IT202100007655A1

IT202100007655A1 - Uso di colecalciferolo come coadiuvante nel trattamento di distrofie muscolari

Info

Publication number: IT202100007655A1
Application number: IT102021000007655A
Authority: IT
Inventors: Silvia Trasciatti
Original assignee: Abiogen Pharma Spa
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2022-09-29
Also published as: JP2024512989A; EP4313063A1; WO2022208256A1; US20240100070A1; CN117120059A

Description

Deposito della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

?USO DI COLECALCIFEROLO COME COADIUVANTE NEL TRATTAMENTO DI DISTROFIE MUSCOLARI?

CAMPO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione riguarda l?uso di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

STATO DELLA TECNICA

Le distrofie o malattie degenerative muscolari progressive dei muscoli scheletrici sono disordini primitivi del muscolo. L'innervazione dei muscoli affetti ? infatti integra, mentre sono alterate le fibre muscolari. Le caratteristiche tipiche di questo gruppo di malattie sono la distribuzione simmetrica della debolezza e dell'atrofia muscolari, mentre la sensibilit? ? conservata e i riflessi cutanei persistono normalmente.

Le Distrofie Muscolari (DM) sono malattie ereditarie causate da difetti in diversi geni che determinano perdita di funzione, riduzione o assenza di proteine necessarie per il corretto funzionamento delle fibre muscolari. La conseguenza ? una progressiva degenerazione del tessuto muscolare e un deficit di forza, di entit?, distribuzione ed epoca di comparsa, variabili.

Nella storia recente delle distrofie, l'evento pi? rilevante ? stata la scoperta, da parte di Kunkel nel 1986, del gene per la distrofina e del suo prodotto proteico. Da allora, c'? stato uno straordinario accumulo di informazioni sulle distrofie muscolari, dal punto di vista genetico-molecolare, ultrastrutturale e biochimico, che hanno enormemente allargato le nostre conoscenze sui meccanismi e le cause di queste malattie.

Esistono molte forme di Distrofie che vengono classificate in base a criteri clinici e al difetto genetico.

Sono stati identificati e classificati diversi tipi di malattie degenerative muscolari, da quella di Emery-Dreifuss, alla distrofia di Becker, a quella di Duchenne. Tutte e tre le malattie presentano un esordio precoce nei soggetti affetti, in genere prima del raggiungimento dell?et? adulta.

Non c'? una terapia specifica per ognuna delle distrofie muscolari. Le varie vitamine (compresa la vitamina E), gli aminoacidi, il testosterone e i farmaci come la penicillamina, raccomandati in passato, si sono dimostrati tutti inefficaci.

La somministrazione di prednisone sembra ritardare il tempo di progressione della distrofia di Duchenne per un periodo maggiore ai 3 anni. La dose ottimale ? di 0,75 mg/kg al giorno, ma molto spesso viene ridotta a causa degli effetti collaterali dei cortisonici, quali aumento di peso, sindrome di Cushing, disturbi del comportamento e gastrointestinali.

Sono in fase sperimentale, sia clinica che preclinica, nuovi farmaci antiinfiammatori, inibitori dell'ossido nitrico (NO), che sembrano diminuire il danno muscolare.

Anche le terapie geniche e quelle con cellule staminali sono in fase sperimentale.

? pertanto fortemente sentita la necessit? di sviluppare dei farmaci che siano in grado di trattare le suddette patologie, o almeno di contrastare gli effetti dannosi da esse provocati, in particolare la degenerazione del tessuto muscolare.

Scopo della presente invenzione ? perci? quello di trovare un rimedio efficace per favorire la rigenerazione del tessuto muscolare nei soggetti affetti da distrofie muscolari, che sia anche ben tollerato dall?organismo.

RIASSUNTO DELL?INVENZIONE

Detto scopo ? stato raggiunto mediante l?uso di colecalciferolo nel trattamento della distrofia muscolare, come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare.

Ai fini della presente invenzione, con il termine ?trattamento?, si intende la somministrazione di colecalciferolo ad un soggetto affetto da distrofia muscolare allo scopo di migliorare la condizione complessiva del suo tessuto muscolare, come pure allo scopo di rallentare, alleviare, ridurre, e/o prevenire qualsiasi alterazione del funzionamento del suo tessuto muscolare.

Con il termine ?rigenerazione?, si intende qualsiasi processo di stimolazione rigenerativa, riparativa e protettiva del tessuto muscolare.

Sotto ancora un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o un integratore alimentare per l?uso nel trattamento di distrofia muscolare, detta composizione o integratore comprendendo colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare ed almeno un adatto eccipiente.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata, dalle forme realizzative fornite a titolo di esempi illustrativi e non limitativi, e dalle annesse Figure relative ai test descritti nell?Esempio 1, in cui:

Figura 1: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi wild-type (WT) trattati col veicolo (olio di oliva) a 24 settimane di trattamento. In rosso sono marcati con anticorpo anti-Pax7 i contorni delle fibre muscolari, dove si localizzano le cellule satellite. In blu, marcati con DAPI, sono visibili i nuclei cellulari delle cellule muscolari sane, che sono localizzati perifericamente.

Figura 2: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi mdx trattati col veicolo a 24 settimane di trattamento.

La marcatura in rosso con anticorpo anti-Pax7 ? poco presente e questo ? indice di degenerazione delle fibre muscolari e di assenza di cellule satellite. In blu, marcati con DAPI, sono visibili i nuclei disordinatamente disposti anche al centro delle fibre, indice di degenerazione del tessuto muscolare.

Figura 3: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi mdx trattati con colecalciferolo a 24 settimane di trattamento. La marcatura in rosso con anticorpo anti-Pax7 ? chiaramente presente e localizzata sui contorni delle fibre muscolari, laddove risiedono le cellule satellite. In blu, marcati con DAPI, sono visibili i nuclei disposti sia perifericamente che al centro delle fibre.

Figura 4: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi wild-type (WT) trattati col veicolo a 24 settimane di trattamento. La marcatura con anticorpo anti-MyoD, marker di proliferazione delle cellule muscolari, in rosso, appare estesa.

Figura 5: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi mdx trattati col veicolo a 24 settimane di trattamento. La marcatura con anticorpo anti-MyoD, marker di proliferazione delle cellule muscolari, in rosso, ? pressoch? assente.

Figura 6: Immunoistochimica su sezioni provenienti da topi mdx trattati con colecalciferolo a 24 settimane di trattamento. La marcatura con anticorpo anti-MyoD, marker di proliferazione delle cellule muscolari, in rosso, appare estesa.

Figura 7: Microscopia a fluorescenza. Sezione trasversale di fibre muscolari provenienti da topo del gruppo mdx non trattato al tempo 0. Sono visibili in blu (marcati con DAPI) i nuclei, disposti centralmente all?interno delle fibre (marcate in rosso con anticorpo anti-WGA).

Figura 8: Microscopia a fluorescenza. Sezione trasversale di fibre muscolari provenienti da topo del gruppo wild-type (WT) non trattato al tempo 0. Sono visibili in blu (marcati con DAPI) i nuclei, disposti perifericamente all?interno delle fibre (marcate in rosso con anticorpo anti-WGA).

Figura 9: Microscopia a fluorescenza. Sezione trasversale di fibre muscolari provenienti da topo del gruppo mdx trattati col veicolo a 12 settimane di trattamento. Sono visibili in blu (marcati con DAPI) i nuclei, disposti centralmente all?interno delle fibre (marcate in rosso con anticorpo anti-WGA). Le fibre appaiono disgregate.

Figura 10: Microscopia a fluorescenza. Sezione trasversale di fibre muscolari provenienti da topo del gruppo wild-type (WT) trattati col veicolo a 12 settimane di trattamento. Sono visibili in blu (marcati con DAPI) i nuclei, disposti perifericamente all?interno delle fibre (marcate in rosso con anticorpo anti-WGA).

Figura 11: Microscopia a fluorescenza. Sezione trasversale di fibre muscolari provenienti da topo del gruppo mdx trattato con colecalciferolo a 12 settimane di trattamento. Sono visibili in blu (marcati con DAPI) i nuclei, disposti sia centralmente che perifericamente all?interno delle fibre (marcate in rosso con anticorpo anti-WGA). Le fibre appaiono visibilmente meno disgregate rispetto a quelle dei topi mdx non trattati di controllo.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

L?invenzione riguarda pertanto l?uso di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante per la rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari. Il colecalciferolo, o vitamina D3, ? il naturale composto della vitamina D, di origine animale/umana. ? un pro-ormone, precursore delle due forme idrossilate [25OHD e 1,25(OH)<2>D] della vitamina D e pertanto ha bisogno di essere sottoposto a due processi naturali di idrossilazione per trasformarsi nella sua forma attiva metabolicamente.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine ?colecalciferolo? si intendono ricompresi tutti gli isomeri ottici, gli isomeri geometrici e gli stereoisomeri, nonch? le loro miscele, quali miscele di enantiomeri, miscele raceme e miscele di diastereoisomeri, nonch? tutte le loro forme polimorfiche, sia amorfe che cristalline, che co-cristalline, nonch? le forme anidre, idrate e solvate, i sali farmaceuticamente accettabili, e loro miscele.

Come sar? chiaro anche dagli esempi riportati qui di seguito, il colecalciferolo ha dimostrato di essere un agente vantaggiosamente utilizzabile come attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari. Pertanto, la presente invenzione ? diretta a colecalciferolo per l?uso come agente attivo o coadiuvante nel trattamento di distrofie muscolari, mediante rigenerazione del tessuto muscolare.

In particolare, il colecalciferolo ha dimostrato una spiccata attivit? nel favorire la rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari. Il colecalciferolo pu? dunque essere efficacemente utilizzato come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari. La presente invenzione concerne dunque anche l?uso di una quantit? terapeuticamente efficace di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

Gli Esempi forniti di seguito hanno infatti mostrato come il tessuto muscolare dei topi mdx trattati con colecalciferolo risulti altamente positivo agli anticorpi anti-Pax6 ed anti-MyoD, che sono, rispettivamente, il marker espresso costitutivamente dalle cellule satellite (cellule staminali situate nella lamina propria del tessuto muscolare) e il marker espresso dai mioblasti proliferanti. L?assenza o la diminuzione di Pax 6 sono indici di degenerazione tissutale e l?assenza del marker MyoD ? indice di mancata rigenerazione tissutale. I risultati dell?analisi immunoistochimica mostrano che i profili di espressione dei marker Pax6 e Myo D dei topi mdx trattati con colecalciferolo sono del tutto comparabili a quelli dei topi wild-type (WT) sani.

Inoltre, il colecalciferolo ha dimostrato anche una spiccata attivit? nella protezione e rigenerazione del tessuto muscolare, per cui il colecalciferolo pu? essere efficacemente utilizzato anche come agente attivo nella protezione e rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari. La presente invenzione concerne dunque anche l?uso di una quantit? terapeuticamente efficace di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella protezione e rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione concerne l?uso di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare, in cui detto trattamento comprende la somministrazione di una quantit? terapeuticamente efficace per la rigenerazione muscolare in soggetti affetti da distrofia muscolare.

In altre forme di realizzazione, la presente invenzione concerne l?uso di colecalciferolo come agente attivo o coadiuvante nella protezione del tessuto muscolare, in cui detto trattamento comprende la somministrazione di una quantit? terapeuticamente efficace per la protezione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

Preferibilmente, il colecalciferolo ? da somministrarsi in dose da 0,83 ?g/kg a 21 ?g/kg, pi? preferibilmente da 4,2 ?g/kg a 21 ?g/kg, ancor pi? preferibilmente 14,2 ?g/kg. In altri termini, preferibilmente il colecalciferolo ? da somministrarsi in dose da 33,3 UI/kg a 833,3 UI/kg di colecalciferolo, preferibilmente da 166,6 UI/kg a 833,3 UI/kg, ancor pi? preferibilmente 560 UI/kg.

Per ?kg?, si intende kg di peso corporeo del soggetto affetto da distrofia muscolare, secondo la presente invenzione, detto soggetto essendo un essere umano.

Vantaggiosamente, il colecalciferolo pu? essere somministrato una sola volta a settimana, ossia in un?unica somministrazione settimanale, nelle dosi sopra indicate. Ci? significa che dette dosi di colecalciferolo corrispondono alla dose settimanale.

Alternativamente, il colecalciferolo pu? essere somministrato una volta al giorno, ossia detta dose settimanale di colecalciferolo ? da somministrarsi in sette somministrazioni giornaliere, in dose giornaliera corrispondente ad un settimo della dose settimanale. In altre forme di realizzazione, il colecalciferolo pu? essere somministrato una sola volta al mese, ossia in un?unica somministrazione mensile, in dosi mensili corrispondenti a 4-5 volte la dose settimanale sopra indicata. In altre parole, il colecalciferolo pu? essere somministrato in una singola somministrazione mensile, in dose mensile corrispondente a 4-5 volte la dose settimanale. Preferibilmente, detta dose mensile ? di 56,8 ?g/kg oppure 2240 UI/kg.

Preferibilmente, il colecalciferolo ? da somministrarsi per via orale, iniettiva o sottocutanea, pi? preferibilmente per via orale. Ad eccezione di condizioni cliniche particolari (e.g. sindromi da malassorbimento), la via di somministrazione orale ? preferibile, poich? superiore in termini di efficacia nell?incrementare la 25OHD sierica rispetto alla formulazione intramuscolare.

Sotto un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o un integratore alimentare, comprendente colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente, per l?uso nella rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

Sotto ancora un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o un integratore alimentare, comprendente colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente, per l?uso nella protezione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o un integratore alimentare, comprendente colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente, per l?uso nella rigenerazione e protezione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

In alcune forme di realizzazione, la presente invenzione concerne una composizione farmaceutica o un integratore alimentare, comprendente colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente, per l?uso nella rigenerazione muscolare, in cui detto uso comprende la somministrazione di composizione farmaceutica o integratore alimentare comprendente una quantit? di colecalciferolo terapeuticamente efficace per la rigenerazione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

In altre forme di realizzazione, la presente invenzione concerne una composizione farmaceutica o un integratore alimentare, comprendente colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente, per l?uso nella protezione del tessuto muscolare, in cui detto uso comprende la somministrazione di composizione farmaceutica o integratore alimentare comprendente una quantit? di colecalciferolo terapeuticamente efficace per la protezione del tessuto muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari.

La composizione farmaceutica, come pure l?integratore alimentare dell?invenzione, pu? essere somministrata per via orale, iniettiva o sottocutanea.

In una forma di realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica o integratore alimentare ? da somministrarsi per via orale.

Quando la composizione farmaceutica o integratore alimentare ? da somministrarsi per via orale, essa ? preferibilmente in forma di preparato solido orodispersibile, gel, capsula, compressa, polvere, granulato, soluzione, sospensione, emulsione o tintura.

La composizione farmaceutica o integratore alimentare dell?invenzione da somministrarsi per via orale in forma di preparato solido orodispersibile, gel, capsula, compressa, polvere, granulato, soluzione, sospensione, emulsione o tintura, preferibilmente ? somministrata in dose tale da fornire da 0,83 ?g/kg a 21 ?g/kg, pi? preferibilmente da 4,2 ?g/kg a 21 ?g/kg ancor pi? preferibilmente 14,2 ?g/kg.

Ovvero, detta composizione farmaceutica o integratore alimentare dell?invenzione da somministrarsi per via orale in forma di preparato solido orodispersibile, gel, capsula, compressa, polvere, granulato, soluzione, sospensione, emulsione o tintura, preferibilmente ? somministrata in dose tale da fornire da 33,3 UI/kg a 833,3 UI/kg di colecalciferolo, preferibilmente da 166,6 UI/kg a 833,3 UI/kg, ancor pi? preferibilmente 560 UI/kg.

Vantaggiosamente, la composizione farmaceutica o l?integratore alimentare dell?invenzione possono essere somministrati una sola volta a settimana, alle dosi sopra indicate, oppure una volta al mese, in dose corrispondente a 4-5 volte le dosi sopra indicate, preferibilmente in dose di 56,8 ?g/kg o 2240 UI/kg.

In forme di realizzazione preferite, la composizione farmaceutica o l?integratore alimentare dell?invenzione da somministrarsi per via orale, in forma di soluzione, sospensione, emulsione, gel o tintura, comprende colecalciferolo in concentrazione da 14.000 UI/mL a 20.000 UI/mL.

Detta composizione farmaceutica o integratore alimentare dell?invenzione possono vantaggiosamente essere in forma di dose unitaria.

Detta composizione farmaceutica o integratore alimentare dell?invenzione, anche in forma di dose unitaria, comprendono inoltre almeno un adatto eccipiente. Con il termine ?eccipiente? si intende un composto o una miscela di composti adatti per l?utilizzo farmaceutico o alimentare, rispettivamente. Ad esempio, un eccipiente per l?uso in una formulazione farmaceutica o alimentare generalmente non deve causare una risposta avversa in un soggetto, n? deve inibire in modo significativo l?efficacia del colecalciferolo in essa contenuto.

Adatti eccipienti sono acidificanti, correttori di acidit?, anti-agglomeranti, antiossidanti, agenti di carica, agenti di resistenza, gelificanti, agenti di rivestimento, amidi modificati, sequestranti, addensanti, edulcoranti, diluenti, disaggreganti, glidanti, coloranti, leganti, lubrificanti, stabilizzanti, adsorbenti, umettanti, aromi, sostanze filmogene, emulsionanti, bagnanti, ritardanti di rilascio e loro miscele.

Preferibilmente, detti eccipienti sono olio di oliva, olio minerale, paraffina liquida, vaselina bianca, poliossietilene, cera emulsionante, alcool stearilico, alcool isostearilico, alcool cetilstearilico, acido stearico, gliceril stearato, sodio lauril sarcosinato, glicerina, dietilenglicolmonoetiletere, polietilenglicoli, polietilenglicoli stearati, carbopol, carbomeri, Poloxamer 407, Macrogol 400, bentonite purificata, miristil propionato, dimeticone, diossido di titanio, tensioattivi anionici, cationici e non ionici, acqua, potassio sorbato, sodio benzoato, ?-polilisina, sucralosio, maltodestrina, acido citrico, sodio carbonato, calcio carbonato, magnesio carbonato, magnesio stearato, amido naturale, amido parzialmente idrolizzato, amido modificato, lattosio, fosfato di calcio, carbonato di calcio, solfato di calcio, polivinilpirrolidone, silice, silice colloidale, silice precipitata, silicati di magnesio, silicati di alluminio, sodio laurilsolfato, magnesio laurilsolfato, copolimeri metacrilati, sodio deidroacetato, gomma xantana, gomma guar, gomma di tara, gomma di semi di carruba, gomma di fieno greco, gomma arabica, acido alginico, sodio alginato, glicole propilenico alginato, sodio croscaramellosio, polivinilpolipirrolidone, gliceril beenato, indigotina, cellulosa, cellulosa modificata, calcio carbossimetilcellulosa, sodio carbossimetilcellulosa, cellulosa microcristallina, etilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, idrossipropilcellulosa, polidestrosio, carragenina, metilcellulosa, saccarosio, esteri del saccarosio, sorbitolo, xilitolo, destrosio, fruttosio, maltitolo, gomma adragante, pectina, agar-agar, carbossipolimetilene, idrossipropilmetilcellulosa, tragacanth, mannitolo, o loro miscela.

In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica o l?integratore alimentare dell?invenzione consiste essenzialmente in colecalciferolo ed almeno un adatto eccipiente. L?espressione ?consiste essenzialmente in? significa che il colecalciferolo ? l?unico ingrediente attivo nella rigenerazione muscolare ad essere presente nella composizione o integratore, mentre eventuali ulteriori componenti o eccipienti non interferiscono con la sua azione. ? da intendersi che tutti gli aspetti identificati sopra come preferiti e vantaggiosi per l?uso del colecalciferolo, la composizione o l?integratore, sono da ritenersi analogamente preferiti e vantaggiosi anche per queste forme di realizzazione. In altre forme di realizzazione, la composizione farmaceutica o integratore alimentare dell?invenzione consiste in colecalciferolo e almeno un adatto eccipiente.

Tutte le composizioni farmaceutiche o integratori alimentari sopra descritti possono essere preparati mediante metodi noti nella tecnica.

? da intendersi che risultano descritte, e quindi analogamente preferite, anche tutte le possibili combinazioni degli aspetti preferiti del colecalciferolo, dei prodotti che lo contengono e dei rispettivi usi, come sopra indicati.

? inoltre da intendersi che tutti gli aspetti identificati come preferiti e vantaggiosi per il colecalciferolo ed i suoi prodotti, sono da ritenersi analogamente preferiti e vantaggiosi anche per la preparazione e gli usi degli stessi.

L?efficacia del colecalciferolo come un agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione muscolare in soggetti affetti da distrofie muscolari sar? chiara anche dagli esempi riportati qui di seguito.

Inoltre, il colecalciferolo ? normalmente immagazzinato nel tessuto adiposo, dove crea dei depositi da cui ? rilasciato lentamente. Proprio per questo motivo, ha un?emivita ematica piuttosto breve (T1/2 stimato di 19-25 ore), mentre la sua emivita funzionale (parecchie settimane) ? decisamente pi? lunga (correlata al lento rilascio). L?elevata emivita funzionale (lento rilascio da parte del tessuto adiposo) rende il colecalciferolo un agente attivo estremamente flessibile e adattabile nella pratica clinica, permettendo regimi di somministrazione anche intermittente.

Si riportano di seguito esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo e non limitativo.

ESEMPI

Esempio 1 ? Valutazione dell?efficacia della somministrazione orale di colecalciferolo in un modello murino in vivo di distrofia muscolare (topi mdx) Per lo studio ? stato scelto come modello sperimentale il topo mdx (Muscular Distrophy X-linked), che ? da tempo utilizzato per la valutazione della efficacia di farmaci contro la distrofia muscolare e le altre malattie degenerative che colpiscono la muscolatura scheletrica inducendo la perdita funzionale. Questi topi rappresentano il modello animale di riferimento per le proiezioni cliniche, anche perch? hanno permesso di superare l?ostacolo della limitata disponibilit? di materiale bioptico umano a fini sperimentali. Il modello risponde a trattamenti antiinfiammatori, sia steroidei che non-steroidei, e immunosoppressivi ed ? anche usato per lo studio della espressione genica e proteica differenziale indotta dai vari trattamenti.

Il sistema test era complessivamente costituito da 50 topi maschi C57BL/10ScSn-Dmdxdx/J e 27 topi maschi C57/BL con un?et? di circa 4-5 settimane.

Gli animali, dopo un breve periodo di pre-stabulazione (circa 4 giorni dall?arrivo in stabulario), sono stati sottoposti ad analisi comportamentali basali, descritte pi? avanti. Il tempo di inizio delle analisi, dopo il periodo di pre-stabulazione, ? definito tempo zero (t=0).

I topi sono stati inoltre sottoposti ad esercizio fisico con un treadmill rotante (Ugo Basile, Milano) per 15 minuti due volte alla settimana alla velocit? di 12 m/min, per standardizzare la patologia.

Gli animali sono stati trattati per via orale secondo lo schema riportato in tabella 1. Tabella 1

Gli animali appartenenti ai gruppi 1 e 2 sono stati sacrificati subito dopo il periodo di prestabulazione (t=0) per le analisi stabilite.

Al termine del trattamento (t=12 o t=24) gli animali sono stati sacrificati per dissanguamento in anestesia profonda da isofluorano.

Four limb hang test

Questo test ? stato eseguito all?inizio e al termine della sperimentazione (basale e finale).

Viene eseguito servendosi di un apparecchio che utilizza una griglia in acciaio per misurare la capacit? del topo di sostenersi con le quattro zampe, opponendosi alla forza di gravit?. L?animale viene posto sulla griglia (40x40 cm, delimitata da listelli in ferro posti perpendicolarmente alla griglia e alti 5 cm, con quadrati da 1 cm formati da filo di acciaio di 1mm di diametro) che viene invertita in modo che l?animale si trovi capovolto e si regga con le zampe, a circa 30 cm dal pavimento. Sul pavimento viene posto uno strato di lettiera morbida in modo che l?animale non provi dolore al momento dell?eventuale caduta. La griglia viene mantenuta in posizione per 5 minuti al massimo e viene registrato il tempo, in secondi, per il quale l?animale riesce a rimanere appeso con le zampe.

Risultati

I risultati del test sono mostrati nella seguente tabella 2 e sono espressi in secondi e normalizzati per il peso dell?animale. I gruppi 1-8 riportati sono quelli descritti in tabella 1.

Tabella 2

Gli animali wild-type (WT) hanno mostrato la resistenza maggiore, mentre gli animali mdx non trattati o trattati col solo veicolo in genere hanno resistito per tempi minori nel test.

Il trattamento con colecalciferolo ha consentito agli animali mdx di mantenersi aggrappati alla griglia per tempi maggiori rispetto a quelli non trattati, a tutti gli intervalli di analisi, con incrementi di resistenza al distacco dalla griglia molto significativi, in termini di tempo, anche dell?80% nel caso del test a 24 settimane.

Analisi istopatologiche

Queste analisi sono state eseguite sul materiale prelevato durante necropsia effettuata dopo il sacrificio degli animali dei gruppi 7 ed 8. In particolare, sono stati prelevati i quadricipiti femorali, il diaframma e il muscolo tibiale anteriore.

I campioni prelevati e fissati sono stati decalcificati, inclusi in paraffina secondo tecnica nota, tagliati in sezioni da 5-7?m di spessore e colorati con ematossilina-eosina.

Sono state valutate, a livello del tessuto muscolare, le forme di alterazione di seguito elencate, ognuna delle quali ? stata classificata secondo un grado da 0 (assente) a 3 (molto elevata):

-Atrofia

-Degenerazione

-Infiammazione

-Edema

-Presenza tessuto adiposo

-Ipertrofia

-Rigenerazione

-Mineralizzazione

Risultati

I risultati del test sono mostrati nella seguente tabella 3.

Tabella 3

L?esame microscopico del tessuto muscolare colorato con ematossilina-eosina ha mostrato segni di una significativamente elevata atrofia delle fibre muscolari, con zone di necrosi e fibrosi in tutti i topi mdx trattati col solo veicolo. In questi gruppi le zone di degenerazione e quelle in cui il tessuto adiposo sostituisce quello muscolare erano molto estese. Molti campioni presentavano anche zone edematose con estesa flogosi. In particolare, il muscolo diaframma degli animali mdx mostrava un elevato grado di fibrosi e il suo spessore era notevolmente pi? marcato.

I topi mdx trattati con colecalciferolo per 24 settimane mostravano invece zone di rigenerazione e ipertrofia, e solo in pochi casi atrofia muscolare, tra l?altro a bassi livelli. Nella tabella 3 ? evidente l?incremento dei valori dei parametri di rigenerazione ed ipertrofia nel gruppo 8, trattato con colecalciferolo rispetto al gruppo 7 trattato col solo veicolo e, parallelamente, la diminuzione dei valori dei parametri correlati a fenomeni degenerativi, infiammatori ed atrofici.

Immunoistochimica

La crescita e la rigenerazione del muscolo scheletrico sono attribuibili alle cellule satellite, che sono cellule staminali residenti nella lamina basale che circonda ogni miofibra. L?espressione di Pax7 (Paired-Box Transcription Factor 7) ? costitutiva, ossia questo fattore ? espresso in queste cellule sia in fase di quiescenza che di attivazione. Quando le cellule satellite sono attivate, co-esprimono anche MyoD, che correla con una attiva rigenerazione muscolare.

? stata quindi analizzata l?espressione di Pax7 per l?identificazione di cellule satellite (progenitori) situate sotto la lamina basale delle miofibre, e di MyoD, espresso dai mioblasti durante la proliferazione.

Le analisi sono state eseguite sui gruppi dopo 24 settimane di trattamento.

I campioni per immunoistochimica sono stati inclusi in OCT, posti in isopentano, congelati con azoto liquido e mantenuti a -80?C. Sono stati utilizzati anticorpi anti-Pax7 per marcare le cellule satelliti e anti-MyoD per i mioblasti.

Risultati

Negli animali wild-type (WT), trattati col veicolo, Pax7 marcava visibilmente i contorni delle fibre muscolari, evidenziando la presenza di cellule satellite (Fig.1). Al contrario, la marcatura diminuiva notevolmente nei topi mdx trattati col veicolo in assenza di colecalciferolo (Fig.2), mentre appariva pi? evidente negli animali mdx trattati con colecalciferolo (Fig.3).

La presenza di MyoD era molto evidente nei topi wild-type (Fig.4), mentre risultava quasi assente nei topi mdx (Fig.5). Il trattamento con il colecalciferolo, invece, riportava l?espressione di MyoD a livelli simili a quelli dei topi wild-type (Fig.6), indicando quindi una significativa attivit? di colecaciferolo nella rigenerazione muscolare.

Microscopia a fluorescenza

Per le analisi in microscopia a fluorescenza ? stata utilizzata la colorazione DAPI per i nuclei (blu), mentre per marcare le fibre muscolari ? stato utilizzato un anticorpo anti-WGA (WGA, o wheat germ agglutinin, Alexa Fluor? 594 conjugate), che colora le membrane cellulari di rosso.

Risultati

L?analisi in fluorescenza ha mostrato che il tessuto muscolare dei topi mdx sacrificati al tempo 0 (Fig.7) non ? ben differenziato in quanto i nuclei dei miociti che compongono le fibre si trovano in posizione centrale e non periferica, come accade invece nel caso di tessuto ben differenziato. Al contrario, il gruppo di animali wild-type (WT) al tempo 0 ha mostrato un tessuto ben differenziato, con i nuclei cellulari localizzati perifericamente all?interno delle fibre (Fig.8). Le stesse analoghe considerazioni valgono per il gruppo mdx (Fig.9) e per il gruppo wild-type (WT) a 12 settimane di trattamento col solo veicolo (Fig.10). Inoltre, i topi mdx trattati col veicolo per 12 settimane mostravano anche una struttura alterata e piuttosto disgregata delle fibre muscolari. Invece, i topi mdx trattati con colecalciferolo a 12 settimane di trattamento mostravano dei nuclei cellulari distribuiti sia centralmente che perifericamente e delle fibre muscolari meno disgregate (Fig.11), ossia un tessuto muscolare con una struttura certamente pi? integra rispetto a quella che caratterizzava il gruppo di topi mdx non trattati.

Esempio 2 ? Composizione farmaceutica comprendente colecalciferolo per uso orale in forma di soluzione

Al fine di realizzare composizioni farmaceutiche in forma di soluzione per uso orale, il colecalciferolo ? stato miscelato con opportuni eccipienti.

Le composizioni realizzate contenevano un dosaggio unitario di circa 50.000 UI e 35.000 UI per flacone.

I quantitativi degli eccipienti contenuti in ciascun flacone sono indicati nelle seguenti tabelle 4a e 4b, rispettivamente.

Tabella 4a

Componente Quantit? unitaria

Colecalciferolo 50.000 UI

Olio d?oliva raffinato A volume fino a 2,5 mL

Tabella 4b

Componente Quantit? unitaria

Colecalciferolo 35.000 UI

Olio d?oliva raffinato A volume fino a 2,5 mL

Dopo avere introdotto olio d?oliva raffinato in un serbatoio di dissoluzione scaldato a 40?C ? 3 ?C (controllando che la temperatura non superasse mai i 45?C), ? stato aggiunto sotto azoto il colecalciferolo agitando fino a completa dissoluzione (almeno 60 minuti). La miscela ? stata poi raffreddata a circa 27?C (? 3 ?C) e filtrata sotto azoto alla pressione massima di 0,8 atm nel serbatoio.

La soluzione filtrata ? stata infine dosata automaticamente all?interno di flaconi di tipo amber III e sigillata al loro interno.

Esempio 3- Composizioni farmaceutiche comprendenti colecalciferolo per uso orale in forma di capsula rigida di gelatina.

Al fine di realizzare una composizione farmaceutica in forma di capsula rigida per uso orale, il colecalciferolo ? stato miscelato con opportuni eccipienti.

Le composizioni realizzate contenevano un dosaggio unitario di circa 50.000 UI e 35.000 UI per capsula.

I quantitativi degli eccipienti contenuti in ciascuna capsula sono indicati nelle seguenti tabelle 5a e 5b, rispettivamente.

Tabella 5a

Componente Quantit? unitaria (mg)

Colecalciferolo 1,250 mg (equivalente a 50.000 UI)

Olio d?oliva, raffinato 181,150 mg

Tabella 5b

Componente Quantit? unitaria (mg)

Colecalciferolo 0,875 mg (equivalente a 35.000 UI)

Olio d?oliva, raffinato 181,525 mg

All?olio d?oliva raffinato in un serbatoio di dissoluzione, ? stato aggiunto il colecalciferolo, sotto azoto, lasciandolo in agitazione sino a completa dissoluzione (per almeno 60 minuti).

Le capsule sono state riempite, sempre sotto azoto, per mezzo di macchine automatiche, con 200?L della soluzione di colecalciferolo cos? preparata.

Successivamente le capsule sono state sigillate con bandeggio mediante una banda di gelatina e confezionate in blister di PVC/PVDC/Al per mezzo di una blisteratrice automatica.

Conclusioni

Gli studi eseguiti hanno mostrato un effetto del colecalciferolo sulla muscolatura di topi con distrofia, sia in termini di prestazioni funzionali che relativamente alla morfologia del tessuto stesso.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Colecalciferolo per l?uso nel trattamento della distrofia muscolare, come agente attivo o coadiuvante nella rigenerazione del tessuto muscolare.

2. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 1, in cui detta distrofia muscolare ? la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), la distrofia muscolare di Becker o la distrofia muscolare di Emery-Dreifuss.

3. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 1 o 2, in cui il colecalciferolo ? da somministrarsi in dose da 0,83 ?g/kg a 21?g/kg, oppure in dose da 33,3UI/kg a 833,3 UI/kg.

4. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 3, in cui il colecalciferolo ? da somministrarsi in dose da 4,2 ?g/kg a 21 ?g/kg, preferibilmente in dose di 14,2 ?g/kg, oppure in dose da 166,6 UI/kg a 833,3UI/kg, preferibilmente in dose di 560UI/kg.

5. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 4, in cui detta dose di colecalciferolo corrisponde alla dose settimanale.

6. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 5, in cui detta dose di colecalciferolo ? da somministrarsi in una singola somministrazione settimanale, oppure ? da somministrarsi in sette somministrazioni giornaliere con dose giornaliera corrispondente ad un settimo della dose settimanale.

7. Il colecalciferolo per l?uso di rivendicazione 5, in cui detta dose di colecalciferolo ? da somministrarsi in una singola somministrazione mensile con dose corrispondente a 4-5 volte la dose settimanale.

8. Il colecalciferolo per l?uso di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui il colecalciferolo ? da somministrarsi per via orale, iniettiva o sottocutanea, preferibilmente per via orale.

9. Composizione farmaceutica o integratore alimentare comprendente colecalciferolo per l?uso di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, ed almeno un adatto eccipiente.

10. La composizione farmaceutica o l?integratore alimentare di rivendicazione 9, in cui detta composizione farmaceutica o integratore alimentare ? da somministrarsi per via orale, ed ? in forma di preparato solido orodispersibile, gel, capsula, compressa, polvere, granulato, soluzione, sospensione, emulsione o tintura.

11. La composizione farmaceutica o integratore alimentare di rivendicazione 10, in forma di soluzione, sospensione, emulsione gel o tintura, comprendente colecalciferolo in concentrazione da 14.000 UI/mL a 20.000 UI/mL.