EA019837B1 - Применение 25-oh d3 для воздействия на физиологию мышц человека - Google Patents

Abstract

Предлагается применение 25-ОН D3 (кальцифедиола) в комбинации с витамином D3 для увеличения мышечной силы, мышечной функции или обеих. Раскрыты формы и дозы лекарственных препаратов, а также способ их приготовления и использования.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению 25-гидроксивитамина Ό3 (кальциферол, 25-ОН Ό3) для повышения или сдерживания или предотвращения потери мышечной силы или мышечной функции или их обеих, при котором 25-ОН Ό3 вводят совместно с витамином Ό3.

Предпосылки создания изобретения

Витамин Ό (напр., эргокальциферол и холекальциферол) представляет группу растворимых в жирах соединений, сгруппированных по их биологической активности. Дефицит витамина Ό вызывает рахит у детей и остеомаляцию у взрослых. Однако после длительного потребления в течение нескольких месяцев в дозе, превышающей более чем в 100 раз рекомендованную суточную норму (например, 5-15 мкг или 200-600 МЕ витамина Ό), может развиться токсичность. Для витамина Ό пороговая величина токсичности составляет 500-600 мкг/кг массы тела в день. В целом, взрослые не должны потреблять более трех рекомендованных суточных норм (ВОЛ) в течение длительного периода времени (СаггЕои & Зотег, Т1зе МПпбоп Эе^к ВеЕегеисе, ТЫгб Еб., МсСга\\-НП1, рд. 82, 1997). Гиперкальциемия может развиться при содержании 25-гидроксивитамина Ό в крови более чем 375 нмоль/л. В последнее время был идентифицирован безопасный верхний уровень витамина Ό, который составляет по меньшей мере 250 мкг/день (10000 МЕ) (НаШсоск е! а1. Лш.1 С11и. ΝιιΙγ. 85:6-18, 2007). Было показано, что прием внутрь такого количества витамина Ό в качестве пищевой добавки приводит к образованию 200 нмоль/л 25гидроксивитамина Ό в крови.

Витамин Ό является прогормоном, который должен гидроксилироваться в печени с получением 25гидроксивитамина Ό (кальцифедиол; 25-ОН витамин Ό; 25-ОН Ό), который затем подвергается другому гидроксилированию в почках и других тканях с получением 1,25-дигидроксивитамина Ό, активной формы гормона витамина Ό. 1,25-дигидроксивитамин Ό высвобождается в кровь, соединяется с белком, связывающим витамин Ό (ΌΒΡ) и транспортируется к тканям-мишеням. Связывание между 1,25дигидроксивитамином Ό и рецептором витамина Ό приводит к образованию комплекса, который действует как фактор транскрипции в клеточном ядре.

Дефицит витамина Ό может повышать резорбцию костей. Он может также модулировать функцию сердечнососудистой, иммунной и мышечной систем. Эпидемиологические исследования обнаружили связь между потреблением витамина Ό и его действием на кровяное давление или метаболизм глюкозы. Активность витамина Ό регулируется паратиреоидным гормоном по механизму отрицательной обратной связи.

В прошлом оба витамин Ό и 25-ОН Ό3 применяли как лекарственные средства. Разумеется, витамин Ό является широко доступным; 25-ОН Ό3 ранее продавался в США фирмой Огдапоп ИЗА под названием САЕПЕВОЕ, но сейчас он входит в ΡΌΑ-перечень лекарственных средств, снятых с производства. Он представлял собой желатиновую капсулу, содержащую кукурузное масло и 25-ОН Ό3.

В настоящее время жидкая форма 25-ОН Ό3 продается в Испании фирмой БАЕ8 Багша под названием НШВОБЕВОЕ в масляном растворе.

Комбинацию витамина Ό и 25-ОН Ό3 применяют в корме для животных. 25-ОН Ό3 для применения в корме коммерчески доступен от ΌδΜ под названием ВОУ1М1Х ΗΥ-Ό.

ТпШсй е! а1. (И8 2003/0170324) описали композицию кормового премикса, содержащую, по меньшей мере, 25-ОН Ό3 в количестве от 5 до 50% (вес./вес.), растворенный в масле, и антиоксидант, капли инкапсулирующего агента из 25-ОН Ό3 и масла, и пищевую добавку (например, витамин Ό3). Премикс можно добавлять к корму для домашних птиц, свиней, собак или кошек. Эта композиция стабилизирует 25-ОН Ό3 от окисления.

8|тое5-№те5 е! а1. (И8 2005/0064018) описал добавление комбинации 25-ОН витамина Ό3 и витамина Ό3 к корму для животных. В частности, от около 10 до около 100 мкг/кг 25-ОН витамина Ό3 и от около 200 до около 4000 МЕ/кг витамина Ό3 добавляют к корму для свиней. Эта добавка повышает прочность костей.

81агк е! а1. (ϋδ 5695794) описали добавление комбинацию из 25-ОН витамина Ό3 и витамина Ό3 к корму для домашних птиц для облегчения течения дисхондроплазии голени.

Вогеийеш е! а1. ϋδ 5,043,170 описал комбинацию из витамина Ό3 и либо 1-альфагидроксихолекальциферола либо 1-альфа-25-дигидроксихолекальциферола для повышения прочности яиц и силы лапок у кур-несушек и старых кур.

Сйиид е! а1., \¥О 2007/059960 показал, что диета с потреблением корма для свиней, содержащего оба витамин Ό3 и 25-гидроксивитамин Ό3, повышала общее состояние здоровья, скелет тела, размер помета и состояние здоровья и другие параметры продуктивности. Также представлена пищевая добавка для людей, содержащая 25-ОН Ό3, но в диапазоне очень высоких доз, 5-15 мкг на кг массы тела, что эквивалентно экстремально высокой дневной дозе 300-900 мкг на человека.

РСТ/ЕР 08/006357 показывает, что пренатальное снабжение поросят 25-ОН Ό3 (путем включения в корм беременных свинок) улучшает развитие мышц у потомства.

Сведения из уровня техники не раскрывают и не предполагают возможность применения 25-ОН витамина Ό3 или комбинации из 25-ОН Ό3 и витамина Ό в качестве лекарственного средства для людей для усиления мышечной силы, мышечной функции или обеих. Другие преимущества и усовершенство

- 1 019837 вания описываются ниже или будут очевидны из описания, представленного здесь.

Сущность изобретения

Было обнаружено, согласно настоящему изобретению, что ежедневное или еженедельное потребление 25-ОН Ό3 неожиданно привело к усилению мышечной силы и/или функции по сравнению с потреблением аналогичных доз витамина Ό.

Таким образом, одним аспектом данного изобретения является применение комбинации 25-ОН Ό3 с витамином Ό3 в качестве лекарственного средства для повышения мышечной силы и/или функции у человека. Человек может быть любого возраста, включая детей и подростков, начиная с рождения до периода полового созревания, и от 18 лет до 80 лет или более.

Витамин Ό3 можно принимать вместе с или раздельно от 25-ОН Ό3. Их можно принимать один раз в день, один раз в неделю или один раз в месяц. Обычно период приема составляет, по меньшей мере, один месяц, предпочтительно более двух месяцев, и более предпочтительно четыре месяца с тем, чтобы можно было четко определить изменения мышечной силы. Сила может быть определена с использованием тестов, принятых в данной области техники, таких как тесты определения силы сгибателей и разгибателей колена.

В другом аспекте обеспечен способ повышения мышечной функции путем введения эффективного количества 25-ОН Ό3. При необходимости, витамин Ό можно вводить совместно с или раздельно от 25ОН Ό3. Они могут быть введены один раз в день, один раз в неделю или один раз в месяц. Мышечная функция может быть оценена с помощью общеизвестных тестов, таких как тест повторных встать-сесть и теста встань-иди на время.

Было обнаружено, в соответствии с данным изобретением, что комбинация из 25-ОН Ό3 и витамина Ό синергетически регулирует (либо активирует, либо подавляет) синергетическое количество генов скелетных мышц, чувствительных к витамину Ό, включая ряд генов, которые не чувствительны к наличию ни витамина Ό ни 25-ОН Ό3 по отдельности. Это неожиданный результат, поскольку он не объяснен традиционной моделью метаболизма витамина Ό, который постулирует, что фактически весь витамин Ό метаболизируется в 25-ОН Ό.

Комбинация, в соответствии с данным изобретением, обеспечивает два значимых преимущества:

1) она приводит к быстрой и синергетической плазменной реакции 25-ОН Ό,

2) она приводит к непредвиденно выраженному и длинному плато плазменных уровней 25-ОН Ό. Это в особенности важная цель при лечении мышечных заболеваний, которые вызваны недостатком витамина Ό: быстрая коррекция недостаточного статуса витамина Ό и длительная и подходящая плазменная концентрация для обеспечения достаточной подачи 25-ОН к мышечной ткани.

Другим аспектом изобретения является применение комбинации 25-ОН Ό3 и витамина Ό3 в производстве композиции для фармацевтической, нутрицевтической, пищевой добавки или продукта питания для увеличения или сдерживания или предотвращения потери мышечной массы функции или мышечной силы у человека.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов для мышиных генов для группы мышей, нагруженных за заднюю конечность (Ни группа), группы лечения (витамин Ό3, 25-ОН Ό3 или комбинация).

Фиг. 2 - диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов между группой приема 25ОН Ό3 и группой приема комбинации из 25-ОН Ό3 + витамин Ό3.

Фиг. 3 - диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов между группой приема витамина Ό3 и группой приема комбинации из 25-ОН Ό3 + витамин Ό3.

Фиг. 4 - анализ обогащения (выполненный с СеиеСо Ме1аСоте) 1745 наборов проб для генов, различно экспрессирующихся между НИ-группой и группой, принимающей комбинированное лечение 25ОН Ό3 и витамином Ό3.

Фиг. 5 - диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов в группе приема 25-ОН Ό3 + витамин Ό3 и наборов зондов для выбранных генов скелетных мышц.

Фиг. 6 - диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов в группе приема 25гидроксивитамина и наборов зондов для выбранных генов скелетных мышц.

Фиг. 7 - диаграммы Венна различно экспрессирующихся наборов зондов в группе приема витамина Ό3 и наборов зондов для выбранных генов скелетных мышц.

В используемых в описании и формуле изобретения значениях, следующие понятия означают:

Витамин Ό означает или витамин Ό3 (холекальциферол) и/или витамин Ό2 (эргокальциферол). Человек не способен вырабатывать витамин Ό2 (эргокальциферол), но способен использовать его как источник витамина Ό. Витамин Ό2 может синтезироваться разными растениями и часто используется в витамине Ό в добавках в качестве эквивалента витамину Ό.

Метаболит витамина Ό означает любой витамин Ό, отличный от 25-гидрокси витамина Ό3.

25-ОН Ό3 относится специфично к 25-гидроксивитамину Ό3

25-ОН Ό относится к 25-гидроксилированному метаболиту или витамина Ό2 или витамину Ό3, который является основной циркулирующей формой, обнаруживаемой в плазме.

- 2 019837

Предотвращение включает уменьшение интенсивности заболевания, снижение тяжести симптомов, раннего развития и удлинение периода начала заболевания и не ограничивается ситуацией, когда пациент более не способен ни заболеть, ни проявить какие-либо симптомы.

В другом воплощении обеспечен набор, который содержит множество раздельных доз витамина Ό или витамина Ό3 вместе с дозировкой 25-ОН Ό3. Они могут быть закрыты в контейнере, например баночке, блистерной упаковке или ампуле. Также набор обеспечен инструкциями для применения композиции в качестве лекарственной формы для человека.

В другом воплощении 25-ОН Ό3 в комбинации с витамином Ό является активным ингредиентом для сохранения здоровой мышечной силы или функции в продуктах питания, пищевых добавках или нутрицевтиках, подходящих для потребления человеком. Дозировки 25-ОН и/или Ό3 могут быть аналогичными с теми, которые присутствуют в фармацевтическом продукте, но предпочтительно будут иметь склонность к более низким значениям. Пищевые добавки и нутрицевтики могут быть в форме таблеток, капсул или других традиционных лекарственных форм. Продуктом питания может быть напиток или пища, и если необходимо, может также содержать другие диетически эффективные соединения, такие как другие витамины, минералы и подобные.

Дефицит витамина Ό является очень распространенным состоянием в популяции людей пожилого возраста и тех, кто страдает хронической неподвижностью независимо от возраста. Это может быть благодаря общему недостатку воздействия солнца, снижению способности организма вырабатывать витамин Ό или эффективности метаболизма, или благодаря ряду других причин. Одним последствием недостатка витамина Ό является потеря мышечной силы и/или функции. Таким образом, аспект изобретения заключается в применении комбинации из витамина Ό и 25-ОН Ό3 в популяции пожилых людей для сохранения, предотвращения потери и/или для восстановления здоровой мышечной силы и функции. В используемом значении, термин пожилые охватывает людей в возрасте более 65 лет, предпочтительно более 70 и даже более 80.

В другом воплощении эта комбинация из 25-ОН Ό3 и витамина Ό подходит для сохранения, предотвращения потери и/или для восстановления здоровой мышечной силы и функции у людей, кто имеет риск развития недостатка мышечной силы и/или функции, характеризующихся нехваткой витамина Ό или недостаточностью. В эту группу входят взрослые, включая постменопаузальных женщин (т.е. около 45 и старше) и мужчин в возрасте около 45 лет и старше. Комбинация в особенности подходит для индивидуумов, кто не загорает на солнце в достаточном количестве, таких людей, которые традиционно одеты в длинные вещи, не регулярно совершают прогулки или кто использует кремы от загара, когда они находятся на солнце, или живут в географических областях, в особенности на севере или юге от экватора, где солнце наименее интенсивно.

Другим аспектом изобретения является способ сохранения, предотвращения потери и/или восстановления здоровой мышечной силы и функции у человека с синдромом мальабсорбции (напр., страдающего глютеновой болезнью, спру или синдромом короткой кишки), и, следовательно, с риском недостаточности витамина Ό, причем способ включает введение комбинации из витамина Ό и 25-ОН Ό3.

Другим аспектом данного изобретения является способ сохранения, предотвращения потери и/или восстановления здоровой мышечной силы и функции у человека с ослабленной функцией печени, при этом организм человека не может превращать витамин Ό в 25-гидроксивитамин Ό эффективно, причем способ включает обеспечение человека комбинацией из витамина Ό и 25-гидроксивитамин Ό3.

Комбинации изобретения также являются полезными для сохранения мышечной массы у лиц пожилого возраста (до 80 лет) и очень пожилого возраста (80 и более), в частности тех, кто находится на попечении в условиях стационара (напр., в госпитале, в доме престарелых, реабилитационной клинике, пансионате для престарелых), или тех, у которых имеется мышечная атрофия.

Другим воплощением изобретения является применение 25-ОН Ό3 для сохранения или предотвращения потери мышечной силы у пожилых людей. Потеря мышечной силы также главным образом происходит вследствие падений пожилых и способствует большому количеству падений, которые имеют место в госпиталях. Для более старого человека, у которого сокращены физиологические резервы, но все еще который может вести дневную активность (напр., гулять, мыться и ходить в туалет), ускоренное снижение мышечной силы даже после нескольких дней постельного режима может привести к длительной потери независимой функции. Даже если эта потеря в итоге остановится, для реабилитации необходимо экстенсивное и дорогое вмешательство, поскольку восстановление мышц процесс более длительный, чем процесс детренированности.

Комбинации изобретения также полезны для сохранения и/или увеличения мышечной массы у людей, которые могут быть не старыми, но которые потеряли мышечную массу, поскольку они неподвижны вследствие другого состояния. Как объяснено в Мегск Мапиа1 о£ Сспа1пс5. 2 Ей: (р316-318): при полной обездвиженности мышечная сила снижается на 5% в день. Даже молодые люди в постельном режиме теряют мышечную силу при скорости 1,0-1,5% в день (или около 10% в неделю).

Таким образом, комбинации изобретения полезны для людей, кто подвержен потере мышечной массы вследствие снижения двигательной активности или кто уже не двигается. Причина снижения подвижности не имеет значения для практики изобретения, при этом целью изобретения является защита от

- 3 019837 потери мышечной массы. Например, потеря подвижности может быть следствием травмы, инсульта, пребывания в тюрьме, болезни Паркинсона, рассеянного склероза, тяжелой псевдопаралитической миастении или даже болезни Крейтцфельдта-Якоба. Следовательно, другим аспектом изобретения является введение соединений изобретения параплегическому или квадриплегическому индивидууму.

Комбинации изобретения также полезны для тех, кто страдает от кахексии или саркопении. Кахексия представляет собой синдром истощения организма человека, которая является сопутствующим заболеванием с раками и СПИДом. Другие синдромы или состояния, которые могут вызывать скелетномышечную атрофию, представляют собой острую сердечную недостаточность, хроническую обструктивную болезнь легких, заболевание печени, голодание, ожоги и др. Саркопения является другим состоянием (отличным от кахексии и атрофии), которое касается снижением мышечной функции, связанной с возрастом. Точная причина не известна.

Данное изобретение также приносит пользу тем, у кого имеется мышечная слабость. Мышечная слабость является физической частью утомления (медицинского). Положение мышечной слабости - центральное, невральное и периферическое. Центральная мышечная слабость является общим истощением всего организма, тогда как периферическая слабость является истощением отдельных мышц. Невральная слабость является чем-то средним.

Мышечная слабость может быть вызвана проблемами иннервации или проблемами мышц самих по себе. Последняя категория включает полиомиелит и другие мышечные заболевания, напр., боковой амиотрофический склероз, ботулизм, центронуклеарную миопатию, вегетативную дистонию, болезнь Шарко-Мари, гипокалемию, заболевание двигательных нейронов, мышечную дистрофию, миотоническую дистрофию, тяжелую псевдопаралитическую, миастению, прогрессирующую мышечную атрофию, спинальную мышечную атрофию, церебральный паралич, инфекционный мононуклеоз, герпес зостер, дефицит витамина Ό, фибромиалгию, глютеновую болезнь, гиперкортицизм (синдром Кушинга), гиперкортизолизм (болезнь Аддисона), первичный гиперальдостеронизм (синдром Кона) и диарею.

Лекарственные формы

Витамин Ό и 25-ОН Ό3 можно получить из любого источника, и композиция из них может быть приготовлена с использованием традиционной технологии. В целом, кристаллы витамина Ό3, 25-ОН Ό3 или обоих (раздельно или совместно) растворяют в масле при нагревании и перемешивании. Предпочтительно, масло переливают в сосуд и нагревают. Затем к сосуду добавляют витамин Ό3, 25-ОН Ό3 или оба, до достижения температуры масла или повышая ее постепенно. Композицию перемешивают для растворения кристаллов витамина Ό3, 25-ОН Ό3 или обоих. Перед добавлением к маслу кристаллы можно измельчить путем дробления и/или фильтрования, для увеличения растворимости. Композицию можно перемешивать путем встряхивания, вращения сосуда, смешивания, гомогенизации, рециркуляции или ультразвуковой обработки. Предпочтительно масло можно нагревать в сосуде до температуры от около 80 до около 85°С, измельченные кристаллы вводят в сосуд и содержимое перемешивают для растворения кристаллов в масле.

Масло может представлять собой любое пригодное для пищи масло, липид или жир: напр., пальмовое масло, кокосовое масло, масло семян пальмы, топленое сало тигитуги, косточковое пальмовое масло или масло 1иеит. Масло может быть природным, синтетическим, полусинтетическим или любой комбинацией из них. Природное масло может быть получено из любого источника (напр., животного, растения, грибков, морепродуктов); синтетическое или полусинтетическое масло может быть получено с помощью традиционной технологии. Предпочтительно масло представляет собой смесь из среднецепочечных триглицеридов растений, главным образом смесь из каприловой и каприновой кислот. Композиция может при необходимости содержать один или более других подходящих ингредиентов, таких как, например, фармацевтически приемлемые антиоксиданты, консерванты, растворители, сурфактанты, регулирующие рН агенты или буферы, увлажнители и любую комбинацию из них. Далее представлены примеры фармацевтически подходящих носителей.

Пригодные антиоксиданты включают токоферол, смешенные токоферолы, токоферолы, полученные из природных или синтетических источников, бутилированный гидрокситолуол (БГТ), бутилированный гидроксианизол (БГ А), природные антиоксиданты, такие как экстракт розмарина, пропилгаллат и другие, которые применяют в производстве фармацевтических препаратов для людей. Предпочтительно, антиоксидантом является токоферол. Пригодные консерванты включают метилпарабен, пропилпарабен, сорбат калия, бензоат натрия, бензойную кислоту и их смеси. Пригодные растворители включают неорганические или органические растворители, в том числе спирты, хлорированные углеводороды и их смеси. Пригодные сурфактанты могут быть анионогенными, катионогенными или неионогенными, в том числе аскорбилпальмитат, полисорбаты, полиэтиленгликоли и их смеси. Пригодные агенты для регулирования значения рН или буферы включают лимонную кислоту - цитрат натрия, фосфорную кислоту фосфат натрия, уксусную кислоту - ацетат натрия и их смеси. Пригодные увлажнители включают глицерин, сорбит, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и их смеси.

После получения масляную композицию можно включать в состав различных других применяемых композиций, некоторые из которых описаны ниже. Например, можно получать эмульсии, которые при необходимости можно инкапсулировать или высушивать распылением. Разнообразные эмульсии можно

- 4 019837 получать путем объединения масляных композиций, описанных выше, с водными композициями. Эмульсия может быть любого типа. Подходящие эмульсии включают эмульсии типа масло-в-воде, эмульсии типа вода-в-масле, безводные эмульсии, твердые эмульсии и микроэмульсии. Эмульсии можно получать любым пригодным методом. Эмульсия содержит водную композицию и неводную (напр., масляную) композицию, где последняя содержит витамин Ό3, 25-ОН Ό3 или оба (раздельно или совместно), растворенные в масле в количестве от около 3% до около 50% по весу от общего веса масляной композиции. В настоящем описании понятия водная композиция и водная фаза используются взаимозаменяемо. Как правило, эмульсия может содержать от примерно 20 до приблизительно 95% водной композиции и от примерно 5 до примерно 80% неводной композиции. Предпочтительно при этом эмульсия содержит от примерно 85 до примерно 95% (об./об.) водной композиции и от примерно 5 до примерно 15% (об./об.) неводной композиции.

Предпочтительно неводную композицию можно диспергировать в виде капель в водной композиции. Например, капли в водной композиции могут иметь средний диаметр менее примерно 500 нм. Предпочтительно капли имеют средний диаметр от примерно 150 до примерно 300 нм.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения эмульсия содержит инкапсулирующий агент, который облегчает инкапсулирование масляной композиции после дополнительной обработки эмульсии (например, распылительной сушкой). Инкапсулирующий агент может представлять собой любую съедобную субстанцию, способную инкапсулировать масляную композицию. Предпочтительно инкапсулирующий агент представляет собой в основном коллоидный продукт. Такие продукты включают крахмалы, протеины животного происхождения (в том числе желатины), протеины растительного происхождения, казеин, пектин, альгинат, агар, мальтодекстрины, лигнинсульфонаты, производные целлюлозы, сахара, сахариды, сорбиты, камеди и их смеси.

Пригодными крахмалами являются крахмалы растительного происхождения (например, САРЗИБ® или ΗΙ-САР® от Ναΐίοηαΐ 81агсй & Сйеш1са1 Согр., Нью-Йорк, шт.Нью-Йорк), другие модифицированные пищевые крахмалы и их смеси. Предпочтительно крахмал представляет собой модифицированный растигельный крахмал САРЗИБ®. Пригодными белками животного происхождения являются желатины (например, бычьи желатины, свиные желатины (типа А или Б) с различными числами Блума, рыбьи желатины), белок из сепарированного молока, казеинат и их смеси. Предпочтительно белок животного происхождения представляет собой желатин. Пригодными белками растительного происхождения являются картофельный протеин (например, АБВИКЕХ® от КосщеИе Ргегек 8ос1е1е Апопуте, Лестрем, Франция)), гороховый протеин, соевый протеин и их смеси. Предпочтительно белок растительного происхождения представляет собой картофельный белок АБВИКЕХ®. Пригодными мальтодекстринами с различными декстрозными эквивалентами являются мальтодекстрин 5, мальтодекстрин 10, мальтодекстрин 15, мальтодекстрин 20, мальтодекстрин 25 и их смеси. Предпочтительно мальтодекстрин представляет собой мальтодекстрин 15. Пригодными производными целлюлозы являются этилцеллюлоза, метилэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и их смеси. Пригодными сахаридами являются лактоза, сахароза или их смеси. Предпочтительно сахарид представляет собой сахарозу. Пригодными камедями являются аравийская камедь, камедь рожкового дерева, каррагенан и их смеси. Предпочтительно камедь представляет собой аравийскую камедь.

Если эмульсия содержит инкапсулирующий агент, то инкапсулирующий агент можно диспергировать в воде с помощью любых пригодных методов с образованием водной фазы. Водная фаза может представлять собой раствор или смесь в зависимости от свойств выбранных компонентов. Выбранные компоненты можно диспергировать с помощью любых пригодных методов, включая гомогенизацию, смешение, эмульгирование, рециркуляцию, статическое смешение, облучение ультразвуком, перемешивание, нагревание и комбинации указанных методов. Затем при необходимости можно регулировать вязкость образовавшейся водной фазы путем добавления воды. Водная композиция, входящая в состав эмульсии, при необходимости может содержать любой пригодный продукт, включая (но не ограничиваясь ими) продукты, описанные выше для неводной композиции. Предпочтительно водная композиция может содержать инкапсулирующий агент, пленкообразующий агент, пластификатор, консервант, антиоксидант и их смеси. Пригодными консервантами являются метилпарабен, пропилпарабен, сорбиновая кислота, сорбат калия, бензоат натрия и их смеси. Пригодными антиоксидантами являются аскорбат натрия, аскорбиновая кислота, лимонная кислота и их смеси.

Предпочтительно водная фаза содержит модифицированный пищевой крахмал, такой как октенилсукцинилкрахмал (САР8иЬ®), мальтодекстрин и аскорбат натрия. Другая предпочтительная водная фаза содержит картофельный белок (АЬВиКЕХ®), мальтодекстрин 20 и аскорбат натрия. Выбранные компоненты можно растворять в воде любыми пригодными методами, предпочтительно путем перемешивания. Смесь предпочтительно гомогенизируют до однородного состояния и отсутствия комков. Предпочтительно, гомогенизацию осуществляют при температуре от приблизительно 50 до приблизительно 75°С. Конечную вязкость образовавшейся водной фазы можно затем доводить до требуемой вязкости, составляющей предпочтительно от приблизительно 250 до приблизительно 450 сП, более предпочтительно от приблизительно 300 до приблизительно 400 сП, еще более предпочтительно приблизительно 385 сП.

- 5 019837

Эмульсию можно получать путем эмульгирования неводной композиции и водной фазы с помощью любых методов, включая гомогенизацию, методы с использованием создаваемых ротором и статором сдвиговых усилий, сдвиговых усилий при повышенном давлении и кавитацию, применение высокоскоростных дефлекторов или перемешивание с использованием сдвиговых усилий и сочетание этих методов. После эмульгирования, объем и вязкость эмульсии предпочтительно можно регулировать путем добавления воды. Предпочтительно, неводную композицию и водную композицию эмульгируют путем гомогенизации. Предпочтительно, эмульсия не должна содержать никаких минеральных веществ, переходных металлов или пероксидов.

Как указано выше, эмульсию можно включать в состав других применяемых композиций или использовать при получении таких композиций, прежде всего инкапсулированных масел, например, высушенных распылением порошков. Как правило, инкапсулированное масло содержат масляную композицию и инкапсулирующий агент, служащий для инкапсуляции масляной композиции, где масляная композиция содержит растворенный в масле витамин Ό3, 25-ОН Ό3 или оба в количестве от приблизительно 3 до приблизительно 50 мас.% в пересчете на общую массу масляной композиции. Инкапсулированное масло должно обладать хорошей текучестью и гомогенным распределением витамина Ό3 и/или 25гидроксивитамина Ό3 в композиции. Предпочтительно, инкапсулированное масло находится в виде порошка. В инкапсулированное масло можно включать любые пригодные добавки. Одна из таких добавок может представлять собой агент, повышающий текучесть, такой как диоксид кремния, предназначенный для повышения текучести микроинкапсулированного масла.

Композиция может быть представлена в форме таблетки, капсулы (напр., твердой или мягкой) или жидкости (напр., масло или эмульсия). Они могут быть упакованы в виде однократной ежедневной дозы.

Дозы

Дневная. Композиция изобретения, в которой два активных ингредиента применяют раздельно, содержит витамин Ό или 25-ОН Ό3 в количестве от около 1 мкг до около 50 мкг, предпочтительно, от около 5 мкг до 25 мкг. Альтернативно, однократная дневная доза, содержащая оба витамин Ό и 25-ОН Ό3, включает каждый активный ингредиент в количестве от около 1 мкг до около 50 мкг, предпочтительно, от около 5 мкг до 25 мкг.

Дозовое соотношение витамина Ό к 25-ОН Ό3 может составлять от около 50:1 до около 1:50, более предпочтительно, от около 25:1 до около 1:25, и даже более предпочтительно от около 6:1 до около 1:6.

Многократные, раздельные дозы можно упаковать в один набор (или контейнер). Например, набор может содержать до тридцати раздельных дневных доз обоих активных ингредиентов по отдельности (т.е. 60 раздельных доз), или совместно (т.е. 30 доз, содержащих оба активных ингредиента). В состав набора можно включить инструкции по применению дозировок для человека.

Недельная. Однократная недельная доза содержит витамин Ό или 25-ОН Ό3 в количестве от около 7 мкг до около 350 мкг, и предпочтительно, от около 35 до 175 мкг. Альтернативно, однократная недельная доза может содержать оба витамин Ό и 25-ОН Ό3 каждый в количестве от около 7 до около 350 мкг и предпочтительно от около 35 до 175 мкг. Дозовое соотношение витамина Ό к 25-ОН Ό3 может составлять от около 50:1 до около 1:50, более предпочтительно от около 25:1 до около 1:25 и даже более предпочтительно от около 6:1 до около 1:6.

Месячная. Однократная месячная доза содержит витамин Ό или 25-ОН Ό3 в количестве от около 30 до около 1500 мкг, предпочтительно от около 75 до около 500 мкг. Альтернативно, однократная месячная доза может содержать оба витамин Ό и 25-ОН Ό3 каждый в количестве от 30 до около 1500 мкг, предпочтительно от около 75 до около 500 мкг. Набор может включать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать недельных или месячных доз.

Дозовое соотношение витамина Ό к 25-ОН Ό3 должно входить в диапазон от 50:1 до около 1:50, более предпочтительно, от около 25:1 до около 1:25, и даже более предпочтительно от около 6:1 до около 1:6.

Генный анализ

Для демонстрации повышенной биоактивности комбинации проводили анализ с применением ДНК-чипов на мышечной ткани, на которую воздействовали витамином Ό, 25-ОН Ό3 и комбинацией из них. Подробности представлены в примере 2, с использованием крысиной модели «рыси бросками», при которой переносимые задние ноги ставятся за следом, оставленным передними ногами. Как можно увидеть, наблюдается значительное увеличение количества генов, активированных или регулируемых (либо активированных либо подавленных), если принимается комбинация из двух витаминов по сравнению с применением каждого по отдельности. Если учесть, как ранее полагали, что подавляющее большинство витамина Ό превращается в 25-ОН Ό при приеме внутрь и преобразуется в печени, то полученный результат стал сюрпризом.

Так, другим аспектом изобретения является способ активирования или регулирования витамин Ό- и 25-ОН Ό-реагирующих генов человека, экспрессирующихся в мышечной ткани, включающий введение индивидууму комбинации из витамина Ό и 25-ОН Ό3.

Приведенные ниже не ограничивающие примеры служат для более подробной иллюстрации изобретения.

- 6 019837

Примеры

Пример 1. Клиническое исследование

Приготовление лекарственной формы

Материалы и методы

Готовили высушенный распылением состав из 25-ОН Ό3 в виде порошка. Вкратце, 25-ОН Ό3 и ΌΕα-токоферол растворяли в масле среднецепочечных триглицеридов, затем эмульгировали в водный раствор, состоящий из модифицированного крахмала, сахарозы и аскорбата натрия. Эмульсию распыляли в распылительной сушилке в присутствии диоксида кремния. Полученный порошок собирали при содержании воды (ΓΌΟ) менее 4% и фильтровали через 400 мкм-мембрану. Его упаковывали и герметизировали в алюминиевые мешки, затем хранили в сухом месте при температуре ниже 15°С и применяли не позднее 12 месяцев со дня его изготовления.

Изготавливали три отдельные партии. Подробно, получали матрицу путем перемешивания в течение 120 мин в устройстве для смешивания ΕΚΥΜΙΧ с якорной мешалкой при 70°С под действием вакуу ма, при этом матрица состояла из

17,460 кг модифицированного пищевого крахмала (САР8ИЕ Н8)

3,270 кг сахарозы

0,730 кг аскорбата натрия

Водную фазу получали путем перемешивания в течение 35 мин в сосуде с двойными стенками с винтовой мешалкой при 82°С, причем водная фаза состояла из

0,550 кг ВЕКСАВЕ8Т МСТ-масла 60/40

0,049 кг кальцифедиола (ΗΥ-Ό И8Р)

0,183 кг ΌΕ-α-токоферола

Водную фазу переносили в матрицу в устройстве для смешивания ΕΚΥΜΙΧ и предварительно эмульгировали во внутренней коллоидной мельнице (60 мин, 70°С). Первичную эмульсию пропускали через гомогенизатор высокого давления (20 мин). Эмульсию с вязкостью от 60 до 90 мПа-с при 70°С переносили через насос высокого давления в распылитель. В качестве пластификатора диоксид кремния (8ΙΡΕΚΝΑΤ 320 Ό8) заполняли в башню. Параметры распыления и сушки перечислены ниже.

__________Параметр________ Место воздуха на входе_________

Подача воздуха на входе________

Температура воздуха на входе ΙΡΒ подача воздуха на входе_____

ΙΡΒ температура воздуха на входе Место выходящего воздуха______

Переработка мелкоизмельченного порошка

Скорость подачи эмульсии

Место обработки 8Ю2__________

Скорость подачи 8102-кислоты

Распыление

Верх башни 1500 м³/ч 170°С________

500 м³/ч

65°С_________

Низ башни ________Сушка Верх башни_____

1400 м³/ч_________

Нагреватель выкл. 500 м³/ч__________

50°С___________

Низ башни

До ΙΡΒ

До ΙΡΒ кг/ч

Верх башни

100 г/ч

Остановлена обработка эмульсии________________

ЗЮг-обработка остановлена

ЗЮг-обработка остановлена

Для каждой из трех партий 25-ОН Ό3, получили в среднем 8,4 кг высушенного распылением порошка с содержанием 25-ОН Ό3 около 0,25%. Другие компоненты состава следующие: 73,2% модифицированного пищевого крахмала, 17,6% сахарозы, 4,0% аскорбата натрия, 3,0% среднецепочечных триглицеридов, 1,0% диоксида кремния и 1,0% ΌΕ-α-токоферола.

Высушенный распылением состав витамина Ό3 обеспечивался в виде порошка. Вкратце, витамин Ό3 и ΌΕ-α-токоферол растворяли в масле среднецепочечных триглицеридов, затем эмульгировали в водный раствор, состоящий из модифицированного крахмала, сахарозы и аскорбата натрия. Эмульсию распыляли в распылительной сушилке в присутствии диоксида кремния. Полученный порошок собирали при содержании воды (ΕΟΌ) менее 4% и фильтровали для удаления больших комков. Его хранили в сухом месте при температуре ниже 15°С и применяли не позднее 12 месяцев со дня его изготовления

Клиническое исследование

Субъекты

В клиническом исследовании при информированном согласии участвовали здоровые, постменопаузальные женщины (50 - 70 лет) и обследование проводили по следующим критериям: уровень 25-ОН Ό3 в сыворотке крови между 20 нмоль/л и 50 нмоль/л, индекс массы тела между 18 и 27 кг/м², кровяное давление менее 146/95 мм.рт.ст., уровень кальция в сыворотке крови менее 2,6 нмоль/л, уровень глюкозы в крови натощак менее 100 мг/дл, высокоинтенсивные упражнения не более трех раз в неделю, пациентки не принимали лекарства от гипертензии, не принимали в высоких дозах добавки с витамином Ό или кальцием или лекарственные средства, влияющие на обмен веществ в костной ткани (например, бифосфонат, кальцитонин, модулятор эстрогеновых рецепторов, гормонозаместительную терапию, паратиреоидный гормон), и не посещали солнечные места в течение исследования.

Субъектов зачислили произвольным порядком в одну из семи групп лечения (т.е. дневная, недельная, ударная в виде однократной дозы и ударная в виде комбинированной дозы). Каждая группа включа

- 7 019837 ла пять субъектов. Они провели пять месяцев в Цюрихе в течение зимы.

Клиническое исследование

Целью исследования являлось изучение и сравнение фармакокинетических характеристик витамина Ό3 и 25-ОН Ό3, вводимых человеку. Изучали эквимолярные количества обоих веществ. Режим базировался на 20 мкг/день 25-ОН Ό3 (или эквивалентном количестве в пересчете на неделю). Поскольку максимальная заданная исходная концентрация 25-ОН Ό3 будет составлять 50 нмоль/л, то неожиданным было, что у субъектов будет наблюдаться диапазон, где имеется нарушение Са²⁺-гомеостаза. Для целей сравнения, необходимо вводить эквимолярные количества либо витамина Ό3 либо 25-ОН Ό3. Что касается применения витамина Ό3, то доза считается эффективной для преодоления фоновой изменчивости и представления эффективной дозы участникам исследования.

Дневная: 120 приемов

1. 25-ОН Ό3

2. витамин ϋ3 мкг мкг (800 МЕ)

Недельная: 16 приемов

3. 25-ОН Ό3

4. витамин ЭЗ

140 мкг

140 мкг (5600 МЕ)

Ударная: однократный прием

5. 25-ОН Ώ3 140 мкг

6. витамин Ώ3 140 мкг (5600 МЕ)

Ударная: комбинированный прием.

7. ϋ3 и 25(ОН)ЭЗ 140 мкг (5600 МЕ) + 140 мкг

Твердые гелевые капсулы, которые упакованы во флаконы, содержат или 20 или 140 мкг либо высушенного распылением витамина Ό3 либо 25-ОН Ό3 на капсулу. Каждую дозу принимали перорально во время завтрака. Длительность исследования составляла четыре месяца для Дневной и Недельной групп. Субъекты, записанные в Ударную группу, принимали перорально однократную дозу во время второго визита для обследования.

Плазменные концентрации 25-ОН Ό3 (напр., пик и установившееся состояние) определяли путем получения образцов от субъектов в разный период времени после приема дозы. Для целей скрининга и для определения исходных значений, получали образец крови перед записью на исследование и измеряли клинические показатели содержания витамина Ό3, 25-ОН Ό3, кальция, креатинина, альбумина и глюкозы натощак в сыворотке крови. В понедельник 1 недели исследования, в течение 24 ч измеряли содержание в сыворотке крови витамина Ό3, 25-ОН Ό3 и 1,25-дигидроксивитамина Ό3; сывороточные маркеры (например, витамин Ό3, 25-ОН Ό3, кальций, креатинин, альбумин, РТН, НОТ, ОРТ, ЛЬР, триглицериды, НОЕ, ЬВЬ, общий холестерин, ЪЛЬР и глюкозу натощак); и маркеры мочи (например, кальций, креатинин, и ΌΡΌ). Дневные образцы для оставшихся дней недели Шеек 1 и понедельника 2 недели отбирали для определения сывороточного содержания витамина Ό3 и 25-ОН Ό3, сывороточных маркеров (например, кальция, креатинина, альбумина), и маркеров мочи (например, кальция, креатинина). Измерения продолжали в понедельник недель 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15. В Понедельник 16 Недели, образцы отбирали для определения фармакокинетик сывороточного содержания витамина Ό3, 25-ОН Ό3 и 1,25дигидроксивитамина Ό3; сывороточных маркеров (например, витамина Ό3, 25-ОН Ό3, кальция, креатинина, альбумина, РТН, ООТ, ОРТ, ЛЬР, триглицеридов, НИЦ ЬВЬ, общего холестерина, ЪЛЬР и глюкозы натощак) и маркеров мочи (например, кальция, креатинина и ИРИ).

Мышечную силу и функцию оценивали по следующим стандартным тестам: по силе сгибания и разгибания коленей, по Т8Т-тесту (пять раз встать и сесть) и по ТИО-тесту (встать с кресла, пройти три метра, вернуться и сесть) в 1 неделю во время 2 посещения (исходное) и в конце исследования во время 15 посещения. Мышечную силу измеряли как сгибание и разгибание коленей в Ньютонах (килограммсила). ТИО является измерением функциональной мобильности, включая мышечную силу, скорость походки и баланс и выражали в секундах. Тест повторных встать-сесть является функциональным тестом и измеряется в секундах.

Результаты

Табл. 1 показывает изменение мышечной силы после дневного и недельного приема 25-ОН Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно) или после дневного и недельного приема витамина Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно). Время приема составляло 4 месяца. Показатели представлены в виде изменения после четырех месяцев от исходного значения (перед началом приема).

- 8 019837

Таблица 1

	Мышечная сила (изменение против исходного в Ньютонах)
Дневной/недельный прием витамина Бз	Дневной/недельный прием 25-ОН ϋ3
Разгибание колена (среднее	-23,7	13
значение)
Разгибание колена (лучшее	-24,8	13,6
значение)
Сгибание колена (среднее значение)	3,6	7,9
Сгибание колена (лучшее	2,4	7,2
значение)

Табл. 2 показывает относительное изменение мышечной силы после дневного и недельного приема 25-ОН Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно) по сравнению с дневным и недельным введением витамина Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно). Длительность введения составляла 4 месяца. Показатели представляют собой значения СЕМ (общая линейная модель) наименьших квадратов, выраженные как % улучшений с учетом исходной силы, возраста и индекса массы тела для 25-ОН Ό3 против витамина Ό3.

Таблица 2

	Мышечная сила (Изменение ν§. дневного/недельного приема витамина ИЗ в %)
Дневной /недельный прием 25-ОН ИЗ
Разгибание колена (среднее значение)	17
Разгибание колена (лучшее значение)	17,6
Сгибание колена (среднее значение)	3,1
Сгибание колена (лучшее значение)	4,7

Табл. 3 показывает изменение мышечной функции после дневного и недельного приема 25-ОН Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно) или дневного и недельного приема витамина Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно). Длительность введения составляла 4 месяца. Значения даны как время (в секундах), которое требуется для выполнения задачи после 4 месяцев по сравнению с исходным периодом (перед началом приема).

Таблица 3

	Мышечная функция (изменение против исходного в секундах)
Дневной/недельный прием витамина ИЗ	Дневной/недельный прием 25-ОН ИЗ
Повторные сесть-встать	0,3	0,63
Встать-идти на время	-0,46	0,27

Табл. 4 показывает относительное изменение мышечной функции после дневного и недельного приема 25-ОН Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно) по сравнению с дневным и недельным приемом витамина Ό3 (20 мкг в день; 140 мкг в неделю, соответственно). Длительность введения составляла 4 месяца. Значения представляют собой значения СЕМ (общая линейная модель) наименьших квадратов, выраженные как % улучшений с учетом исходной силы, возраста и индекса массы тела для 25-ОН Ό3 против витамина Ό3.

Таблица 4

	Мышечная функция (изменение ν§. дневного/недельного приема витамина ИЗ в %)
Дневной/недельный прием 25-ОН ИЗ
Повторные сесть-встать	13,9
Встать-идти на время	8,4

Эти данные демонстрируют, что дневной или недельный прием 25-ОН Ό3 неожиданно привел к значительному улучшению мышечной силы и функции по сравнению с приемом идентичных доз витамина Ό3. После приема 25-ОН Ό3 субъекты были способны выполнять более сильное разгибание и сгибание коленей по сравнению с началом исследования и по сравнению с группой приема витамина Ό3. Относительное улучшение мышечной силы у субъектов, принимавших 25-ОН Ό3 против витамина Ό3, составляло между 3 и 18%, эффективное количество, которое клинически релевантно и представляет значительное преимущество для субъектов во всех возрастных группах и в особенности для постменопаузальных женщин.

Мышечная функция, определенная с помощью стандартных тестов (повторные сесть-встать, встать

- 9 019837 идти на время), была лучше у субъектов, принимавших 25-ОН Ό3, по сравнению с приемом идентичных доз витамина Ό3. После приема 25-ОН Ό3, субъекты завершали тесты быстрее по сравнению с началом исследования и по сравнению с приемом витамина Ό3. Относительные улучшения мышечной функции после приема 25-ОН Ό3 в отличие от витамина Ό3 составляли 8-14%, эффективное количество, которое клинически релевантно и представляет значительное преимущество для субъектов во всех возрастных группах и в особенности для постменопаузальных женщин.

Кроме того, нескорректированный анализ тестов на нижних конечностях (разгибание колена, сгибание колена, встать-идти на время и повторные встать-сесть) показал, что субъекты, принимавшие 25ОН Ό3, имеют в 2,8 раза более высокую вероятность сохранения или улучшения силы и функции нижних конечностей по сравнению с субъектами, принимавшими идентичные дозы витамина Ό3. Этот эффект является статистически значимым и клинически релевантным и показывает, что 25-ОН Ό3 является подходящим для лечения, направленного на поддержание или улучшение мышечной силы и функции.

Пример 2. Данные с применением ДНК-чипов

Целью данного исследования являлось определение действия витамина Ό3, 25-ОН Ό3 и комбинации из витамина Ό3 и 25-ОН Ό3 на модели атрофии скелетных мышц, используя мышей Ва1ЬС, где подвешивание за хвост приводит к атрофии скелетных мышц в нагруженных задних конечностях животных. Изначально эту модель создали на крысах для имитирования космического полета людей и использовали в других научных областях для изучения потери массы скелетных мышц или костей. Результаты считаются показательными в отношении такого состояния человека, как сакропения (дегенеративная потеря мышечной массы и силы в процессе старения) или иммобилизации скелетных мышц (например, после длительного постельного режима вследствие переломов, операции или травмы).

Методы

Для данного исследования девятимесячных мышей-самок линии Ва1ЬС рандомизировали в начале исследования на четыре группы по 10 животных на группу:

1) контрольная группа: нагруженные задние конечности (НИ),

2) группа приема витамина Ό3: НИ + прием витамина Ό3,

3) группа приема 25-ОН Ό3: НИ + прием 25-ОН Ό3,

4) группа приема витамина Ό+ 25-ОН Ό3: НИ +прием витамина Ό3 и 25-ОН Ό3 (комбинация).

Животных помещали в специальные клетки на семь дней; всех мышей содержали раздельно, и все они имели открытый доступ к еде и воде в неограниченном количестве. Все животные принимали следующие агенты дважды путем чреззондового введения в начале эксперимента и за 3 ч до разреза:

1) контрольная группа принимала носитель (желатин),

2) Э3-группа принимала витамин Ό3 (50 мкг/кг/Ьте),

3) 25-ОН Э3-группа принимала 25-ОН Ό3 (50 мкг/кг/Ьте),

4) комбинированная группа принимала витамин Ό3 + 25-ОН Ό3 (50 + 50 мкг/кг/Ьте).

В конце исследования вырезали икроножную мышцу и сразу замораживали в жидком азоте для дальнейшего анализа. Для идентификации изменений в экспрессии генов и анализа изменений уровня мРНК в икроножной мышце мы использовали микрочипы АГГутеМх Мойке 430-2 совместно с аннотацией версии 27 (Декабрь 2008) от Айутейтх для данного типа набора. Набор содержит 45000 зондов для анализа уровня экспрессии более чем 39000 транскриптов и вариантов от более чем 34000 хорошо известных генов мышей и ИиЮеие кластеров (ЛГГутеМ.х. 2009).

Общую РНК изолировали с использованием хорошо известного протокола Ττίζοί. РНК считали, используя спектрофотометрический анализ. Целостность общей РНК в образцах также определяли качественно на анализаторе Лдйеи! 2100 Вюаиа^ет. Затем приготавливали РНК для одного цикла синтеза кДНК. Для данной стадии использовали ро1у-А РНК-контроль для обеспечения экзогенных положительных контролей для мониторинга полного эукариотического процесса с меченой мишенью. Провели первый синтез кДНК и после синтеза второй цепи кДНК, кДНК является очищенной двуцепочечной кДНК. Затем синтезировали меченную биотином кРНК, очищали и считали количественно с использованием спектрофотометра при длине волны 260/280 нм. Важно, что кРНК-мишень фрагментировали перед гибридизацией в наборе зондов ОеиеСЫр для получения оптимальной чувствительности анализа. После фрагментации зонды гибридизуют на чипы (чипы АГГутеМ.х Мойке 430-2). Чипы промывают и окрашивают в гидродинамической станции АГГутеРтх и сканируют в сканере генных чипов. Затем данные переносят из сканера для дальнейшего анализа, используя программное обеспечение от Сепеба1а (Ехртеккюиίκΐ 5.0: КеПиег Аггау апб Аиа1ук1). Данные интерпретируют и выполняют анализ пути с онлайн версией пакета ОеиеОо Ме!аеоте (У5.2 Ьш1б 17389).

КеПиег Аггау оценивает данные для определения качественных продуктов и отмечает проблемные измерения. Он представляет набор стандартных алгоритмов и обосновывает конденсированные способы для автоматической предварительной операции и объединяет данные от микрочипа для последующего статистического анализа.

Анализ данных с использованием микрочипов определяет гены (тКНАк), которые различно экспрессируются между НИ-группой и НИ-плюс группой лечения (витамин Ό3, 25-ОН Ό3 или комбинация).

Наши ключевые находки следующие:

- 10 019837

1. Комбинация из 25-ОН 03 и витамина 1)3 изменяет больше ДНК-зондов для генов, чем 25-ОН Ώ3, который в свою очередь изменяет больше ДНК-зондов для генов, чем витамин 03 (таблица).

a) по сравнению с Ηϋ-контрольной группой, группа, получавшая комбинированное лечение (1)3 + 25-гидроксивитамин Ώ3) имела значительно больше зондов для измененных генов (1745), чем группа, которая получала только 25-ОН 03 (1263);

b) по сравнению с Ηϋ-контрольной группой, группа, получавшая 25-ОН 03. имела значительно больше зондов для генов, измененных (1263), чем группа, которая получала витамин 03 (385).

2. Комбинированный прием 25-ОН 1)3 + витамин 1)3 имеет более дифференциально экспрессирующиеся зонды для генов с приемом 25-ОН 03, чем с приемом витамина 1)3.

a) -61% наборов зондов для генов, дифференциально экспрессирующихся в группе приема 25-ОН Ώ3, также дифференциально экспрессируются в группе приема 25-ОН 03 + витамин 03 (769 из 1263, фиг. 2)

b) -46% наборов зондов для генов, дифференциально экспрессирующихся в группе приема витамина 1)3, также дифференциально экспрессируются в группе приема 25-ОН 1)3 + витамин 1)3 (177 из 385, фиг. 3)

c) Комбинированное лечение 25-ОН 1)3 и витамином 1)3 значительно отражается на генах, участвующих в процессе развития мышц, как показано на фиг. 4, 6 и 7.

с1) Рассматриваемые гены являются частью следующих основных категорий в скелетных мышцах: мышечного сокращения, мышечного развития и мышечного обеспечения (таблица).

3. Для наборов зондов выбранных генов скелетных мышц, комбинированный прием 25-ОН 1)3 и витамина 1)3 показывает более высокие экспрессии, чем прием только витамина 1)3 или только 25-ОН 1)3 (таблица)

Таблица 5. Дифференциально экспрессирующиеся наборы зондов для генов между Ηϋ и Ηϋ + группами приема витамина 1)3, 25-ОН 1)3 или комбинации

Параметр	Дифференциально экспрессирующиеся наборы зондов для генов
Группа с нагрузкой задних конечностей (Ηϋ - контроль)	-
Против Ηϋ + витамин Ό3	385
Против Ηϋ + 25-ОН ЭЗ	1263
Против Ни + витамин Ώ3 + 25-ОН 03	1745 |

Таблица 6. Дифференциально экспрессирующиеся наборы зондов для выбранных скелетно-мышечных генов между Ηϋ и группами лечения

Параметр	Дифференциально экспрессирующиеся мышечные гены по сравнению с Ни
Ни + витамин Ό3	Десмин; мионеврин; тропомиозин 1, альфа; тропомиозин 2, бета; Х-связанный ген 1 миотубулярной миопатии
Ни + 25-ОН Ό3	Десмин; дистонин; миоцит-энхансерный фактор 2А; мионеврин; миозин УПЬ; миозин, легкий полипептид 6, щелочной, гладкомышечный и немышечный; Киназа легкой цепи миозина; белок, связанный с миотубулярином, 2; белок, связанный с миотубулярином, 4; белок, связанный с миотубулярином, б; тропомиозин 2, бета; Χ-связанный ген миотубулярной миопатии 1
НН + витамин ϋ3 + 25-ОН ЭЗ	кальсеквестрин 2; десмин; дистонин; дистрофин, мышечной дистрофии; миоцит-энхансерный фактор 2А; миоцитэнхансерный фактор 2С; миоцит-энхансерный фактор 2Э; миомезин 1; мионеврин; миозин X; миозин, тяжелый полипептид 6; миозин, тяжелый полипептид 8; миозин, легкий полипептид б; белок, связанный с миотубулярином, 1; белок, связанный с миотубулярином, 2; белок, связанный с миотубулярином, 4; белок, связанный с миотубулярином, 6; небулин; саркогликан, бета; аналогичный миозину, тяжелый полипептид 4; титин; тропомиозин 2, бета; тропонин С; тропонин I; Χ-связанный ген миотубулярной миопатии 1

Таблица 7. Паттерн экспрессии для выбранных генов скелетной мышцы

	ни	Витамин ϋ3	25-ОН ϋ3	25-ОН Ώ3 + витамин ОЗ
Тропомиозин 1 (Трш1)	1179	2199	2110	2456
Киназа легкой цепи миозина (Му1к)	749	786	994	1022
Миомезин 1 (Муош 1)	84697	99099	105393	114398
Титин (Τηΐ)	11353	11354	13786	15647

Обсуждение, касающееся специфичности выбранных генов

В течение одного жизненного цикла скелетные мышцы постоянно адаптируются к различным стимулам, таким как физические упражнения и тренировки, но также к иммобилизации. Скелетная мышца

- 11 019837 отвечает или гипертрофией или атрофией. Развитие и адаптация скелетной мышцы является комплексным процессом. Вкратце, перициты - так называемые стволовые клетки скелетной мышцы — получают стимул и формируют недифференцированные миобласты, которые подвергаются слиянию с получением мышечных трубочек - новых мышечных волокон.

Для движений и адаптации скелетной мышцы важным является сокращение. Сокращение скелетных мышц - это совместное скольжение двух основных скелетно-мышечных волокон миозина (миозиновые нити) и актина (актиновые нити), которые организованы в саркомеры. Это придает скелетным мышцам поперечнополосатый вид при наблюдении в микроскоп.

Около миозиновых и актиновых нитей скелетной мышцы содержится титин и небулин, а также белки саркомеров, такие как тропомиозин. Функции скелетных мышц зависит от определенного положения актиновых и миозиновых нитей и акцессорных белков, таких как α-актинин, миомезин, М-белок, титин, десмин- и миозин-связывающие белки.

Полагали, что миомезин и М-белок могут связывать титин и миозиновые волокна и миомезин играет важную роль в интеграции аткиновых волокон при сборке саркомеров. Титин, который является очень большим белком, формирует систему непрерывных волокон в миофибриллах. преобладающий средний филаментный белок поперечнополосатых мышц — это десмин, и обеспечивает сохранение целостности и правильного положения микрофибрил.

Мутации в некоторых белковых компонентах (например, миозиновой тяжелой цепи, актине, тропомиозине и др.), а также в белках саркомеров (например, титине, десмине и др.) связаны с мышечными заболеваниями/миопатиями.

Тропомиозин 1, альфа (Трт1):

Как указано в Ш1К1РЕЭ1А, Тропомиозин является актин-связывающим белком, который регулирует актиновые механизмы. Это важно, среди всего прочего, для мышечного сокращения. Тропомиозин, наряду с тропониновым комплексом, связан с актином в мышечных волокнах и регулирует сокращение мышц путем регуляции связывания с миозином. В покое мышц тропомиозин перекрывает миозинсвязывающие сайты на актине и блокируется в этом положении тропонином Т (тропомиозинсвязывающий тропонин) и тропонином Ι (ингибирующий тропонин). При высвобождении кальция из саркоплазматического ретикулума кальций связывается с тропонином С (кальций-связывающий тропонин). Это освобождение тропомиозина от актина, позволяет ему удаляться от связывающих желобков. Миозиновые головки могут в это время иметь доступ к связывающим сайтам на актине. Как только одна миозиновая головка прикрепилась, то полностью вытесняется тропомиозин и позволяет прикрепиться другим миозиновым головкам, инициируя мышечное укорочение и сокращение. Как только кальций выкачивается из цитоплазмы и уровень кальция возвращается к норме, тропомиозин снова связывается с актином, предохраняя миозин от связывания.

Тропомиозин 1 альфа является геном, который требуется для развития и мышечной функции (например, мышечного сокращения). В общем, мышечно-специфичные тропомиозины регулируют актинмиозиновое взаимодействие и, следовательно, сокращение. Кодирующий белок является одним типом альфа спиральной цепи, которая формирует предоминантный тропомиозин поперечно-полосатых мышц, где он также функционирует в связи с тропониновым комплексом для регуляции кальций-зависимого взаимодействия актина и миозина в процессе мышечного сокращения (ΝΟΒΙ)

Паттерн экспрессии (Трш1):

Ни Ηυ+νίΦ3 Ηυ+25-гидроксивитамин Ώ3 Ни+У1ФЗ+25-гидроксивитамин ϋ3

1179 2199 2110 2456

Пример группы приема 25-гидроксивитамина Ό3:

Киназа легких цепей миозина (ΜΥΕΚ): νίΕρ^ία:

Му1к является геном человека. Этот ген, мышечный член семейства генов иммуноглобулина, кодирует киназу легких цепей миозина, которая является кальций/кальмодулин-зависимым ферментом. Эта киназа фосфорилирует легкие цепи, регулирующие миозин, для облегчения связывания миозина с актиновыми нитями с получением сократительной способности. Этот ген кодирует обе гладкомышечную и немышечную изоформы. В дополнении, используя отдельные промоторы в интроне в 3' области, она кодирует телокин, маленький белок идентичный в последовательности с С-концом киназы легких цепей миозина, который независимо экспрессируется в поперечнополосатой мышце и функционирует для обеспечения стабильности нефософрилированных миозиновьгх нитей. Псевдоген расположен на р плече хромосомы 3. Четыре транскриптных варианта, которые продуцируют четыре изоформы кальций /кальмодулин-зависимого фермента, были идентифицированы, а также два транскрипта, которые продуцируют две изоформы телокина. Были идентифицированы дополнительные варианты, но с недостатком полноразмерных транскриптов.

- 12 019837

Паттерн экспрессии (МУЬК):

Ни ни+У1ЮЗ Ηυ+25-гидроксивитамин 03 НЦ+УйОЗ+25-гидроксивитамин 03

749 786 994 1022

Пример группы приема витамина Ό3 + 25-гидроксивитамина Ό3:

Ш1к1ре01а:

Миомезин является белком концевой линии, который является частью М-линии. Он прикрепляет миозиновые нити к М-концу.

Паттерн экспрессии (Миомезин 1 - Муот1):

Ни НН+УШЭЗ Ηυ+25-гидроксивитамин Ώ3 Ни+УйОЗ+25-гидроксивитамин ЭЗ

84697 99099 105393 114398

Ш1к1реЛа:

Титин, также известный как коннектин, является белком, который играет важную роль в сокращении поперечно-полосатой мышечной ткани. Титин является крупным белком в избыточном количестве поперечнополосатой мышцы.

Белок подразделяется на две области:

Ν-концевой 1-участок является эластической частью молекулы, содержит две области тандемных иммуноглобулиновых доменов на каждой стороне РЕУК-области, которая богата пролином, глутаматом, валином и лизином.

С-концевой А-участок действует как направитель белка, содержит смесь иммуноглобулиновых и фибриновых повторов и обладает киназной активностью.

Ν-концевая Ζ-дисковая область и С-концевая М-область связываются с Ζ-участком и М-участком саркомера, соответственно, так что одна молекула титина перекрывает половину длины саркомера. Титин также содержит связывающий сайт для белков, связанных с мышцами, так он служит как адгезионная матрица для сборки сократительного аппарата в мышечных клетках. Также он был идентифицирован как структурный белок для хромосом. Значительная изменчивость существует в областях 1-участка, Млинии и Ζ-диска титина. Изменчивость в области 1-участка способствует различиям в эластичности разным тетиновым изоформам и, следовательно, различиям в эластичности различных мышечных типов. Из различных идентифицированных титановых вариантов, пять, для которых полная транскриптная информация доступна, описаны.

Титина связывается со многими саркомерными белками, включая:

Область Ζ-участка: телетонин и альфа-актинин

Область 1-участка: калпаин-3 и обскурин

Область М-линии: миозин-связывающий белок С, кальмодулин 1, ΟΑΡΝ3 и ΜϋΚΡΙ

Паттерн экспрессии (Титин - Τηΐ):

НИ Ни+У1ЮЗ Ни+25-гидроксивитамин ОЗ Ни+УНОЗ+25-гидроксивитамин ОЗ

11353 11354 13786 15647

Пример 3. Мышиная модель

Целью настоящего исследования являлось определение действия 25-ОН Ό3 в модели мышечной гипертрофии и в тесте способности выполнять упражнения на выносливость мышей линии С57БЕ/6Т Из уровня техники известно, что удаление икроножной мышцы вызывает компенсаторную гипертрофию в камбаловидной и подошвенной мышцах за счет множественных механизмов, приводящих к увеличению мышечной силы и силы конечностей.

Двум группам из 10 животных давали наркоз и фиксировали левую заднюю конечность животных. Всем животным давали анальгетик. Делали небольшой разрез через кожу вдоль икроножной мышцы. Обнажали всю икроножную мышцу и связки. Обе головки икроножной мышцы аккуратно отсекали от лежащих ниже интактных мышц и с осторожностью не затрагивали нервы и сосуды. Кожу зашивали шелковым швом и животных возвращали в клетки. После отхождения от наркоза животные могли двигаться без ограничения в своих клетках. Животным давали через зонд в течение трех недель 25-ОН Ό3 в дневной дозе 50 мкг/кг и контрольная группа получала носитель. В конце исследования тестировали способность животных выполнять упражнения на выносливость на беговой дорожке для грызунов.

Сырая масса камбаловидной и подошвенной мышц была увеличена у животных, принимавших 25ОН Ό3 по сравнению с контрольными животными (табл. 8). Кроме того, когда мышечные массы нормировались по отношению к массам тела животных по сравнению с массой тела, животные, принимавшие 25-ОН Ό3, демонстрировали увеличенный индекс камбаловидная-подошвенная мышечная масса/ масса тела (табл. 8). Измерения компьютерной томографии мышечной и всей области конечности подтвердили, что лечение 25-ОН Ό3 повышает скелетную массу (табл. 8). Животные, получавшие 25-ОН Ό3, демонст

- 13 019837 рируют повышенную способность выполнения упражнений на выносливость по сравнению с контрольными мышами, что показано более длинной пробегаемой дистанцией и длительностью пробега (табл. 8).

Табл. 8 показывает мышечные массы, индексы мышечная масса/масса тела, все поперечные области конечности и мышц, пробегаемую дистанцию и длительность пробега мышей, принимавших 25-ОН Ό3 в дозе 50 мкг/кг /день или плацебо (контроль) в течение 3 недель.

Таблица 8

Параметры	Контроль (п=10)	25-ОН ϋ3 (п=10)
Сырая масса камбаловидной мышцы (мг)	5,25	6,37
Сырая масса подошвенной массы (мг)	31,68	33,24
Индекс камбаловидная-подошвенная мышечная масса/ масса тела (мг/г)	1,82	1,94
Вся поперечная область конечности (мм2)	22,78	24,04
Поперечная область мышц (мм2)	19,9	20,98
Пробегаемая дистанция (м)	986	1078,4
Продолжительность пробега (мин)	37,6	41

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (3)

1. Способ повышения или сдерживания, или предотвращения потери мышечной силы или мышечной функции у человека, включающий введение человеку комбинации 25-гидрокси витамина Ό3 (25-ОН Ό3) и витамина Ό3 в количестве, достаточном для увеличения мышечной силы, мышечной функции или обеих.

2. Способ по п.1, в котором человек представляет собой взрослого или пожилого человека.

3. Применение комбинации 25-ОН Ό3 и витамина Ό3 в производстве композиции для фармацевтической, нутрицевтической, пищевой добавки или продукта питания для увеличения или сдерживания, или предотвращения потери мышечной функции или мышечной силы у человека.