ES2599761T3

ES2599761T3 - Uso de 25-hidroxi-vitamina D3 y vitamina D para afectar a la fisiología muscular humana

Info

Publication number: ES2599761T3
Application number: ES09710537.3T
Authority: ES
Inventors: Neil Robert Buck; Wouter Claerhout; Bruno H. Leuenberger; Elisabeth Stoecklin; Kai Urban; Swen Wolfram
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2017-02-03
Anticipated expiration: 2029-02-12
Also published as: IL207588A0; US20110039810A1; US20160263128A1; MX2010008904A; EA019837B1; JP5593550B2; KR20100117113A; AU2009214054B2; CN107412237A; AU2009214054A1; EA201001285A1; CN101951916A; WO2009101137A1; IL207588A; PL2249842T3; EP2249842B1; KR101561717B1; EP2249842A1; US20130150598A1; BRPI0907953A2

Abstract

Uso de 25-hidroxivitamina D3 ("25-OH D3") y vitamina D en la fabricación de un producto farmacéutico, producto nutracéutico, complemento alimentario o composición alimentaria para mantener o prevenir la pérdida de la función muscular o la resistencia muscular en un ser humano, en que el ser humano es una persona de edad, una persona que padece inmovilidad crónica independientemente de la edad, o una persona con deficiencia o insuficiencia de vitamina D.

Description

DESCRIPCION

Uso de 25-hidroxi-vitamina D3 y vitamina D para afectar a la fisiolog^a muscular humana CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere al uso de 25-hidroxivitamina D3 (calcifediol, 25-OH D3) para aumentar o mantener 5 la resistencia muscular, la funcion muscular, o ambas, en una persona de edad, una persona que sufre inmovilidad cronica o en una persona con deficiencia o insuficiencia de vitamina D. La vitamina D (colecalciferol y/o ergocalciferol se utiliza junto con 25-OH D3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La vitamina D (p. ej., ergocalciferol y colecalciferol) es un grupo de compuestos liposolubles definidos por su 10 actividad biologica. Una deficiencia de vitamina D provoca raquitismo en ninos y osteomalacia en adultos. Sin embargo, la toxicidad puede producirse despues de la ingesta cronica de mas de 100 veces la cantidad diaria recomendada (es decir, 5-15 |jg o 200-600 UI de vitamina D) durante varios meses. Para la vitamina D, "El umbral de toxicidad es de 500 a 600 mcg/kg de peso corporal al dfa. En general, los adultos no deben consumir mas de tres veces la RDA durante un periodo prolongado de tiempo" (Garrison y Somer, The Nutrition Desk Reference, Tercera 15 Ed., McGraw-Hill, pag. 82, 1997). La hipercalcemia puede producirse en una concentracion en sangre de 25-

hidroxivitamina D mayor que 375 nmol/L. Mas recientemente, se identifico un nivel superior de seguridad de la vitamina D como al menos 250 jg/dfa (10.000 UI) (Hathcock et al. 85:6-18, 2007). La ingesta de un suplemento dietetico de este tipo como ha demostrado dar como resultado una concentracion en sangre de aproximadamente 200 nmol/L de 25-hidroxivitamina D.

20 La vitamina D es una prohormona que tiene que ser hidroxilada en el tngado para producir 25-hidroxivitamina D (calcifediol; 25-OH vitamina D, 25-OH D), que luego se somete a otra hidroxilacion en el rinon y otros tejidos para producir 1,25-dihidroxivitamina D, la forma activa de la hormona de la vitamina D. 1,25-hidroxivitamina D se libera en la sangre, se une a la protema de union a vitamina D (DBP) y se transporta a los tejidos diana. La union entre 1,25- dihidroxivitamina D y el receptor de la vitamina D permite que el complejo actue como un factor de transcripcion en 25 el nucleo de la celula.

La deficiencia de vitamina D puede fomentar la resorcion del hueso. Tambien puede modular la funcion de los sistemas cardiovascular, inmunologico y muscular. Estudios epidemiologicos encuentran asociaciones entre la ingesta de vitamina D y su efecto sobre la presion arterial o el metabolismo de la glucosa. La actividad de la vitamina D esta bajo el control de retroalimentacion negativa por la hormona paratiroidea.

30 Tanto la vitamina D como 25-OH D3 se han administrado como productos farmaceuticos en el pasado. La vitamina D esta, por supuesto, ampliamente disponible; 25-OH D3 se vendio previamente en los EE.UU. por Organon USA bajo el nombre de "CALDEROL", pero se encuentra actualmente en la lista de medicamentos de la FDA interrumpidos. Era una capsula de gelatina que contiene aceite de mafz y 25-OH D3.

Una formulacion lfquida de 25-OH D3 se vende actualmente en Espana por FAES Farma bajo el nombre de 35 "HIDROFEROL" en una disolucion en aceite.

La combinacion de vitamina D y 25-OH D3 se ha utilizado en la alimentacion animal. 25-OH D3 para su uso en la alimentacion esta disponible comercialmente de DSM bajo el nombre "ROVIMIX HY-D".

Tritsch et al. (documento US 2003/0170324) describen una composicion de premezcla de piensos de al menos 25- OH D3 en una cantidad entre 5% y 50% (p/p) disuelto en aceite y un antioxidante, un agente de encapsulacion de 40 gotitas de 25-OH D3 y aceite, y un aditivo nutricional (p. ej.,, la vitamina D3). La premezcla se puede anadir a los piensos para aves de corral, cerdos, animales caninos o felinos. Esta composicion estabiliza 25-OH D3 frente a la oxidacion.

Simoes-Nunes et al. (documento US 2005/0064018) describe la adicion de una combinacion de 25-OH vitamina D3 y vitamina D3 a piensos para animales. En particular, aproximadamente 10 jg/kg a aproximadamente 100 pg/kg de 45 25-OH vitamina D3 y aproximadamente 200 UI/kg a aproximadamente 4.000 UI/kg de vitamina D3 se anaden a

piensos para cerdos. Esta adicion mejora la fortaleza de los huesos del cerdo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Stark et al. (documento US 5.695.794) describen la adicion de una combinacion de 25-OH vitamina D3 y vitamina D3 a los piensos de aves de corral para mejorar los efectos de discondroplasia tibial.

Borenstein et al., documento US 5.043.170 describe la combinacion de vitamina D3 y 1-alfa-hidroxicolecalciferol o lalfa, 25-dihidroxicolecalciferol para mejorar la resistencia del huevo y la resistencia de las patas en gallinas ponedoras y gallinas de mayor edad.

Chung et al., documento WO 2007/059960 describe que cerdas alimentadas con una dieta que contiene tanto vitamina D3 como 25-hidroxivitamina D3 habfan mejorado el estado general de salud, estructura corporal, el tamano de la camada y la salud, y otros parametros de produccion. Tambien se describe un complemento alimenticio humano 25-OH D3, pero su intervalo de dosificacion, 5-15 microgramos por kg de peso corporal, que equivale a una dosificacion diaria extremadamente alta de 300-900 microgramos por ser humano, es muy alto.

El documento PCT/EP08/006357 describe que la exposicion prenatal de lechones a 25-OH D3 (por la alimentacion de la cerda prenada) mejora el desarrollo muscular en la descendencia.

Sato et al. 2005 Cerebrovasc Dis 20:187-192 discute la terapia con vitamina D para la prevencion de cafdas en supervivientes de accidentes cerebrovasculares que eran deficientes en vitamina D. No hay mencion alguna de la combinacion de vitamina D con 25-OH D3.

Bischoff-Ferrari 2007 Int. Congress Ser. 1297:143-147 recomienda el uso de vitamina D para prevenir cafdas y fracturas en ultima instancia, en los ancianos institucionalizados. No hay sugerencia alguna de la combinacion de este con 25-OH D3.

Al leal saber y entender de los autores de la invencion, la tecnica anterior no ensena ni sugiere el uso de la combinacion de 25-OH D3 y vitamina D como un medicamento para seres humanos para aumentar la resistencia muscular, la funcion muscular, o ambas. Otras ventajas y mejoras se describen a continuacion o resultaran evidentes a partir de la descripcion en esta memoria.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona el uso de 25-hidroxivitamina D3 ("25-OH D3") y vitamina D en la fabricacion de un producto farmaceutico, producto nutraceutico, complemento alimentario o composicion alimentaria para mantener o prevenir la perdida de la funcion muscular o la resistencia muscular en un ser humano, en que el ser humano es una persona de edad, una persona que padece inmovilidad cronica independientemente de la edad, o una persona con deficiencia o insuficiencia de vitamina D.

Se ha encontrado, de acuerdo con esta invencion, que el tratamiento diario o semanal con 25-OH D3 resulta sorprendentemente en mejoras de la resistencia y/o la funcion muscular en comparacion con el consumo de dosis identicas de vitamina D.

De acuerdo con la invencion, 25-OH-D3 es util como un medicamento para aumentar la resistencia y/o la funcion muscular en un ser humano. El medicamento comprende, ademas, vitamina D. Tambien se describen formas y dosis de una composicion farmaceutica, asf como procedimientos para la fabricacion de medicamentos.

Opcionalmente, la vitamina D3 se puede administrar junto con o por separado de 25-OH D3. Se puede administrar una vez al dfa, una vez a la semana o una vez al mes. Generalmente, el periodo de administracion es de al menos un mes, preferiblemente de mas de dos meses y mas preferiblemente de al menos cuatro meses, de modo que se pueden observar claramente cambios en la resistencia muscular. La resistencia se puede medir utilizando ensayos reconocidos en la tecnica tales como ensayos de resistencia del flexor y extensor de la rodilla.

En otro aspecto, se proporciona un metodo para aumentar la funcion del musculo mediante la administracion de una cantidad eficaz de 25-OH D3 y vitamina D3. Opcionalmente, la vitamina D puede administrarse junto con o por separado de 25-OH D3. Se pueden administrar una vez al dfa, una vez a la semana o una vez al mes. La funcion muscular puede evaluarse mediante ensayos reconocidos en la tecnica tales como la prueba repetida de postura sentada a postura de pie, y la prueba de levantate y anda.

En otro aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica adecuada para uso humano, que comprende vitamina D3, 25-OH d3, y un soporte farmaceuticamente aceptable en cantidades de fortalecimiento muscular.

5

10

15

20

25

30

35

40

Ademas, se ha encontrado, de acuerdo con esta invencion que la combinacion de 25-OH D3 y vitamina D regula de forma sinergica (ya sea regula al alza o regula a la baja) un cierto numero sinergico de genes del musculo esqueletico que responden a la vitamina D, incluyendo un numero alto de genes que no son sensibles a la presencia de vitamina D ni 25-OH D3 solo. Este es un resultado sorprendente, ya que no se explica por el actual modelo de metabolismo de la vitamina D, que postula que virtualmente toda la vitamina D se metaboliza en primer lugar en 25- OH D.

La combinacion, de acuerdo con esta invencion, proporciona dos ventajas significativas:

1) resulta en una respuesta rapida y sinergica en plasma de 25-OH D

2) conduce a una meseta inesperadamente pronunciada y larga de los niveles en plasma de 25-OH D.

Estos son objetivos especialmente importantes del tratamiento de trastornos musculares que son la consecuencia de una deficiencia de vitamina D: una correccion rapida del estado de la vitamina D suboptima y una concentracion en plasma larga y estable para garantizar un suministro suficiente de 25-OH a tejido muscular.

Otro aspecto de esta invencion es un alimento, alimento funcional, nutraceutico o complemento alimenticio para su uso en el mantenimiento de la resistencia y la funcion muscular para el consumo humano que contiene una combinacion de vitamina D y 25-OH D3.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIGURA 1 muestra diagramas de Venn de conjuntos de sondas expresados diferencialmente para genes murinos para los grupos de extremidad posterior sin carga ("grupo HU") y de tratamiento (vitamina D3, 25-OH D3 o la combinacion).

FIGURA 2 muestra diagramas de Venn de conjuntos de sonda expresados diferencialmente para genes entre el grupo de tratamiento 25-OH D3 y el grupo de tratamiento con la combinacion de 25-OH D3 + vitamina D3.

FIGURA 3 muestra diagramas de Venn de conjuntos de sonda expresados diferencialmente para genes entre el grupo de tratamiento con vitamina D3 y el grupo de tratamiento con la combinacion de 25-OH D3 + vitamina D3.

FIGURA 4 es un analisis de enriquecimiento (realizado con GeneGo MetaCore) de los 1745 conjuntos de sonda para genes expresados diferencialmente entre el grupo HU y el grupo que recibio un tratamiento de combinacion de 25-OH D3 y vitamina D3.

FIGURA 5 muestra diagramas de Venn de conjuntos de sonda expresados diferencialmente en los conjuntos del grupo de tratamiento y de sonda 25-OH D3 + vitamina D3 para los genes seleccionados del musculo esqueletico.

FIGURA 6 muestra diagramas de Venn de conjuntos de sonda expresados diferencialmente en los conjuntos del grupo de tratamiento y de sonda 25-hidroxivitamina D3 de los genes seleccionados del musculo esqueletico.

FIGURA 7 muestra diagramas de Venn de los conjuntos de sonda expresados diferencialmente en los conjuntos del grupo de tratamiento y la sonda de vitamina D3 para genes seleccionados del musculo esqueletico.

Tal como se utiliza en toda la memoria y las reivindicaciones, se aplican las siguientes definiciones:

"Vitamina D" significa cualquiera de vitamina D3 (colecalciferol) y/o vitamina D2 (ergocaciferol). Los seres humanos son incapaces de producir vitamina D2 (ergocalciferol), pero son capaces de utilizarla como una fuente de vitamina D. La vitamina D2 puede ser sintetizada por diversas plantas y se utiliza a menudo en la vitamina D en complementos como un equivalente a la vitamina D.

“Metabolito de vitamina D" significa cualquier metabolito de la vitamina D que no sea 25-hidroxi-vitamina D3.

"25-OH D3" se refiere espedficamente a 25-hidroxivitamina D3.

"25-OH D" se refiere al metabolito 25-hidroxilado de cualquiera de vitamina D2 o vitamina D3, que es la principal forma circulante en el plasma.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

"Prevenir" se entiende que incluye mejora de la enfermedad, disminucion de la gravedad de los smtomas, intervencion temprana y el alargamiento de la duracion del brote de la enfermedad, y no pretende limitarse a una situacion en la que el paciente ya no es capaz de contraer la enfermedad ni experimentar smtoma alguno.

En otra realizacion, se proporciona un kit que se compone de multiples dosis, separadas de la vitamina D o vitamina D3 junto con una dosis de 25-OH D3. Pueden estar encerradas en un recipiente: p. ej., una botella, blister o soporte para viales. Ademas, se proporcionan en el kit instrucciones para administrar la composicion como una dosis a un ser humano.

En otra realizacion, la 25-OH D3, sola o en combinacion con vitamina D es el ingrediente activo para preservar la resistencia o funcion muscular sana en un alimento, alimento funcional, nutraceutico o complemento alimenticio adecuado para el consumo humano. Las dosificaciones de la 25-OH y/o D3 pueden ser las mismas que las presentes en el producto farmaceutico, pero preferiblemente tenderan hacia las zonas mas bajas. Los complementos alimenticios y los productos nutraceuticos pueden estar en forma de comprimidos, capsulas u otras formas de dosificacion convenientes. El alimento puede ser una bebida o comida y, si se desea, puede contener tambien otros compuestos nutricionalmente eficaces tales como otras vitaminas, minerales y similares.

La deficiencia de vitamina D es una afeccion especialmente frecuente en la poblacion de edad avanzada y aquellos que padecen inmovilidad cronica independientemente de su edad. Esto puede ser debido a la falta general de exposicion a la luz solar, una capacidad reducida del cuerpo para la fabricacion de vitamina D o metabolizarla de manera eficiente, o un cierto numero de otras causas. Una de las consecuencias de la deficiencia de vitamina D es una perdida de resistencia y/o funcion muscular. Por lo tanto, un aspecto de esta invencion es el uso de la combinacion de vitamina D y 25-OH D3 en una poblacion anciana para mantener, evitar la perdida de y/o restablecer la resistencia y/o funcion muscular saludable. Tal como se usa a lo largo de esta memoria, la expresion "personas mayores" pretende abarcar aquellas personas que tienen mas de 65 anos de edad, preferentemente mas de 70, e incluso mas de 80.

En otra realizacion, esta combinacion de 25-OH D3 y vitamina D es adecuado para mantener, evitar la perdida de y/o restablecer la resistencia y funcion muscular saludable en personas que esten en riesgo de desarrollar condiciones de resistencia y/o funcion muscular caracterizadas por la deficiencia o insuficiencia vitamina D. Estas incluinan especialmente los adultos, incluidas las mujeres post-menopausicas (es decir, aproximadamente de 45 anos de edad y mayores) y los hombres de aproximadamente 45 anos de edad y mayores. Es especialmente adecuado para individuos que no reciben una gran cantidad de exposicion a la luz solar natural tales como para las personas que tradicionalmente utilicen ropa larga, no salgan de casa regularmente, o que utilicen filtros solares cuando estan expuestos a la luz solar, o vivan en zonas geograficas de manera significativa al norte o al sur del ecuador, en donde la luz solar es menos intensa.

La invencion es util en un metodo para mantener, evitar la perdida de y/o restablecer la resistencia y funcion muscular saludable en un ser humano con un smdrome de mala absorcion (p. ej., afectado por la enfermedad celfaca, esprue o smdrome de intestino corto) y, con ello, estan en riesgo de deficiencia de vitamina D mediante la administracion de la combinacion de vitamina D y 25-OH D3.

La invencion es util en un metodo para mantener, evitar la perdida de y/o restablecer la resistencia y funcion muscular saludable en un ser humano con la funcion hepatica deteriorada, en el que el ser humano no puede procesar la vitamina D en 25-hidroxivitamina D de manera eficiente, proporcionando al ser humano una combinacion de vitamina D y 25-hidroxivitamina D3.

Las composiciones para uso de acuerdo con la invencion tambien son beneficiosas para la retencion de masa muscular en las personas de edad (de hasta 80 anos) y los muy ancianos (de 80 o mas anos de edad), sobre todo los que estan en los centros de atencion institucionales (p. ej., hospital, asilo, clinica de rehabilitacion, atencion domiciliaria de mayores), o aquellos con atrofia muscular.

En otra realizacion, 25-OH D3 y vitamina D3 para uso de acuerdo con la invencion mantienen o previenen la perdida de la resistencia muscular en los ancianos. La perdida de resistencia muscular es tambien una causa principal de cafdas en los ancianos y puede contribuir al elevado numero de cafdas que se producen en el hospital. Para una persona mayor que ha disminuido las reservas fisiologicas, pero aun puede realizar las actividades diarias (tales como caminar, banarse y funciones para ir al bano), las perdidas aceleradas de la resistencia muscular despues de incluso unos pocos dfas de reposo en cama pueden resultar en una perdida prolongada de la funcion independiente. Incluso si esta perdida es finalmente invertida, la rehabilitacion requiere una intervencion extensa y costosa porque el reacondicionamiento de los musculos lleva considerablemente mas tiempo que el proceso de perdida de acondicionamiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Las composiciones para uso de acuerdo con la invencion tambien son beneficiosas para la retencion y/o el aumento de la masa muscular en personas que pueden no ser de edad, pero que pierden masa muscular debido a que estan inmovilizados debido a otra afeccion. Segun se explica por el Merck Manual of Geriatric, 2 Ed: (pags. 316-318): con una inactividad completa, la resistencia muscular disminuye un 5% al dfa. Incluso los hombres jovenes en reposo en cama pierden resistencia muscular a un ritmo de 1,0% a 1,5% al dfa (o alrededor del 10% a la semana).

Por lo tanto, las composiciones para uso de acuerdo con esta invencion son beneficiosas para las personas que estan sujetas a una perdida de masa muscular debido a la disminucion de la movilidad, o incluso que son inmoviles. La causa de la disminucion de la movilidad no importa en la practica de esta invencion, ya que el objetivo aqu es el de proteger contra la perdida de masa muscular. Por ejemplo, la perdida de movilidad puede ser desde trauma, apoplejfa, estar escayolado, la enfermedad de Parkinson, esclerosis multiple, miastenia grave, o incluso la enfermedad de Creutzfeldt-Jacobs. Asf, otro aspecto es administrar los compuestos para uso de acuerdo con esta invencion a un individuo paraplejico, o a un individuo tetraplejico.

La composicion para uso de acuerdo con esta invencion tambien es beneficiosa para los que sufren de caquexia o sarcopenia. La caquexia es un smdrome de "perdida de cuerpo" que es una co-morbilidad con el cancer y el SIDA. Otros smdromes o afecciones que pueden inducir una atrofia del musculo esqueletico son la enfermedad cardfaca congestiva, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfermedad del tugado, el hambre, quemaduras, etc. La sarcopenia es otra afeccion (distinta de la caquexia y atrofia), que se refiere a una disminucion relacionada con la edad en la funcion del musculo. La causa exacta es desconocida.

Esta invencion se refiere tambien a beneficiar a aquellos con debilidad muscular. La debilidad muscular es la parte ffsica de la fatiga (medica). Los puntos de debilidad muscular son centrales, neurales y perifericos. La debilidad muscular central es un agotamiento general del cuerpo entero, mientras que la debilidad periferica es un agotamiento de los musculos individuales. La debilidad neural es en algun punto entremedia.

La debilidad muscular puede ser debida a problemas con el suministro de los nervios o problemas con el musculo en sf. La ultima categona incluye polimiositis y otros trastornos musculares, p. ej., esclerosis lateral amiotrofica, botulismo, miopatfa centronuclear, miopatfa miotubular, disautonoirna, Charcot-Marie-Tooth, hipocalemia, enfermedad de las neuronas motoras, distrofia muscular, distrofia miotonica, miastenia grave, atrofia muscular progresiva, atrofia muscular espinal, paralisis cerebral, mononucleosis infecciosa, herpes zoster, deficiencia de vitamina D, fibromialgia, enfermedad celfaca, hipercortisolismo (smdrome de Cushing), hipocortisolismo (enfermedad de Addison), hiperaldosteronismo primario (smdrome de Conn), y diarrea.

Formas de Dosificacion

La vitamina D y 25-OH D3 se pueden obtener de cualquier fuente, y una composicion de las mismas se puede preparar utilizando una tecnologfa conveniente. En general, cristales de vitamina D3, 25-OH D3, o ambos (por separado o juntos) se disuelven en un aceite con calentamiento y agitacion. Preferiblemente, el aceite se transfiere a un recipiente y se calienta. Despues de ello, la vitamina D3, 25-OH D3, o ambos se anaden al recipiente, mientras que se mantiene la temperatura del aceite o se aumento con el tiempo. La composicion se agita para disolver los cristales de vitamina D3, 25-OH D3, o ambos. Antes de la adicion al aceite, los cristales pueden reducirse en tamano mediante molienda y/o tamizado, para mejorar la disolucion. La composicion puede ser agitada por agitacion, rotacion del recipiente, mezcladura, homogeneizacion, recirculacion o tratamiento con ultrasonidos. Preferiblemente, el aceite se puede calentar en el recipiente a una temperatura de aproximadamente 80°C a aproximadamente 85°C, los cristales de tamano se introducen en el recipiente y los contenidos se agitan para disolver los cristales en el aceite.

El "aceite" puede ser cualquier aceite comestible, lfpidos, o grasas: p. ej., aceite babasu, aceite de coco, aceite de corozo, sebo de murumyru, aceite de almendra de palma o aceite de tucum. El aceite puede ser natural, sintetico, semisintetico, o cualquier combinacion de los mismos. El aceite natural puede derivarse de cualquier fuente (p. ej., animal, vegetal, hongos, marino); aceite sintetico o semisintetico puede ser producido mediante una tecnologfa conveniente. Preferiblemente, el aceite es una mezcla de trigliceridos de cadena media de vegetales, principalmente acidos capnlico y caprico. La composicion puede contener opcionalmente uno o mas de otros ingredientes adecuados tales como, p. ej., un antioxidante farmaceuticamente aceptable, conservantes, agentes de disolucion, tensioactivos, agentes de ajuste del pH o tampones, humectantes, y cualquier combinacion de los mismos. Los anteriores son ejemplos de soportes farmaceuticamente aceptables.

Antioxidantes adecuados incluyen tocoferol, tocoferoles mixtos, tocoferoles de fuentes naturales o sinteticas, hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), antioxidantes naturales tales como extracto de romero, galato de propilo y cualesquiera otros que se utilizan en la fabricacion de productos farmaceuticos para seres

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

humanos. Preferiblemente, el antioxidante es tocoferol. Conservantes adecuados incluyen metilparabeno, propilparabeno, sorbato de potasio, benzoato de sodio, acido benzoico y cualquier combinacion de los mismos. Agentes de disolucion adecuados incluyen disolventes inorganicos u organicos: p. ej., alcoholes, hidrocarburos dorados, y cualquier combinacion de los mismos. Los tensioactivos adecuados pueden ser anionicos, cationicos o no ionicos: p. ej., palmitato de ascorbilo, polisorbatos, polietilenglicoles, y cualquier combinacion de los mismos. Agentes o tampones de ajuste del pH adecuados incluyen acido dtrico-citrato de sodio, acido fosforico-fosfato de sodio, acido acetico-acetato de sodio, y cualquier combinacion de los mismos. Humectantes adecuados incluyen glicerol, sorbitol, polietilenglicol, propilenglicol, y cualquier combinacion de los mismos.

Una vez formada, la composicion de aceite se puede incorporar en otras diversas composiciones utiles, algunas de las cuales se discuten a continuacion. Por ejemplo, pueden formarse emulsiones que pueden estar opcionalmente encapsuladas o secadas por pulverizacion. Se puede preparar una diversidad de emulsiones mediante la combinacion de las composiciones no acuosas descritas anteriormente con una composicion acuosa. La emulsion puede ser de cualquier tipo. Emulsiones adecuadas incluyen emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, emulsiones anhidras, emulsiones solidas y microemulsiones. Las emulsiones se pueden preparar por cualquier tecnologfa conveniente. La emulsion contiene una composicion acuosa y una composicion no acuosa (p. ej., aceite), en donde esta ultima comprende vitamina D3, 25-OH D3, o ambas (por separado o juntas) disuelto en un aceite en una cantidad de entre aproximadamente 3% y aproximadamente 50% en peso basado en el peso total de la composicion de aceite. Tal como se utiliza en esta memoria, "composicion acuosa" y "fase acuosa" se utilizan indistintamente. En general, la emulsion puede contener de aproximadamente 20% a aproximadamente 95% de una composicion acuosa, y de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% de una composicion no acuosa. Preferiblemente, sin embargo, la emulsion contiene de aproximadamente 85% a aproximadamente 95% (vol./vol.) de una composicion acuosa, y de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% (vol./vol.) de una composicion no acuosa. Convenientemente, la composicion no acuosa se puede dispersar en forma de gotitas en la composicion acuosa. Por ejemplo, las gotitas pueden tener un diametro medio de menos de aproximadamente 500 nm en la composicion acuosa. Convenientemente, las gotitas tienen un diametro medio de entre aproximadamente 150 nm y aproximadamente 300 nm.

En una realizacion particularmente ventajosa, la emulsion contiene un agente de encapsulacion, que facilita la encapsulacion de la composicion de aceite tras el procesamiento posterior de la emulsion (p. ej., mediante secado por pulverizacion). El agente encapsulante puede ser cualquier sustancia comestible capaz de encapsular la composicion de aceite. Preferiblemente, el agente de encapsulacion es predominantemente un material coloidal. Tales materiales incluyen almidones, protemas de fuentes animales (incluyendo gelatinas), protemas de fuentes vegetales, casema, pectina, alginato, agar, maltodextrinas, lignosulfonatos, derivados de celulosa, azucares, sacaridos, sorbitoles, gomas y cualquier combinacion de los mismos.

Almidones adecuados incluyen: almidones vegetales (p. ej., CAPSUL® o HI-CAP® de National Starch & Chemical Corp., Nueva York, NY), otros almidones alimenticios modificados, y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, el almidon es almidon vegetal modificado CAPSUL®. Protemas adecuadas de fuentes animales incluyen: gelatinas (p. ej., gelatinas bovinas, gelatinas porcinas (Tipo A o B) con diferentes indices de Bloom, gelatinas de pescado), protema de la leche desnatada, caseinato, y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, la protema animal es una gelatina. Protemas adecuadas procedentes de fuentes vegetales incluyen: protema de patata (p. ej., ALBUREX® de Roquette Preres Societe Anonyme, Lestrem, Francia), protema de guisante, protema de soja, y cualquier combinacion de las mismas. Preferiblemente, la protema vegetal es protema de patata ALBUREX®. Maltodextrinas adecuadas con un equivalente de dextrosa diferente incluyen: maltodextrina 5, maltodextrina 10, maltodextrina 15, maltodextrina 20, maltodextrina 25, y cualquier combinacion de las mismas. Preferiblemente, la maltodextrina es maltodextrina 15. Derivados de celulosa adecuados incluyen: etil- celulosa, metiletil-celulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa, y cualquier combinacion de las mismas. Sacaridos adecuados incluyen lactosa, sacarosa, o cualquier combinacion de las mismas. Preferiblemente, el sacarido es sacarosa. Gomas adecuadas incluyen: acacia, algarroba, carragenano, y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, la goma es goma de acacia.

Cuando la emulsion contiene un agente encapsulante, el agente encapsulante puede dispersarse en agua mediante cualquier tecnologfa conveniente para formar una fase acuosa. La fase acuosa puede ser una disolucion o una mezcla, dependiendo de las propiedades de los componentes seleccionados. Los componentes seleccionados se pueden dispersar por cualquier tecnologfa conveniente, incluyendo: homogeneizacion, mezcladura, emulsion, recirculacion, mezcladura estatica, ultrasonidos, agitacion, calentamiento, o cualquier combinacion de los mismos. La viscosidad de la fase acuosa resultante se puede ajustar entonces, segun se desee, por la adicion de agua. La composicion acuosa de la emulsion puede contener opcionalmente cualquier otro material adecuado incluyendo, pero no limitado a los descritos anteriormente en referencia a la composicion no acuosa. Preferiblemente, la composicion acuosa puede incluir un agente encapsulante, un agente formador de pelmula, un plastificante, un conservante, un antioxidante, o cualquier combinacion de los mismos. Conservantes adecuados incluyen

metilparabeno, propilparabeno, acido sorbico, sorbato de potasio, benzoato de sodio, y cualquier combinacion de los mismos. Antioxidantes adecuados incluyen ascorbato de sodio, acido ascorbico, acido citrico y cualquier combinacion de los mismos.

Preferiblemente, la fase acuosa contiene un almidon modificado tal como almidon de octenil-succinilo (CAPSUL®), 5 maltodextrina y ascorbato de sodio. Otra fase acuosa preferida contiene protema de patata (ALBUREX®), maltodextrina 20 y ascorbato de sodio. Los componentes seleccionados se pueden disolver en agua por cualquier tecnologfa conveniente, preferiblemente con agitacion. Preferentemente, la mezcla se homogeneiza hasta que sea uniforme y sin grumos. Preferiblemente, la homogeneizacion se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 75°C. La viscosidad final de la fase acuosa resultante se puede ajustar 10 a la viscosidad deseada, preferiblemente de aproximadamente 250 cp a aproximadamente 450 cp, mas preferiblemente de aproximadamente 300 cp a aproximadamente 400 cp, incluso mas preferiblemente a aproximadamente 385 cp.

La emulsion puede formarse mediante la emulsion de la composicion no acuosa y la fase acuosa por cualquier medio, incluyendo homogeneizacion, cizallamiento rotor-estator, cizallamiento a alta presion y cavitacion, “boquillas” 15 de alta velocidad o agitacion con cizallamiento, y cualquier combinacion de los mismos. El volumen y la viscosidad de la emulsion se pueden ajustar preferentemente mediante la adicion de agua despues de la emulsificacion. Preferiblemente, las composiciones no acuosas y acuosas se emulsionan por homogeneizacion. Preferiblemente, la emulsion no debe contener mineral, metal de transicion o peroxido alguno.

Tal como se senalo anteriormente, la emulsion se puede incorporar o emplear en la produccion de otras 20 composiciones utiles, especialmente aceites encapsulados, p. ej., polvos secados por pulverizacion. Generalmente, el aceite encapsulado comprende una composicion de aceite y un agente de encapsulacion que encapsula la composicion de aceite, en donde la composicion de aceite contiene vitamina D3, 25-OH D3, o ambos disueltos en el aceite en una cantidad entre aproximadamente 3% y aproximadamente 50% en peso, basado en el peso total de la composicion de aceite. El aceite encapsulado se puede producir mediante cualquier tecnologfa conveniente: p. ej., 25 secado de una emulsion descrito anteriormente mediante cualquier tecnologfa convencional, incluyendo secado por pulverizacion, liofilizacion, secado en lecho fluido, secado en bandeja, adsorcion y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, el aceite encapsulado se produce mediante secado por pulverizacion de una emulsion que tiene una fase acuosa que contiene un agente de encapsulacion; los parametros de secado por pulverizacion vienen dictaminados por las caractensticas ffsicas deseadas en el aceite encapsulado final. Tales parametros ffsicos 30 incluyen el tamano de las partfculas, la forma y el flujo de polvo y el contenido de agua. Preferiblemente, el aceite esta en una cantidad de menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5% en peso, basado en el peso total del aceite encapsulado. El aceite encapsulado debena tener una buena capacidad de flujo y la vitamina D3 y/o 25-OH D3 debena ser distribuida homogeneamente por toda la composicion. Convenientemente, el aceite encapsulado es un polvo. Puede 35 anadirse cualquier otro aditivo adecuado al aceite encapsulado. Uno de tales aditivos puede ser un agente de flujo tal como dioxido de silicio, para aumentar la fluidez del aceite encapsulado.

La composicion puede proporcionarse en forma de un comprimido, capsula (p. ej., dura o blanda), o inyeccion (p. ej., aceite o emulsion). Se puede envasar en una dosificacion diaria unica.

Dosificaciones

40 Diarias. Una composicion de acuerdo con esta invencion en la que los dos ingredientes activos se han de administrar por separado, contiene vitamina D o 25-OH D3 en una cantidad de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 50 jg, preferiblemente de aproximadamente 5 jg a 25 jg. Alternativamente, una dosificacion diaria unica que tiene tanto vitamina D como 25-OH D3 contiene cada uno de los ingredientes activos en una cantidad de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 jg, preferiblemente de aproximadamente 5 jg y 25 jg.

45 La relacion de dosificacion de vitamina D a 25-OH D3 puede ser de aproximadamente 50: 1 a aproximadamente 1:50, mas preferiblemente de aproximadamente 25: 1 a aproximadamente 1:25, e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1:6.

Dosificaciones multiples separadas se pueden envasar en un solo kit (o recipiente). Por ejemplo, el kit puede estar compuesto de treinta dosificaciones diarias separadas de los dos principios activos por separado (es decir, 60 50 dosificaciones separadas), o combinadas (es decir, 30 dosis que contienen los dos ingredientes activos). Las instrucciones para administrar las dosificaciones a un ser humano pueden ser incluidas en el kit.

Semanal. Una dosificacion unica semanal contiene vitamina D o 25-OH D3 en una cantidad de aproximadamente 7 jg a aproximadamente 350 |jg, y preferiblemente de aproximadamente 35 a 175 |jg. Alternativamente, una unica dosificacion semanal puede contener tanto vitamina D como 25-OH D3, cada una en una cantidad de aproximadamente 7 jg a aproximadamente 350 jg, y preferiblemente de aproximadamente 35 a 175 jg. La relacion 5 de dosis de vitamina D a 25-OH D3 puede ser de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1:50, mas

preferiblemente de aproximadamente 25:1 a aproximadamente 1:25, y aun mas preferiblemente de

aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1:6.

Mensual. Una dosificacion unica mensual contiene vitamina D o 25-OH D3 en una cantidad de 30 jg a aproximadamente 1500 jg, preferiblemente de aproximadamente 75 jg a aproximadamente 500 jg.

10 Alternativamente, una dosificacion unica mensual puede contener tanto vitamina D como 25-OH D3, cada uno en una cantidad de 30 jg a aproximadamente 1500 jg, preferiblemente de aproximadamente 75 jg a aproximadamente 500 jg. Un kit puede estar compuesto de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce dosificaciones semanales o mensuales.

Relaciones de dosificacion de vitamina D a 25-OH D3 debenan oscilar entre 50:1 y aproximadamente 1:50, mas 15 preferiblemente de aproximadamente 25:1 a aproximadamente 1:25, y aun mas preferiblemente de

aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1:6.

ANALISIS DE GENES

Para demostrar la bioactividad incrementada de la combinacion, se realizo un analisis de chips de genes de tejido muscular expuesto a vitamina D, 25-OH D3 y la combinacion. Detalles se dan en el Ejemplo 2, utilizando un modelo 20 de suspension en pata trasera murino. Como se puede ver, existe un aumento espectacular en el numero de genes activados o regulados (ya sea regulados al alza o regulados a la baja) cuando se suministra la combinacion de los dos en comparacion con la administracion individual. Dado que se cree actualmente que la gran mayona de la vitamina D se convierte en 25-OH D despues de la ingestion y el procesamiento en el hugado, este es un resultado sorprendente.

25 Se describe en esta memoria un procedimiento de activacion o regulacion de genes relacionados con la musculatura humanos que responden a la vitamina D y 25-OH D, que comprende la administracion a una persona de una combinacion de vitamina D y 25-OH D3.

Los siguientes Ejemplos no limitativos se presentan para ilustrar mejor la invencion.

EJEMPLOS

30 Ejemplo 1

Ensayo Clmico

Formulacion Materiales y Metodos

Se proporciono una formulacion secada por pulverizacion de 25-OH D3 en forma de un polvo. En resumen, 25-OH 35 D3 y DL-a-tocoferol se disolvieron en un aceite de trigliceridos de cadena media, luego se emulsionaron en una disolucion acuosa de almidon modificado, sacarosa y ascorbato de sodio. La emulsion se atomizo en un secador por pulverizacion en presencia de dioxido de silicio. Se recogio el polvo resultante cuando el contenido de agua (lDo) era menor que 4% y se tamizo a traves de 400 jm. Se envaso y sello en bolsas de aluminio, luego se almaceno en una zona seca por debajo de 15°C y se utilizo en el espacio de 12 meses de su fabricacion.

40 Se fabricaron tres lotes separados. En detalle, se produjo una matriz mezclando durante 120 minutos en una unidad de procesamiento FRYMlX con un agitador de ancla a 70°C bajo vacfo y que consiste en:

■ 17.300 kg de agua (WBI)

■ 13.460 kg de almidon modificado (CAPSUL HS)

■ 3,270 kg de sacarosa

45 ■ 0,730 kg de ascorbato de sodio

Se preparo una fase en aceite mezclando durante 35 min en un recipiente de doble pared con un agitador de helice a 82°C y que consiste en:

■ 0,550 kg de aceite BERGABEST MCT 60/40

■ 0,049 kg de calcifediol (HY-D USP)

5 ■ 0,183 kg de DL-a-tocoferol

La fase oleosa se transfirio a la matriz en la unidad de procesamiento FRYMIX y se pre-emulsiono con su molino coloidal interno (60 min, 70°C). La pre-emulsion se hizo circular a traves de un homogeneizador de alta presion (20 min). La emulsion con una viscosidad de 60 mPas a 90 mPas a 70°C se transfirio a traves de la bomba de alta presion a la boquilla de pulverizacion. Como agente de fluidizacion, dioxido de silicio (SIPERNAT 320 DS) se 10 alimento a la torre. Los parametros de pulverizacion y secado se enumeran a continuacion.

Parametro: Pulverizacion Secado

Posicion de entrada de aire: parte superior de la torre parte superior de la torre

Alimentacion de aire de entrada: 1500 m3/h 1400 m3/h

Temperatura del aire de entrada: 170°C desconexion del calentador

Alimentacion de aire de entrada de IFB: 500 m3/h 500 m3/h

Temperatura del aire de entrada de IFB: 65°C 50°C

Posicion de aire de escape: parte inferior de la torre parte inferior de la torre

Reciclaje de polvo fino: a IFB a IFB

Velocidad de alimentacion de emulsion: 50 kg/h alimentacion de emulsion detenida

Posicion de la alimentacion de SiO2: parte superior de la torre alimentacion de SiO2 detenida

Velocidad de alimentacion de acido SiO2: 100 g/h alimentacion de SiO2 detenida

Para cada uno de los tres lotes de 25-OH D3, se obtuvo una media de 8,4 kg de polvo secado por pulverizacion con un contenido de aproximadamente 0,25% de 25-OH D3. Los otros componentes de la formulacion son: 73,2% de almidon alimentario modificado, 17,6% de sacarosa, 4,0% de ascorbato de sodio, 3,0% de trigliceridos de cadena media, 1,0% de dioxido de silicio y 1,0% de DL-a-tocoferol.

15 La formulacion de vitamina D3 secada por pulverizacion se proporciono en forma de un polvo. En resumen, la vitamina D3 y DL-a-tocoferol se disolvieron en un aceite de trigliceridos de cadena media, despues se emulsionaron en una disolucion acuosa de almidon modificado, sacarosa y ascorbato de sodio. La emulsion se atomizo en un secador por pulverizacion en presencia de dioxido de silicio. Se recogio el polvo resultante cuando el contenido de agua (LOD) fue de menos de 4% y se tamizo para separar grandes grumos. Se almaceno en una zona seca por 20 debajo de 15°C y se utilizo en el espacio de 12 meses de su fabricacion.

Ensayo Ctfnico

Sujetos

Mujeres post-menopausicas sanas (50 a 70 anos de edad) fueron reclutadas mediante consentimiento informado y fueron seleccionadas utilizando los siguientes criterios: suero 25-OH D3 entre 20 nmol/L y 50 nmol/L, mdice de masa 25 corporal entre 18 kg/m2y 27 kg/m2, presion arterial, menor que 146/95 mm de Hg, calcio en suero menor que 2,6 nmol/L, glucosa en ayunas inferior a 100 mg/dl, sin ejercicio de alta intensidad, mas de tres veces por semana, ningun tratamiento de la hipertension, ningun uso de altas dosis de vitamina D o complementos de calcio o el metabolismo oseo que afecta a farmacos (p. ej., bifosfonatos, calcitonina, modulador del receptor de estrogeno, terapia de reemplazo de hormonas, hormona paratiroidea), y sin visitar un lugar "soleado" durante el estudio.

30 Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a uno de siete grupos de tratamiento (es decir, diariamente, semanalmente, en bolo como dosis unica, y en bolo como dosis de combinacion). Cada uno de los grupos incluia cinco sujetos. Ello fue seguido por cuatro meses en Zurich, Suiza durante el invierno.

Estudio Ctfnico

El objetivo era estudiar y comparar las caractensticas farmacocineticas de la vitamina D3 y 25-OH D3 administradas 35 a seres humanos. Se investigaron cantidades equimolares de ambas sustancias. El regimen se basa en 20 jgMa (o su equivalente en una base semanal) de 25-OH D3. Dado que la concentracion de lmea de referencia maxima pre- existente de 25-OH D3 sera 50 nmol/L, no se preve que los sujetos se acercaran al intervalo en el que se ha observado una perturbacion en la homeostasis de Ca2+. Para fines comparativos, es necesario administrar cantidades equimolares de vitamina D3 o 25-OH D3. Con respecto a la administracion de la vitamina D3, la dosis se

5

10

15

20

25

30

35

considera que es suficiente para superar la variabilidad de fondo y proporcionar una dosis eficaz para los participantes.

Diario: 120 administraciones 1.25-OH D3 20 jg

2. Vitamina D3 20 jg (800 UI)

Semanal: 16 administraciones

3. 25-OH D3 140 pg

4. Vitamina D3 140 pg (5600 UI)

Bolo: administracion unica

5. 25-OH D3 140 pg

6. Vitamina D3 140 pg (5600 UI)

Bolo: administracion combinada

7. D3 y 25 (OH) D3 140 pg (5600 UI) + 140 pg

Capsulas de gelatina dura, que se envasan en frascos, contienen, por capsula, 20 jg o 140 jg de vitamina D3 o 25- OH D3 secada por pulverizacion. Cada una de las dosificaciones se consume por via oral en el desayuno. La duracion del estudio es de cuatro meses para los grupos "Semanal" y "Diario". Sujetos incluidos en el grupo de "bolo" consumen por via oral una dosificacion unica en la segunda visita de estudio.

Las concentraciones en plasma de 25-OH D3 (p. ej., el pico y el estado estacionario) se determinan mediante la obtencion de muestras de los sujetos en diversos momentos despues de ingerir la dosificacion. Para fines de rastreo y para establecer los valores basales, se obtiene una muestra de sangre antes de la inscripcion en el estudio y el laboratorio clinico mide vitamina D3, 25-OH D3, calcio, creatinina, albumina y glucosa en ayunas en el suero. El lunes de la Semana 1 del estudio, se evaluan a lo largo de 24 horas la farmacocinetica de vitamina D3, 25-OH D3 y vitamina 1,25-dihidroxi D3; marcadores en suero (es decir, la vitamina D3, 25-OH D3, calcio, creatinina, albumina, PTH, GOT, GPT, ALP, trigliceridos, HDL, LDL, colesterol total, bALP y glucosa en ayunas); y los marcadores en orina (es decir, calcio, creatinina, y DPD). Se tomaron muestras diarias durante los dfas restantes de la Semana 1 y lunes de la Semana 2 para evaluar la vitamina D3 en suero y 25-OH D3, los marcadores en suero (p. ej., calcio, creatinina, albumina) y los marcadores en orina (p. ej., calcio, creatinina). Las evaluaciones continuan el lunes de las Semanas 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. El lunes de la Semana 16 se toman muestras para evaluar la farmacocinetica de vitamina en suero D3, 25-OH D3 y vitamina 1,25-dihidroxi D3; marcadores en suero (es decir, vitamina D3, 25-OH D3, calcio, creatinina, albumina, PTH, GOT, GPT, ALP, trigliceridos, HDL, LDL, colesterol total, bALP y glucosa en ayunas); y los marcadores en orina (es decir, calcio, creatinina y DPD).

La resistencia y la funcion muscular se evaluaron mediante los siguientes ensayos de comportamiento estandar: resistencia flexora y extensora de la rodilla, la prueba repetida de postura sentada a postura de pie, y la prueba de levantate y anda (TUG) en la Semana 1 en la visita 2 (lmea de referencia) y al final del estudio en la visita de 15. La resistencia muscular se midio como extensor y flexor de la rodilla en Newton (kilopondios). TUG es una medida de la movilidad funcional, incluyendo la resistencia muscular, velocidad de marcha y el equilibrio y se evalua en segundos. La prueba repetida de postura sentada a postura de pie es una prueba funcional y se mide en segundos.

Resultados:

La Tabla 1 muestra el cambio en la resistencia muscular despues de tratamiento diario y semanal con 25-OH D3 (20 jg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente) o el tratamiento diario o semanal con vitamina D3 (20 jg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente). La duracion del tratamiento fue de 4 meses. Los valores se dan como el cambio despues de 4 meses frente a la lmea de referencia (antes del inicio del tratamiento).

TABLA 1

: Resistencia muscular (Cambio frente a lmea de referencia en Newton)

Vitamina D3 diaria/semanal: 25-OH D3 diaria/semanal

Extension de la rodilla (valor medio): -23,7 13,0

5

10

15

20

25

Extension de la rodilla (mejor valor): -24,8 13,6

Flexion de la rodilla (valor medio): 3,6 7,9

Flexion de la rodilla (mejor valor): 2,4 7,2

La Tabla 2 muestra el cambio relativo en la resistencia muscular despues de tratamiento diario y semanal con 25-OH D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente) en comparacion con el tratamiento diario y semanal con vitamina D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente). La duracion del tratamiento fue de 4 meses. Los valores son medias de mmimos cuadrados de GLM (modelo lineal general) dados como % de mejora ajustado por la resistencia de lmea de referencia, la edad y el mdice de masa corporal de 25-OH D3 frente a vitamina D3.

TABLA 2

: Resistencia muscular (Cambio frente a vitamina D3 diaria/semanal en %)

25-OH D3 diaria/semanal

Extension de la rodilla (valor medio): 17,0

Extension de la rodilla (mejor valor): 17,6

Flexion de la rodilla (valor medio): 3,1

Flexion de la rodilla (mejor valor): 4,7

La Tabla 3 muestra el cambio en la funcion muscular despues de tratamiento diario y semanal con 25-OH D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente) o tratamiento diario y semanal con vitamina D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente). La duracion del tratamiento fue de 4 meses. Los valores se dan como el tiempo (en segundos) que se necesita para completar la tarea despues de 4 meses frente a la lmea de referencia (antes del inicio del tratamiento).

TABLA 3

: Funcion muscular (Cambio frente a lmea de referencia en Segundos)

Vitamina D3 diaria/semanal: 25-OH D3 diaria/semanal

Postura sentada a postura de pie repetida: 0,30 0,63

Levantate y anda: -0,46 0,27

La Tabla 4 muestra el cambio relativo en funcion de los musculos despues de tratamiento diario y semanal con 25- OH D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente) en comparacion con el tratamiento diario y semanal con vitamina D3 (20 pg al dfa; 140 pg a la semana, respectivamente). La duracion del tratamiento fue de 4 meses. Los valores son medias de mmimos cuadrados de GLM (modelo lineal general) dados como % de tiempo necesario para completar la tarea ajustada para la funcion de la lmea de referencia, la edad y el mdice de masa corporal para 25- OH D3 frente a vitamina D3.

TABLA 4

: Resistencia muscular (Cambio frente a vitamina D3 diaria/semanal en %)

25-OH D3 diaria/semanal

Postura sentada a postura de pie repetida: 13,9

Levantate y anda: 8,4

Estos datos demuestran que tratamiento diario o semanal con 25-OH D3 resulta sorprendentemente en mejoras mucho mas fuertes de la resistencia y la funcion muscular en comparacion con el consumo de dosificaciones identicas de vitamina D3. Despues del tratamiento con 25-OH D3, los sujetos eran capaces de realizar extensiones y flexiones de la rodilla mas intensas en comparacion con antes del tratamiento y en comparacion con el tratamiento con vitamina D3. La mejora relativa de la resistencia muscular en los sujetos tratados con 25-OH D3 frente a vitamina D3 fue de entre 3 a 18%, una magnitud del efecto que es clmicamente relevante y representa un beneficio significativo para sujetos de todos los grupos de edad y especialmente para las mujeres post-menopausicas.

La funcion muscular determinada por pruebas de rendimiento estandar (postura sentada a postura de pie repetida, levantate y anda) fue mejor en sujetos tratados con 25-OH D3 en comparacion con el tratamiento con dosificaciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

identicas de vitamina D3. Despues del tratamiento con 25-OH D3, los sujetos tratados completaron las pruebas de rendimiento mas rapidamente en comparacion con antes del tratamiento y en comparacion con el tratamiento con vitamina D3. Mejoras relativas de la funcion muscular despues del tratamiento con 25-OH D3 frente a vitamina D3 fue de entre 8 y 14%, un tamano del efecto que es clmicamente relevante y representa un beneficio significativo para sujetos de todas las edades y especialmente para las mujeres post-menopausicas.

Ademas de ello, un analisis no ajustado a traves de las cuatro pruebas de las extremidades inferiores (extension de la rodilla, flexion de la rodilla, postura sentada a postura de pie repetida, levantate y anda) revelaron que los sujetos tratados con 25-OH D3 tienen una posibilidad 2,8 veces mayor de mantener o mejorar la resistencia y la funcion de las extremidades inferiores en comparacion con sujetos tratados con dosificaciones identicas de vitamina D3. Este efecto es estadfsticamente significativo y clmicamente relevante e indica que 25-OH D3 es adecuada para tratamientos destinados a mantener o mejorar la resistencia y la funcion del musculo esqueletico.

EJEMPLO 2

Datos del chip de genes

El objetivo de este estudio era evaluar los efectos de la vitamina D3, 25-OH D3, y la combinacion de vitamina D3 y 25-OH D3 en un modelo de atrofia del musculo esqueletico utilizando ratones BalbC, en que la suspension por la cola conduce a la atrofia del musculo esqueletico en las extremidades posteriores descargadas de los animales. Inicialmente, este modelo fue establecido en ratas para la simulacion del vuelo espacial en los seres humanos y se utiliza comunmente en otros campos cientfficos para estudiar la perdida de masa del musculo esqueletico o hueso. Los resultados se consideran indicativos de las condiciones humanas tales como sarcopenia (perdida degenerativa de masa del musculo esqueletico y resistencia durante el proceso de envejecimiento) o la inmovilizacion del musculo esqueletico (p. ej., despues de reposo en cama prolongado debido a fracturas, cirugfa o trauma).

Metodos Para el estudio de los autores de la invencion, ratones BalbC hembras de nueve meses de edad se asignaron al azar al comienzo del estudio a cuatro grupos con 10 animales por grupo

1. Grupo control: extremidad posterior descargada (HU)

2. Grupo de vitamina D3: HU + tratamiento con vitamina D3

3. Grupo de 25-OH D3: HU + tratamiento con 25-OH D3

4. Grupo de vitamina D + 25-OH D3: HU + tratamiento con vitamina D3 y 25-OH D3 (combinacion)

Los animales se colocaron en jaulas especiales durante un tiempo de siete dfas; todos los ratones fueron alojados por separado y teman libre acceso al alimento y agua ad libitum. Todos los animales se trataron dos veces por sonda esofagica al comienzo del experimento y 3 horas antes seccionar:

1. El grupo de control recibio vehmulo (gelatina)

2. El grupo D3 recibio vitamina D3 (50 pg/kg/peso corporal),

3. El grupo 25-OH D3 recibio 25-oH d3 (50 pg/kg/peso corporal)

4. El grupo de combinacion recibio vitamina D3 + 25-OH d3 (50 + 50 pg/kg/peso corporal)

Al final del estudio se retiro el musculo gastrocnemio y directamente se congelo en nitrogeno lfquido para su posterior analisis. Para identificar los cambios en la expresion genica y analizar desplazamientos en los niveles de ARNm en el musculo gastrocnemio se utilizaron chips Affymetrix Mouse 430-2 junto con archivos de anotacion version 27 (diciembre de 2008) de Affymetrix para este tipo de chip. El chip contiene "45.000 conjuntos de sonda para analizar el nivel de expresion de mas de 39.000 transcripciones y variantes de mas de 34.000 genes de raton bien caracterizados y racimos UniGene" (Affymetrix, 2009).

El ARN total se aislo utilizando el protocolo Trizol comunmente utilizado. El ARN se cuantifico utilizando el analisis espectrofotometrico. La integridad de muestras de ARN total tambien se evaluo cualitativamente en un bioanalizador Agilent 2100. El ARN se preparo entonces para la smtesis de ADNc de un ciclo. Un control de ARN poli-A se utiliza para esta etapa para proporcionar controles positivos exogenos para controlar todo el proceso de marcaje diana eucariota. Se realiza la smtesis del primer ADNc, y despues de la smtesis de la segunda hebra de ADNc, el ADNc se limpia de cDNA de doble cadena. A continuacion se sintetiza un ARNc marcado con biotina, se limpia y se cuantifica utilizando un espectrofotometro a 260/280 nm. Es importante que la diana de ARNc se fragmente antes de la hibridacion sobre chips de sondas GeneChip para obtener una sensibilidad del ensayo optima. Despues de la fragmentacion, las sondas se hibridan en los chips (chips Affymetrix Mouse 430-2). Los chips se lavan y se tinen en la estacion de fluidos de Affymetrix y se exploran en el escaner de chips de genes. Los datos se transfieren luego desde el escaner para su posterior analisis utilizando el software de Genedata (Expressionist 5.0: Chip Refinador y Analizador). La interpretacion de los datos y el analisis de las vfas se hicieron con la version en lmea del paquete GeneGo MetaCore (V5.2 build 17389).

5

10

15

20

25

30

35

El Chip Refinador evalua los datos de chips para los aspectos de calidad y marca mediciones problematicas. Proporciona un conjunto de algoritmos de normalizacion y metodos de condensacion validados para pre-procesar de forma automatica y resumir los datos en bruto de los chips para su posterior analisis estadfstico.

El analisis de los datos de chips revelo genes (ARNm), que eran expresados diferencialmente entre el grupo HU y los grupos HU mas tratamiento (vitamina D3, 25-OH D3 o combinacion).

Los hallazgos clave de los autores de la invencion son

1. Una combinacion de 25-OH D3 y vitamina D3 cambia mas conjuntos de sondas para genes que

25-OH D3; la cual, a su vez, cambia mas conjuntos de sondas para los genes que la vitamina D3

(Tabla).

a. en comparacion con el grupo de control HU, el grupo que recibio un tratamiento de combinacion (D3 + 25-hidroxivitamina D3) tiene significativamente mas conjuntos de sondas para genes modificados (1745) que el grupo que recibio un tratamiento con solo el 25-OH D3 (1263)

b. en comparacion con el grupo de control HU, el grupo que recibio un tratamiento con 25- OH D3 tiene significativamente mas conjuntos de sondas para genes modificados (1263) que el grupo que recibio un tratamiento con vitamina D3 (385) Error! Fuente de referencia no se encuentra.)

2. Un tratamiento de combinacion de 25-OH D3 + vitamina D3 tiene mas conjuntos de sondas expresados diferencialmente comunes para genes con tratamiento con 25-OH D3 que con tratamiento con vitamina D3.

a. ~61% de los conjuntos de sondas para genes expresados diferencialmente expresados en el grupo de 25-Oh D3 tambien se expresaban diferencialmente en el grupo de 25-OH D3 + vitamina D3 (769 de 1263, Figura 2)

b. ~46% de los conjuntos de sondas para genes expresados diferencialmente expresados en el grupo de vitamina D3 tambien se expresaban diferencialmente en el grupo de 25-OH D3 + vitamina D3 (177 de 385, Figura 3)

c. Un tratamiento de combinacion de 25-OH D3 y vitamina D3 tiene el impacto mas significativo sobre los genes del proceso de desarrollo muscular, tal como se ilustra en las Figuras 4, 6 y 7.

d. Los genes implicados son parte de las siguientes categonas principales en el musculo esqueletico: contraccion muscular, desarrollo muscular y mantenimiento muscular. (Tabla).

3. Para los conjuntos de sondas de genes seleccionados del musculo esqueletico, un tratamiento de combinacion de 25-OH D3 y vitamina D3 muestra expresiones mas altas que los tratamientos solamente con vitamina D3 o solo el 25-OH D3 (Tabla)

Tabla 5: Conjuntos de sondas diferencialmente expresados de genes entre HU y los grupos de tratamiento HU + vitamina D3, 25-OH D3, o combinacion.

Parametro: Conjuntos de sondas para genes expresados diferencialmente

Grupo de extremidad posterior descargada (HU - control): -

Contra HU + vitamina D3: 385

Contra HU + 25-OH D3: 1263

Contra HU + vitamina D3 + 25-OH D3: 1745

Tabla 6: Conjuntos de sondas diferencialmente expresados para los genes del musculo esqueletico seleccionados entre HU y los grupos de tratamiento

Parametro: Genes musculares expresados diferencialmente en comparacion con HU

HU + vitamina D3: desmina; mioneurina; tropomiosina 1, alfa; tropomiosina 2, beta; gen 1 de miopatfa miotubular ligado al cromosoma X

HU + 25-OH D3: desmina; distonina; factor potenciador de miocitos 2A; mioneurina; miosina VIIb; miosina, polipeptido ligero 6, alcali, musculo liso y no musculo; miosina, polipeptido ligero de quinasa; protema 2 relacionada con miotubularina; protema 4 relacionada con miotubularina; protema 6 relacionada con miotubularina; tropomiosina 2, beta; gen 1 de miopatfa miotubular ligado al cromosoma X

HU + vitamina D3 + 25-OH: calsecuestrina 2; desmina; distonina; distrofina, distrofia muscular; factor 2A potenciador de miocitos; factor 2C potenciador de miocitos factor 2D potenciador de miocitos; miomesina 1;

5

10

15

20

25

30

35

D3

mioneurina; miosina X; miosina, polipeptido pesado 6; miosina, polipeptido pesado 8; miosina, polipeptido ligero 6; protema 1 relacionada con miotubularina; protema 2 relacionada con miotubularina; protema 4 relacionada con miotubularina; protema 6 relacionada con miotubularina; nebulin; sarcoglmano, beta; similar a miosina, polipeptido pesado 4; titina; tropomiosina 2, beta; troponina C; troponina I; gen 1 de miopatfa miotubular ligado al cromosoma X_________________

Tabla 7: Patron de expresion para genes seleccionados del musculo esqueletico

: HU Vitamina D3 25-OH D3 25-OH D3 + Vitamina D3

Tropomiosina 1 (Tpm1): 1179 2199 2110 2456

Miosina, quinasa de cadena ligera (Mylk): 749 786 994 1022

Miomesina 1 (Miom 1): 84697 99099 105393 114398

Titina (Tnt): 11353 11354 13786 15647

DISCUSION CON RESPECTO A GENES ESPECIFICOS SELECCIONADOS

Durante un periodo de la vida, los musculos esqueleticos se adaptan permanentemente a diferentes estfmulos, tales como el ejercicio y el entrenamiento ffsico, pero tambien a la inmovilizacion. El musculo esqueletico responde con hipertrofia o atrofia. El desarrollo y la adaptacion del musculo esqueletico es un proceso complejo. Brevemente, las celulas satelite - las denominadas celulas madre del musculo esqueletico - reciben estfmulos y forman mioblastos indiferenciados que se someten a la fusion para formar miotubos - nuevas fibras musculares.

Para los movimientos y la adaptacion del musculo esqueletico, la contraccion es importante. La contraccion del musculo esqueletico es un deslizamiento mutuo de las dos principales fibras del musculo esqueletico miosina (filamentos gruesos) y actina (filamentos finos) que se organizan en sarcomeros. Dan a los musculos esqueleticos su aspecto estriado transversal en el microscopio.

Ademas de filamentos finos y gruesos, el musculo esqueletico se compone de titina y nebulina y protemas tambien sarcomericas tales como tropomiosina. La funcion del musculo esqueletico depende de una alineacion precisa de los filamentos de actina y miosina y las protemas accesorias tales como a-actinina, miomesina, protema M, titina, desmina y protemas de union a miosina.

Se ha sugerido que miomesina y protema M pueden conectar sistemas de filamentos de titina y de miosina y que miomesina juega un papel en la integracion de los filamentos gruesos en sarcomeros de ensamblaje. La titina, que es una protema enorme, forma un sistema de filamentos continuo en miofibrillas. La protema de filamentos intermedios predominante del musculo estriado es desmina, y contribuye a mantener la integridad y la alineacion de las miofibrillas.

Las mutaciones en varios componentes de la protema (p. ej., cadena pesada de miosina, actina, tropomiosina, etc.) y tambien protemas sarcomeras (p. ej., titina, desmina, etc.) se asocian con enfermedades musculares/miopatias.

Tropomiosina 1, alfa (Tpm1):

Tal como se establece en WIKIPEDIA,

"Tropomiosina es una protema de union a actina que regula la mecanica de actina. Es importante, entre otras cosas, para la contraccion muscular. Tropomiosina, junto con el complejo de troponina, se asocia con actina en las fibras musculares y regula la contraccion muscular mediante la regulacion de la union de miosina. En reposo muscular, tropomiosina recubre los sitios en la actina de union a miosina y esta "bloqueada" en esta posicion por parte de troponina T (troponina de union a tropomiosina) y troponina I (troponina inhibidora). Despues de la liberacion de calcio del retmulo sarcoplasmico, el calcio se une a troponina C (troponina de union a calcio). Este "desbloquea" la tropomiosina de actina, permitiendo que se aleje de la ranura de union. Las cabezas de miosina pueden ahora acceder a los sitios de union en la actina. Una vez que se une una cabeza de miosina, esta desplaza totalmente tropomiosina y permite que las cabezas de miosina adicionales se unan, iniciando un acortamiento del musculo y la contraccion. Una vez que el calcio es bombeado fuera del citoplasma y los niveles de calcio vuelven a la normalidad, la tropomiosina se une de nuevo a la actina, evitando la union de miosina".

10

15

20

25

30

35

Tropomiosina 1 alfa es un gen que se requiere para el desarrollo y la funcion muscular (p. ej., la contraccion muscular). En general los tropomiosinas espedficas para los musculos regulan interacciones actina-miosina y, por lo tanto, la contraccion. La protema codificada es un tipo de cadena alfa helicoidal que forma la tropomiosina predominante de musculo estriado, en donde tambien funciona en asociacion con el complejo de troponina para regular la interaccion dependiente de calcio de la actina y la miosina durante la contraccion muscular. (NCBI)

Patron de expresion (Tpm1):

HU HU + VitD3 HU + 25-hidroxivitamina D3 HU + VitD3 + 25-hidroxivitamina D 3 1179 2199 2110 2456

Ejemplo del grupo tratado con 25-hidroxivitamina D3:

Miosina, quinasa de cadena ligera (MYLK):

Wikipedia:

"Mylk es un gen humano. Este gen, un miembro de musculo de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, codifica la cadena quinasa ligera de la miosina que es una enzima dependiente de calcio/calmodulina. Esta quinasa fosforila cadenas ligeras reguladora de la miosina para facilitar la interaccion de miosina con los filamentos de actina para producir una actividad contractil. Este gen codifica isoformas tanto del musculo liso como no musculares. Ademas, el uso de un promotor separado en un intron en la region 3', codifica telokina, una pequena protema identica en la secuencia al extremo C de la cadena de quinasa ligera de la miosina que se expresa de forma independiente en el musculo liso y funciona para estabilizar filamentos de miosina no fosforilados. Un pseudogen esta localizado en el brazo p del cromosoma 3. Se han identificado cuatro variantes de transcripcion que producen cuatro isoformas de la enzima dependiente de calcio/calmodulina, asf como dos transcripciones que producen dos isoformas de telokina. Se han identificado variantes adicionales, pero carecen de transcripciones de longitud completa".

Patron de expresion (MYLK):

HU HU + VitD3 HU + 25-hidroxivitamina D3 HU + VitD3 + 25-hidroxivitamina D 3 749 786 994 1022

Ejemplo del grupo tratado con vitamina D3 + 25-hidroxivitamina D3:

Wikipedia:

Miomesina es una protema de lmea extrema que forma parte de la lmea M. Une los filamentos gruesos de miosina en la lmea M.

Patron de expresion (Miomesina 1 - Miom1):

HU HU + VitD3 HU + 25-hidroxivitamina D3 HU + VitD3 + 25-hidroxivitamina D 3 84697 99099 105393 114398

Wikipedia:

"Titina, tambien conocida como conectina, es una protema que es importante en la contraccion de los tejidos musculares estriadas. Titina es una protema grande abundante del musculo estriado. La protema se divide en dos regiones:

Banda I N-terminal - es la parte elastica de la molecula, contiene dos regiones de dominios de inmunoglobulina en tandem a cada lado de una region PEVK que es rica en prolina, glutamato, valina y lisina

Banda A C-terminal - se piensa que actua como un controlador de protemas, contiene una mezcla de repeticiones de inmunoglobulina y fibronectina, y posee actividad de quinasa. Una region de disco Z N- terminal y una region de lmea de M C-terminal se unen a la lmea Z y la lmea M del sarcomero respectivamente, de modo que una sola molecula de titina se extiende por la mitad de la longitud de un

5

10

15

20

25

30

35

40

sarcomero. Titina tambien contiene sitios de union para las protemas asociadas al musculo, por lo que sirve como un molde de adhesion para el ensamblaje de la maquinaria contractil de las celulas musculares. Tambien se ha identificado como una protema estructural de cromosomas. Existe una variabilidad considerable en la banda I, la lmea M y las regiones de disco Z de la titina. La variabilidad en la region de la banda I contribuye en las diferencias en la elasticidad de diferentes isoformas de titina y, por lo tanto, en las diferencias en la elasticidad de los diferentes tipos de musculos. De las muchas variantes de titina identificadas, se describen cinco para las cuales esta disponible una informacion completa de la transcripcion".

La titina interactua con muchas protemas sarcomericas incluyendo: region de la lmea Z: teletonina y alfa-actinina region de la banda I: calpama-3 y obscurina

region de la lmea M: protema de union a miosina C, calmodulina 1, CAPN3 y MURF1 Patron de expresion (titina - Tnt):

HU HU + VitD3 HU + 25-hidroxivitamina D3 HU + VitD3 + 25-hidroxivitamina D 3 1135311354 13786 15647

Ejemplo 3 Modelo de Raton

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de 25-OH D3 en un modelo de hipertrofia muscular y en una prueba de la capacidad de ejercicio de resistencia en ratones C57BL/6J. Se reconoce en la tecnica que la separacion del musculo gastrocnemio induce la hipertrofia compensatoria en los musculos soleo y plantar por multiples mecanismos que conducen a la mejora de la resistencia muscular y potencia de las patas.

Dos grupos de 10 animales fueron anestesiados y se fijo la extremidad posterior izquierda de los animales. Todos los animales recibieron un analgesico. Se practico una pequena incision a traves de la piel sobre el musculo gastrocnemio. El musculo gastrocnemio completo y los tendones quedaron expuestos. Las dos cabezas del musculo gastrocnemio se diseccionaron cuidadosamente de los musculos subyacentes intactos y se tuvo cuidado de no romper los nervios ni los vasos. La piel se cerro con una sutura de seda, y los animales fueron devueltos a las jaulas. Despues de recuperarse de la anestesia, los animales podfan moverse directamente y sin problemas en sus jaulas. Los animales fueron tratados durante tres semanas mediante sonda esofagica con 25-OH D3 a una dosificacion diaria de 50 pg/kg y el grupo control recibio vehmulo. Al final del estudio se testo la capacidad de ejercicio de resistencia de todos los animales en una cinta de roedores.

El peso en humedo de los musculos soleo y plantar aumento en los animales tratados con 25-OH D3 en comparacion con los animales control (Tabla 8). Ademas, cuando los pesos de los musculos se normalizaron a los pesos corporales de los ratones en comparacion con el peso corporal, los animales tratados con 25-OH D3 demostraron un aumento de la relacion peso del musculo soleo-plantar/peso corporal (Tabla 8). Mediciones de la tomograffa computarizada de la zona del musculo y total de la pata confirmaron que el tratamiento con 25-OH D3 aumenta la masa esqueletica (Tabla 8). Los animales que recibieron 25-OH D3 mostraron una mayor capacidad de ejercicio de resistencia en comparacion con los ratones control, demostrada por una mayor distancia recorrida y tiempo de marcha (Tabla 8).

La Tabla 8 muestra los pesos del musculo, las relaciones peso muscular/peso corporal, las areas en seccion transversal totales de patas y musculos, la distancia recorrida y el tiempo de marcha de ratones tratados con 25-OH D3 a una dosificacion de 50 pg/kg/dfa o placebo (control) durante 3 semanas.

TABLA 8

Parametros: Control (n = 10) 25-OH D3 (n = 10)

Soleo peso humedo (mg): 5,25 6,37

Plantar peso humedo (mg): 31,68 33,24

Musculo soleo-plantar / peso corporal (mg/g): 1,82 1,94

Area en seccion transversal total de la pata (mm2): 22,78 24,04

Area en seccion transversal del musculo(mm2): 19,90 20,98

Distancia recorrida (m): 986,0 1078,4

Tiempo de marcha (min): 37,6 41,0

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de 25-hidroxivitamina D3 ("25-OH D3") y vitamina D en la fabricacion de un producto farmaceutico, producto nutraceutico, complemento alimentario o composicion alimentaria para mantener o prevenir la perdida de la funcion muscular o la resistencia muscular en un ser humano, en que el ser humano es una persona de edad, una persona

5 que padece inmovilidad cronica independientemente de la edad, o una persona con deficiencia o insuficiencia de vitamina D.
2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la 25-OH D3 y vitamina D estan presentes en unidades de dosificacion separadas.
3. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde la 25-OH D3 y vitamina D se utilizan una vez al dfa, una vez 10 a la semana o una vez al mes.
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el uso es para al menos un mes, preferiblemente para mas de dos meses y mas preferiblemente para al menos cuatro meses.
5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la relacion de vitamina D a 25-OH-D3 es de 6:1 a 1:6.