número total de entradas de braço (índice de exploração), como descrito em Maurice et al., op. cit., e Meunier et al., The anti-amnesic and neuroprotective effects of do- nepezil against amyloid beta25-35 peptide-induce toxicity in mice in- volve an interaction with the sigma1 receptor, Br. J. Pharmacol., 2006, 149(8), 998-1012.

[00160] Os animais que mostram um comportamento extremo (porcentagem de alternação < 20% ou > 90% ou número de entradas de braço< 10) foram descartados do cálculo. Apenas um animal foi descartado.

TESTE DE EVITAÇÃO PASSIVA

[00161] O aparelho usado para executar este teste consistiu em uma caixa com dois compartimentos (15 x 20 x 15 cm de altura), uma iluminada com paredes de PVC branca e a outra escurecida com pa- redes de PVC pretas e um piso de grade. Uma porta de guilhotina se- parou os dois compartimentos. Cheques elétricos (0,3 mA por 3 s) foram liberados ao chão de grade usando um gerador de cheque (Lafayette Instruments, EUA). A porta de guilhotina foi inicialmente fechada durante a sessão de treinamento. Durante esta sessão, cada animal foi colocado no compartimento branco. Após 5s, a porta foi levantada. Quando o animal entrou no compartimento preto e colocou suas patas no piso de grade, a porta foi fechada e um cheque elétrico foi liberado durante 3s. A latência durante a etapa, que é a latência gasta para entrar no compartimento escuro, e o número de vocalizações foram registrados. O teste de retenção foi realizado 24h após o treino. Cada animal foi colocado no compartimento branco. Após 5s, a porta foi levantada. As latências durante a etapa e de fuga (correspondendo à reentrada no compartimento escuro) foram registradas até 300s, como descrito em Meunier et al., op. cit.

[00162] Neste tipo de teste, os animais que mostram latências menores que 10s durante a sessão de treinamento e durante a sessão de retenção são considerados como não respondendo ao teste e são descartados dos cálculos. Neste estudo, nenhum animal foi descartado.

DETERMINAÇÃO DE PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDIOS

[00163] No dia 17, todos os animais de cada grupo foram sacrificados e ambos os hipocampos foram rapidamente removidos. Eles foram pesados e mantidos em nitrogênio líquido até serem submetidos ao ensaio. Após descongelação, um hipocampo por animal foi homogeneizado em metanol frio (1/10 p/v), centrifugado a 1000g durante 5 min e o sobrenadante foi colocado em um tubo Eppendorf. Em cada tubo, foram adicionados 1 mM de FeSO4 , 0,25 M de H2SO4 , 1 mM de xilenol laranja e foram incubados por 30 min em temperatura ambiente. Após registrar a absorbância a 580 nm (A580_1), 10μI de 1 mM de hidroperóxido de cumeno (CHP) foram adicionados à amostra e incubados por 30 min em temperatura ambiente para determinar o nivel máximo de oxidação. A absorbância foi registrada a 580 nm (A580_2). O nível de peroxidação de lipídio foi calculado como equivalentes de CHP de acordo com a equação:

[00164] CHPE = (A508_1/A508_2) x [CHP] expresso em nmol,

[00165] e expresso como equivalentes de CHP por mg de tecido e como a porcentagem dos dados de grupo de controle (animais tratados com Sc-Aβ e veículo).

ANALISE ESTATISTICA

[00166] Todos os valores, exceto as latências de evitação passiva, foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). As análises foram executadas separadamente para cada composto usando ANOVA unidirecional (valor F), seguido pelo teste de comparação múltipla pós-hoc de Dunnett. As latências de evitação passiva não seguem uma distribuição Gaussiana, e foram analisadas usando um ANOVA nãoparamétrico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.

RESULTADOS

[00167] Na TABELA V (figura 2.1) são mostrados os resultados que correspondem à ALTERNAÇÃO espontânea no teste de labirinto Y, expresso como o valor medição da porcentagem de ALTERNAÇÃO e o erro padrão da média:

[00168] Pode ser observado que:

[00169] - O extrato da invenção previne efetivamente os déficits de memória de funcionamento espacial induzidos por toxicidade de peptídeo β25-35, a partir de uma dose de 200 mg/kg (Grupos 4-6).

[00170] Na TABELA VI (figura 2.2) são mostrados os resultados que correspondem à alternação espontânea no teste de labirinto Y, expressos como médias dos grupos 2, 3, 8 e 11 com relação ao grupo de controle (grupo 1): TABELA VI

[00171] Os resultados dos grupos 2, 3, 8 e 11 podem ser vistas como um projeto fatorial 22 de acordo com a TABELA VII dos fatores (Extrato da invenção e Extrato DHA/EPA) e resultados: TABELA VII

[00172] Os efeitos calculados a partir dos resultados da TABELA VI para cada um dos fatores e sua interação, são como segue:

[00173] Efeito do extrato da invenção: +7,3

[00174] - Efeito do extrato DHA/EPA: +16,5

[00175] - Efeito da interac;ao: +418

[00176] A interac;ao entre os dois extratos e estatisticamente significativa e significa que o efeito da combinac;ao de ambos nãoe aditivo, mas tern um efeito sinergfstico claro.

[00177] Desse modo, pode ser observado que a combinac;ao da dose mais baixa do extrato da invenc;ao (100 mg/kg) com a dose alta (450 mg/kg) do extrato, que compreende DPA e EPA, tern um efeito sinergfstico que e significativamente maior que a soma dos efeitos dos componentes administrados separadamente.

[00178] Embora o grupo tratado com a dose mais baixa do extrato a invenção tenha um efeito comparável ao do grupo tratado com veículo e o peptídeo - amiloide A 25 _35 , para o grupo tratado com o extrato da invenção combinado com um extrato compreendendo DHA, o efeito obtido não é a simples adição dos efeitos de ambos os extratos, mas um efeito mais alto e obtido.

[00179] Na TABELA VIII (figuras 3.1 e 3.2) são mostrados os resultados que correspondem ao teste de evitação passiva, expressos em segundos, como valores médios e erro padrão da média da latência durante a etapa e da latência de fuga: TABELA VIII

[00180] Pode ser observado que o extrato da invenção previne efetivamente os deficits de memória a longo prazo induzidos pela toxicidade de peptídeo A 2 5 _35 , a partir de uma dose de 200 mg/kg (Grupos 4-6) e particularmente de 500 mg/kg.

[00181] Na TABELA IX (figura 4) são mostrados os resultados que correspondem ao teste de peroxidação de lipídio, expresses como o valor médio e erro padrão da média dos equivalentes de CHP por peso de tecido molhado (ECHP): TABELA IX

[00182] Pode ser observado que o extrato da invenção ternatividade neuroprotetora na redução dos níveis de peroxidação de lipídios, uma consequência da tensão oxidativa, a partir de uma dose de 100 mg/kg. Um bloqueio complete e observado a partir de uma dose de 500 mg/kg (Grupos 5 e 6). B) ESTUDO DA ATIVIDADE NEUROPROTETORA RELACIONADA AS CITOCINAS PRO-INFLAMATORIAS COMPOSTOS E EXTRATOS

[00183] Neste estudo, usou-se o extrato de cérebro obtido de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, solubilizado em água bidestilada.

[00184] Nos grupos de controle, o óIeo de gergelim foi usado como veículo.

[00185] 0 peptídeo 13-amiloide A132s-3s, Registro CAS No. 131602- 53-4, e o peptídeo 13-amiloide aleatório, Sc-Al3, foram obtidos da empresa Polypeptides (França).

ANIMAIS

[00186] 72 camundongos suíços machos, 5 semanas de idade e pesando de 30 a 35 g, foram usados, obtidos da empresa Janvier (França). Os animais de cada grupo foram alojados em gaiolas separadas com acesso livre ao alimento e a água, exceto durante os experimentos comportamentais.

GRUPOS DE TRATAMENTO

[00187] Com os 72 animais, 6 grupos de 12 animais cada foram constituidos, como mostrado na TABELA X: TABELA X

[00188] Entre o dia 1 e o dia 31 (para os grupos 1, 2, 5 e 6) ou entre o dia 15 e o dia 31 (para os grupos 3 e 4), os extratos foram administrados oralmente através de gavagem oral uma vez ao dia.

[00189] No dia 22, o pepídeo amiloide Sc-A ou o pepídeo amiloi- de oligomerico A 25_35 foi intracérebroventricularmente injetado (ICV) para provocar toxicidade associada ao pepídeo-amiloide. A preparação dos pepídeos e a injeção dos mesmos foram executadas de acordo com o método descrito em Maurice et al., op. cit.

[00190] No dia 31, os animais foram sacrificados. As amostras de sangue foram colhidas de cada animal. O hipocampo e o córtex frontal foram dissecados e congelados com nitrogênio liquido e mantidos em uma temperatura de -80CC. Em 6 animais por grupo, o s hipocampos foram usados para determinar, por ELISA, os níveis das citocinas pr6- inflamat6rias interleucina-1 (IL1 ), interleucina-6 (IL6) e o fator de necrose tumoral a (TNFa).

ENSAIOS DE ELISA

[00191] Os kits comerciais a seguir foram usados:

[00192] - IL1 : Referencia SEA563Mu (USCN Life Science)

[00193] - IL6: Referencia SEA079Mu (USCN Life Science)

[00194] - TNFa: Referencia EMTNFA01 (ThermoScientific)

[00195] Os hipocampos foram preparados e ensaiados em duplicata de acordo com o seguinte processo: os hipocampos foram homogeneizados após descongelar em uma solução tampão de 50 mM Tris e 150 mM NaCl, em pH 7,5 e sonicados por 10 s. Após centrifugação 5000 g durante 10 minutes a 4CC, os sobrenadantes foram usados para ensaios de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Em cada ensaio, a absorbância a 450 nm foi registrado, e a concentração da amostra foi calculada usando uma curva de calibração. Os resultados foram expressos como pg de marcador por ml de sobrenadante. ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00196] Todos os valores foram expressos como media ± erro padrão da média (SEM). AnálÍses foram executadas para cada tratamento usando ANOVA unÍdÍrecÍonal (valor F), seguÍdo pelo teste de comparação múltÍpla pós-hoc de Dunnett.

RESULTADOS

[00197] Na TABELA XI (figura 5) são mostrados os resultados obtidos para as três citocinas pró-inflamatória, expresses em pg/ml (valor médio e erro padrão da média): TABELA XI

[00198] Na figura 5, os resultados são apresentados de modo que o valor do grupo de controle 1 seja atribuído a 100, e outros grupos se refiram a este valor.

[00199] Pode ser observado que:

[00200] - lnjeção do peptídeo Al325_35 aumentou muito significativa mente a inflamação no hipocampo dos animais em comparação aos animais tratados com o peptídeo 13-amiloide aleat6rio, Sc-Al3.

[00201] - 0 extrato da invenção tem um efeito anti-inflamatório que pode estar relacionado a uma atividade neuroprotetora contra as citocinas inflamatórias induzidas pelo peptídeo Aβ25-35. Em particular, o efeito e mais significativo quando a dose for 100 mg/kg durante 4 semanas ou 1000 mg/kg durante 2 semanas.

Claims

1 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” onde o animal não é humano caracterizado por compreender: 1) submeter os cérebros picados a uma extração com uma mistura de etanol:água ou com uma mistura de cloroforme:metanol e separar a fração liquida, referida como L1, 2) destilar o solvente da fração liquida L1 e precipitar com acetona para obter a fração sólida, referida como S2, 3) saponificar a fração sólida S2, descartar os produtos solúveis em acetona resultantes da saponificação e obter a fração sólida, referida como S3.

2 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o cérebro ser de origem suína.

3 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a mistura de etanol:agua estar em uma razão compreendida entre 80:20 e 60:40, expressa em (v/v).

4 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a mistura de clorofórmio:metanol estar em uma razão compreendida entre 70:30 e 60:40, expressa em (v/v).

5 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender uma etapa anterior de remoção de gordura dos cérebros através da extração com um solvente selecionado de acetona, hexano e anidrido carbônico em condições supercríticas.

6 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a saponificação ser realizada através de tratamento com uma solução aquosa de um hidróxido alcalino.

7 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por adicionalmente compreender uma etapa de lavar uma fração sólida S3.

8 .- “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE CÉREBRO ANIMAL” de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por adicionalmente compreender uma etapa de secagem da fração sólida S3.

9 .- “EXTRATO DE CÉREBRO” caracterizado por ser obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

10 .- “EXTRATO DE CÉREBRO” de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o teor de esfingomielinas estar compreendido entre 28% e 43% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de gangliosídeos estar compreendido entre 34% e 46% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de cerâmidas estar compreendido entre 12% e 19% em peso com relação ao peso total do extrato, o teor de sulfatideos estar compreendido entre 2% e 8% em peso com relação ao peso total do extrato e o teor de fosfolipídios e triglicerídeos ser inferior a 10%, e a soma das porcentagens dos componentes do extrato ser 100%.

11 .- “COMPOSIÇÃO” caracterizada por compreender o extrato como definido na reivindicação 9 ou 10 e pelo menos um veículo ou excipiente.

12 .- “COMPOSIÇÃO” de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por compreender pelo menos um componente ativo adicional adequado para a prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas e/ou do sistema nervoso central, ou para o fortalecimento da saúde do sistema nervoso.

13 .- “COMPOSIÇÃO” de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o componente ativo adicional compreender um extrato de ácidos omega-3 na forma de triglicerídeos.

14 . “EXTRATO DE CÉREBRO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado por ser usado como medicamento.

15 . “USO DO EXTRATO CEREBRAL”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado por ser usado na preparação de uma composição farmacêutica, de uma preparação alimentar, de uma preparação alimentar funcional ou de um suplemento alimentar.