EA021135B1

EA021135B1 - Пролекарства триптолида

Info

Publication number: EA021135B1
Application number: EA201190293A
Authority: EA
Inventors: Ингрид Гунда Георг; Сатиш Пракаш Патил; Ашок К. Салуя; Рохит Чугх; Селвин М. Виккерс
Original assignee: Реджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2015-04-30
Also published as: BRPI1014802B8; KR101821823B1; KR20120015339A; ES2552163T3; JP6000122B2; US8507552B2; MY160392A; CN102596977A; WO2010129918A8; JP2014185181A; CA2964631A1; EA201190293A1; JP2012526148A; CA2760953A1; PL2427467T3; AU2010245669B2; BRPI1014802A2; EP2427467B1; EP2427467A1; HK1168107A1

Abstract

Согласно изобретению предложены соединения формулы Iтакже предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы I, и способы лечения с применением соединений формулы I.

Description

Рак поджелудочной железы представляет собой остро протекающее и изнуряющее заболевание, для которого пятилетняя выживаемость составляет менее 5%. В настоящее время отсутствует эффективная лекарственная терапия, способная эффективно повышать выживаемость пациентов. По сообщениям, в 2006 году было выявлено более 35000 новых случаев рака поджелудочной железы и почти столько же составило число умерших от указанного заболевания. В качестве ключевого фактора отсутствия развития у пациентов ответа на терапию для лечения рака поджелудочной железы и других злокачественных опухолей была исследована устойчивость к апоптозу.

Триптолид представляет собой встречающееся в природе соединение, получаемое из растения Трёхкрыльник Вильфорда (Тпр!егудшт \уПГогйи). Известно, что триптолид подходит для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения при трансплантации (иммуносупрессии) и обладает противораковым и антифертильным действием, а также другими биологическими действиями (Οιιί апй Као, 2003, Игц§8 К.И. 4, 1-18). Триптолид обладает сильным противоопухолевым действием в отношении ксенотрансплантатных опухолей (например, Уапд е! а1. Мо1. Сапсег Тйет, 2003, 2, 65-72). Триптолид представляет собой антиапоптический агент с многочисленными клеточными мишенями, вовлеченными в процесс роста и метастазирования злокачественных опухолей. Триптолид ингибирует активацию ΝΡ-кВ, индуцирует отщепление Ый, блокирует индукцию гена выживания р21 ХУАН/'¹¹’¹ (ХУапд е! а1. 1оцтпа1 о! Мо1есц1аг Мейюше, 2006, 84, 405-415) и ингибирует функцию фактора транскрипции теплового шока 1 (Η8Ρ1), тем самым подавляя эндогенную экспрессию гена Н§р70 (№е8!етйе1йе е! а1. 2006, 1оцтпа1 о! Вю1ощса1 СНетНгу. 281, 9616-9622). Триптолид также выполняет функцию мощного ингибитора ангиогенеза опухоли (Не е! а1. 2010, 1п!. 1оцтпа1 о! Сапсег, 126, 266-278).

В живых клетках существует несколько механизмов, защищающих от неблагоприятных состояний, включая раковые клетки. Синтез семейства белков, называемых белками теплового шока (Η3Ρ8), представляет собой один из указанных защитных механизмов. Основные Η8Ρ включают Η8Ρ90, Η8Ρ70, Η8Ρ60, Η8Ρ40 и более мелкие ΗδΡ. Η8Ρ могут присутствовать в большинстве внутриклеточных компартментов, при этом Η8Ρ70 главным образом локализован в цитозоле.

Известно, что разрегулированная экспрессия Η8Ρ70 связана со многими заболеваниями, включая раковые. Η8Ρ70 в большом количестве экспрессируется в злокачественных опухолях различного происхождения (например: Ηηπ!8^1 е! а1. 2000, Се11 8!ге88 Сйаретопек, 5, 438-442), что приводит к резистентности опухолевых клеток к терапии и плохому прогнозу для пациента (1цс.|ца е! а1. 1994, Вгеа8! Сапсег Ке8, Тгеа!теп! 32, 67-71). Известно, что белок теплового шока 70 (Ηβρ70) активирован и чрезмерно экспрессирован в клетках рака поджелудочной железы по сравнению с нормальными клетками. Кроме того, Η8Ρ70 обладает защитным действием в отношении раковых клеток, ингибируя апоптоз указанных клеток. Было показано, что ингибирование Η8Ρ70 в клетках рака поджелудочной железы увеличивает апоптическую гибель данных клеток (см., например, Адййа881 е! а1., Сапсег Кезеатсй, 67(2) р.616-625 (2007)). Было показано, что триптолид ингибирует рост и метастазирование опухоли поджелудочной железы у мышей. Также было показано, что при применении триптолида в комбинации с ионизирующим излучением его терапевтический эффект при лечении рака поджелудочной железы усиливается (ХУапд е! а1. ΡΐΌα Атег. Аккос. Сапсег Ке8. 2006, 47, аЬ8!тас! #4720 и ХУапд е! а1. С1ш. Сапсег Ке8. 2007, 13, 4891-4899). Считается, что противораковое действие, связанное с триптолидом, возникает в результате снижения уровней белка Η8Ρ70, экспрессируемого в значительных количествах клетками рака поджелудочной железы, по сравнению с нормальными клетками поджелудочной железы. Таким образом, виды терапии с применением триптолида представляют интерес в области медицины в свете потенциального лечения раковых опухолей, которые чрезмерно экспрессируют Η8Ρ70, включая рак поджелудочной железы. См., например, Ρ1ιί11ίρ8 е! а1., Сапсег Ке8еатсй, 67(19), р.9407-16 (2007).

Однако существуют некоторые недостатки, связанные с введением триптолида, и были исследованы различные решения для разрешения данных проблем. Одна из проблем, связанных с природным триптолидом, заключается в том, что он нерастворим в водном растворе. Другая проблема, связанная с природным триптолидом, заключается в плохой биодоступности и токсических побочных эффектах. Известны триптолид, производные триптолида и некоторые пролекарства, обладающие улучшенной растворимостью и сниженной токсичностью. Например, в патенте США 6548537 описаны пролекарства триптолида, обладающие повышенной растворимостью и сниженной токсичностью.

В данной области техники, по существу, известна фосфоноксиметильная группа для получения пролекарств некоторых фармацевтических соединений. Например, Кп8е е! а1., 1. Мей. Сйет., 42, стр.3094-3100 (1999) описывает получение Ν-фосфонооксиметильных пролекарств некоторых соединений для улучшения растворимости в воде.

Тем не менее, пролекарства должны обладать рядом свойств для того, чтобы быть практически полезными. Например, желаемые пролекарства должны быть стабильными для получения составов и введения. Кроме того, после того, как лекарство введено и присутствует в организме реципиента, оно должно быть успешно активировано. Кроме того, как пролекарство, так и активированное соединение должны быть совместимы с биологическими жидкостями, такими как плазма, и гомогенатами тканей. И наконец, активированное соединение, изначально доставляемое в форме пролекарства, должно обладать необхо- 1 021135 димым терапевтическим или фармацевтическим эффектом. Учитывать эти и другие факторы одновременно или совместно сбалансировать с определенными типами соединений может быть непросто. В контексте триптолида и пролекарственных соединений триптолида было трудно достичь улучшенной растворимости в воде, эффективной биодоступности для лекарственных форм для перорального применения, более быстрого высвобождения триптолида ίη νίνο и относительно сниженной или более низкой токсичности в комбинации со значительным ингибированием роста раковых клеток. Например, см. Сйа8кашд с1 а1., ШдЫу \Уа1сг-5>о1иЫс Ргобгидз οί АтНеНшпОис Веп/ши4а/о1е СагЬашаЮз: δνηΐΐιοδίδ. Рйагтасойупаш1С8 апб РЬагтасокшейсз, 1. Меб. Сйет., 51 (5), стр.1111-1114 (2008).

Известны сукцинатные пролекарственные формы триптолида, но им присущи определенные недостатки. См., например, Наггои88еаи е1 а1., Наета1о1ощса 2008, 93(81), 14 АЬ81гас1 0038 и 1<П/еп е1 а1. Еигореап 1оита1 оГ Сапсег 2009, 45, 1764-1772. Наблюдали неполное и неустойчивое превращение сукцинатного пролекарства триптолида.

Таким образом, в области медицины и фармацевтики существует потребность в разработке улучшенных лекарственных средств для лечения раковых опухолей, включая агрессивные солидные раковые опухоли, такие как рак поджелудочной железы. Также существует дополнительная потребность в улучшенной доставке или улучшенных фармакокинетических параметрах, или сниженной токсичности таких лекарственных средств. Также существует потребность в разработке пролекарственных форм триптолида, обладающих улучшенной растворимостью или ускоренным высвобождением активного соединения триптолида, или более терапевтически эффективным высвобождением активного соединения триптолида, или в пролекарственных формах триптолида, обладающих улучшенной биодоступностью.

Краткое описание изобретения

Соответственно, в настоящем изобретении предложено соединение согласно изобретению, представляющее собой соединение формулы I

где каждый К¹ представляет собой Н или (С'-С6)алкил; и каждый К² представляет собой Н или (С'-С6)алкил; η представляет собой 1, 2 или 3; и каждый Х+ представляет собой фармацевтически приемлемый органический катион или неорганический катион.

Согласно частному варианту реализации соединение формулы I представляет собой соединение формулы 1а

где Х+ представляет собой фармацевтически приемлемый органический катион или неорганический катион.

Согласно частному варианту реализации К¹ в соединении формулы I представляет собой Н.

Согласно частному варианту реализации каждый Х+ в соединении формулы I представляет собой Н.

Согласно частному варианту реализации каждый Х+ в соединении формулы I представляет собой литий, натрий, калий, магний, кальций, барий, цинк или алюминий.

Согласно частному варианту реализации каждый Х+ в соединении формулы I имеет формулу ΗΥ+, где Υ представляет собой аммиак, триэтиламин, трометамин, триэтаноламин, этилендиамин, глюкамин, Ν-метилглюкамин, глицин, лизин, орнитин, аргинин, этаноламин или холин.

Согласно частному варианту реализации каждый Х+ в соединении формулы I представляет собой

Ν;ί.

Согласно частному варианту реализации соединение формулы I представляет собой динатриевую соль 14-О-фосфонооксиметилтриптолида, динатриевую соль 14-О-фосфонооксиэтилтриптолида или динатриевую соль 14-О-фосфонооксипропилтриптолида.

Согласно частному варианту реализации соединение формулы I представляет собой динатриевую соль 14-О-фосфонооксиметилтриптолида.

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения рака (например, рака поджелудочной железы, карциномы желчного протока, нейробластомы, рака толстой кишки, рака молочной железы, миеломы, рака желудка, рака печени, глиобластомы, рака яичников, рака ободочной и прямой

- 2 021135 кишки, неходжкинской лимфомы, рака легкого, рака предстательной железы, мелкоклеточного рака легкого, крупноклеточного рака легкого, рака почки, рака пищевода, рака желудка, рака шейки матки или лимфомных опухолей) у млекопитающего (например, человека), включающий введение соединения формулы I указанному млекопитающему (например, человеку).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ ингибирования роста раковых клеток в экспрессирующей Н8Р70 злокачественной опухоли (например, рак поджелудочной железы, нейробластома, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудка, рак печени или глиобластома) у млекопитающего (например, человека), включающий введение ингибирующего эффективного количества соединения формулы I или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения указанному млекопитающему (например, человеку).

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана схема химической реакции для получения соединения 1.

На фиг. 2 показана схема химической реакции, демонстрирующая получение производного триптолида, представляющего собой соединение 1, и последующее ферментативное расщепление - химический распад соединения 1 с высвобождением триптолида.

На фиг. 3 показано ферментативное превращение ίη νίίτο пролекарства триптолида (соединение 1) в триптолид.

На фиг. 4 показано сравнительное влияние триптолида и пролекарства триптолида (соединение 1) на жизнеспособность клеток М1аРаса-2 ίη νίίτο через 48 ч.

На фиг. 5 показано сравнительное влияние триптолида и пролекарства триптолида (соединение 1) на жизнеспособность клеток Рапс-1 ίη νίίτο как через 24 ч, так и 48 ч.

На фиг. 6 показано сравнительное влияние триптолида и пролекарства триптолида (соединение 1) на жизнеспособность клеток 82УР10 ίη νίίτο через 24 ч и 48 ч.

На фиг. 7 показан рост опухоли в контрольной группе мышей с помощью пяти фотографий ίη δίΐιι и одной фотографии опухолей ех νίνο.

На фиг. 8 показан рост опухоли в группе мышей, получавшей триптолид, с помощью трех фотографий ίη 81Щ и одной фотографии опухолей ех νίνο.

На фиг. 9 показан рост опухоли в группе мышей, получавшей пролекарство триптолида (соединение 1), с помощью четырех фотографий ίη δίΐιι и одной фотографии опухолей ех νίνο.

Фиг. 10 представляет собой фотографию серии опухолей ех νίνο из эксперимента ίη νίνο, демонстрирующую сравнительные размеры опухолей для контрольной группы, группы триптолида и группы пролекарства триптолида (соединение 1).

На фиг. 11 показана сравнительная масса (г) опухолей контрольной группы мышей, группы триптолида и группы пролекарства триптолида (соединение 1) из эксперимента ίη νίνο.

На фиг. 12 показан сравнительный объем (см³) опухолей у мышей контрольной группы, группы триптолида и группы пролекарства триптолида (соединение 1) в эксперименте ίη νίνο.

На фиг. 13 показан анализ выживаемости мышей, получавших лечение соединением 1, и контрольных мышей.

На фиг. 14 показан анализ выживаемости мышей, получавших лечение соединением 1, и контрольных мышей.

На фиг. 15 показана опухолевая масса (объем и масса) для мышей, получавших лечение соединением 1 и носителем.

На фиг. 16 показана опухолевая масса (объем и масса) для мышей, получавших лечение соединением 1 и носителем.

На фиг. 17 показана опухолевая масса (объем и масса) для мышей, получавших лечение соединением 1 и носителем.

На фиг. 18 показан объем опухоли для мышей, получавших лечение соединением и носителем.

На фиг. 19 показана жизнеспособность клеток (Нейробластома Ν2;·ι и 8ΚΝ8Η) в присутствии триптолида.

На фиг. 20 показана активность Каспазы 3 в присутствии триптолида.

Подробное описание изобретения Определения

В настоящем описании термин (С1-С₆)алкил относится к алкильным группам, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, которые представляют собой линейные или разветвленные группы. Данный термин представлен в качестве примера группами, такими как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, третбутил, изобутил, н-пентил, неопентил и н-гексил, и т.п.

В настоящем описании термин (С1-С₆)алкокси относится к группе (С1-С₆)алкилО-, где (С1-С₆)алкил является таким, как определено в настоящем описании. Данный термин представлен в качестве примера группами, такими как метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, втор-бутокси, пентокси, 3-пентокси или гексилокси и т.п.

В настоящем описании термин (С₃-С₇)циклоалкил относится к насыщенной или частично ненасыщенной циклической углеводородной кольцевой системе, содержащей от 3 до 7 атомов углерода.

- 3 021135

Данный термин представлен в качестве примера такими группами, как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексен или циклогептан и т.п.

В настоящем описании термин арил относится к фенильному радикалу или орто-конденсированному бициклическому карбоциклическому радикалу, содержащему примерно от девяти до десяти атомов углерода в кольце, в котором по меньшей мере одно кольцо является ароматическим. Данный термин представлен в качестве примера такими группами, как фенил, инданил, инденил, нафтил, 1,2дигидронафтил и 1,2,3,4-тетрагидронафтил.

В настоящем описании термин арил(С₁-С₆)алкил- относится к группе арил-(С₁-С₆)алкил-, где (С₁С₆)алкил и арил являются такими, как определено в настоящем описании. Данный термин представлен в качестве примера такими группами, как бензил и фенэтил, и т.п.

В настоящем описании термин содержащий означает перечисленные элементы или их эквивалент по структуре или функции плюс любой другой элемент (элементы), который не указан. Термины имеющий и включающий также следует рассматривать как неограничивающие, если из контекста не следует иное. Термины, такие как примерно, в целом, по существу и т.п. следует рассматривать как модифицирующие термин или значение так, что оно не является абсолютным, но не включает уровень техники. Указанные термины будут определяться обстоятельствами, при этом термины, которые они модифицируют, понятны специалисту в данной области техники. Это включает, по меньшей мере, степень ожидаемой экспериментальной ошибки, технической ошибки и инструментальной ошибки для конкретной методики, применяемой для измерения значения.

Термины терапевтически эффективное количество и фармацевтически эффективное количество употребляются в настоящем описании, например, для обозначения количества, достаточного для уменьшения или ингибирования ίη νίνο роста раковых клеток при введении живому млекопитающему. Данные термины относятся к количеству, определенному как необходимое для оказания физиологического действия, предполагаемого и связанного с данным активным компонентом, измеренному в соответствии с установленными фармакокинетическими способами и технологиями для данного способа введения.

Термин ингибирующее эффективное количество, употребляемый в связи с количеством активного соединения и композиции согласно настоящему изобретению, относится, например, к проявляемым противоопухолевым свойствам, продемонстрированным с применением стандартных методов анализа культуры клеток.

В настоящем описании термин пролекарство относится к фармацевтическому соединению, для которого необходим дальнейший метаболизм (включая, но не ограничиваясь им, метаболизм в печени) прежде чем оно станет биологически активным.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что соединения согласно настоящему изобретению, содержащие хиральный центр, могут существовать и быть выделены в оптически активных и рацемических формах. Некоторые соединения могут проявлять полиморфизм. Следует понимать, что настоящее изобретение включает любую рацемическую, оптически активную, полиморфную или стереоизомерную форму соединения согласно настоящему изобретению, или их смеси, обладающие подходящими свойствами, указанными в настоящем описании, при этом в данной области техники хорошо известно как получать оптически активные формы, например, путем разделения рацемической формы с помощью перекристаллизации, путем синтеза из оптически активных исходных веществ, путем хирального синтеза или путем хроматографического разделения с использованием хиральной неподвижной фазы.

Соль соединения формулы I может подходить в качестве промежуточного соединения для выделения или очистки соединения формулы I. Кроме того, может быть подходящим введение соединения формулы I в качестве фармацевтически приемлемой кислой или основной соли. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются органические соли присоединения кислоты и неорганические соли.

Термин органический катион или неорганический катион или катионная органическая или неорганическая соль включает органические катионы или неорганические катионы (например, соли металлов или аминов), которые хорошо известны в данной области техники, и включает катионные вещества, которые могут образовывать ионную ассоциацию с О-фрагментами в соединении и не оказывают значительного отрицательного влияния на необходимые свойства пролекарства для целей настоящего изобретения. Термин фармацевтически приемлемые органические катионы или неорганические катионы или фармацевтически приемлемая катионная органическая или неорганическая соль включает органические катионы или неорганические катионы, которые фармацевтически приемлемы для применения у млекопитающего и хорошо известны в данной области техники.

Органические катионы или неорганические катионы включают, но не ограничиваются ими, катионы лития, натрия, калия, магния, кальция, бария, цинка, алюминия и амина. Катионы аминов включают, но не ограничиваются ими, катионы, получаемые из аммиака, триэтиламина, трометамина (ΤΚΙ8), триэтаноламина, этилендиамина, глюкамина, Ν-метилглюкамина, глицина, лизина, орнитина, аргинина, этаноламина, холина и т.п. В одном из вариантов реализации катионы аминов представляют собой катионы, где Х' имеет формулу ΥΗ', где Υ представляет собой аммиак, триэтиламин, трометамин (ΤΚΙ8), триэтаноламин, этилендиамин, глюкамин, Ν-метилглюкамин, глицин, лизин, орнитин, аргинин, этаноламин,

- 4 021135 холин и т.п.

В одном из вариантов реализации подходящие катионные органические или неорганические соли, которые можно применять, включают катионные фрагменты, которые могут образовывать ионную связь с О-фрагментами в соединении, и не оказывают значительного отрицательного влияния на необходимые свойства пролекарства для целей настоящего изобретения, например, повышенную растворимость, стабильность и быстрое гидролитическое высвобождение активной формы соединения. Предпочтительно, X выбран из Ы⁺, К+ или Να'. Более предпочтительно, X представляет собой Να', таким образом образуя динатриевую соль.

Фармацевтически приемлемые соли также могут включать соли, образованные кислотами, которые образуют физиологически приемлемый анион, например, тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, а-кетоглутарат и α-глицерофосфат. Также могут быть образованы подходящие неорганические соли, включая гидрохлоридные, сульфатные, нитратные, бикарбонатные и карбонатные соли. Соли, включая фармацевтически приемлемые соли, могут быть получены с использованием стандартных процедур, хорошо известных в данной области техники, например, путем осуществления взаимодействия достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой с получением физиологически приемлемого аниона.

Настоящее изобретение включает как свободную кислоту (например, -ОР(О)(ОН)₂), моносоли (например, -ОР(О)(ОН)(О^-Х+)), так и двойные соли (например, -ОР(О)О^-Х+)₂) соединений формулы I. Указанная кислота и соли могут быть очищены с помощью различных методов, хорошо известных в данной области техники, таких как хроматография с последующей лиофилизацией или перекристаллизацией.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что соединение формулы I, где Х' представляет собой органический катион или неорганический катион, может быть превращено в соединение формулы I, содержащее один или более разных органических или неорганических катионов. Указанное превращение может быть осуществлено с использованием множества хорошо известных технологий и веществ, включая, но не ограничиваясь ими, ионообменные смолы, ионообменную хроматографию и селективную кристаллизацию.

Конкретным значением К¹ является Н или (С_р -С₆)алкил.

Другим конкретным значением К¹ является Н.

Другим конкретным значением К¹ является (С₁ -С₆)алкил.

Другим конкретным значением К¹ является метил или этил.

Конкретным значением К² является Н или (С₁ -С₆)алкил.

Другим конкретным значением К² является Н.

Конкретным значением Х^' является Н.

Другим конкретным значением Х^' является литий, натрий, калий, магний, кальций, барий, цинк или алюминий.

Другая конкретная группа соединений формулы I представляет собой соединения, где Х' имеет формулу ΗΥ+, где Υ представляет собой аммиак, триэтиламин, трометамин, триэтаноламин, этилендиамин, глюкамин, Ν-метилглюкамин, глицин, лизин, орнитин, аргинин, этаноламин или холин.

Другим конкретным значением Х' является Ы⁺, К' или Να'.

Другим конкретным значением Х⁺ является Να'.

Конкретное соединение формулы I представляет собой динатриевую соль 14-О-фосфонооксиметилтриптолида, динатриевую соль 14-О-фосфонооксиэтилтриптолида или динатриевую соль 14-Офосфонооксипропилтриптолида, или его соль.

Конкретная группа соединений формулы I представляет собой соединения формулы !а:

где Х^' представляет собой фармацевтически приемлемый органический катион или неорганический катион.

Другая конкретная группа соединений формулы I представляет собой соединения формулы !а:

где Х^' представляет собой фармацевтически приемлемую катионную органическую или неорганическую соль.

- 5 021135

Способы, которые могут быть использованы для получения соединений формулы I и промежуточных соединений, подходящих для получения соединений формулы I, показаны на схеме 1 и схеме 2.

Соединение формулы I может быть получено путем снятия одной или более защитных групп с соединения формулы ΙΑ

с получением соответствующего соединения формулы I. Таким образом, промежуточное соединение формулы подходит для получения соединения формулы I.

Соединение формулы I также может быть получено путем превращения группы -8Ме соединения формулы ГО

в группу -ОР(О)(О^-Х+)₂ с получением соответствующего соединения формулы I. Таким образом, промежуточное соединение формулы ГО подходит для получения соединения формулы I.

Соединение формулы I также может быть получено путем снятия одной или более защитных групп с соединения формулы ГС

с получением соответствующего соединения формулы I. Таким образом, промежуточное соединение формулы ГС подходит для получения соединения формулы I.

в группу -ОР(О)(О^-Х+)₂ с получением соответствующего соединения формулы I. Таким образом,

- 6 021135 промежуточное соединение формулы ГО подходит для получения соединения формулы I.

Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен способ:

a) получения соединения формулы I, включающий снятие защитных групп с соответствующего соединения формулы ΙΑ, содержащего одну или более защитных групп, с получением соединения формулы I;

b) получения соединения формулы I, включающий превращение группы -8Ме соединения формулы ΙΒ в группу -ОР(О)(О^-Х+)₂ с получением соединения формулы I;

c) получения соединения формулы I, включающий снятие защитных групп с соответствующего соединения формулы ГО, содержащего одну или более защитных групп, с получением соединения формулы I;

ά) получения соединения формулы I, включающий превращение группы -8Ме соединения формулы ГО в группу -ОР(О)(О^-Х+)₂ с получением соединения формулы I;

е) получения соли соединения формулы I, включающий действие на соответствующее соединение формулы I кислотой (например, органической кислотой или неорганической кислотой) или основанием (например, щелочным основанием) с получением соли соединения формулы I;

ί) превращения соединения формулы I, где один или более Х+ представляет собой катионную органическую или неорганическую соль, в соединение формулы I, где один или более Х+ представляет собой другую органическую или неорганическую соль.

Соединение согласно настоящему изобретению может быть также введено в состав фармацевтических композиций путем комбинирования с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции могут быть получены на основе хорошо известных соединений и методик, легкодоступных специалисту в области фармацевтики. Для целей настоящего изобретения указанный фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любое традиционное и легкодоступное биологически совместимое или инертное вещество, которое химически совместимо с активным фармацевтическим компонентом и в значительной степени не ослабляет его предполагаемый терапевтический эффект при приготовлении состава или доставке. Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с использованием стандартных процедур и технологий, хорошо известных в данной области техники.

Твердая форма соединения согласно настоящему изобретению может представлять собой наночастицу и, таким образом, получена в виде наночастицы. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены наночастицы соединения формулы I и композиции, содержащие наночастицы соединения формулы I.

Пролекарственные соединения триптолида согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием множества составов наполнителей и получены в различных лекарственных формах, описанных ниже. Химические свойства и характеристики, связанные с соединениями согласно настоящему изобретению, также могут позволять получать твердые лекарственные формы соединений согласно настоящему изобретению для перорального применения.

Соединение согласно настоящему изобретению может быть получено в виде фармацевтических композиций и введено реципиенту в различных формах, подходящих для необходимого конкретного способа введения или системы. Способы введения могут включать, но не ограничиваются ими, пероральные способы, парентеральные способы, внутривенные способы (включая внутривенные способы путем инъекции с помощью помпы), внутримышечные способы, топические способы, включая глазные капли, подкожные способы и способы введения через слизистую. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены системно, например, перорально, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как инертный разбавитель или усваиваемый пищевой носитель. Таким образом, фармацевтическая композиция, содержащая соединения согласно настоящему изобретению в качестве активного компонента, может быть получена в разных лекарственных формах. Например, композиции могут быть заключены в твердые или мягкие капсулы (например, желатин или вещества для капсул растительного происхождения). Композиции могут быть спрессованы в форму таблетки для проглатывания или проникновения через слизистую, пастилки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы, пластины, суппозитории и т.п. Количество активного компонента может варьироваться в соответствии с конкретной необходимой фармацевтически эффективной величиной дозы.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать дополнительные компоненты, такие как связующие вещества (такие как трагакант, камедь, кукурузный крахмал или желатин); наполнители, такие как дикальцийфосфат; разрыхлители, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т.п.; смазывающие вещества (такие как стеарат магния), которые можно применять для технологий прессования таблеток, например; подсластители, такие как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам; и ароматизаторы, такие как мята перечная, грушанка, вишня и т.п. Дополнительные компоненты, которые могут быть включены в композиции согласно настоящему изобретению, представляют собой маннит, мочевину, декстраны и лактозу, невосстанавливающие сахара.

Когда лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать жидкий носитель, включая полиэтиленгликоль, растительное масло и т.п. Другие вещества, которые могут быть использованы с определенными лекарственными формами, включают желатин, воск, шеллак, сахар и т.п. Формы

- 7 021135 сиропов или эликсиров могут содержать сахарозу, фруктозу в качестве подсластителей, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, красители и пигменты, и ароматизаторы.

При введении внутривенно или интраперитонеально путем инфузии или инъекции, растворы активного компонента и его солей могут быть получены, например, в воде или физиологическом растворе, возможно содержащем нетоксичное поверхностно-активное вещество. Дисперсии могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине и их смесях, и в маслах. Условия хранения также могут потребовать включения консерванта.

Фармацевтические лекарственные формы, подходящие для инъекции или инфузии, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, или стерильные порошки, содержащие активный компонент, подходящие для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций или инфузий, возможно заключенные в липосомы. Во всех случаях конечная лекарственная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях получения и хранения. Жидкий носитель или среда может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т.п.), растительные масла, нетоксичные глицерил эфиры и подходящие смеси указанных веществ. Необходимая текучесть может быть сохранена, например, путем образования липосом, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включение изотонических агентов, например, сахаров, буферов или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция композиций для инъекций может быть обеспечена применением в указанных композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций получают путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими компонентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией путём фильтрации. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительные способы получения представляют собой технологии вакуумной сушки и сушки методом сублимации, в результате которых получают порошок активного компонента, а также любого необходимого дополнительного компонента, присутствующего в предварительно стерилизованных путем фильтрации растворах.

Соответственно, настоящее изобретение включает стерильный препарат соединения согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает нестерильные препараты соединения согласно настоящему изобретению.

Фармацевтические лекарственные формы для инъекции или инфузии могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, или стерильные порошки, содержащие активные соединения согласно настоящему изобретению, полученные для немедленного приготовления. Жидкие носители могут включать растворители или жидкие дисперсионные среды, содержащие воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоли) и т.п. Могут быть добавлены различные агенты для ингибирования или предотвращения противомикробной активности, такие как парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и т.п.

Соединения и композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы или с интервалами в виде нескольких доз. Величина дозы, лекарственная форма, способ введения и компоненты конкретного состава могут варьироваться в соответствии с необходимой концентрации в плазме и задействованной фармакокинетикой. Важный аспект настоящего изобретения заключается в том, что конкретные соединения согласно настоящему изобретению могут обеспечивать улучшенный и эффективный способ введения лекарственной формы для перорального применения в силу характеристик и свойств, связанных со структурой соединения согласно настоящему изобретению и расположением заместителей.

Для топического введения, в целом, будет необходимо вводить соединения согласно настоящему изобретению в кожу в виде композиций или составов в комбинации с дерматологически приемлемым носителем, который может представлять собой твердое вещество или жидкость.

Подходящие твердые носители включают мелкодисперсные твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, диоксид кремния, оксид алюминия и т.п. Подходящие жидкие носители включают воду, спирты или гликоли, или смеси вода-спирт/гликоль, в которых настоящие соединения могут быть растворены или диспергированы на эффективных уровнях, возможно с помощью нетоксичных поверхностно-активных веществ. Адъюванты, такие как отдушки и дополнительные противомикробные агенты, могут быть добавлены для оптимизации свойств для конкретного применения. Полученные жидкие композиции могут быть нанесены с впитывающих прокладок, используемых для пропитки бинтов и других повязок, или могут быть распылены на пораженную область с использованием распылителей насосного типа или аэрозольных распылителей.

Загустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли и эфиры жирных кислот, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные вещества, также

- 8 021135 можно применять с жидкими носителями с образованием паст для нанесения гелей, мазей, мыл и т.п., для нанесения напрямую на кожу потребителя.

Примеры подходящих дерматологических композиций, которые можно применять для доставки соединений формулы I в кожу, известны в данной области техники; например, см., Ласс]ие1 е1 а1. (патент США 4608392), Сепа (патент США 4992478), διηίΐΐι е1 а1. (патент США 4559157) и АоП/тап (патент США 4820508).

Подходящие дозы соединений формулы I могут быть определены путем сравнения их активности ίη νίίτο и активности ίη νίνο в моделях у животных. Способы экстраполяции эффективных доз у мышей и других животных на людей известны в данной области техники; например, см. патент США 4938949.

Количество соединения или его активной соли, или производного, необходимое для применения в лечении, будет варьироваться не только в зависимости от конкретной выбранной соли, но и от способа введения, природы вылечиваемого состояния и возраста, и состояния пациента, и в конечном итоге будет представлено на усмотрение лечащего врача или клинициста.

Однако, в целом, подходящая доза будет находиться в диапазоне от примерно 3 до примерно 100 мкг/кг массы тела в сутки (например, от примерно 6 до примерно 96 мкг/кг массы тела в сутки или от примерно 6 до примерно 48 мкг/кг массы тела в сутки, или от примерно 6 до примерно 24 мкг/кг массы тела в сутки, или от примерно 12 до примерно 24 мкг/кг массы тела в сутки).

Соединение удобным образом получают в дозированной лекарственной форме; например, содержащей от примерно 80 мкг до примерно 8000 мкг, удобным образом от примерно 480 мкг до примерно 7680 мкг, удобным образом от примерно 480 мкг до примерно 3840 мкг и удобным образом от примерно 960 мкг до примерно 1920 мкг. В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению, полученное в указанной дозированной лекарственной форме.

Необходимая доза удобным образом может быть представлена в виде однократной дозы или в виде разделенных доз, вводимых через подходящие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более субдоз в сутки. Сама по себе субдоза может быть дополнительно разделена, например, на некоторое количество отдельных свободно распределенных введений, например, несколько ингаляций из инсуффлятора или путем введения множества капель в глаз.

Соединения согласно настоящему изобретению также могут быть введены в комбинации с другими терапевтическими агентами, например, другими агентами, подходящими для лечения рака (например, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака ободочной и прямой кишки, неходжкинской лимфомы, лейкоза, острого и хронического миелобластного лейкоза, нейробластомы, рака щитовидной железы, остеосаркомы, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, карциномы желудка, рака уротелия, мультиформной глиобластомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, фибросаркомы, плоскоклеточного рака, множественной миеломы, холангиокарциномы, немелкоклеточного рака легкого) в качестве радиосенсибилизатора для раковых клеток, воспалительных заболеваний, ревматических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, поликистоза почек, нефрита, выживаемости трансплантата при трансплантации (почка, сердце), легочной гипотензии, воспаления легких, фиброза легких, нейрозащиты, ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга, паркинсонизма и язв роговицы. Примеры указанных агентов включают 5-фторурацил, ТКАТС (ΤΝΡ-связанный апоптозиндуцирующий лиганд), активирующие антитела ΌΚ-4/5, циклофосфамид (сус1орко8рЬат1бе), гидроксидаунорубицин (ЬубгохубаипогиЫст) (доксорубицин (бохогиЫсш)), онковин (опсоуш) (винкристин (νίηсг1811пе)). паклитаксел (расШахе1), доцетаксел (бохе!ахе1), цисплатин (с18р1айп), карбоплатин (сагЬор1а1ш), СРТ-11, бортезомиб (ЬоПе/ишЬ) и преднизон-преднизолон (ргебш8опе-ргебш8о1опе). Соответственно, в одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере один другой терапевтический агент и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере один другой терапевтический агент, упаковочный материал и инструкции по введению соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и другого терапевтического агента или агентов животному (например, млекопитающему) для лечения рака (например, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака ободочной и прямой кишки, неходжкинской лимфомы, лейкоза, острого и хронического миелобластного лейкоза, нейробластомы, рака щитовидной железы, остеосаркомы, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, карциномы желудка, рака уротелия, мультиформной глиобластомы, рака толстой кишки, рака шейки матки, фибросаркомы, плоскоклеточного рака, множественной миеломы, холангиокарциномы, немелкоклеточного рака легкого), воспалительного заболевания, ревматического заболевания, аутоиммунного заболевания, поликистоза почек, нефрита, выживаемости трансплантата при трансплантации (почка, сердце), легочной гипотензии, воспаления легких, фиброза легких, нейрозащиты, ишемическиреперфузионного повреждения головного мозга, паркинсонизма, язв роговицы или колита. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, по меньшей мере один другой терапевтический

- 9 021135 агент, упаковочный материал и инструкции по введению соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и другого терапевтического агента или агентов животному (например, млекопитающему) для сенсибилизации раковых клеток, покрытия стентов (выделение лекарственного средства), восстановления спинного мозга или для применения в качестве мужской и женской контрацепции у животных. Следующие документы относятся к триптолиду в комбинации с другими терапевтическими агентами:

(1. СОеп, Υ. νν. е1 ак, Апйсапсег Огидз,

2010, 21(5), 502-13. 2. Хи В. е! ак, Сапсег 1_еН„ 2010, 291(2), 200-208. 3. Вода-Сасйо, ϋ. е1 ак, б. ОазйопКезк Зигд., 2010,14(2), 252-60. ИезИаН δ. ϋ. е! а!„ СПетоЮегару, 2008, 54(1),

67-76. 4. Тапд X. Υ. е1 ак, Роз1дгаб. Меб. 1., 2007, 83(979), 338-43. 5. Рапюйаки! Т. е1 ак,

Апйсапсег Вез. 2006, 26(1 А), 259-65. 6. РесОакг. В1ооб Сапсег, 2008, 51(6):754-97. Ма1зи1 е1 ак Опсодепе, 2008, 27, 4603-4614. 7. Сйапд е! ак, ТПе боигпа! о( Вю1одюа1 СМегтнзйу, 2001 276, 2221-2227. 8.1Л/ез(1а11 е! ак, СПетоПзегару, 2008, 54(1), 67-76. 9. СаПег е1 ак, В1ооб,

2008, νοΙ. 111, Νο. 7, рр. 3742-3750. 10. Вода-Сасйо е! ак, б. Саз1го1п1ез1 Зигд., 2010, 14,

252-260. 11. Тапд е1 ак, Роз1дгабиа1е Мебюа1 боигпа! 2007, 83, 338-343. 12. Сеп е1 ак, ΑηϋСапсег Огидз, 2010, 21(5), 502-513. 13. Кароог, 1пк б. Мок Меб. 2008, 22(4), 489-96. 14.

Р|б1ег е! ак, Мо1еси1аг Сапсег ТМегареийсз, 2003, 2, 855).

Важный аспект настоящего изобретения заключается в том, что соединения согласно настоящему изобретению обеспечивают необходимые комбинации фармакокинетических свойств, физических свойств и преимуществ лечения по сравнению с другими пролекарственными формами триптолида. Пролекарственные соединения триптолида согласно настоящему изобретению демонстрируют необходимую комбинацию характеристик, включая химическую стабильность, повышенную растворимость и быстрое метаболическое высвобождение активного триптолида из пролекарственной формы. В совокупности данные свойства обеспечивают улучшенные терапевтические противораковые эффекты. Указанные эффекты включают эффективное ингибирование клеток рака поджелудочной железы путем ингибирования защитных эффектов, обеспечиваемых Н8Р70 в клетках, и резистентности к апоптозу и видам лечения.

Химический путь метаболического и ферментативного расщепления пролекарства триптолида из примера 1 показан на фиг. 2. Исходное природное соединение (не пролекарственная форма) триптолида обладает плохой растворимостью в воде. Полученное соединение из примера 1 демонстрирует высокий уровень растворимости. В ходе ферментативного расщепления и метаболизма соединение из примера 1 в конечном счете высвобождает активную форму соединения триптолида.

Соединения и композиции согласно настоящему изобретению можно применять в качестве способа лечения солидных раковых опухолей у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающего введение фармацевтически эффективного количества соединения, описанного выше, в качестве активного компонента. При употреблении в контексте способов лечения термин млекопитающее включает людей.

Соединения и композиции согласно настоящему изобретению могут быть эффективны для ингибирования ίη νίίτο и ίη νίνο роста раковых клеток в экспрессирующих Н8Р70 раковых опухолях. Примеры экспрессирующих Н8Р70 раковых опухолей включают рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак легкого, рак головного мозга, лейкоз, нейробластому, рак толстой кишки, рак желудка, рак печени и глиобластому.

Соответственно, в одном из вариантов реализации настоящее изобретение включает ингибирование популяции раковых клеток, демонстрирующих чрезмерную экспрессию белка теплового шока Н8Р70, путем введения соединения формулы I. Особенно важное значение для настоящего изобретения имеет эффективное ингибирующее действие на клетки рака поджелудочной железы, экспрессирующие Н8Р70, такие как клетки Мта-Раса, Рапс-1 и 82УР10. Соответственно, в другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака 82 (например, рака 82УР10 или 82013) у млекопитающего (например, человека), включающий введение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли млекопитающему (например, человеку).

Как ίη νίίτο, так и живом организме у млекопитающих фермент щелочная фосфатаза превращает соединение из примера 1 в активную форму триптолида, как показано в примерах в настоящем описании. Период полупротекания ферментативного гидролиза (ΐ'/₂) для соединения из примера 1 показывает относительно высокую скорость превращения и, следовательно, более быстрое высвобождение активной терапевтической формы соединения.

Триптолид применяют для лечения множества заболеваний, таких как воспалительные заболевания. Триптолид также применялся в качестве терапевтического агента для лечения различных заболеваний. Данные заболевания включают рак (например, рак поджелудочной железы, карцинома желчного протока, нейробластома, рак толстой кишки, рак молочной железы, миелома, рак желудка, рак печени, глиоб- 10 021135 ластома, рак яичников, рак ободочной и прямой кишки, неходжкинская лимфома, рак легкого, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легкого, крупноклеточный рак легкого, рак почки, рак пищевода, рак желудка, рак шейки матки, лимфомные опухоли), аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, поликистоз почек, воспалительные заболевания, астму, ревматоидный артрит, системную красную волчанку и нефрит. Триптолид также исследовали в покрытиях стентов (выделение лекарственного средства), восстановлении спинного мозга, колите и контрацепции у самцов и самок. Соответственно, настоящее изобретение включает, но не ограничивается им, применение соединений формулы I для лечения заболеваний, включая рак (например, рак поджелудочной железы, карцинома желчного протока, нейробластома, рак толстой кишки, рак молочной железы, миелома, рак желудка, рак печени, глиобластома, рак яичников, рак ободочной и прямой кишки, неходжкинская лимфома, рак легкого, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легкого, крупноклеточный рак легкого, рак почки, рак пищевода, рак желудка, рак шейки матки, лимфомные опухоли), аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, поликистоз почек, воспалительные заболевания, астму, ревматоидный артрит, системную красную волчанку и нефрит. Соединения формулы I также можно применять для покрытия стентов (выделение лекарственного средства), восстановления спинного мозга, при колите и для контрацепции у самцов и самок млекопитающих.

Следующие документы относятся к триптолиду и раку:

(1. αμι_: Сайег е1 ак, Βίοοΰ,

2008, 111(7), 3742-3750. 2. Апар1азйс ЙпугоИ сагапота: Мо1 РМагтасок, 2009, 75(4), 8129. 3. В1аййег сапсег: Уапд е( ак, Мок СапсегТНег., 2003, 2(1), 65-72. 4. В16 Ме1апота: Уапд е! ак, Мок Сапсег ТНег. 2003, 2(1), 65-72. 5. Вгеаз1 Сапсег: Ыапд е1 ак, Сапсег ЬеНегз,

270(2), 2008, 337-341. Си е1 ак, РНу1отей1апе, 2009, 16(11), 1006-1013. 6. СегМса! Сапсег:

Мапд е1 ак, й. Мок Мей., 2006, 84(5),405-15. 7. СНо1апдюсагапота: ТепдсНа13п е1 ак,

Сапсег ЬеПегз, 1998, 133(2), 169-175. 8. СМЬ: 1_ои е1 ак, 1_еикет1а апй 1-утрНота, 2004, 45,

373-376. 9. Со1оп: Тапд е1 ак, Роз1дгайиа1е Мейюа! йоигпа! 2007, 83, 338-343. 10.

ЕзорНадеа! сапсег: ВоиИ е( ак, В. й, Сапсег, 2008, 89, 1985-92, 11. НЬгозагсота: КтНади е1 ак, СНпюа! Сапсег РезеагсН, 2002, 8, 2666-2674. 12. М|уа1а е1 ак, ВюсНет. ВюрНуз. Рез.

Соттип., 2005, 336(4), 1081-6. 13. Оае1пс Сапсег: Й1апд., Опсодепе, 2001,20(55), 8009-18.

14. Уапд е1 ак, Мок Сапсег ТНег. 2003, 2(1), 65-72. 15. С1юЫаз1ота МиНИогте: Ьт е! ак, Й.

Ιηΐ. Мей. Рез., 2007, 35(4), 490-6. 16. Кароог, ΙηΙ. й. Мок Мей., 2008, 22(4), 489-96. 17.

Ншпап РгозТаЬс ЕрННеНа! Се11з: КмНа^и е1 ак, 2002., СНпюа1 Сапсег РезеагсН, 8, 26662674. 18. Ьеикегшаз 1пс1иЙ1пд АМЬ: Сайег е! ак, В1оой, 2006, 108(2), 630-7. 19. ΜυΙΙίρΙβ туе1ота: Υΐηΐυη е1 ак, Ьеик. Рез. 2005 29(1), 99-105. 20. МеигоЫаз1ота: ΑηΙοηοίί е1 ак,

Зигдегу, 2009, 146(2), 282-90. 21. поп-Нойдкт 1утрНота: гНапд е! ак, Ас1а РНагтасо1одюа 31П1са, 2006, 27, 1438—1446. 22. Νοη-зтаН сеН 1ипд сапсег: СНапд е! ак, ТНе Йоита1 οί Вю1од1са1 СНет1з1гу, 276, 2221-2227. 23, Оз1еозагсота: УУапд е1 ак, РесйаТг. В1оой Сапсег,

2008, 51(6), 754-9. 24. СЛ/апап Сапсег: МезЙаН е1 ак, СНето1Негару, 2008, 54(1), 67-76. 25.

Рапсгеайс Сапсег: УУапд е1 ак, й. Мок Мей. 2006, 84(5), 405-15., ΖΗου е1 ак, 1Л/ог1й й., Саз1гоеп1его1, 2008, 14(10), 1504-1509., У7апд е! ак СНпса! Сапсег РезеагсН 2007,13, 4891.,

ΡήίΙΙΐρδ, 5а1ща е! ак, Сапсег Рез., 2007. Здиатоиз сеН сагапота; М|уа(а е( ак, ВюсНет.

ВюрНуз. Рез. Соттип., 2005, 336(4),1081-6. 26. ТНуго1Й сагапота: ΖΗυ е! ак, Опсо! Рер.,

2009, 22(6),1397-401. 27. Шеппе сеп/юа1 сагапота: М1уа1а е1 ак, ВюсНет. Вюр1луз- Рез.

Соттип,, 2005, 336(4), 1081-6. 28. игоТЬеНа! Сапсег: Ма1зш е1 ак, Опсодепе, (2008) 27, 4603-4614).

Следующие документы относятся к триптолиду и заболеваниям, отличным от рака:

- 11 021135 (1. ΜυΙίϊρΙβ сйзеазез: ϋ Сил е1 ак, Огид Η & ϋ, 2003, 4, 1-16. 2. Огдап 1гапзр1ап1а(юп: СРеп,

1_еикеггпа атй ЬутрРота, 2001, 42, 253-256. 3. К|йпеу 1гапзр1ап1: гРапд е1 ак, 1оигпа1 οί Е1РпорРагтасо1оду, 2009, 125(1 >, 141-46, 4. Тгапзр1ап1а1юп дгай зимуа! (эк<п): Уапд е1 ак ΙηΙ. ά. 1ттипорРатас., 1992, 14, 963-969. 5. ОгаН-Уегзиз-Ноз! йзеазе: СРеп е( ак,

Тгапзр1ап1айоп, 2000, 70, 1442-1447. 6. 1п11атта1огу апй аи1о1ттипе сКзеазез: Р.Е. Ырзку е1 ак, Зегтпагз ίη АйРгШз апй ПРеитайзт, 1997, 5, 713-723. 7. Аийиттипе епсер0а1отуеПйз: ΚίζθΙδζίβίη е1 ак 1оигпа1 οί 1\1еиго1ттипо1оду,2009, 217, 28-37. 8. СегеЬга!

15сКет1а/герейи310п 1пщгу: \Λ(θϊ е1 ак, Ыеига! Ведепегайоп РезеагсК, 2007. 9. СоНйэ: \Λ/βί е1 ак, СОп. 1ттипо1. 2008, 129, 211-218, 10. Сопкасерйоп ίη та!ез апй 1ета1ез: НО-йт е! ак,

1оита1 οί Апйго1оду, 2000, 21, 431-437., НиупР е1 ак, Йоигпа1 οί Апйго1оду, 2000, 21, 689699., Жапд е1 ак, Аз1ап 1оигпа1 οί Апйго1оду, 1999, 1, 121-125., 1_ие е1 ак, 1оигпа1 οί Апйго1оду, 1998, 19, 479-486. 11, Согпеа! и!сег: 1_и βί ак 1пуезйдайуе ОрР1Ра1то1оду апй \Дзиа1 Заепсе. 2006, 47, 3796-3800. 12. кипд 1пПаттайоп: КпзРпа, е( ак, 2001, Ат. Й Ра1Рок, 2001, 158(3), 997-1004. 13. ΝβρΡπΙίδ: Тао е1 ак, ΑΠΡπίίδ ПРеит. 2008, 58(6), 177483. 14. Рагк1П$оп1$т апй пеигорго1есЙоп: ΖΡου е1ак, ЫеигоЬ1о1оду οί О|$еазе, 2005,18, 441449, 15. Ро1усузйс к1йпеу сйзеазе (ΡΚϋ): ЬеиепгоЮ е! ак, ΡΝΑ8, 2007, 104, 4389-4394. 16.

Зр1па1 согй гера1г: Зи е! ак, Ойа 2010, 58, 901-915. 17. 3ίβηί соайпд: О. Ьио 2005, заявка на патент 20050043788).

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами:

Пример 1. Синтез динатриевой соли 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (соединение 1).

К раствору дибензилового эфира 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (50 мг, 0,08 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) добавляли палладий на углероде (10%, 10 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода (1 атм) в течение 3 ч. Катализатор удаляли путем фильтрования через ЦЕЛИТ™ и фильтрат обрабатывали раствором гидрата карбоната натрия (8,9 мг в 3 мл воды, 0,076 ммоль). Тетрагидрофуран выпаривали при пониженном давлении и остаточный водный раствор экстрагировали эфиром (3x3 мл). Водный слой выпаривали досуха и полученное твердое вещество сушили в течение ночи в вакууме, промывали эфиром и снова сушили в вакууме с получением динатриевой соли 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (35 мг, выход 90%) в виде белого порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, Ό2Ο) δ 0,81 (й, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 1,00 (й, 3Н, 1=6,8 Гц), 1,03 (5, 3Н), 1,35 (т, 1Н), 1,50 (т, 1Н), 2,00 (йй, 1Н, 1! = 14,7 и 12 = 13,4 Гц), 2,08-2,61 (т, 4Н), 2,85 (т, 1Н), 3,63 (й, 1 Н, 1 = 5,5 Гц), 3,81 (й, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,86 (5, 1Н), 4,12 (й, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 4,92 (т, 2Н), 5,07 (т, 2Н) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, Ό2Ο) δ 12,9, 16,0, 16,3,

16,5, 22,3, 25,5, 28,9, 35,2, 39,8, 55,4, 56,1, 61,0, 61,5, 65,1, 65,5, 71,9, 77,6, 91,7, 123,8, 164,2, 177,3 ррт; масс-спектрометрия высокого разрешения (НРМ8), рассчитанная для (С₂1Н₂₆ОюР) необходимо т/ζ [М+1]+ 469,1264, обнаружено т/ζ 469,1267.

Получение дибензилового эфира 14-О-фосфонооксиметилтриптолида.

Этап 1. Получали раствор триптолида (100 мг, 0,29 ммоль) в уксусной кислоте (5 мл, 87,5 ммоль) и ангидриде уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) в ДМСО (1,5 мл, 21,4 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 дней с получением промежуточного соединения 14-О-метилтиометилтриптолида. Затем реакционную смесь вливали в воду (100 мл) и нейтрализовали твердым ΝαНСО₃, добавляемым порциями. Смесь экстрагировали этилацетатом (50 млх3) и смешанный органический экстракт сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали с получением продукта в виде масла. В результате колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (3:2 гексан/этилацетат) получали 14-О-метилтиометилтриптолид с выходом 52% (60 мг) в виде белой пены. ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃) δ 0,82 (й, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 1,00 (й, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 1,09 (5, 3Н), 1,20 (т, 1Н), 1,59 (т, 1Н), 1,93 (йй, 1Н, 1! = 14,7 и 1₂ = 13,4 Гц), 2,19 (5, 3Н), 2,10-2,42 (т, 4Н), 2,68 (т, 1Н), 3,24 (й, 1Н, 1 = 5,5 Гц), 3,51 (й, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,67 (5, 1Н), 3,79 (й, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 4,68 (т, 2Н), 4,93 (й, 1Н, 1 = 11,8 Гц), 5,07 (й, 1Н, 1 =

- 12 021135

11,8 Гц) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, СЭС1₃) δ 13,6, 14,8, 16,8, 17,0, 17,1, 23,4, 26,3, 29,5, 35,8, 40,4, 54.5, 55,0, 58,0, 61,5, 63,9, 64,4, 69,9, 75,8, 76,7, 125,5, 160,2, 173,2 ррт; НИМЗ рассчитанная для (С22Н28Об8Ыа) необходимо т/ζ [М+Ыа]⁺ 443,1505, обнаружено т/ζ 443,1507.

Этап 2. Раствор 14-О-метилтиометилтриптолида (50 мг, 0,12 ммоль) в сухом метиленхлориде (2 мл) в атмосфере N2 смешивали с порошкообразными активированными молекулярными ситами 4А (50 мг) с последующим добавлением смеси дибензилфосфата (40 мг, 0,14 ммоль) и Ν-йодсукцинимида (32 мг, 0,14 ммоль) в тетрагидрофуране (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч, фильтровали и разбавляли метиленхлоридом (20 мл). Полученный раствор промывали раствором тиосульфата натрия (2 мл, 1 М раствор), насыщенным раствором бикарбоната натрия, солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Маслянистый остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (1:2 гексан/этилацетат) с получением дибензилового эфира 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (62 мг, выход 80%) в виде белой пены. *Н ЯМР (400 МГц, СБС1э) δ 0,72 (ά, 3Н, I = 6,8 Гц), 0,89 (ά, 3Н, I = 6,8 Гц), 1,05 (8, 3Н), 1,27 (т, 1Н), 1,48 (т, 1Н), 1,82 (άά, 1Н, А = 14,7 и 12= 13,4 Гц), 2,03-2,35 (т, 4Н), 2,64 (т, 1Н), 3,14 (ά, 1Н, I = 5,5 Гц), 3,46 (ά, 1Н, I = 3,1 Гц), 3,65 (8, 1Н), 3,76 (ά, 1Н, I = 3,1 Гц), 4,65 (т, 2Н), 5,02 (т, 4Н), 5,27 (т, 1Н), 5,47 (т, 1Н), 7,34 (т, 10Н) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, СЭС1₃) δ 13,6, 16,8, 17,0, 23,3, 26,2, 29,62, 29,67, 35,7, 40,3, 54,7, 55,2, 59,3, 61,1, 63,6, 64,0, 69,36, 69,39, 69,42, 69,45, 69,9, 78,2, 92,9, 93,0, 125,5, 127,9, 128,0, 128,6, 135,5, 135,6,

160,1, 173,2 ррт; НИМЗ, рассчитанная для (ТГЦ ΓνΟ,ηΡΝα) необходимо т/ζ |М+№|' 673,2179, обнаружено т/ζ 673,2176.

Пример 2. Синтез динатриевой соли 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (соединение 1).

К раствору, содержащему 14-О-метилтиометилтриптолид (50 мг, 0,12 ммоль), фосфорную кислоту (82 мг, 0,84 ммоль) и молекулярные сита (4А, 0,45 г) в ТГФ (10 мл), при 0°С добавляли Ν-йодсукцинимид (41 мг, 0,18 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь фильтровали через Целит и твердые вещества промывали ТГФ. Фильтрат обрабатывали 1 М №₂З₂О3 пока он не стал бесцветным, и фильтрат обрабатывали раствором карбоната натрия (13 мг в 3 мл воды, 0,12 ммоль). Фильтрат выпаривали при пониженном давлении и остаточный водный раствор экстрагировали эфиром (3x3 мл). Водную фазу выпаривали досуха и полученный остаток очищали путем хроматографии (С18), элюируя градиентом метанола 0-100% в воде, с получением динатриевой соли 14-О-фосфонооксиметилтриптолида (43 мг, выход 70%) в виде бесцветного порошка.

Получение 14-О-метилтиометилтриптолида.

К раствору триптолида (100 мг, 0,28 ммоль) и метилсульфида (0,16 мл, 2,24 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) при 0°С добавляли пероксид бензоила (0,27 г, 1,12 ммоль) четырьмя равными порциями в течение 20 мин, а затем смесь перемешивали при 0°С в течение одного часа, а затем при комнатной температуре в течение одного часа. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 10% №₂С'О₃, а затем солевым раствором. Органическую фазу сушили над МдЗО4, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (1:1 гексан/этилацетат) с получением 14-О-метилтиометилтриптолида (63 мг, выход 54%) в виде бесцветного порошка.

Пример 3. Синтез динатриевой соли 14-О-фосфонооксиэтилтриптолида.

- 13 021135

К раствору, содержащему 14-О-метилтиоэтилтриптолид (52 мг, 0,12 ммоль), фосфорную кислоту (82 мг, 0,84 ммоль) и молекулярные сита (4А, 0,45 г) в ТГФ (10 мл), при 0°С добавляли Νйодсукцинимид (41 мг, 0,18 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь фильтровали через Целит и твердые вещества промывали ТГФ. Фильтрат обрабатывали 1М Ν;·ι₂δ₂ϋ₃ пока он не стал бесцветным, и фильтрат обрабатывали раствором карбоната натрия (13 мг в 3 мл воды, 0,12 ммоль). Фильтрат выпаривали при пониженном давлении и остаточный водный раствор экстрагировали эфиром (3x3 мл). Водную фазу выпаривали досуха и полученный остаток очищали путем хроматографии (С18), элюируя градиентом метанола 0-100% в воде, с получением динатриевой соли 14-О-фосфонооксиэтилтриптолида (46 мг, выход 72%) в виде бесцветного порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, Ό2Θ) δ 0,68 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,70 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 1,03 (5, 3Н), 1,21 (т, 1Н), 1,57 (ά, 3Н, 1 = 5,3 Гц), 1,58 (т, 1Н), 1,94 (άά, 1Н, 1! = 14,7 и Ц = 13,4 Гц), 2,08-2,61 (т, 4Н), 2,62 (т, 1Н), 3,27 (ά, 1 Н, 1 = 5,5 Гц), 3,45 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,72 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,79 (5, 1Н), 4,63 (т, 2Н), 6,43 (ц, 1Н, 1 = 5,3 Гц) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, Ό20) δ 13,5, 16,9, 17,0, 17,1, 21,4, 23,5, 26,8, 29,5, 35,9, 40,3, 54,0, 55,1, 59,4, 61,2,

63.6, 64,2, 69,8, 75,8, 76,5, 91,6, 125,6, 164,2, 177,2 ррт; НРМ8, рассчитанная для (С₂₂Н₂₈ОюР) необходимо т/ζ [М+1]+ 483,1137, обнаружено т/ζ 483,1134.

Получение 14-О-метилтиоэтилтриптолида.

К раствору триптолида (100 мг, 0,28 ммоль) и этилсульфида (0,24 мл, 2,24 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) при 0°С добавляли пероксид бензоила (0,27 г, 1,12 ммоль) четырьмя равными порциями в течение 20 мин, а затем смесь перемешивали при 0°С в течение одного часа, а затем при комнатной температуре в течение одного часа. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 10% №-ьСО₃,. а затем солевым раствором. Органическую фазу сушили над М§§0₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (1:1 гексан/этилацетат) с получением 14-0-метилтиоэтилтриптолида (60 мг, выход 50%) в виде бесцветного порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃) δ 0,68 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,70 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 1,04 (5, 3Н), 1,20 (т, 1Н), 1,57 (ά, 3Н, 1 = 5,3 Гц), 1,59 (т, 1Н), 1,88 (άά, 1Н, ί₁ = 14,7 и Г 13,4 Гц), 2,19 (5, 3Н), 2,06-2,27 (т, 4Н), 2,62 (т, 1 Н), 3,24 (ά, 1Н, 1 = 5,5 Гц), 3,42 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,70 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,73 (5, 1Н), 4,61 (т, 2Н), 5,02 (ц, 1Н, 1 = 5,3 Гц) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, СПСТ) δ

13.6, 14,8, 16,9, 17,0, 17,1, 21,0, 23,5, 26,4, 29,6, 35,8, 40,5, 54,0, 55,2, 59,4, 61,3, 63,7, 64,2, 69,9, 75,8, 76,7,

125.6, 160,2, 173,2 ррт; НРМ8, рассчитанная для (С₂₃Н₃₀О₆8№) необходимо т/ζ |Μ+Να|' 457,1763, обнаружено т/ζ 457,1765.

Пример 4. Синтез динатриевой соли 14-О-фосфонооксипропилтриптолида.

К раствору, содержащему 14-О-метилтиопропилтриптолид (54 мг, 0,12 ммоль), фосфорную кислоту (82 мг, 0,84 ммоль) и молекулярные сита (4А, 0,45 г) в ТГФ (10 мл), при 0°С добавляли Νйодсукцинимид (41 мг, 0,18 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь фильтровали через Целит и твердые вещества промывали ТГФ. Фильтрат обрабатывали 1М Ν;·ι₃8₃0₃ пока он не стал бесцветным, и фильтрат обрабатывали раствором карбоната натрия (13 мг в 3 мл воды, 0,12 ммоль). Фильтрат выпаривали при пониженном давлении и остаточный водный раствор экстрагировали эфиром (3x3 мл). Водную фазу выпаривали досуха и полученный остаток очищали путем хроматографии (С18), элюируя градиентом метанола 0-100% в воде, с получением динатриевой соли 14-О-фосфонооксипропилтриптолида (43 мг, выход 65%) в виде бесцветного порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, Ό20) δ 0,66 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,68 (ά, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,99 (1, 3Н, 1 = 5,3 Гц), 1,03 (5, 3Н), 1,20 (т, 1Н), 1,53 (т, 1Н), 1,90 (άά, 1Н, ί1 = 14,7 и Ц = 13,4 Гц), 2,04-2,66 (т, 4Н), 2,65 (т, 3Н), 3,27 (ά, 1Н, 1 = 5,5 Гц), 3,49 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,71 (ά, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,78 (5, 1Н), 4,69 (т, 2Н), 6,31 (ц, 1Н, 1 = 5,3 Гц) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, Ό20) δ 7,55, 13,5, 16,2, 16,9, 17,2, 20,8, 23,2, 26,1, 28,4, 34,7, 38,5, 54,1, 55,0, 59,0, 61,3, 62,5, 63,9, 68,5, 75,4, 76,4, 91,9, 125,7, 160,1, 174,5 ррт; НРМ8, рассчитанная для (С₂₃Н₂₉ОюР) необходимо т/ζ [М+1]+ 497,1294, обнаружено т/ζ 497,1292.

Получение 14-О-метилтиопропилтриптолида.

К раствору триптолида (100 мг, 0,28 ммоль) и пропилсульфида (0,32 мл, 2,24 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) при 0°С добавляли пероксид бензоила (0,27 г, 1,12 ммоль) четырьмя равными порциями в течение 20 мин и смесь перемешивали при 0°С в течение одного часа, а затем при комнатной температуре в течение одного часа. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали 10% №₂С0₃, а затем солевым рас- 14 021135 твором. Органическую фазу сушили над Μ§δ0₄, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали путем флэш-хроматографии на силикагеле (1:1 гексан/этилацетат) с получением 14-О-метилтиопропилтриптолида (60 мг, выход 48%) в виде бесцветного порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭСТ) δ 0,65 (б, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,67 (б, 3Н, 1 = 6,8 Гц), 0,99 (ί, 3Н, 1 = 5,3 Гц), 1,01 (5, 3Н), 1,20 (т, 1Н), 1,59 (т, 1Н), 1,88 (бб, 1Н, ί1 = 14,7 и 12= 13,4 Гц), 2,18 (5, 3Н), 2,01-2,26 (т, 4Н), 2,62 (т, 3Н), 3,24 (б, 1Н, 1 = 5,5 Гц), 3,42 (б, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,70 (б, 1Н, 1 = 3,1 Гц), 3,73 (5, 1Н), 4,61 (т, 2Н), 5,03 (ц, 1Н, 1 = 5,3 Гц) ррт; ¹³С ЯМР (100 МГц, СИСЬ) δ 7,68, 13,5, 14,6, 16,2, 17,0, 17,2, 21,4, 23,2, 26,1, 28,9, 34,7, 39,5, 54,1, 55,6, 59,0, 61,3, 63,5, 64,0, 69,5, 75,1, 76,4, 125,1, 160,9, 173,5 ррт; НКМ§, рассчитанная для (С24Н₃₂0₆8Ыа) необходимо т/ζ |Μ+Να|' 471,1920, обнаружено т/ζ 471,1918.

Пример 5. Химические свойства соединений формулы I.

Оценивали химические свойства соединений согласно настоящему изобретению. Измеряли растворимость в воде и химическую стабильность. При применении раствора соединения из примера 1 с рН, доведенным до 7,4, определили, что растворимость при комнатной температуре составляла 61,4 мг/мл. Стабильность соединений согласно настоящему изобретению оценивали в буферном растворе Ττΐ5 (рН 7,4) и боратном буферном растворе (рН 7,4) при комнатной температуре. По окончании периода, составляющего 1 (один) месяц, не наблюдали распада соединения из примера 1. Результаты приведены в следующей таблице.

Таблица 1. Физико-химические свойства соединений формулы I

Соединени е	Растворимост ь (мг/мл) буфер Тпз, комнат, темп.	Химическая стабильность (1 Щ буфер Тпз, комнат, темп.	Химическая стабильность (1 ’Л), боратный буфер, комнат, темп.	Ферментативный гидролиз (1½). щелочная фосфатаза, 37^еС
Соединен и е из Примера 1/2	61,4	А	А	2 мин.
Соединен и е из Примера 3	>50			9 мин.
Соединен и е из Примера 4	>50	А	А	17 мин.

* Через один месяц не наблюдали распада.

Пример 6. Ферментативное превращение соединения 1 ίη νίίτο.

Соединение 1 превращается в активную форму триптолида под действием фермента щелочной фосфатазы. Проводили эксперимент ίη νίίτο для исследования биологического превращения пролекарственного соединения триптолида согласно настоящему изобретению. Биологическое превращение ίη νίίτο имитировали с использованием щелочной фосфатазы (из бычьей слизистой оболочки кишечника, Тип ΥίΙ-δ от 5>щта-Л1бпе11 (Сент-Луис, штат Миссури) в глициновом буфере (рН 9,8)).

Щелочные фосфатазы представляют собой группу ферментов, встречающихся главным образом в печени (изофермент ЛЬР-1) и кости (изофермент ЛЬР-2), и небольшие количества вырабатываются клеточной выстилкой тонкого кишечника (изофермент ЛЬР-3), плаценты и почек. Щелочные фосфатазы отщепляют фосфор с созданием щелочного рН. Другие ферменты помимо щелочной фосфатазы также могут способствовать гидролизу ίη νίνο.

На фиг. 3 видно, что уменьшающиеся количества пролекарственной формы триптолида совпадали с пропорционально увеличивающимися количествами высвобождаемой активной формы триптолида. Кроме того, наблюдали, что превращение происходило в течение относительно короткого периода времени, при этом большая часть превращения происходила в течение начального периода времени, составляющего 10 мин.

Константу распада первого порядка рассчитывали путем подбора оставшейся концентрации относительно периода инкубации. Было определено, что период полураспада (ί ¹/2) соединения 1 составлял 2 мин.

Пример 7. Сравнительное исследование жизнеспособности клеток ίη νίίτο.

Проводили эксперимент для сравнительной оценки жизнеспособности клеток ίη νίίτο с использованием триптолида, пролекарства триптолида (соединение 1) и контроля (без триптолида или пролекарственной формы). Жизнеспособность клеток определяли с использованием набора для подсчета клеток Όορίκίο Се11 ί'.’οιιηΙίηβ Κίί-8 (от Όοίίι^ο ΓαδοΗΐΙοπο5. Роквилл, штат Мэриленд). Клетки поджелудочной железы высевали в 96-луночный планшет по 2х10³ клеток на лунку и оставляли на ночь для протекания адгезии. Затем указанные клетки обрабатывали пролекарством триптолида (соединение 1) согласно настоящему изобретению и природным триптолидом в различных концентрациях в течение периодов, составляющих 24 ч и 48 ч. В каждую лунку планшета добавляли тетразолиевый субстрат (10 мкл). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 ч, после чего измеряли поглощение при 460 нм. Каждый экс- 15 021135 перимент проводили в трех повторностях и повторяли независимо три раза.

Влияние соединения 1 и триптолида на жизнеспособность клеток рака поджелудочной железы наблюдали после инкубации в среде, содержащей пролекарство триптолида в концентрациях в диапазоне от 50 до 200 нмоль/л через 24 ч и 48 ч. Данные собирали и преобразовывали в графики на фиг. 4 (жизнеспособность клеток М1а-Раса через 48 ч), фиг. 5 (жизнеспособность клеток Рапс-1 через 24 и 48 ч) и фиг.

(жизнеспособность клеток 82УР10 через 24 и 48 ч).

Как видно из приведенных выше данных и на каждой из фигур, присутствие пролекарства триптолида и щелочной фосфатазы, и природной формы триптолида значительно уменьшало жизнеспособность клеток поджелудочной железы ίη νίΐτο время- и дозозависимым образом.

Пример 8. Сравнительное исследование ίη νίνο соединения 1 на мышах.

Тридцать бестимусных мышей линии пийе пи/пи были получены из Национального института рака (Ναΐίοηαΐ Сапсег 1п5111п1е. N0) (Роквилл, штат Мэриленд) и содержались в центре КАК (Животные ресурсы для исследований, КекеатсЬ Ашша1 Кекоигсек). Мышей анестезировали в соответствии с рекомендациями центра КАК с использованием кетамина (кеОишпе) 75-200 мг/кг и ксилазина (\у1а/1пе) 4-8 мг/кг. Делали небольшой разрез 3 мм на левой стороне брюшной стенки и щипцами извлекали селезенку в достаточной степени для того, чтобы обнажить и обеспечить доступ к поджелудочной железе. Получали среду клеток М1аРаса-2 и выдерживали на льду до доставки мышам. Каждой из мышей вводили путем инъекции 1 миллион клеток М1аРаса-2, суспендированных в МАТРИГЕЛЕ™ (от ВесЮп-Оюкткоп Согротайоп, Ртапкйп Ьакек, Νον 1егкеу), в хвост поджелудочной железы (определяется анатомическим соединением с селезенкой) с использованием шприца Гамильтона. После доставки клеток шприц держали в неизменном положении в течение дополнительных 5-10 с, чтобы позволить МАТРИГЕЛЮ™ осесть. Селезенку помещали обратно в брюшную полость и брюшную стенку закрывали непрерывным викриловым швом. Кожу соединяли и закрывали с использованием скобок для стягивания краев ран. Затем мышей переносили на грелку-подушку до полного восстановления перед возвращением в клетку. Послеоперационное обезболивающее средство (бупренорфин (ЬиртепопотрЫпе) 0,1 мг/кг) вводили интраперитонеально сразу же после полного восстановления от анестезии для предупреждения угнетения дыхания, а затем вводили каждые 12 ч в течение 2 дней. Скобки для стягивания краев ран снимали у мышей через дней после операции.

Мышей рандомизировали на 3 группы, каждая группа включает 10 мышей. Группы были следующие: контрольная группа, группы триптолида и группа пролекарства триптолида (соединение 1). Контрольная группа состояла из мышей, которым вводили интраперитонеально носитель - ДМСО - путем инъекции. Субъектам группы триптолида вводили путем инъекции 0,2 мг/кг триптолида, растворенного в ДМСО и разбавленного фосфатным буферным раствором до объема, равного 100 мкл, при этом интраперитонеальные инъекции осуществляли ежедневно в течение 60 дней. Субъектам группы соединения 1 интраперитонеально вводили путем инъекции ежедневно в течение 60 дней 0,28 мг/кг указанного соединения, растворенного в фосфатном буферном растворе, разбавленном до объема, равного 100 мкл.

Мышей подвергали эвтаназии под наркозом по завершении лечения в течение 60 дней. Забирали образцы (кровь, легкое, селезенка, печень, почки и опухолевая ткань) и измеряли объем и массу опухоли, и сравнивали между разными группами. Проводили наблюдения локорегионарного роста и роста раковой опухоли.

Фиг. 8 (фотографии контрольной группы), фиг. 9 (фотографии группы триптолида) и фиг. 10 (фотографии группы пролекарства триптолида из Примера 1) представляют собой серию фотографий, демонстрирующих конечный рост опухолей в каждой из групп мышей эксперимента ш νί\Ό. Фиг. 11 представляет собой фотографию серии удаленных опухолей, извлеченных у мышей каждой из групп и расположенных в ряд, соответствующий каждой группе.

Опухоли, удаленные у мышей контрольной группы, не получавшей лечение, были значительно больше через 60 дней, чем опухоли, удаленные у мышей двух других групп, что демонстрирует продолжающийся агрессивный рост клеток опухоли поджелудочной железы. В отличие от этого, группа соединения из Примера 1 демонстрировала значительное ингибирование роста опухоли поджелудочной железы по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечение, и существенное эффективное ингибирование опухолевых клеток по сравнению с природной формой триптолида. Теперь обратимся к фиг. 11 и 12, демонстрирующим сравнительную массу опухоли и объем опухоли среди трех групп соответственно. Опухоли у контрольной группы были значительно больше с точки зрения как массы (г), так и объема (см³) по сравнению с данными опухолей у группы триптолида и пролекарства триптолида (соединение 1).

Таким образом, при введении живому млекопитающему ш νί\Ό пролекарственное соединение триптолида согласно настоящему изобретению может эффективно ингибировать рост опухоли, и эффективность ингибирующего действия сопоставима с эффективностью природной не пролекарственной формой триптолида. Как видно из приведенных выше данных и фигур, рост раковой опухоли поджелудочной железы у мышей, получавших лечение природным триптолидом и пролекарством триптолида (соединение 1) в течение 60 дней, демонстрировал значительно уменьшенный объем опухоли по сравнению с

- 16 021135 контрольной группой, не получавшей лечение. Кроме того, было значимым то, что у субъектов как группы триптолида, так и группы пролекарства триптолида, не наблюдали очевидного значительного влияния на массу тела и не наблюдали очевидных признаков токсичности у указанных субъектов. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению могут обеспечивать ингибирование опухоли и ингибировать рост раковых клеток и, в частности, рост клеток рака поджелудочной железы. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению также могут служить основой для эффективного лечения для ингибирования рака поджелудочной железы с низким уровнем токсических побочных эффектов у живых млекопитающих.

Пример 9: Индуцированная соединением 1 регрессия опухоли в ортотопической модели рака поджелудочной железы у мышей (исследование введения доз в течение 60 дней). Клетки МПА РаСа-2 (1х 10⁶) суспендировали в матригеле и вводили в хвост поджелудочной железы 4-6-недельных самок безтимусных мышей путем инъекции. Через десять дней после имплантации клеток мышам интраперитонеально вводили путем инъекции указанные концентрации соединения 1 (0,1, 0,15, 0,3, 0,6 или 0,9 мг/кг) или 0,2 мг/кг триптолида один раз в сутки в течение 60 дней. Контрольным мышам вводили физиологический раствор путем инъекции дважды в сутки. Лечение прекращали через 60 дней и мышей наблюдали в течение еще 28 дней перед умерщвлением. Забирали образцы опухоли, при наличии, у данных мышей и измеряли массу и объем опухоли. Если опухолевая масса превышала массу, указанную в рекомендациях по уходу за животными Университета Миннесоты (Ишуегкку о£ ΜίηηοκοΙα атта1 саге дшбеНиек), мышей умерщвляли в более ранние моменты времени и их опухоли забирали. Фиг. 13 иллюстрирует повышенную выживаемость мышей, получавших лечение соединением 1 и триптолидом по сравнению с растворигелем. Растворитель вводили дважды с сутки: все смерти происходили из-за опухолевой массы;

0,1 мг/кг соединения 1 один раз в сутки: наблюдали 1 смерть из-за опухолевой массы;

0,15 мг/кг соединения 1 дважды в сутки: отсутствие смертей;

0,2 мг/кг соединения 1 один раз в сутки: 1 смерть из-за повреждения, не связана с опухолевой массой или действием лекарственного средства.

Фиг. 14 иллюстрирует повышенную выживаемость мышей, получавших лечение соединением 1 по сравнению с растворителем. Растворитель дважды с сутки: все смерти происходили из-за опухолевой массы;

0,3 мг/кг соединения 1 один раз в сутки: 1 смерть из-за повреждения, не связана с опухолевой массой;

0,6 мг/кг соединения 1 один раз в сутки: отсутствие смертей;

0,9 мг/кг соединения 1 один раз в сутки: 1 смерть при инъекции в 6 день исследования, причина не определена. Остальные смерти из-за действия лекарственного средства.

На фиг. 15 показана уменьшенная опухолевая масса, измеряемая по объему опухоли или массе опухоли, у мышей, получавших лечение соединением 1, по сравнению с контрольными мышами.

Пример 10. Индуцированная соединением 1 регрессия опухоли в ортотопической модели рака поджелудочной железы у мышей (исследование введения доз в течение 21 дня).

х 10⁶ клеток 82013, крайне метастатической линии клеток рака поджелудочной железы, суспендировали в матригеле и вводили в хвост поджелудочной железы 4-6-недельных самок безтимусных мышей путем инъекции. Через семь дней после имплантации клеток мышам интраперитонеально вводили путем инъекции 0,42 мг/кг соединения 1 в течение 21 дня. Лечение прекращали через 21 день и мышей умерщвляли. Забирали образцы опухоли, при наличии, у данных мышей и измеряли массу и объем опухоли. Если опухолевая масса превышала массу, указанную в рекомендациях по уходу за животными Университета Миннесоты (иИуегкку о£ М1пиекоСа атта1 саге дшбеНиек), мышей умерщвляли и их опухоли забирали в более ранний момент времени. Контрольным мышам вводили физиологический раствор путем инъекции один раз в сутки. На фиг. 16 показана уменьшенная опухолевая масса, измеряемая по объему опухоли или массе опухоли, у мышей, получавших лечение соединением 1, по сравнению с контрольными мышами.

Пример 11. Индуцированная соединением 1 регрессия опухоли в модели подкожной холангиокарциномы у мышей.

Клетки 8кСНА-1 (5х10⁵) суспендировали в матригеле и вводили подкожно в левый бок 4-6недельных самок безтимусных мышей путем инъекции. Через семь дней после имплантации клеток мышам интраперитонеально вводили путем инъекции 0,3 мг/кг соединения 1 дважды в сутки в течение 25 дней. Лечение прекращали в данный момент и мышей умерщвляли. Забирали образцы опухоли, при наличии, у данных мышей и измеряли массу и объем опухоли. Если опухолевая масса превышала массу, указанную в рекомендациях по уходу за животными Университета Миннесоты (Итуегкку о£ М1пиекоСа атта1 саге дшбеНиек), мышей умерщвляли и их опухоли забирали в более ранний момент времени. Контрольным мышам вводили физиологический раствор путем инъекции дважды в сутки. На фиг. 17 показана уменьшенная опухолевая масса, измеряемая по объему опухоли или массе опухоли, у мышей, получавших лечение соединением 1 по сравнению с контрольными мышами.

Пример 12. Индуцированная триптолидом регрессия опухоли в ортотопической модели нейробла- 17 021135 стомы у мышей.

Клетки нейробластомы N2 (1х 10⁶) суспендировали в матригеле и вводили в левое забрюшинное пространство 4-6-недельных иммунокомпетентных мышей линии АЛ путем инъекции. Через три дня после имплантации клеток мышам интраперитонеально вводили путем инъекции 0,4 мг/кг триптолида в течение 21 дня. Лечение прекращали в данный момент и мышей умерщвляли. Забирали образцы опухоли, при наличии, у данных мышей и измеряли массу и объем опухоли. Если опухолевая масса превышала массу, указанную в рекомендациях по уходу за животными Университета Миннесоты (итуегзИу οί Μίηηе8οίа атта1 саге дшйе1ше8), мышей умерщвляли и их опухоли забирали в более ранний момент времени. Контрольным мышам вводили ДМСО путем инъекции в течение 21 дня. На фиг. 18 показана уменьшенная опухолевая масса, измеряемая по объему опухоли и массе опухоли, у мышей, получавших лечение триптолидом по сравнению с контрольными мышами.

Пример 13. Индуцированная триптолидом гибель клеток и активация каспазы-3 в клетках нейробластомы.

Клетки нейробластомы Ν2Α и 8ΚΝ8Η обрабатывали триптолидом, что приводило к дозо- и времязависимой гибели клеток в Ν2Α, при этом более 50% клеток погибали под действием 62,5 нМ триптолида через 24 ч и около 85% клеток погибали под действием 250 нМ триптолида через 48 ч (фиг. 19). Для подтверждения гипотезы о том, что триптолид приводит к гибели клеток нейробластомы по пути апоптоза, измеряли активность каспазы-3 в качестве маркера апоптоза. В обеих линиях клеток наблюдали повышение активности каспазы при более высоких дозах триптолида и более продолжительной терапии. Лечение триптолидом было связано с дозо- и времязависимыми повышениями уровней активности каспазы-3 (Фиг. 20). Данные результаты показывают, что опосредуемая триптолидом гибель клеток происходит путем индукции апоптоза.

Пример 14. Следующие данные иллюстрируют типичные фармацевтические лекарственные формы, содержащие соединение формулы I ('соединение X'), для терапевтического или профилактического применения у людей.

ίί) Таблетка 1	мг/таблетка
Соединение Х=	0,5
Лактоза	77,5
Повидон	15,0
Кроскармеллоза натрия	12,0
М икрокристаллическая
целлюлоза	92,5
Стеарат магния	10
	185
(ϋ) Таблетка 2	мг/таблетка
Соединение Х=	1,0
Микрокристаллическая
целлюлоза	410,0
Крахмал	50,0

Натрия крахмала гликолят 15,0

Стеарат магния	10 481
ίίί) Капсула	мг/капсула
Соединение Х=	2,0
Коллоидный диоксид
кремния	1,5
Лактоза	465,5
Прежелатинизированный
крахмал	120,0
Стеарат магния	10
	468

Оу) Инъекция 1 (1 мг/мл)

Соединение Х=

Двухосновный фосфат натрия Одноосновный фосфат натрия Хлорид натрия

1,0 Н раствор гидроксида натрия (доведение рН до 8,2-9)

Вода для инъекций мг/мл

0,5

12,0

0,7

4,5 достаточное количество достаточное количество до 1 мл (у) Инъекция 1 <1 мг/мл) мг/мл

- 18 021135

Соединение Х=

1,0 Н раствор гидроксида натрия (доведение рН до 8,2-9,0)

Вода для инъекций

12,0

0,7

4,5 достаточное количество достаточное количество до 1 мп (νί) Инъекция 2 (10 мг/мл)

Соединение Х=

Одноосновный фосфат натрия Двухосновный фосфат натрия Полиэтиленгпикопь 400 1,0 Н раствор гидроксида натрия (доведение рН до 8,2-9,0)

Вода для инъекций мг/мл

0,3

1,1

200,0 достаточное количество достаточное количество до 1 мл

Вышеуказанные составы могут быть получены с помощью традиционных процедур, хорошо известных в области фармацевтики.

Содержание всех публикаций, патентов и патентных документов включено в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы было индивидуально включено посредством ссылки. Настоящее изобретение описано относительно различных конкретных и предпочтительных вариантов реализации и технологий. Однако следует понимать, что возможны различные вариации и модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения.

1. Соединение формулы I

Claims

где каждый К¹ представляет собой Н или (С1-С6)алкил; каждый К² представляет собой Н или (С1-С₆)алкил; η представляет собой 1, 2 или 3 и каждый Х' представляет собой фармацевтически приемлемый органический катион или неорганический катион.
2. Соединение по п.1, представляющее собой соединение формулы !а где Х' представляет собой фармацевтически приемлемый органический катион или неорганический катион.
3. Соединение по п.1, где К¹ представляет собой Н.
4. Соединение по п.1 или любому из пп.2-3, где каждый Х+ представляет собой Н.
5. Соединение по п.1 или любому из пп.2-3, где каждый Х' представляет собой литий, натрий, калий, магний, кальций, барий, цинк или алюминий.
6. Соединение по п.1 или любому из пп.2-3, где каждый Х' имеет формулу НУ', где Υ представляет собой аммиак, триэтиламин, трометамин, триэтаноламин, этилендиамин, глюкамин, Ν-метилглюкамин, глицин, лизин, орнитин, аргинин, этаноламин или холин.
7. Соединение по любому из пп.1-3, где каждый Х' представляет собой Να'.
8. Соединение, представляющее собой динатриевую соль 14-О-фосфонооксиметилтриптолида, динатриевую соль 14-О-фосфонооксиэтилтриптолида или динатриевую соль 14-Офосфонооксипропилтриптолида.
9. Соединение, представляющее собой динатриевую соль 14-О-фосфонооксиметилтриптолида.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I по любому из пп.1-9 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
11. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему соединения формулы I по любому из пп.1-9.
12. Способ ингибирования роста раковых клеток в экспрессирующей Н8Р70 злокачественной опухоли у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного для ингибирования количества соединения формулы I по любому из пп.1-9.

- 19 021135

Фиг. 1

Фиг. 3

- 20 021135

Фиг. 4

Т=Триптолид рТ=Пролекарство (соединение 1)

Фиг. 5

Фиг. 6

Фиг. 7

- 21 021135

Фиг. 8

Фиг. 9

Фиг. 11

- 22 021135

Фиг. 12

С 20 40 €0 30 100

Дни (День 1 = Доза 1)

Растворитель дважды с сутки: все смерти происходили из-за опухолевой массы

0,1 мг/кг Соединения 1 один раз в сутки: наблюдали 1 смерть из-за опухолевой массы

0,15 мг/кг Соединения 1 дважды в сутки: отсутствие смертей

0,2 мг/кг Соединения 1 один раз в сутки: 1 смерть из-за повреждения, не связана с опухолевой массой или действием лекарственного средства.