EA017305B1

EA017305B1 - Новые аспарагиназы и их применение

Info

Publication number: EA017305B1
Application number: EA200901432A
Authority: EA
Inventors: ВАН ДЕР Ян Метске ЛААН; Марк Кристиаан Стор; Де Илсе Ланге; Лисетте Морман
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2012-11-30
Also published as: CL2008001128A1; AU2008240797A1; US20130023029A1; US20100136169A1; WO2008128975A1; JP2010524448A; EP2137306B1; US8323948B2; IL201018A0; ES2550362T3; EP2137306A1; BRPI0810481B1; DK2137306T3; CA2682677A1; EA200901432A1; BRPI0810481A2; US20120045549A1; AR066410A1; CL2008001129A1; MX2009011256A

Abstract

Изобретение касается аспарагиназы, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5 единицы рН. Изобретение также касается недавно идентифицированных полипептидов аспарагиназы согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 и их вариантов, а также последовательностей полинуклеотидов, кодирующих эти новые варианты аспарагиназы. Кроме того, изобретение касается применения этих новых вариантов аспарагиназы в промышленных процессах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается недавно идентифицированных вариантов полипептида аспарагиназы и последовательностей полинуклеотидов, содержащих гены, кодирующие эти новые аспарагиназы. В изобретении приведена аминокислотная последовательность полноразмерного функционального белка и функциональные эквиваленты гена или аминокислотной последовательности. Изобретение также касается способов применения этих вариантов белка в промышленных процессах. Также охвачены изобретением клетки, трансформированные полинуклеотидом по изобретению, пригодным для получения этих белков и клеток, причем белок согласно изобретению генетически модифицирован для повышения или снижения активности и/или уровня экспрессии. Изобретение также касается способов применения этих белков в промышленных процессах.

Уровень техники

Недавно сообщали о появлении акриламида во многих пищевых продуктах при нагревании (Тагеке с1 а1., Сйеш. Век. Τοχίοοί. 13, 517-522 (2000)). Поскольку акриламид считается возможным канцерогеном для животных и человека, эти данные вызвали озабоченность во всем мире. Дальнейшие исследования показали, что значительные количества акриламида обнаруживаются в целом ряде распространенных продуктов при выпекании, жарке и приготовлении в печи, и было показано, что наличие акриламида в продуктах является результатом процесса нагревания.

В работе Мойгат е1 а1., ИаШге 419: 448 (2002) было предположено, что акриламид образуется из аминокислот и восстанавливающих сахаров в результате реакции Майяра (МаШагй). Согласно этой гипотезе, акриламид может образоваться при реакции Майяра. За цвет, запах и вкус при выпекании и поджаривании главным образом ответственна реакция Майяра. На пути, ведущему к акриламиду, с реакцией Майяра связано и расщепление аминокислот по Штреккеру (81гескег). Образование акриламида становилось заметным при повышении температуры выше 120°С, а максимальная скорость его образования наблюдалась примерно при 170°С. Максимальный уровень акриламида наблюдался в присутствии аспарагина и глюкозы, тогда как глутамин и аспарагиновая кислота давали только следовые количества.

Действующий в ЕС предел для переноса акриламида в продукты из контактирующих с ними пластиков составляет 10 ррЬ (10 мкг на 1 кг). Хотя пока еще не установлен предел для акриламида, образующегося при приготовлении пищи, однако тот факт, что многие продукты превышают эту величину, особенно блюда из круп, хлебопродукты и продукты из картофеля или кукурузы, вызывает озабоченность.

Известно, что некоторые растительные материалы содержат значительное количество аспарагина. В картофеле аспарагин является преобладающей свободной аминокислотой (940 мг/кг, что соответствует 40% от общего содержания аминокислот), а в пшеничной муке содержание аспарагина составляет около 167 мг/кг, что соответствует 14% от общего содержания свободных аминокислот (Ве111х аий Сгоксй ίη Еоой СЕетМгу -8ргшдег Иете Уогк, 1999). То, что акриламид в основном образуется из аспарагина (вместе с восстанавливающими сахарами), может объяснить высокий уровень акриламида в жареных, запеченных или поджаренных растительных продуктах. Следовательно, в интересах здоровья населения существует настоятельная потребность в том, чтобы пищевые продукты содержали существенно меньше акриламида, а предпочтительно его совсем не содержали.

Предлагались различные способы снижения содержания акриламида как путем изменения параметров обработки, например температуры или продолжительности нагревания, так и путем химического или энзиматического предотвращения образования акриламида, либо путем удаления образовавшегося акриламида.

В некоторых патентных заявках изложено применение аспарагиназы для снижения содержания аспарагина и тем самым количества образующегося акриламида. Подходящие для этой цели аспарагиназы были получены из некоторых грибков, например из АкрегдШик шдег в №О 2004/030468 и АкрегдШик огухае в №О 04/032648.

Хотя все Ь-аспарагиназы катализируют одно и то же химическое превращение, но это не значит, что все они подходят для одинакового применения. При различных применениях будут разные требования к условиям, в которых ферментам придется работать. Физические и химические параметры, которые могут повлиять на скорость энзиматического превращения, - это температура (которая оказывает положительный эффект на скорость химической реакции, но может оказывать отрицательный эффект на стабильность фермента), влагосодержание, рН, концентрация солей, структурная целостность пищевого матрикса, присутствие активаторов или ингибиторов фермента, концентрация субстрата и продуктов реакции и др.

Таким образом, все еще существует потребность в улучшении аспарагиназ для некоторых применений с улучшенными свойствами.

Цель изобретения

Целью изобретения является получение новых вариантов полипептидов аспарагиназы и полинуклеотидов, кодирующих эти варианты. Другой целью является получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих такие варианты. Составной частью изобретения являются и слитые полипептиды, а также способы получения и применения полинуклеотидов и полипептидов по изобретению.

- 1 017305

Сущность изобретения

Изобретением предусмотрены новые варианты полипептидов, обладающих аспарагиназной активностью. В частности, изобретением предусматривается вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 8Е0 Ш N0: 4, а также другие варианты, по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них. Как правило, такие дополнительные варианты по изобретению будут функциональными эквивалентами полипептида по 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4. Термин функциональный эквивалент в настоящем изобретении предполагает, что полипептиды такого функционального эквивалента, по крайней мере, должны обладать аспарагиназной активностью.

Настоящим изобретением также предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В контексте настоящего изобретения ширина рН-профиля активности означает тот диапазон рН (выраженный в единицах рН), в котором фермент проявляет от 50 до 100% максимальной активности. Ширина рН-профиля активности фермента вычисляется, как указано в примерах. Аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5 единицы рН, может быть выделена из природных источников, либо она может быть искусственным ферментом аспарагиназы. В предпочтительном воплощении аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН, представляет собой вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 Ш N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4, а также другие варианты по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них.

В одном воплощении изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью, приведенной в 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4, либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них.

В другом воплощении изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4, либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них.

Кроме того, изобретением предусмотрены новые полинуклеотиды, кодирующие новые варианты полипептидов по изобретению.

Кроме того, изобретением предусмотрена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН.

Изобретение также касается векторов, содержащих последовательность полинуклеотида по изобретению, и праймеров, зондов и фрагментов, которые могут использоваться для амплификации или детектирования такого полинуклеотида по изобретению.

В следующем предпочтительном воплощении предусмотрен вектор, у которого последовательность полинуклеотида по изобретению функционально соединяется по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, пригодной для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в подходящих клетках хозяина, как то, нитчатого грибка, к примеру ЛкретдШик. Изобретением также предусмотрен способ получения полинуклеотидов и векторов по изобретению.

Изобретение также касается полученных рекомбинантным способом клеток хозяина, содержащих варианты (гетерологических) полинуклеотидов по изобретению.

В следующем воплощении изобретения предусмотрены рекомбинантные клетки хозяина, у которых значительно повышена экспрессия варианта аспарагиназы по изобретению либо повышена активность продуцируемой аспарагиназы.

В следующем воплощении изобретения предусмотрены полученные рекомбинантным способом клетки хозяина, содержащие полинуклеотид по изобретению, вследствие чего эти клетки способны продуцировать функциональный вариант аспарагиназы по изобретению, предпочтительно они способны суперэкспрессировать функциональный вариант аспарагиназы по изобретению, например клетки штамма ЛкретдШик шдет, содержащие полинуклеотид по изобретению.

В следующем аспекте изобретения предусмотрен очищенный вариант полипептида. К полипептидам по изобретению относятся полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по изобретению. Особенно предпочтительным является вариант полипептида согласно 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4 либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них.

В рамки изобретения также входят слитые белки, содержащие полипептид по изобретению.

Изобретением также предусмотрены способы получения вариантов полипептидов по изобретению.

Изобретение также касается применения вариантов аспарагиназы по изобретению в промышленных процессах, как описано в изобретении.

Краткое описание чертежа

На чертеже представлено сопоставление 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 4 с последовательностью аспарагиназы дикого типа (\\1) А. шдет, приведенной в 8Е0 ΙΌ N0: 3 из \¥0 2004/030468.

- 2 017305

Осуществление изобретения

По всему настоящему описанию и прилагаемой формуле изобретения слова содержать и включать и их варианты, как то, содержит, содержащий, включает и включающий следует понимать включительно. А именно, эти слова предполагают возможность включения и других элементов или чисел, не указанных специально, если контекст это позволяет.

Настоящее изобретение касается вариантов аспарагиназы, имеющих последовательность, приведенную в 8Е6 ΙΌ N0: 2 или 8Е6 ΙΌ N0: 4, а также других вариантов.

Ниже приводятся особенности последовательностей обоих полипептидов.

Последовательность 8Е6 ΙΌ N0: 2 включает следующие замены по сравнению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из АкрегдШик шдег, которая приведена в \У0 2004/030468: Т25А, Е28Т, Ε30Υ, А358, Е53Ь, Ό638, 864А, 865Ό, 866Ν, 874А, У771, У791, Ь80р, 881Т, 888Е, Е106Р, Ι108ν, Ό1118, Н14Ь, 8117А, К119Т, В122Е, Ε126Ό, А1318, Ι161ν, 8168А, Е181р, Т189Р, 8190А, М197Ь, А205У, Υ208Ε, ν2^ Т2118, Μ224ν, Υ228Ν, Е231А, Μ232Ι, Ι233ν, Т236К, Ε238Υ, Ε240Υ, ν250Τ, А251Т, Ε252ν, Ι254ν, Т255В, Е2598, Ε267Υ, Е270Р, Η273Ρ, N2798, 8282Ό, 8283Ν, 6286К. А2938, 62978, Τ2998, 83016, N3038, Ε304Ό, Ε307Ό, ν309Ι, 610А, N3118, В312К, Ь313Н, Е3148, ν317Ι, Р319Б, Μ321Τ, ν3246, Б330Т, Υ345Ε, 8351А, 8360А, Р361Е, N3646, Ι365Ε, Т366К, А369В, Ό370Ε, Ь374К, 6375ν и Ό377ν.

Последовательность аспарагиназы дикого типа, полученной из А. шдег, которая приведена в \У0 2004/030468, приводится в ней как 8Е6 ΙΌ N0: 3 (аминокислотная последовательность). Аспарагиназа, приведенная в 8Е6 ΙΌ N0: 2 настоящей заявки, условно названа А8^01.

Вариант последовательности, приведенной в 8Е6 ΙΌ N0: 2, к примеру функциональный эквивалент, может содержать одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТЬг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Аки в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, 61п в положении 80, ТЬг в положении 81, 61и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, 61и в положении 122, Акр в положении 126, 8ег в положении 131, Vа1 в положении 161, А1а в положении 168, 61п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Vа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Vа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Vа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Vа1 в положении 252, Vа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, 61п в положении 270, 61п в положении 273, 8ег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 61у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, 61у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, 61и в положении 361, 61у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, 61и в положении 370, Ьук в положении 374, Vа1 в положении 375 и Vа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8Е6 ΙΌ N0: 2.

Иными словами, при совмещении варианта последовательности, приведенной в 8Е6 ΙΌ N0: 2, с последовательностью, приведенной в 8Е6 ΙΌ N0: 2, этот вариант может содержать одну или несколько замен из числа:

А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 25 в 8Е6 ΙΌ N0: 2;

ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 28 в 8Е6 ΙΌ N0: 2;

Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 30 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 35 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 53 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 63 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 64 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 65 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Акп в положении (у варианта), соответствующем положению 66 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 74 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 77 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 79 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; 61п в положении (у варианта), соответствующем положению 80 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 81 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; 61и в положении (у варианта), соответствующем положению 88 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 106 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; Vа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 108 в 8Е6 ΙΌ N0: 2; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 111 в 8Е6 ΙΌ N0: 2;

- 3 017305

Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 114 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 117 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 119 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 122 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 126 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 131 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 161 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 168 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 181 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 189 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 190 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 197 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 205 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; РНе в положении (у варианта), соответствующем положению 208 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 210 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 211 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 224 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Аки в положении (у варианта), соответствующем положению 228 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 231 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 232 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 233 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Бук в положении (у варианта), соответствующем положению 236 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 238 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 240 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 250 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 251 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 252 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 254 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Агд в положении (у варианта), соответствующем положению 255 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 259 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 267 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 270 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 273 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 279 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 282 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Акп в положении (у варианта), соответствующем положению 283 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Ьук в положении (у варианта), соответствующем положению 286 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 293 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 297 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 299 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 301 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 303 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;

Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 304 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 307 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 309 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 310 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 311 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 312 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Н1к в положении (у варианта), соответствующем положению 313 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; 8ет в положении (у варианта), соответствующем положению 314 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 317 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;

Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 319 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; ТНг в положении (у варианта), соответствующем положению 321 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 324 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 330 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; РНе в положении (у варианта), соответствующем положению 345 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 351 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 360 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 361 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 364 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; РНе в положении (у варианта), соответствующем положению 365 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; Ьук в положении (у варианта), соответствующем положению 366 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2;

- 4 017305

Агд в положении (у варианта), соответствующем положению 369 в 8ЕЦ Ш N0: 2;

С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 370 в 8ЕЦ Ш N0: 2;

Ьук в положении (у варианта), соответствующем положению 374 в 8ЕЦ Ш N0: 2;

Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 375 в 8ЕЦ Ш N0: 2 и

Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 377 в 8ЕЦ Ш N0: 2.

Вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, либо все из следующих аминокислот: А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, §ет в положении 35, Ьей в положении 53, §ет в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Аки в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1и в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, §ет в положении 111, Ьей в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, §ет в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1и в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьей в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, §ет в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, §ет в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, §ет в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, §ет в положении 293, §ет в положении 297, §ет в положении 299, С1у в положении 301, §ет в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, §ет в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, §ет в положении 314, 11е в положении 317, Ьей в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РНе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ Ш N0: 2.

Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать любую комбинацию из двух или нескольких аминокислот из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, §ет в положении 35, Ьей в положении 53, §ет в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, §ет в положении 111, Ьей в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, §ет в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьей в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, §ет в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, §ет в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, §ет в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, §ет в положении 293, §ет в положении 297, §ет в положении 299, С1у в положении 301, §ет в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, §ет в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, §ет в положении 314, 11е в положении 317, Ьей в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РНе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ Ш N0: 2.

Предпочтительно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать все аминокислоты из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, §ет в положении 35, Ьей в положении 53, §ет в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, §ет в положении 111, Ьей в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, §ет в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьей в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, §ет в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, §ет в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, §ет в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, §ет в положении 293, §ет в положении 297, §ет в положении 299, С1у в положении 301, §ет в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, §ет в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в поло

- 5 017305 жении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Ьеи в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РНе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.

Те положения у варианта полипептида аспарагиназы по изобретению, которые соответствуют положениям 25, 28, 30, 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254, 255, 259, 267, 270, 273, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366, 369, 370, 374, 375 и 377, могут быть идентифицированы путем совмещения последовательности варианта полипептида с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, например, методом САР-совмещения с наиболее гомологичной последовательностью, обнаруженной программой САР (подробно об этой программе см. ниже). При этом можно идентифицировать те положения у варианта, которые соответствуют положениям 25, 28, 30, 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254, 255, 259, 267, 270, 273, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366, 369, 370, 374, 375 и 377 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 и именуются положениями, определенными по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 2.

Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 содержит следующие замены по сравнению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из АкретдШик шдет, которая приведена в \У0 2004/030468: А358, Е53Ь, Ό638, 864А, 865Ό, 866Ы, 874А, ν77Ι, ν79Ι, Ь80р, 881Т, 888Е, Е106Р, П08У, Ό1118, П14Ь, 8117А, К119Т, Н122Е, Е126Э, П61У, 8168А, Е181р, Т189Р, 8190А, М197Ь, А205У, Υ208Ε, Т2118, М224У, Υ228Κ, Е231А, Μ232Ι, Ι233ν, Т236К, Ε238Υ, У250Т, А251Т, Ι254ν, Т255Н, Е2598, Ε267Υ, Е270С). N2790, 8282Ό, 8283^ 0286К. А2938, С2978, Т2998, Т3008, 8301С, N3038, Е304Э, У309С N3118, Н312Т, Ь313Н, Е3148, У3Ш, М321Т, У324С, Ь330Р, У333Е, Н340Р, Υ345Ε, 8360А, Х.У4С1. Т366Е, А369Н, Э370Е, Ь374К, С375У, Т376С и Э377У.

Кроме того, последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 содержит делецию 4 аминокислот в сравнении с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из АкретдШик шдет, которая приведена в \У0 2004/030468, т.е. приведенная в настоящей заявке 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 не содержит аминокислот, соответствующих Ό336, Т337, А338 и Т339 в последовательности аспарагиназы дикого типа, полученной из АкретдШик шдет, которая приведена в \У0 2004/030468 и именуется в ней как 8ЕЦ ГО N0: 3 (аминокислотная последовательность). Аспарагиназа, приведенная в 8ЕЦ ГО N0: 4 настоящей заявки, условно названа А8М)02.

Вариант последовательности, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 4, к примеру функциональный эквивалент, может содержать одну или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Аки в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, ТНг в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РНе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ГО N0: 4.

Иными словами, при совмещении варианта последовательности, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 4, с последовательностью, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 4, этот вариант может содержать одну или несколько аминокислот из числа

8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 35 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 53 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 63 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 64 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 65 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

Акп в положении (у варианта), соответствующем положению 66 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 74 в 8ЕЦ ГО N0: 4;

- 6 017305

11е в положении (у варианта), соответствующем положению 77 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 11е в положении (у варианта), соответствующем положению 79 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1п в положении (у варианта), соответствующем положению 80 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 81 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 88 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 106 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 108 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 111 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 114 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 117 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 119 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 122 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 126 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 161 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 168 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1п в положении (у варианта), соответствующем положению 181 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 189 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 190 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Ьеи в положении (у варианта), соответствующем положению 197 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 205 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; РЬе в положении (у варианта), соответствующем положению 208 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 211 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 224 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акп в положении (у варианта), соответствующем положению 228 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 231 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 232 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 233 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Ьук в положении (у варианта), соответствующем положению 236 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 238 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 250 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 251 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 254 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Агд в положении (у варианта), соответствующем положению 255 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 259 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Туг в положении (у варианта), соответствующем положению 267 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1п в положении (у варианта), соответствующем положению 270 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 279 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 282 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акп в положении (у варианта), соответствующем положению 283 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Ьук в положении (у варианта), соответствующем положению 286 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 293 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 297 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 299 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 300 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 301 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 303 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Акр в положении (у варианта), соответствующем положению 304 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 309 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 311 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 312 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Н1к в положении (у варианта), соответствующем положению 313 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; 8ег в положении (у варианта), соответствующем положению 314 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Не в положении (у варианта), соответствующем положению 317 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; ТЬг в положении (у варианта), соответствующем положению 321 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 324 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; Рго в положении (у варианта), соответствующем положению 330 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 333 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1п в положении (у варианта), соответствующем положению 336 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; РЬе в положении (у варианта), соответствующем положению 341 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; А1а в положении (у варианта), соответствующем положению 356 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 360 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4; С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 362 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4;

- 7 017305

Агд в положении (у варианта), соответствующем положению 365 в 8ЕС Ш N0: 4;

С1и в положении (у варианта), соответствующем положению 366 в 8ЕС Ш N0: 4;

Ьуз в положении (у варианта), соответствующем положению 370 в 8ЕС Ш N0: 4;

Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 371 в 8ЕС Ш N0: 4;

С1у в положении (у варианта), соответствующем положению 372 в 8ЕС Ш N0: 4 и

Уа1 в положении (у варианта), соответствующем положению 373 в 8ЕС Ш N0: 4.

Вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70 либо все из следующих аминокислот: 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Азр в положении 65, Азп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, Т1г в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, Т1г в положении 119, С1и в положении 122, Азр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, Р1е в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Азп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьуз в положении 236, Туг в положении 238, Т1г в положении 250, Т1г в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Азр в положении 279, Азр в положении 282, Азп в положении 283, Ьуз в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Азр в положении 304, 11е в положении 309, 8ег в положении 311, Т1г в положении 312, Нтз в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Т1г в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, Р1е в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьуз в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС Ш N0: 4.

Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать любую комбинацию из двух или нескольких аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Азр в положении 65, Азп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, Т1г в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, Т1п в положении 119, С1и в положении 122, Азр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, Р1е в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Азп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьуз в положении 236, Туг в положении 238, Т1п в положении 250, Т1г в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Азр в положении 279, Азр в положении 282, Азп в положении 283, Ьуз в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Азр в положении 304, 11е в положении 309, 8ег в положении 311, Т1г в положении 312, Н1з в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Т1п в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, Р1е в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьуз в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС Ш N0: 4.

Предпочтительно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать все аминокислоты из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Азр в положении 65, Азп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, Т1г в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, Т1г в положении 119, С1и в положении 122, Азр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, Р1е в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Азп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьуз в положении 236, Туг в положении 238, Т1г в положении 250, Т1г в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Азр в положении 279, Азр в положении 282, Азп в положении 283, Ьуз в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Азр в положении 304, 11е в положении 309, 8ег в положении 311, Т1г в положении 312, Нйз в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Т1г в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, Р1е в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьуз в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС Ш N0: 4.

- 8 017305

Те положения у варианта полипептида аспарагиназы по изобретению, которые соответствуют положениям 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356, 360, 362, 365, 366, 370, 371, 372 и 373, могут быть идентифицированы путем совмещения последовательности варианта полипептида с последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 4, например, методом САР-совмещения с наиболее гомологичной последовательностью, обнаруженной программой САР (подробно об этой программе см. ниже). При этом можно идентифицировать те положения у варианта, которые соответствуют положениям 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356, 360, 362, 365, 366, 370, 371, 372 и 373 в 8ЕС ΙΌ N0: 4 и именуются положениями, определенными по отношению к 8ЕС ΙΌ N0: 4.

Кроме того, вариант полипептида аспарагиназы по изобретению, как правило, не должен содержать одну или несколько, к примеру 2, 3, или все аминокислоты, соответствующие Азр 336, ТЬг 337, А1а 338 и Т1п 339 в последовательности аспарагиназы дикого типа, полученной из АзрегдШиз шдег, которая приведена в \У0 2004/030468. Это значит, что при совмещении варианта полипептида аспарагиназы по изобретению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из АзрегдШиз пфег. которая приведена в \У0 2004/030468, она, как правило, не должна содержать одну или несколько аминокислот, соответствующих тем, что находятся в положениях 336, 337, 338 и 339 последовательности дикого типа А. шдег.

В другом воплощении изобретения также предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рНпрофиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении аспарагиназа с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН, представляет собой вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4, а также другие варианты, по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них.

Полинуклеотиды.

Как изложено выше, настоящим изобретением предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие варианты аспарагиназы, имеющие аминокислотные последовательности согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2 (условно названной А8М)01) или 8ЕС ΙΌ N0: 4 (условно названной А8Н002), а также другие варианты, как то, функциональные эквиваленты. Таким образом, изобретением предусмотрены полинуклеотиды согласно 8ЕС ΙΌ N0: 1 или 8ЕС ΙΌ N0: 3 и другие варианты полинуклеотидов.

Для ясности отметим, что 8ЕС ΙΌ N0: 1 означает последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2; а 8ЕС ΙΌ N0: 3 означает последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно 8ЕС ΙΌ N0: 4.

Изобретением предусмотрены последовательности полинуклеотидов, содержащих ген, кодирующий аспарагиназу по изобретению, а также его кодирующую последовательность. Соответственно изобретение касается последовательности нуклеиновой кислоты, включающей:

a) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4;

b) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу, которая по меньшей мере на 85% гомологична полипептиду согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4;

c) последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности ДНК по п. а) или Ь);

ά) последовательность ДНК, которая гибридизируется с высокой строгостью с комплементарной нитью последовательности ДНК по п.а) или Ь);

е) часть последовательности ДНК по пп.а)-с) или ά), содержащую по меньшей мере 100 нуклеотидов; или

1) комплементарную нить последовательности ДНК по пп.а)-б) или е).

Изобретение также касается выделенных полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4. Далее это описано более подробно в отношении полипептидов по изобретению.

Как правило, в отношении 8ЕС ΙΌ N0: 2 такой домен должен содержать аминокислоту или аминокислоты, соответствующие одной или нескольким из числа А1а в положении 25, ТЬг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Азр в положении 65, Азп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Азр в положении 126, 8ег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Азп в положении 228, А1а в

- 9 017305 положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1и в положении 270, С1и в положении 273, 8ег в положении 279, Авр в положении 282, Ави в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, Авр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьув в положении 312, Ηίβ в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьув в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьув в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.

В одном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует полипептид, причем этот полипептид представляет собой вариант, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую одно или несколько усечений и/или по меньшей мере одну замену, делецию и/или вставку аминокислоты по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-378 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Такой полипептид, как правило, содержит одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТЬг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении 126, 8ег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Авп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, 8ег в положении 279, Авр в положении 282, Авп в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, Авр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьув в положении 312, Н1в в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьув в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьув в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.

Как правило, в отношении 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 такой домен должен содержать аминокислоту или аминокислоты, соответствующие одной или нескольким из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, 11е в положении 77, 11е в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Авп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Авр в положении 279, Авр в положении 282, Авп в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, 11е в положении 309, 8ег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1в в положении 313, 8ег в положении 314, 11е в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьув в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.

В одном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует полипептид, причем этот полипептид представляет собой вариант, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую одно или несколько усечений и/или по меньшей мере одну замену, делецию и/или вставку аминокислоты по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-374 8ЕЦ ΙΌ N0: 4. Такой полипептид, как правило, содержит одну или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении

- 10 017305

126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, §ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, §ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, Зег в положении 293, Зег в положении 297, Зег в положении 299, Зег в положении 300, С1у в положении 301, Зег в положении 303, Акр в положении 304, 11е в положении 309, Зег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, Зег в положении 314, 11е в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Бук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к ЗБО ГО N0: 4.

В другом воплощении изобретения предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5 единиц рН, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая включает:

a) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу согласно ЗБО ΙΌ N0: 2 или 3ΕΟ ΙΌ N0: 4;

b) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу, которая по меньшей мере на 85% гомологична полипептиду согласно 3ΕΟ ГО N0: 2 или 3ΕΟ ГО N0: 4;

й) последовательность ДНК, которая гибридизируется с высокой строгостью с комплементарной нитью последовательности ДНК по п.а) или Ь);

е) часть последовательности ДНК по пп.а)-с) или й), содержащую по меньшей мере 100 нуклеотидов; или

1) комплементарную нить последовательности ДНК по пп.а)-й) или е).

В настоящем изобретении термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновых кислот, включающим открытую рамку считывания, кодирующую вариант аспарагиназы, как описано в настоящей заявке, например вариант аспарагиназы дикого типа из АкрегдШик шдег. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Это значит, что ген в настоящем изобретении может означать выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем изобретении. Соответственно термин ген в контексте настоящей заявки относится не только к встречающимся в природе последовательностям.

Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может быть создана стандартными методами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам, в сочетании с информацией о последовательности, приведенной в настоящем изобретении.

Например, нужная молекула нуклеиновой кислоты может быть синтезирована йе πονο стандартными методами синтеза. Такой процесс синтеза обычно является автоматизированным. Такие методы хорошо известны специалистам в этой области.

С другой стороны, молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может быть создана при помощи направленного мутагенеза существующей молекулы нуклеиновой кислоты, к примеру молекулы нуклеиновой кислоты дикого типа. Направленный мутагенез может осуществляться с применением ряда методов, хорошо известных специалистам в этой области.

В одном из таких методов, который здесь приводится просто для примера, на плазмидной матрице проводится реакция ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих нужную мутацию. Поскольку праймеры представляют собой концевые участки синтезируемых заново нитей, если во время первого цикла будет несоответствие при связывании с матричной нитью ДНК, то после этого первого цикла образующаяся на основе праймера нить (содержащая мутацию) сравняется по концентрации с исходной матрицей. После следующих циклов она будет возрастать экспоненциально и через 25 циклов превзойдет исходную, не несущую мутации нить в соотношении порядка 8 млн к 1, в результате чего образуется почти однородный раствор несущих мутацию амплифицированных фрагментов. Затем матричную ДНК можно удалить посредством энзиматического расщепления, например, с помощью такого рестрикционного фермента, как ЭрпЕ который расщепляет только метилированную ДНК. Матрица, которая происходит из полученного методом щелочного лизиза препарата плазмид и поэтому метилирована, на этой стадии разрушается, а несущая мутацию плазмида сохраняется, так как она была создана ш νίίτο и поэтому не метилирована.

В таком методе можно вводить более чем одну мутацию в молекулу нуклеиновой кислоты при одной реакции ПНР, например, используя один или несколько олигонуклеотидов, каждый из которых содержит одно или несколько несоответствий. С другой стороны, можно ввести более чем одну мутацию в

- 11 017305 молекулу нуклеиновой кислоты путем выполнения более чем одной реакции ПЦР, при каждой из которых вводится одна или несколько мутаций таким образом, что изменения в нуклеиновую кислоту вводятся последовательно, многократно.

Нуклеиновая кислота по изобретению может быть создана с использованием в качестве матрицы кДНК, мРНК или же геномной ДНК и соответствующих олигонуклеотидных праймеров с несоответствиями согласно методу направленного мутагенеза, описанному выше. Полученная при этом молекула нуклеиновой кислоты может быть клонирована в соответствующий вектор и охарактеризована методами анализа последовательности ДНК.

Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать одну или несколько делеций, т.е. пробелов, в сравнении с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из ЛкрегдШш шдет, приведенной в \УО 2004/030468, и/или с последовательностью, приведенной в 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4. Такие делеции/пробелы могут быть созданы и методом направленного мутагенеза с помощью соответствующих олигонуклеотидов. Методы создания таких делеций хорошо известны специалистам в этой области.

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизирующиеся с последовательностями нуклеотидов по изобретению, могут быть получены стандартными методами синтеза, например с помощью автоматизированного синтезатора ДНК.

Настоящим изобретением также охвачены комплементарные молекулы нуклеиновых кислот. Молекула нуклеиновой кислоты комплементарна другой последовательности нуклеотидов, если она настолько комплементарна этой последовательности нуклеотидов, что может гибридизироваться с ней с образованием устойчивой двойной спирали.

Один из аспектов изобретения касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, как то, биологически активный фрагмент или домен, а также молекул нуклеиновых кислот, пригодных для применения в качестве зондов для гибридизации при идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по изобретению, и фрагментов таких молекул нуклеиновых кислот, пригодных для применения в качестве праймеров для ПЦР при амплификации или мутагенезе молекул нуклеиновых кислот, к примеру, для получения молекул нуклеиновых кислот по изобретению.

Выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота означает такую ДНК или РНК, которая не соприкасается непосредственно с теми двумя кодирующими последовательностями (одной на 5'-конце и другой на 3'-конце), с которыми она непосредственно соприкасается в естественном геноме того организма, из которого она получена. Так, в одном воплощении выделенная нуклеиновая кислота включает часть или все 5'-некодирующие последовательности (например, промотор), которые непосредственно соприкасаются с кодирующей последовательностью. Следовательно, этот термин охватывает, к примеру, рекомбинантную ДНК, встроенную в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус либо в геномную ДНК прокариот или эукариот, либо существующую в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, полученных методом ПЦР или при обработке рестрикционными эндонуклеазами) независимо от других последовательностей. Он также охватывает рекомбинантную ДНК, составляющую часть гибридного гена, кодирующего другой полипептид, которая практически свободна от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении методами рекомбинантной ДНК) либо химических предшественников или других химикатов (при химическом синтезе). Кроме того, выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты означает такой фрагмент нуклеиновой кислоты, который в природе не встречается в виде фрагмента и не встречается в естественном состоянии.

В настоящем изобретении термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты служат для обозначения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК), а также аналогов ДНК или РНК, полученных с помощью аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов нуклеотидов или их производных (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут применяться, к примеру, для получения нуклеиновых кислот, обладающих измененной способностью к спариванию оснований или повышенной устойчивостью к нуклеазам.

В следующем воплощении изобретения предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые являются антисмысловыми по отношению к молекулам нуклеиновых кислот по изобретению, например кодирующей нити молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 8Е0 ΙΌ N0: 3. Также в рамки изобретения входят комплементарные нити описанных в нем молекул нуклеиновых кислот.

Идентичность и гомологичность.

Термины гомологичность или степень идентичности в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемым образом. В целях настоящего изобретения установлено, что для определения степени идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей проводится совмещение этих последовательностей с целью их оптимального сравнения (например, могут

- 12 017305 вводиться пробелы в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность для оптимального совмещения со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем проводится сравнение аминокислотных или нуклеотидных остатков по соответствующим аминокислотным или нуклеотидным положениям. Если какое-то положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным или нуклеотидным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то эти молекулы идентичны в этом положении. Степень идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений между этими последовательностями (т.е. % идентичности=числу идентичных положений/общее число положений (т.е. совпадающих положений)/100)). Предпочтительно две последовательности имеют одинаковую длину.

Сравнение последовательностей может проводиться по всей длине двух сравниваемых последовательностей или по фрагменту этих двух последовательностей. Как правило, сравнение проводится по всей длине двух сравниваемых последовательностей. Однако идентичность последовательностей может устанавливаться по какому-то участку, например, из 20, 50, 100 или больше смежных аминокислотных остатков.

Специалистам должно быть известно, что имеется несколько различных компьютерных программ для определения гомологичности между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение степени идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с помощью математического алгоритма. В предпочтительном воплощении степень идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяется с помощью алгоритма №еб1етап апб ХУшъсй (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), встроенного в программу САР в комплекте программного обеспечения Ассе1гук ССС (доступно на Ййр://^тете.ассе1гу5.сот/ргобис!5/дсд/), используя матрицу В1о5ит 62 либо матрицу РАМ250 и весовой коэффициент для пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и весовой коэффициент для длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалистам должно быть известно, что все эти различные параметры дают слегка отличные результаты, но в целом степень идентичности двух последовательностей существенно не меняется при использовании разных алгоритмов.

Последовательности нуклеотидов или белков настоящего изобретения также можно использовать в качестве запрашиваемой последовательности для проведения поиска в публичных базах данных, например, для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такой поиск может проводиться с помощью программ ВЬА§ТЫ и ВЬА8ТР (версия 2.0) по А115сйи1 е! а1. (1990) 1. Μο1. Βίο1. 215:403-10. Поиск ВЬА8Т по белкам может проводиться с помощью программы ВЬА8ТР при значениях ^οιό=50. \\όγ6Κ1'1§11ι=3. получая аминокислотные последовательности, гомологичные белковым молекулам по изобретению. Для получения совмещений с пробелами в целях сравнения можно использовать Сарреб ВЬА8Т, как описано в А1(зсНи1 е! а1. (1997) Ыис1е1с Ас1бк Век. 25(17): 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ВЬА8ТР и ВЬА^ТЫ), см. домашнюю страницу Национального центра информации по биотехнологии на йΐίр://^^^.ηсЬ^.η1т.η^й.дον/.

Гибридизация.

Полинуклеотид по изобретению и последовательность, комплементарная приведенной в 8ЕО ГО N0: 1 или 8ЕО ГО N0: 3, как правило, могут гибридизироваться на уровне, существенно превышающем фон. Фоновая гибридизация может происходить, к примеру, из-за присутствия других кДНК в библиотеке кДНК. Уровень сигнала, издаваемого при взаимодействии между полинуклеотидом по изобретению и кодирующей последовательностью, комплементарной приведенной в 8ЕО ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 3, как правило, по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз больше интенсивности при взаимодействии между другими полинуклеотидами и последовательностью по 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 3. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, к примеру, методом радиометки.

В настоящем изобретении термины гибридизироваться и гибридизация служат для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности, гомологичные друг другу, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как то, по меньшей мере на 95%, например, гомологичные друг другу по меньшей мере на 98%, как то, по меньшей мере на 99% при определении на участке по меньшей мере из 20, к примеру по меньшей мере 50, как то, по меньшей мере 100, например, по меньшей мере 200, более предпочтительно по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов, а еще более предпочтительно по всей длине сравниваемых последовательностей, обычно остаются гибридизированными друг с другом.

Предпочтительным неограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6-кратном №1С1/№1-цитрате (88С) при 45°С с последующей одной или несколькими отмывками в 1/88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С.

Очень строгие условия включают, к примеру, проведение гибридизации при 68°С в 5/88С/5/ растворе Денхардта/1,0% 8Ό8 и отмывка в 0,2/88С/0,1% 8Ό8 при комнатной температуре. С другой стороны, отмывка может проводиться при 42°С.

- 13 017305

Специалистам должно быть известно, какие условия соответствуют строгим и очень строгим условиям гибридизации. Дополнительные рекомендации в отношении таких условий легко доступны, например, в 8ашЬтоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!оту Мапиа1, Со1б 8ртшд НатЬот Ртевв, Ν.Υ. и АивиЬе1 е! а1. (ебв.), 1995, Ситтей Рто!осо1в ίη Мо1еси1аг Вю1оду (бокп ХУбеу & 8опв, Ν.Υ.).

Конечно, полинуклеотиды, гибридизирующиеся только с последовательностью поли-А (как то, 3'концевым участком поли-А в мРНК) или с комплементарным отрезком остатков Т (или и), не относятся к тем полинуклеотидам по изобретению, которые используются для специфической гибридизации с участком нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такие полинуклеотиды будут гибридизироваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли-А или комплементарный ему (например, практически с любым клоном двухцепочечной кДНК).

Для определения полинуклеотидов по изобретению могут использоваться любые комбинации вышеприведенных степеней идентичности последовательностей и минимальной протяженности, причем предпочтительны более строгие комбинации (т.е. большая идентичность последовательностей на большем протяжении).

Векторы.

Следующий аспект изобретения касается векторов, предпочтительно экспрессионных (экспрессирующих) векторов, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант аспарагиназы по изобретению, к примеру белок аспарагиназы согласно 8ЕО ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4 либо его функциональный эквивалент.

В настоящем изобретении термин вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он соединен. Одним из типов вектора является плазмида, что означает кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать (вставить) дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом в вирусный геном можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Некоторые вектора обладают способностью к автономной репликации в клетках хозяина, в которые они введены (например, бактериальные вектора, содержащие бактериальное начало репликации, и эписомные вектора млекопитающих). Другие вектора (например, неэписомные вектора млекопитающих) встраиваются в геном клеток хозяина после введения в клетки и при этом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые вектора способны управлять экспрессией тех генов, с которыми они функционально связаны. Такие вектора именуются экспрессионными векторами. Обычно экспрессионные вектора, имеющие применение в методах рекомбинантной ДНК, имеют вид плазмид. Термины плазмида и вектор в настоящем изобретении используются взаимозаменяющим образом, так как плазмида является наиболее распространенным типом вектора. Однако изобретение охватывает и другие разновидности экспрессионных векторов, как то, вирусные вектора (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Рекомбинантные экспрессионные вектора по изобретению содержат нуклеиновую кислоту по изобретению в виде, подходящем для экспрессии её в клетках хозяина, а это значит, что рекомбинантный экспрессионный вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных исходя из клеток хозяина, используемых для экспрессирования, которые функционально связаны с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессионном векторе функционально связаны означает то, что данная последовательность нуклеотидов связана с регуляторными последовательностями таким образом, который позволяет экспрессию этой последовательности нуклеотидов (например, в системе транскрипции/трансляции ш νίΙΐΌ или в клетках хозяина при введении вектора в эти клетки). Термин регуляторные последовательности охватывает промоторы, энхансеры и другие контролирующие экспрессию элементы (например, сигнал полиденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, к примеру, в Соеббе1, Сепе Ехртеввюп Тес1шо1оду: МеШобв ш Еп/ушо1оду 185, Асабепйс Ртевв, 8ап Б1едо, СА (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые управляют конститутивной экспрессией последовательности нуклеотидов во многих типах клеток хозяина, и те, которые управляют экспрессией последовательности нуклеотидов только в определенных клетках хозяина (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалистам должно быть известно, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор подлежащих трансформации клеток хозяина, уровень экспрессии нужного белка и т.д. Экспрессионные вектора по изобретению могут вводиться в клетки хозяина и при этом продуцировать белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем изобретении (например, вариант аспарагиназы согласно 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4 или его вариант, например функциональный эквивалент или фрагмент, либо слитый белок, включающий один или несколько таких вариантов).

Рекомбинантные экспрессионные вектора по изобретению могут предназначаться для экспрессии вариантов белков по изобретению в прокариотических или эукариотических клетках. Например, можно экспрессировать вариант белка по изобретению в таких бактериальных клетках, как Е. соБ, в клетках насекомых (с помощью бакуловирусных экспрессионных векторов), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки хозяина обсуждаются более подробно в Соеббе1, Сепе Ехртеввюп Тес1шо1оду: МеШобв ш Епхушо1оду 185, Асабешю Ртевв, 8ап Б1едо, СА (1990). С другой стороны, реком

- 14 017305 бинантный экспрессионный вектор можно подвергнуть транскрипции и трансляции ίη νίίτο, например, используя регуляторные последовательности промотора Т7 и полимеразу Т7.

Экспрессионные вектора, применимые в настоящем изобретении, включают вектора хромосомного, эписомного и вирусного происхождения, например вектора, происходящие из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, таких вирусов, как бакуловирусы, паповавирусы, вирус коровьей оспы, аденовирусы, птичьи поксвирумы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также вирусы, происходящие из их комбинаций, как то, вирусы, происходящие из генетических элементов плазмид и бактериофагов, как то, космиды и фагомиды.

Вставленная ДНК должна быть функционально связана с соответствующим промотором, таким как промотор РЬ фага лямбда, промоторы 1ас, !гр и !ас Е. сой, ранние и поздние промоторы 8У40 и промоторы вирусных ЬТВк - назовем лишь несколько. Другие подходящие промоторы должны быть известны специалистам. В одном конкретном воплощении предпочтительны такие промоторы, которые способны обеспечить высокий уровень экспрессии аспарагиназы в нитчатых грибах. Такие промоторы известны в этой области. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, сайт связывания с рибосомой для трансляции. Кодирующая часть готовых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, должна включать инициирующий трансляцию ЛИС в начале и терминирующий кодон в соответствующем месте на конце транслируемого полипептида.

ДНК вектора может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки стандартными методами трансформации или трансфекции. В настоящем изобретении термины трансформация и трансфекция служат для обозначения ряда признанных методов введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки хозяина, включая методы осаждения фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекции с помощью ΌΕΑΕ-декстрана, трансдукции, инфицирования, липофекции, трансфекции с помощью катионных липидов или электропорации. Подходящие методы трансформирования или трансфецирования клеток хозяина приведены в 8атЬгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пй ей. Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1й 8рйпд НагЬог, ΝΥ, 1989), Οηνίκ е! а1., Вайс МеИойк ίη Мо1еси1аг Вю1о§у (1986) и других лабораторных пособиях.

Известно, что при устойчивой трансфекции клеток млекопитающих, в зависимости от экспрессионного вектора и метода трансфекции, лишь небольшая часть клеток может встраивать чужеродную ДНК в свой геном. Обычно для идентификации и отбора этих интегрантов в клетки хозяина вместе с заданным геном вводится ген, кодирующий селекционный маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительными селекционными маркерами являются маркеры, придающие устойчивость к лекарственным препаратам, таким как С418, гигромицин и метатрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селекционный маркер, может вводиться в клетки хозяина в том же самом векторе, который кодирует вариант белка по изобретению, либо в отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать путем отбора в присутствии препарата (например, выживут клетки со встроенным геном селекционного маркера, тогда как остальные клетки погибнут).

Экспрессирование белков в прокариотах зачастую проводится в Е. сой с помощью векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией слитых либо не слитых белков. Вектор для слияния добавляет ряд аминокислот к кодируемому им белку, например на Νконец рекомбинантного белка. Как правило, такие вектора для слияния выполняют три задачи: 1) повышения экспрессии рекомбинантного белка; 2) повышения растворимости рекомбинантного белка и 3) облегчения очистки рекомбинантного белка, действуя в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в экспрессионные вектора для слияния вводится сайт протеолитического расщепления на стыке между сливаемой молекулой и рекомбинантным белком, который позволяет отделить рекомбинантный белок от сливаемой молекулы после очистки слитого белка.

Как уже сказано, экспрессионные вектора предпочтительно должны содержать селекционные маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину при культивировании в эукариотических клетках и устойчивость к тетрациклину или ампициллину при культивировании в Е. сой и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих клеток хозяина включают клетки бактерий, как то, Е. сой, 8йер1отусек, 8а1шопе11а 1урЫтийит и некоторые виды ВасШик; клетки грибков типа АкрегдШик, например Α. шдег, Α. огухае и Α. шйи1ап§; дрожжевые клетки типа 1<1иу\'еготусек, например К. 1асйк и/или РисЫа, например Р. райойк; клетки насекомых, как то, ИгокорЫ1а 82 и 8ройор!ега 8ί9; клетки животных, как то, СНО, СО8 и меланомы Вотек; и клетки растений. Известны подходящие среды и условия культивирования вышеописанных клеток хозяина.

Предпочтительные вектора для бактерий приведены, к примеру, в νθ-Α 1-2004/074468, включенной в настоящее изобретение путем ссылки. Другие подходящие вектора должны быть известны специалистам.

Известные бактериальные промоторы, подходящие для настоящего изобретения, включают промоторы, приведенные в νθ-Α1-2004/074468, включенной в настоящее изобретение путем ссылки.

Транскрипция ДНК, кодирующей вариант по настоящему изобретению у высших эукариот, может быть повышена при введении в вектор последовательности энхансера. Энхансеры представляют собой

- 15 017305 ак-элементы ДНК, обычно от 10 до 300 п.о., которые действуют, повышая транскрипционную активность промотора у данного типа клеток хозяина. Примеры энхансеров включают энхансер 8У40, который располагается на поздней стороне начала репликации в районе п.о. 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовирусов.

Для секреции транслируемого белка в просвет эндоплазматического ретикулума в периплазматическое пространство или во внешнюю среду можно вставить подходящий сигнал секреции в экспрессируемый полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида либо гетерологичными.

Вариант по изобретению может экспрессироваться в таком виде, что он будет включать дополнительные гетерологичные функциональные участки, например сигналы секреции. Вариант по изобретению также может содержать, к примеру, участок из добавочных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, вставленный на Ν-конец полипептида, например, для улучшения стабильности и стойкости в клетках хозяина, во время очистки или при последующей обработке и хранении. К тому же к варианту по изобретению могут быть добавлены молекулы пептидов, способствующие очистке, например, при добавлении остатков гистидина или Т7-метки.

Полипептиды по изобретению.

Изобретением предусмотрена аспарагиназа, которая представляет собой:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕБ) ΙΌ ΝΟ: 4;

b) полипептид, который по меньшей мере на 85% гомологичен полипептиду по п.а);

c) полипептид, который может быть получен из полипептида, приведенного в п.а) или Ь), путем замены, делеции и/или вставки одной или нескольких аминокислот;

й) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 или 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3, кодирующей зрелый полипептид, или частью этой последовательности, содержащей по меньшей мере 100 нуклеотидов.

Как правило, в отношении 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 полипептид по пп.Ь), с) или й) содержит одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, 8ег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, 8ег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Бук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Беи в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РНе в положении 365, Бук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Бук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2.

Полипептид по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Беи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Беи в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, 8ег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Беи в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, 8ег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Бук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Беи в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361,

- 16 017305

С1у в положении 364, РЬе в положении 365, Бук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Бук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 2. Более предпочтительно полипептид по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к 8Е0 ΙΌ N0: 2.

В отношении 8Е0 ΙΌ N0: 4 полипептид по изобретению может содержать одну или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении

189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Бук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 4.

Полипептид по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Беи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, СЬ1 в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Беи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении

190, Беи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Бук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 4.

Более предпочтительно полипептид по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 4.

В следующем воплощении изобретения предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рНпрофиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении аспарагиназа с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5 единиц рН, представляет собой:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 5ЕО ΙΌ N0: 4;

Ф) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по 8ЕО ΙΌ N0: 1 или 8ЕО ΙΌ N0: 3, кодирующей зрелый полипептид, или частью этой последовательности, содержащей по меньшей мере 100 нуклеотидов.

Настоящее изобретение также охватывает пептиды или полипептиды, составляющие функциональный эквивалент вышеприведенных полипептидов. Вышеприведенные полипептиды собирательно охватываются терминами полипептид по изобретению или вариант по изобретению.

Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (что общепринято), причем каждый термин может использоваться взаимозаменяемым образом в зависимости от контекста и означает цепочку по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово полипептид в на

- 17 017305 стоящем изобретении применяется в отношении цепочек, содержащих более 7 аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов пишутся слева направо и в направлении от №конца к С-концу. Однобуквенная кодировка аминокислот, используемая в настоящем изобретении, широко известна в данной области и приведена в 8атЬтоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2пй ей. Со1й 8рппд НагЬог БаЬота!огу, Со1й 8рппд НагЬог БаЬота!огу Ргекк, Со1й 8рппд НагЬог, КУ, 1989).

Под выделенным полипептидом или белком подразумевается полипептид или белок, изъятый из его естественного окружения. Например, полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках хозяина, для целей изобретения считаются выделенными, равно как и природные или рекомбинантные полипептиды, подвергавшиеся существенной очистке любым подходящим методом, таким, к примеру, как одноступенчатый метод очистки, приведенный в 8тй11 апй 1оНикоп, Сепе 67:31-40 (1988).

Вариант полипептида по изобретению может быть выделен и очищен из культуры рекомбинантных клеток известными в этой области методами. Наиболее предпочтительно для очистки применяется метод ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС).

Полипептиды настоящего изобретения включают продукты методов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотических или эукариотических клеток хозяина, в том числе бактериальных, дрожжевых клеток, клеток высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от клеток хозяина, используемых в рекомбинантном методе получения, полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Кроме того, полипептиды по изобретению могут содержать и модифицированный остаток начального метионина, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов.

Фрагменты белков.

Изобретением также предусмотрены биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению. Такие фрагменты считаются охваченными термином вариант по изобретению.

Биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению включают полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или происходящие от аминокислотной последовательности варианта белка по изобретению (например, аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 2 ог 8Е0 ΙΌ N0: 4), которые содержат меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, но проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего полноразмерного белка. Как правило, биологически активные фрагменты содержат домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью варианта белка по изобретению. Предпочтительно биологически активные фрагменты, по крайней мере, обладают аспарагиназной активностью. Биологически активный фрагмент белка по изобретению может представлять собой полипептид длиной, к примеру, в 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот. Более того, рекомбинантными методами могут быть получены и другие биологически активные части, из которых удалены остальные участки белка, и исследованы на наличие одной или нескольких биологических активностей нативной формы полипептида по изобретению.

Как правило, в отношении 8Е0 ΙΌ N0: 2 фрагмент белка по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, 8ет в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ет в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ет в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТНг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, 8ет в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РНе в положении 208, А1а в положении 210, 8ет в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Бук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТНг в положении 250, ТНг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ет в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, 8ет в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Бук в положении 286, 8ет в положении 293, 8ет в положении 297, 8ет в положении 299, С1у в положении 301, 8ет в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ет в положении 311, Бук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ет в положении 314, Не в положении 317, Беи в положении 319, ТНг в положении 321, С1у в положении 324, ТНг в положении 330, РНе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РНе в положении 365, Бук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Бук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 2.

Фрагмент белка по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТНг в положении 28, Туг в положении 30, 8ет в положении 35, Беи в положении 53, 8ет в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТНг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ет в положении 111, Беи в положении 114, А1а в положении 117,

- 18 017305

ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Зег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, Зег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, 11е в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, Зег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, Зег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, Зег в положении 293, Зег в положении 297, Зег в положении 299, С1у в положении 301, Зег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, 11е в положении 309, А1а в положении 310, Зег в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, Зег в положении 314, 11е в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьук в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к ЗЕО ΙΌ N0: 2. Более предпочтительно фрагмент белка по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к ЗЕО ΙΌ N0: 2.

Как правило, в отношении ЗЕО ΙΌ N0: 4 фрагмент белка по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа Зег в положении 35, Ьеи в положении 53, Зег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, Зег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, Зег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, Зег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, Зег в положении 293, Зег в положении 297, Зег в положении 299, Зег в положении 300, С1у в положении 301, Зег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, Зег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, Зег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к ЗЕО ΙΌ N0: 4.

Фрагмент белка по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа Зег в положении 35, Ьеи в положении 53, Зег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, Зег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, Зег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, Зег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, Зег в положении 293, Зег в положении 297, Зег в положении 299, Зег в положении 300, С1у в положении 301, Зег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, Зег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, Зег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьук в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к ЗЕО ΙΌ N0: 4. Более предпочтительно фрагмент белка по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к ЗЕО ΙΌ N0: 4.

Изобретением также предусмотрены фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие вышеприведенные биологически активные фрагменты (которые сами представляют собой варианты по изобретению).

Слитые белки.

Варианты по изобретению, как то, белки настоящего изобретения или их функциональные эквиваленты, например их биологически активные части и фрагменты, могут быть функционально соединены с полипептидом не по изобретению (например, гетерологичной аминокислотной последовательностью) с образованием слитых белков. В данном контексте полипептид не по изобретению означает полипептид,

- 19 017305 имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является существенно гомологичным варианту аспарагиназы по изобретению.

В слитом белке вариант по изобретению может соответствовать полноразмерной последовательности либо биологически активному фрагменту полипептида по изобретению. В предпочтительном воплощении слитый белок по изобретению включает по меньшей мере две биологически активные части. В отношении слитого белка термин функционально соединен служит для обозначения того, что вариант белка и полипептид не по изобретению слиты друг с другом в одной рамке считывания. Полипептид не по изобретению может быть пришит к №концу или С-концу варианта белка.

Например, в одном воплощении слитый белок представляет собой белок, у которого последовательность варианта пришита к С-концу последовательностей С8Т. Такие слитые белки могу способствовать очистке рекомбинантного варианта по изобретению. В другом воплощении слитый белок является вариантом по изобретению, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на №конце. В некоторых клетках хозяина (например, клетках млекопитающих и дрожжевых клетках) при помощи гетерологичной сигнальной последовательности может быть повышена экспрессия и/или секреция варианта по изобретению.

В другом примере в качестве гетерологичной сигнальной последовательности может применяться секреторная последовательность белка др67 оболочки бакуловируса (СштеШ Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Βίο1оду, АизиЬе1 е1 а1., еНз., ШЬп ^11еу & 8опз, 1992). Другие примеры эукариотических гетерологичных сигнальных последовательностей включают секреторные последовательности мелиттина и плацентарной щелочной фосфатазы человека (81га1адепе; Ьа 1о11а, СаНогша). В еще одном примере полезные прокариотические гетерологичные сигнальные последовательности включают секреторный сигнал рЬоА (8атЬгоок е1 а1., зирга) и секреторный сигнал белка А (РЬагтааа Вю1ес11; Р1зса1а^ау, №\ν 1егзеу).

Сигнальная последовательность может использоваться для облегчения секреции и выделения варианта по изобретению. Как правило, сигнальные последовательности характеризуются основой из гидрофобных аминокислот, которые обычно отщепляются от зрелого белка при секреции за один или несколько этапов отщепления. Такие сигнальные пептиды содержат сайты для процессинга, которые позволяют отщепление сигнальной последовательности от зрелого белка при прохождении через секреторный путь. Сигнальная последовательность может направлять секрецию варианта, скажем, их клеток эукариотического хозяина, трансформированных экспрессионным вектором, а затем сигнальная последовательность может быть отщеплена, потом или одновременно. После этого вариант по изобретению легко может быть выделен из внеклеточной среды известными методами. С другой стороны, сигнальная последовательность может быть присоединена к данному варианту с помощью последовательности, способствующей очистке, к примеру, с доменом С8Т. Так, например, последовательность, кодирующая вариант по изобретению, может быть слита с последовательностью маркера, как то, последовательности, кодирующей пептид, способствующий очистке слитого варианта по изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях этого аспекта изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид типа метки, встроенной в вектор рОЕ (Р1адеп, Шс.), среди прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в СеШх е1 а1., Ргос. ИаИ. АсаН. 8ск И8А 86: 821-824 (1989), к примеру, гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другим пептидом, полезным для очистки, является метка НА, которая соответствует эпитопу из белка гемагглютинина вируса гриппа, который описан в ХУПзоп е1 а1., Се11 37: 767 (1984), к примеру.

Слитый белок по изобретению может быть получен стандартными методами рекомбинантной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие последовательности различных полипептидов, лигируют друг с другом в одной рамке считывания в соответствии со стандартными методами, к примеру, используя тупые концы или выступающие концы для лигирования, расщепление рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, заполнение липких концов надлежащим образом, обработку щелочной фосфатазой для предотвращения нежелательного соединения и энзиматическое лигирование. В другом воплощении можно синтезировать слитый ген стандартными методами, включая автоматизированные синтезаторы ДНК. С другой стороны, можно провести амплификацию фрагментов генов методом ПЦР с помощью якорных праймеров, создающих комплементарные выступы между двумя соседними фрагментами генов, которые затем можно подвергнуть отжигу и повторно амплифицировать, получая последовательность химерного гена (например, см. СиггеШ Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, АизиЬе1 е1 а1., еНз., 1о11п ХУПеу & 8опз: 1992). Более того, коммерчески доступны многие экспрессионные вектора, кодирующие готовые молекулы для слияния (например, полипептид С8Т). В такой экспрессионный вектор можно клонировать кодирующую вариант нуклеиновую кислоту таким образом, чтобы молекула для слияния соединялась с данным вариантом в одной рамке считывания.

Функциональные эквиваленты.

Термины функциональные эквиваленты и функциональные варианты в настоящем изобретении используются взаимозаменяемым образом. Функциональные эквиваленты по изобретению представляют собой выделенные фрагменты ДНК, которые кодируют полипептид, проявляющий определенную функцию вариантов аспарагиназы АзрегдШиз шдег, как определено в настоящем изобретении. Функциональный эквивалент полипептида по изобретению представляют собой полипептид, проявляющий по мень

- 20 017305 шей мере одну функцию варианта аспарагиназы АкрегдШик шдег, как определено в настоящем изобретении. Следовательно, функциональные эквиваленты также охватывают биологически активные фрагменты и сами охватываются термином вариант по изобретению.

Предпочтительно полипептид функционального эквивалента в отношении 8ЕС Ш N0: 2 по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, ТЬг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, 61п в положении 80, ТЬг в положении 81, 61и в положении 88, Рго в положении 106, Vа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, 61и в положении 122, Акр в положении 126, 8ег в положении 131, Vа1 в положении 161, А1а в положении 168, 61п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Vа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Vа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 252, Vа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, 61п в положении 270, 61п в положении 273, 8ег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 61у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, 61у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, 61и в положении 361, 61у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, 61и в положении 370, Ьук в положении 374, Vа1 в положении 375 и Vа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС ΙΌ N0: 2.

Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 либо все из следующих аминокислот: А1а в положении 25, ТЬг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, 61п в положении 80, ТЬг в положении 81, 61и в положении 88, Рго в положении 106, Vа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, 61и в положении 122, Акр в положении 126, 8ег в положении 131, Vа1 в положении 161, А1а в положении 168, 61п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Vа1 в положении 205, РЬе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Vа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Vа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 252, Vа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, 61п в положении 270, 61п в положении 273, 8ег в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 61у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Акр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьук в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Ьеи в положении 319, ТЬг в положении 321, 61у в положении 324, ТЬг в положении 330, РЬе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, 61и в положении 361, 61у в положении 364, РЬе в положении 365, Ьук в положении 366, Агд в положении 369, 61и в положении 370, Ьук в положении 374, Vа1 в положении 375 и Vа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС ΙΌ N0: 2.

Предпочтительно полипептид функционального эквивалента в отношении 8ЕС Ш N0: 4 по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Акр в положении 65, Акп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, 61п в положении 80, ТЬг в положении 81, 61и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, 61и в положении 122, Акр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, 61п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Акп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьук в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, 61п в положении 270, Акр в положении 279, Акр в положении 282, Акп в положении 283, Ьук в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, 61у в положении 301, 8ег в положении 303, Акр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1к в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, 61у в положении 324, Рго в положении 330, 61и в положении 333, 61п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, 61у в положении 360, 61и в положении 362, Агд в положении 365, 61и в положении 366, Ьук в положении 370, Уа1 в положении 371, 61у в положении 372 и

- 21 017305

Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.

Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70 либо все из следующих аминокислот: 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, ТЬг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, ТЬг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, РЬе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Авп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, ТЬг в положении 250, ТЬг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Авр в положении 279, Авр в положении 282, Авп в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, ТЬг в положении 312, Н1в в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, ТЬг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, РЬе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьув в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕС ΙΌ N0: 4.

Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать замены одной или нескольких аминокислот в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4 либо замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Соответственно несущественная аминокислота представляет собой такой остаток, который может быть изменен в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4 без существенного изменения биологической функции. Более того, изменению и вовсе не подлежат аминокислоты, являющиеся консервативными среди белков по настоящему изобретению и других аспарагиназ.

Для получения функционального варианта по изобретению могут производиться замены аминокислот в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4, например от 1, 2 или 3 до 10, 20, 30 или больше замен.

Функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты, как правило, могут содержать молчащие мутации или мутации, не изменяющие биологическую функцию кодируемого полипептида. Соответственно изобретением предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты белка аспарагиназы, которые содержат замены аминокислотных остатков, не существенных для определенной биологической активности. Такие варианты белка отличаются по аминокислотной последовательности от 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4, но сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность его. В одном воплощении выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую белок, причем этот белок имеет практически гомологичную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант по изобретению, который гомологичен, как правило существенно гомологичен, белку согласно 8ЕС ΙΌ N0: 2 или 8ЕС ΙΌ N0: 4, может быть создана путем введения одной или нескольких замен, добавлений или делеций нуклеотидов в кодирующую последовательность нуклеотидов по изобретению таким образом, чтобы в кодируемый белок была введена одна или несколько замен, делеций или вставок аминокислот. Такие мутации могут вводиться стандартными методами, как то, методами направленного мутагенеза и с помощью ПЦР.

В настоящем изобретении термин существенно гомологичная относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, содержащей достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, с аналогичной боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности с тем, что и первая, и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности содержат общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, содержащие общий домен и идентичные на 60%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше, в настоящем изобретении определяются как достаточно идентичные.

Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующих, т.е. колирующих варианты аспарагиназы по изобретению, могут быть выделены на основе их гомологичности нуклеиновым кислотам изобретения с помощью кДНК, приведенных в настоящем изобретении.

Специалисты должны понимать, что в нуклеотидные последовательности по изобретению могут вводиться изменения при помощи мутагенеза, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности получаемого белка без существенного изменения функции такого белка.

В следующем аспекте изобретения предусмотрены улучшенные варианты белка аспарагиназы. Улучшенными вариантами белка аспарагиназы являются белки, у которых улучшается по меньшей мере одна биологическая активность, например, по сравнению с аспарагиназой дикого типа, как то, аспараги

- 22 017305 назой А. шдег.

В частности, варианты белка по изобретению могут обладать большей удельной активностью при данном рН по сравнению с аспарагиназой дикого типа, как то, аспарагиназой А. шдег, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3 из XV0 2004/030468, или могут лучше реагировать на рН, к примеру быть более алкалофильными или ацидофильными, чем аспарагиназа дикого типа, как то, аспарагиназа А. шдег, приведенная в 8Е0 ГО N0: 3 из ν0 2004/030468. Например, варианты белка по изобретению могут обладать большей удельной активностью по меньшей мере при рН 5 по сравнению с удельной активностью аспарагиназы дикого типа из А. шдег, приведенной в 8Εβ ΙΌ N0: 3 из ν0 2004/030468, при измерении в одинаковых условиях. Например, аспарагиназа дикого типа из А. шдег, приведенная в 8Εβ ГО N0: 3 из ν0 2004/030468, имеет рН-оптимум при рН от 4 до 5. Вариант белка по изобретению может быть более алкалофильным, чем тот же фермент дикого типа, т.е. он может, к примеру, иметь рН-оптимум при рН от 6 до 7. Хотя вариант может быть и более ацидофильным, чем аспарагиназа дикого типа.

В следующем воплощении у вариантов белков по изобретению ширина рН-профиля активности может составлять по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН.

Такие белки могу быть получены путем введения случайных мутаций по всей или по части кодирующей последовательности по изобретению, как то, методом насыщающего мутагенеза. Полученных мутантов можно затем подвергнуть рекомбинантной экспрессии и скринингу на наличие биологической активности. Например, в этой области существуют стандартные методы измерения энзиматической активности аспарагиназы, так что можно легко проводить отбор улучшенных белков.

В предпочтительном воплощении вариант аспарагиназы по изобретению имеет аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4. В другом воплощении вариант по изобретению существенно гомологичен аминокислотной последовательности согласно 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4, а также обычно сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида согласно 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4, но может отличаться по аминокислотной последовательности вследствие мутагенеза, как описано выше.

В другом предпочтительном воплощении вариант аспарагиназы по изобретению имеет аминокислотную последовательность, кодирующуюся выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты, который способен гибридизироваться с нуклеиновой кислотой по изобретению, предпочтительно в условиях гибридизации высокой строгости.

Соответственно вариант аспарагиназы по изобретению предпочтительно представляет собой белок, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида согласно 8Е0 ГО N0: 2 или 8ЕО ΙΌ N0: 4.

Варианты по изобретению, например функциональные эквиваленты белка по изобретению, также можно идентифицировать, например, путем скрининга комбинаторной библиотеки мутантов, например, укороченных мутантов белка по изобретению на наличие аспарагиназной активности. В одном воплощении создается разнородная библиотека вариантов путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты. Разнородная библиотека вариантов может быть получена, к примеру, путем энзиматического лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов с последовательностями гена таким образом, чтобы вырожденный набор потенциальных последовательностей белков можно было экспрессировать в виде индивидуальных полипептидов или же в виде набора более крупных слитых белков (например, при фаговом дисплее). Существует целый ряд методов, которые можно использовать для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов по изобретению из последовательности вырожденных олигонуклеотидов. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в этой области (например, см. №1гапд (1983) Те!гайебгоп 39:3; Иакига е! а1. (1984) Аппи. Веу. ВюсИет. 53:323; Иакига е! а1. (1984) 8с1епсе 198:1056; 1ке е! а1. (1983) ШсШс Лабк Век. 11:477)).

Кроме того, библиотеки фрагментов последовательности, кодирующей полипептид по изобретению, можно использовать для получения разнородной популяции полипептидов для скрининга при последующем отборе вариантов. Например, можно создать библиотеку фрагментов кодирующей последовательности путем обработки нуклеазой двухцепочечного ПЦР-фрагмента заданной кодирующей последовательности в таких условиях, когда точечный разрыв происходит только примерно один раз на молекулу, денатурирования двухцепочечной ДНК, ренатурирования этой ДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которая может включать пары смысловых/антисмысловых нитей из продуктов с разными точечными разрывами, удаления одноцепочечных участков из новообразованных дуплексов при обработке нуклеазой 81, и лигирования полученной библиотеки фрагментов в экспрессионный вектор. Таким способом можно получить экспрессионную библиотеку, кодирующую №концевые и внутренние фрагменты заданного белка различного размера.

Известно несколько методов скрининга генных продуктов из комбинаторных библиотек, полученных путем точечных мутаций или усечения, и скрининга библиотек кДНК на наличие генных продуктов, обладающих заданным свойством. Наиболее распространенные методы, которые поддаются высокопро

- 23 017305 изводительному анализу для скрининга больших генных библиотек, обычно включают клонирование генной библиотеки в реплицирующиеся экспрессионные вектора, трансформирование подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессирование комбинаторных генов в условиях, при которых детектирование требуемой активности способствует выделению вектора, кодирующего тот ген, продукт которого был детектирован. Для идентификации вариантов белка по изобретению в сочетании с методами скрининга может применяться метод рекурсивного группового мутагенеза (КЕМ), который повышает частоту функциональных мутантов в библиотеках (Аткт апй Уонгуап (1992) Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 89: 7811-7815; Ое1дгауе е1 а1. (1993) Рго1ет Епдшеегшд 6(3): 327-331).

Фрагменты полинуклеотидов по изобретению также могут включать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать как зонды или праймеры для реакции ПЦР.

Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве зондов для гибридизации или праймеров для полимеразной цепной реакции (РСК). Применение молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения, не кодирующих полипептид, обладающий аспарагиназной активностью, включает, среди прочего, (1) гибридизацию ίπ кйи (например, ΕΙ8Η) расправленных метафазных хромосом для уточнения хромосомной локализации кодирующего аспарагиназу гена, как описано в Уегта е1 а1., Нитап СНготокотек: а Мапиа1 ок Вак1с Тес11тс|иек, Регдатоп Ргекк, №\ν Υо^к (1988); (2) №гШегп-гибридизацию для детектирования экспрессии мРНК аспарагиназы в определенных тканях и/или клетках и (3) зонды и праймеры, которые могут применяться для анализа на присутствие нуклеиновой кислоты, гибридизирующейся с таким зондом или праймером в данном биологическом образце (например, образце ткани).

Изобретение также охватывает способ получения функционального эквивалента полинуклеотида по изобретению. Такой способ включает получение меченого зонда, включающего выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую всю или часть последовательности белка согласно 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4 либо его варианта; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты с помощью меченого зонда в условиях, способствующих гибридизации зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, при которой образуются дуплексы нуклеиновой кислоты; и получение полноразмерной последовательности гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в меченых дуплексах, получая последовательность, родственную полинуклеотиду по изобретению.

Клетки хозяина.

В следующем воплощении изобретения представлены клетки, например трансформированные клетки хозяина или рекомбинантные клетки хозяина, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Трансформированные клетки или рекомбинантные клетки представляют собой клетки, в которые (или в предка которых) методами рекомбинантной ДНК была введена нуклеиновая кислота по изобретению. Они охватывают как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии, грибки, дрожжи и др., но особенно предпочтительны клетки нитчатых грибов, в особенности АкретдШик шдет.

Можно выбрать такие клетки хозяина, которые модулируют экспрессию вставленных последовательностей либо модифицируют и подвергают процессингу продукт, кодируемый вставленной последовательностью нуклеиновой кислоты определенным, заданным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать оптимальному функционированию кодируемого белка.

Различные клетки хозяина обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Можно выбрать подходящие линии клеток или системы хозяина, известные специалистам в области молекулярной биологии и микробиологии, чтобы обеспечить требуемую и правильную модификацию и процессинг экспрессируемого чужого белка. Для этой цели можно использовать эукариотические клетки хозяина, обладающие клеточными механизмами для правильного процессинга первичного транскрипта, гликолизирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки хозяина хорошо известны в этой области.

Клетки хозяина охватывают и клеточные линии млекопитающих, как то, линии клеток СНО, УЕК0, ВНК, НеЬа, С08, МОСК, 293, 3Т3, ^Ι38 и хориоидного сплетения.

При желании устойчиво трансфецированная линия клеток может продуцировать вариант по изобретению. Имеется целый ряд общедоступных векторов, подходящих для трансфекции клеток млекопитающих, а способы конструирования таких клеточных линий также общеизвестны, например, в АикиЬе1 е1 а1. (кирга).

Применение варианта аспарагиназы по изобретению в промышленных процессах.

В настоящем изобретении также представлены композиции, включающие аспарагиназы по изобретению. Композиции могут необязательно включать и другие ингредиенты, например другие ферменты. Варианты аспарагиназы по изобретению или композиции, содержащие данные аспарагиназы, могут применяться для получения пищевых продуктов. В одном воплощении изобретения варианты аспарагиназы по изобретению или композиции, содержащие данные аспарагиназы, могут применяться для снижения количества акриламида, образующегося при термической обработке пищевых продуктов на основе со

- 24 017305 держащего аспарагин исходного материала. Например, они могут применяться в способе получения пищевых продуктов, включающем по меньшей мере одну стадию нагревания, который включает добавление одного или нескольких ферментов аспарагиназы в промежуточную форму данного пищевого продукта в данном способе получения, при этом фермент добавляется перед стадией нагревания в количестве, эффективно снижающем уровень аспарагина в данной промежуточной форме пищевого продукта. Такой способ раскрыт в \У0 04/030468, причем сам способ и все его преимущества включены в настоящее изобретение путем ссылки. Также и в \У0 04/026043 описаны подходящие способы, в которых может применяться аспарагиназа по изобретению. Раскрытые в \У0 04/026043 способы и все их преимущества включены в настоящее изобретение путем ссылки.

Промежуточная форма пищевого продукта определяется в настоящем изобретении как любая форма, возникающая в процессе получения до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма может включать индивидуальные исходные материалы, и/или их смеси, и/или смеси с добавками и/или технологическими добавками либо их подвергнутые последующей обработке формы. Например, промежуточные формы пищевого продукта - хлеба включают, к примеру, пшеницу, пшеничную муку, исходную смесь её с другими ингредиентами хлеба, такими, к примеру, как вода, соль, дрожжи и композиции для улучшения хлеба, замешанное тесто, вымешенное тесто, поднявшееся тесто и частично испеченное тесто. Например, для некоторых продуктов из картофеля промежуточными продуктами являются обезвоженные картофельные хлопья или гранулы, а промежуточным продуктом для кукурузных чипсов является кукурузная масса.

Пищевой продукт может быть изготовлен по меньшей мере из одного исходного материала, имеющего растительное происхождение, например картофеля, табака, кофе, какао, риса, зерновых, к примеру пшеницы, ржи, кукурузы, ячменя, крупы, гречихи и овса. Здесь и далее пшеница означает все известные виды из рода Тпбсиш, например Т. аекйуиш, бигиш и/или креНа. Также в рамки изобретения входят пищевые продукты, изготовленные из более чем одного исходного или промежуточного материала, например пищевые продукты, содержащие и пшеницу (муку и/или крахмал), и картофель.

Примеры пищевых продуктов, для которых может подойти способ по изобретению, - это мучные продукты, как то, хлеб, выпечка, пирожные, крендели, бублики, медовые торты, печенье, пряники, имбирное печенье и хлебцы, и картофельные продукты, как то, картофель фри, жареный картофель, картофельные чипсы, крокеты.

Вышеприведенные исходные материалы, как известно, содержат значительное количество аспарагина, который в процессе производства участвует в образовании акриламида на стадии нагревания. С другой стороны, аспарагин может происходить из других источников, чем исходные материалы, например из гидролизатов белков, как то, дрожжевых экстрактов, гидролизата сои, гидролизата казеина и др., которые применяются как добавки в процессе производства пищевых продуктов. Предпочтительным производственным процессом является выпекание хлеба и других хлебобулочных изделий из пшеничной муки и/или муки из других злаков. Другим предпочтительным производственным процессом является обжаривание во фритюре картофельных чипсов из ломтиков картофеля.

Предпочтительными стадиями нагревания являются те, при которых по меньшей мере часть промежуточного пищевого продукта, например поверхность пищевого продукта, подвергается воздействию температур, при которых происходит образование акриламида, например 110°С или выше, 120°С или выше. Стадия нагревания в способе по изобретению может проводиться в печи, например, при температуре 180-220°С, как при выпекании хлеба и других хлебобулочных изделий, либо в масле, как при обжаривании картофельных чипсов, например, при 160-190°С.

В следующем аспекте изобретения предусмотрены пищевые продукты, получаемые способом изобретения, как описано выше, или с применением новых аспарагиназ, как описано выше, для получения пищевых продуктов. Эти пищевые продукты отличаются значительным снижением уровня акриламида по сравнению с продуктами, получаемыми такими способами, которые не включают добавления одного или нескольких ферментов в количестве, эффективно снижающем уровень аминокислот, участвующих в образовании акриламида на данной стадии нагревания. Способ по изобретению может применяться для снижения содержания акриламида в приготовленном пищевом продукте предпочтительно до 50%, более предпочтительно до 20%, еще более предпочтительно до 10% и наиболее предпочтительно до 5% по сравнению с пищевым продуктом, полученным традиционным способом.

Другим применением для вариантов аспарагиназы по изобретению является их применение при лечении опухолей у животных и человека. Метаболизм раковых клеток требует Ь-аспарагина, который может быть быстро разрушен аспарагиназами. Аспарагиназа по изобретению также может применяться как вспомогательное средство при лечении некоторых разновидностей лейкемии у человека. Применение аспарагиназы на экспериментальных животных и людях приводит к регрессии некоторых лимфом и лейкемии. Поэтому в одном воплощении изобретения оно касается аспарагиназ или композиций по изобретению для применения в качестве медикамента, например, при лечении опухолей, например при лечении лимфомы или лейкемии у животных или человека.

Варианты аспарагиназы по изобретению можно удобно продуцировать в микроорганизмах. В вышеописанных способах предпочтительно применяются аспарагиназы, полученные методами рекомби

- 25 017305 нантной ДНК. Такие рекомбинантные ферменты обладают рядом преимуществ, как то, продукция при низкой себестоимости, с высоким выходом, отсутствие таких загрязнений, как бактерии или вирусы, а также отсутствие бактериальных токсинов или примесей активности других ферментов.

Далее изобретение раскрывается на следующих неограничивающих примерах.

Примеры

Материалы и методы.

Определение аспарагиназы для измерения рН-зависимости в диапазоне рН 4-9.

Аспарагиназную активность определяли, используя в качестве субстрата Ь-аспарагин. Количество выделяющегося под действием фермента аммиака измеряли согласно реакции ВейНе1о1. Готовые к употреблению реагенты фенолнитропруссид и щелочной гипохлорит получали из фирмы 81дта. Образец фермента в 100 мкл смешивали с 2000 мкл 100 мМ Ь-аспарагина в буфере из смеси 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия с требуемым значением рН. После инкубации при 37°С в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 400 мкл 25% трихлоруксусной кислоты, после чего добавляли 2500 мкл воды. Во время инкубации температуру поддерживали при 37°С, если не указано иначе.

Специалистам должно быть понятно, что дозировку фермента выбирали таким образом, чтобы после инкубации при вышеуказанных условиях полученный сигнал был значительно выше уровня фона, но попадал в такой диапазоне, в котором полученные сигналы пропорциональны количеству добавленного фермента. Предпочтительно реакция была нулевого порядка.

После остановки реакции 4 мкл инкубационной смеси вносили в 156 мкл воды. После этого добавляли 34 мкл раствора фенолнитропруссида (81дта Р6994) и 34 мкл раствора щелочного гипохлорита (81дта А1727). После инкубации в течение 676 с при 37°С измеряли экстинкцию при 600 нм. Показания подвергали коррекции на фоновый сигнал по соответствующим холостым пробам. В качестве холостой пробы использовали образец с инактивированным ферментом (ТХУ). Определения проводили на автоматическом анализаторе Копе1аЬ Агепа 30 (ТНегто 8с1епЦПс). Активность определяли по калибровочной прямой, которую составляли, нанося на график значения поглощения при 600 нм в зависимости от известных концентраций сульфата аммония из стандартного ряда. Активность выражали в единицах, причем 1 единица определялась как количество фермента, необходимое для выделения 1 мкмоль аммиака из Ь-аспарагина за 1 мин при заданных условиях определения.

Определение аспарагиназы для измерения рН-зависимости в диапазоне рН 4-8.

Выполнялась такая же методика, как описанная выше методика для измерения рН-зависимости активности в диапазоне рН 4-9 с тем отличием, что образец фермента в 100 мкл смешивали с 2000 мкл 100 мМ Ь-аспарагина в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере с требуемым значением рН.

При всех определениях активность аспарагиназы в образцах выражали в единицах на 1 мл.

Пример 1. Ферментация, выделение и очистка аспарагиназ по изобретению.

Аспарагиназы по изобретению получали путем конструирования экспрессионных плазмид, содержащих последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу по изобретению, трансформирования этой плазмидой штамма АкрегдШик шдег и культивирования штаммов АкрегдШик шдег, как описано в \У0 2004/030468.

После культивирования клеток АкрегдШик шдег, содержащих соответствующие экспрессионные плазмиды, получали бесклеточные супернатанты путем центрифугирования ферментационной жидкости при 5000хд в течение 30 мин при 4°С. При необходимости супернатанты дополнительно фильтровали через фильтр Мйас1оШ (Са1ЬюсНет, кат. № 475855) и микроволоконный фильтр ОР/А 01акк фирмы ХУНаИпапп (150 мм 0) соответственно для удаления любых частиц. Чтобы избавиться от грибков, супернатанты доводили до рН 5 с помощью 4 N К0Н и стерилизировали фильтрованием через фильтр на 2 мкм (бутылочный) с отсасыванием. Супернатанты хранили до использования при 4°С или замораживали при -20°С, если нужно.

В том случае, когда примеси составляли более 60 мас.%, аспарагиназы очищали методом анионообменной хроматографии, исходя из бесклеточных супернатантов или ссИР, обессоленных пропусканием через колонку РЬ-10 (АтегкНат Вюкаепсек). Обессоленный материал наносили на колонку с сефарозой Мопо-0 или ρ-сефарозой, уравновешенной в 20 мМ гистидиновом буфере рН 5,96. После исчерпывающей промывки аспарагиназы элюировали из колонки с помощью градиента от 0 до 1 М №С1.

Чистоту фракций супернатанта, содержащих аспарагиназную активность, или очищенных фракций аспарагиназы (определяли в мг белка/мл) проверяли методом аналитической эксклюзионной хроматографии (НР-8ЕС: высокоэффективная эксклюзионная хроматография, Т8Кде1 30008^-ХЬ, колонка 300х 7,8 мм; диапазон мол. весов 10-300 кДа, 100 мМ фосфатный буфер рН 7 и 5,96). Скорость протока составляла 1 мл/мин (за исключением инжекции проб на колонке с О-сефарозой, которое проводилось при 5 мл/мин). Детектирование элюированного белка проводили при 280 нм. Концентрацию элюированных аспарагиназ АкрегдШик шдег рассчитывали по экстинкции при 280 нм (А280), используя молярный коэффициент экстинкции 10240 М^-1-см^-1 (А280^{1см,1мг/мл}=0,28, где А280^{1см,1мг/мл} означает экстинкцию при 280 нм, измеренную при длине пути в 1 см и при концентрации очищенного белка в 1 мг/мл). Измерение А280 проводили на спектрофотометре Иу1коп ХЬ 8есотат (Веип бе Ройбе, АЬсоибе, Нидерланды). Для

- 26 017305 аспарагиназы, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0: 4 (А8№)02). и аспарагиназы, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0: 2 (А8К001), использовали 8960 М^-1-см^-1 (А280^{1см,1мг/мл}=0,25) и 11520 М^-1-см^-1 (А280^{1см,1мг/мл}=0,31) соответственно. При наличии примесей, поглощающих при 280 нм, концентрацию аспарагиназ подвергали коррекции по хроматограмме НР-8ЕС, умножая значение А280 в образце аспарагиназы на отношение площади под пиком аспарагиназы к общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Если пики аспарагиназ не были четко отделены от других пиков, то вместо площади пика использовали его высоту.

Пример 2. Функционирование аспарагиназ по изобретению.

Удельная активность в зависимости от рН.

Определяли удельную активность вариантов аспарагиназы при рН 4, 5, 6, 7, 8 при 37°С в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере, используя бесклеточные супернатанты. Удельная активность фермента настоящим определяется как активность, измеренная в образце фермента в единицах на 1 мг очищенного полипептида фермента. Следовательно, удельная активность аспарагиназы есть активность, измеренная в образце аспарагиназы в единицах на 1 мг очищенного полипептида аспарагиназы.

Для определения удельной активности аспарагиназы её концентрацию в супернатанте выводили по измерению А280 с применением коррекции на загрязнения по хроматограмме НР-8ЕС, как указано в Материалах и методах.

Таблица 1

Удельная активность вариантов относительно аспарагиназы дикого типа (χνΐ)

А. шдег (\У0 2004/030468) при использовании в качестве субстрата аспарагина при указанных значениях рН

	рН=4 (%)	рН=5 (%)	рН=6 (%)	рН=7 (%)	рН=8 (%)
м	100	100	100	100	100
Α8Ν002	14	125	226	374	1033
Α8Ν001	55	246	418	697	1758

При каждом значении рН за 100% принималась удельная активность дикого типа. Активность определяли при 37°С.

В сравнении с диким типом у вариантов А8№)02 и А8№)01 рН-оптимум сместился от рН 4 к рН 6. Кроме того, рН-оптимум сильно расширился, в особенности в щелочном диапазоне. Варианты А8№)02 и А8№)01 при всех измеренных значениях рН выше 4 проявляют существенно более высокую удельную активность, чем у дикого типа.

рН-Зависимость активности и рН-оптимум.

Определяли рН-зависимость аспарагиназной активности в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере в диапазоне рН от 4 до 8, используя бесклеточные супернатанты. Значение рН, при котором у варианта наблюдалась самая высокая активность, именуется рН-оптимумом для данного варианта. В табл. 2 за 100% принимали максимальную активность, наблюдавшуюся у данного варианта, а активности при других значениях рН приведены в процентах от максимальной активности, наблюдавшейся у данного варианта.

Таблица 2

Зависимость аспарагиназной активности от рН у вариантов в сравнении с аспарагиназой дикого типа (χνΐ) А. шдег (\У0 2004/030468)

	рН=4 (%)	рН=5 (%)	рН=6 (%)	рН=7 (%)	рН=8 (%)
νΛ	100	98	71	42	15
Α5Ν002	9	76	100	95	90
Α8Ν001	19	81	100	95	83

За 100% принимали самую высокую активность, наблюдавшуюся у каждого варианта. Активность определяли при 37°С.

Из табл. 2 видно, что рН-оптимум сместился к более высоким значениям рН. Кроме того, у вариантов значительно улучшилась активность при щелочных значениях рН, что делает эти варианты очень полезными для применений, требующих аспарагиназной активности при более щелочных условиях.

Ширина рН-профиля активности у вариантов.

Наиболее примечательной особенностью А8№)02 и А8№)01 является то, что эти две аспарагиназы проявляют чрезвычайно широкий рН-профиль активности в наиболее полезном диапазоне рН от 4 до 9, чего не наблюдалось раньше ни у каких аспарагиназ. Для того чтобы установить ширину рН-профиля активности, определяли активность в пределах рН от 4 до 9, используя цитратно-пирофосфатный буфер. Ширина рН-профиля активности означает ширину того интервала рН, выраженного в единицах рН, в котором фермент проявляет от 50 до 100% своей максимальной активности. Ширина рН-профиля активности определяется на графике зависимости активности от рН. Ширина интервала рН, выраженного в единицах рН, в котором фермент проявляет не менее 50% от своей максимальной активности, задает ширину рН-профиля активности данного фермента. Если провести прямую параллельно оси рН на уровне половины от максимальной активности, то рН-профиль активности будет пересекаться с этой прямой

- 27 017305 при двух значениях рН. Эти два значения рН на пересечении, одно для кислотной части и другое для щелочной части рН-профиля активности, и задают ширину рН-профиля активности. При промежуточных значениях рН активность составляет не менее 50% от максимальной активности. Максимальная активность определяется как самая высокая активность, которая наблюдается на графике зависимости активности от рН. Значение рН, соответствующее самой высокой активности, составляет рН-оптимум данного фермента.

Таблица 3

Ширина рН-профиля активности у А8М)02 и А8М)01 в сравнении с аспарагиназой дикого типа А. шдег (\У0 2004/030468) и дикого типа А. огухае (\У0 2004/032648)

Аспарагинаэа	Активность = 50% в кислом сегменте	Активность = 50% в щелочном сегменте	Ширина рН-профиля активности на уровне 50% от максимальной активности
А. пщег	н/о	рН = 6,7	не определяли (н/о)
Α8Ν002	рН = 4,6	рН = 9,0	4,4 единицы рН
Α8Ν001	рН = 4,5	рН = 8,6	4,1 единицы рН
А. огугае	рН = 5,2	рН = 8,2	3,0 единицы рН

Активность определяли при 37°С. Активность в диапазоне рН от 4 до 9 измеряли, используя смесь Ь-аспарагина с буфером из 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия при заданном рН, как описано в разделе Материалы и методы. Использовали образцы фермента в интервале 1,5-12 единиц/мл.

В табл. 4 представлена полная рН-зависимость активности при определении в диапазоне рН от 4 до

9.

Таблица 4

Зависимость активности от рН у А8М)02 и А8М)01 в сравнении с аспарагиназой дикого типа А. шдег (№0 2004/030468) и А. оп/ае (№0 2004/032648)

	Α8Ν002	Α8Ν001	АзрегяШиз ш^ег	Азреод11из огугае
рН	относ, активность (%)	относ, активность (%)	относ, активность (%)	относ, активность (%)
4	10	18	100	4
5	75	76	97	50
6	100	100	69	95
7	95	94	44	100
8	80	72	15	63
9	49	35	0	30

За 100% принимали самую высокую активность у каждой аспарагиназы. Активность определяли при 37°С. Активность в диапазоне рН от 4 до 9 измеряли, используя смесь Ь-аспарагина с буфером из 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия при заданном рН, как описано в разделе Материалы и методы. Использовали образцы фермента в интервале 1,5-12 единиц/мл.

Устойчивость вариантов

Помимо активности при данном рН, функционирование фермента также критически зависит от его термостабильности при преобразовании. Для проверки термостабильности наиболее активных вариантов проводили определение активности при 60°С. В одном опыте реакцию фермента останавливали через 10 мин, а в другом опыте реакцию останавливали через 30 мин. Дозировка фермента в 30-минутном опыте составляла одну треть от дозировки в 10-минутном опыте. Если фермент устойчив в применявшихся условиях, то должна наблюдаться одинаковая активность. Если же происходит инактивация, то активность должна уменьшаться при более продолжительном определении. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Устойчивость вариантов

Дикий тип ед./мл	60°С
10 мин	30 мин
рН 5	59,0	64,8
рН 6	36,1	38,9
рН 7	5,1	1,8
рН8	0,2	0,5
Α8Ν002 ед./мл	60°С
10 мин	30 мин
рН 5	34,2	19,1
рН6	51,8	43,2
рН 7	50,7	45,3
рН 8	46,2	43,3
Α8Ν001 ед./мл	60°С
10 мин	30 мин
рН 5	97,6	79,0
рН6	114,0	106,0
рН 7	101,0	97,7
рН 8	86,2	81,6

Опыты проводились при 60°С, а дозировка фермента в 30-минутном опыте составляла одну треть от дозировки в 10-минутном опыте, что соответствует продолжительности инкубации в 10 и 30 мин со

- 28 017305 ответственно.

Из табл. 5 видно, что устойчивость вариантов очень близка аспарагиназе дикого типа АврегдШив шдег. При рН 6, 7, 8 варианты А8М)02 и А8М)01 полностью активны при 60°С и проявляют лишь небольшое снижение активности после 30-минутной инкубации. Вследствие этого повышенная активность может полностью использоваться при превращении аспарагина в аспарагиновую кислоту. В частности, при заданных значениях рН в нейтральном и щелочном диапазоне функционирование вариантов значительно улучшается.

Claims

1. Аспарагиназа, которая представляет собой:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4; или

b) полипептид, который по меньшей мере на 85% гомологичен полипептиду по п.а); или

c) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 8Е0 ΙΌ N0: 3, кодирующей зрелый полипептид.

2. Аспарагиназа по п.1, у которой в отношении 8Е0 ΙΌ N0: 2 полипептид по пп.Ь), с) или б) содержит одну или несколько аминокислот из числа А1а в положении 25, Тйг в положении 28, Туг в положении 30, 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, Тйг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, Тйг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении 126, 8ег в положении 131, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, Рйе в положении 208, А1а в положении 210, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Авп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, Туг в положении 240, Тйг в положении 250, Тйг в положении 251, Уа1 в положении 252, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, С1п в положении 273, 8ег в положении 279, Авр в положении 282, Авп в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, Авр в положении 307, Не в положении 309, А1а в положении 310, 8ег в положении 311, Ьув в положении 312, Н1в в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Ьеи в положении 319, Тйг в положении 321, С1у в положении 324, Тйг в положении 330, Рйе в положении 345, А1а в положении 351, А1а в положении 360, С1и в положении 361, С1у в положении 364, Рйе в положении 365, Ьув в положении 366, Агд в положении 369, С1и в положении 370, Ьув в положении 374, Уа1 в положении 375 и Уа1 в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 2.

3. Аспарагиназа по п.1, у которой в отношении 8ЕО ΙΌ N0: 4 полипептид по пп.Ь), с) или б) содержит одну или несколько аминокислот из числа 8ег в положении 35, Ьеи в положении 53, 8ег в положении 63, А1а в положении 64, Авр в положении 65, Авп в положении 66, А1а в положении 74, Не в положении 77, Не в положении 79, С1п в положении 80, Тйг в положении 81, С1и в положении 88, Рго в положении 106, Уа1 в положении 108, 8ег в положении 111, Ьеи в положении 114, А1а в положении 117, Тйг в положении 119, С1и в положении 122, Авр в положении 126, Уа1 в положении 161, А1а в положении 168, С1п в положении 181, Рго в положении 189, А1а в положении 190, Ьеи в положении 197, Уа1 в положении 205, Рйе в положении 208, 8ег в положении 211, Уа1 в положении 224, Авп в положении 228, А1а в положении 231, Не в положении 232, Уа1 в положении 233, Ьув в положении 236, Туг в положении 238, Тйг в положении 250, Тйг в положении 251, Уа1 в положении 254, Агд в положении 255, 8ег в положении 259, Туг в положении 267, С1п в положении 270, Авр в положении 279, Авр в положении 282, Авп в положении 283, Ьув в положении 286, 8ег в положении 293, 8ег в положении 297, 8ег в положении 299, 8ег в положении 300, С1у в положении 301, 8ег в положении 303, Авр в положении 304, Не в положении 309, 8ег в положении 311, Тйг в положении 312, Н1в в положении 313, 8ег в положении 314, Не в положении 317, Тйг в положении 321, С1у в положении 324, Рго в положении 330, С1и в положении 333, С1п в положении 336, Рйе в положении 341, А1а в положении 356, С1у в положении 360, С1и в положении 362, Агд в положении 365, С1и в положении 366, Ьув в положении 370, Уа1 в положении 371, С1у в положении 372 и Уа1 в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к 8ЕО ΙΌ N0: 4.

4. Аспарагиназа по любому из пп.1-3, у которой рН-оптимум находится между рН 6 и 7 и/или у которой удельная активность при рН не менее 5 будет выше по сравнению с удельной активностью аспарагиназы дикого типа из А. шдег при измерении в одинаковых условиях.

5. Аспарагиназа по любому из пп.1-4, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН.

6. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аспарагиназу по п.5.

7. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая:

- 29 017305

a) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу согласно ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4;

b) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу, которая по меньшей мере на 85% гомологична полипептиду согласно ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4;

й) последовательность ДНК, которая гибридизируется с высокой строгостью с комплементарной нитью последовательности ДНК по п.а) или Ь); или

е) комплементарную нить последовательности ДНК по пп.а)-й) или е).

8. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.7, причем полипептид, кодируемый данной последовательностью нуклеиновой кислоты, представляет собой вариант, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую одно или несколько усечений и/или по меньшей мере одну замену, делецию и/или вставку аминокислоты по сравнению с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4.

9. Конструкция из нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.6-8, функционально соединенную с одной или несколькими контрольными последовательностями, способными управлять экспрессией аспарагиназы в подходящем организме хозяина.

10. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий конструкцию из нуклеиновой кислоты по п.9.

11. Рекомбинантные клетки хозяина, содержащие экспрессионный вектор по п.10.

12. Способ получения аспарагиназы, включающий культивирование клеток хозяина по п.11 в условиях, способствующих продукции аспарагиназы, и выделение аспарагиназы.

13. Композиция, включающая аспарагиназу по любому из пп.1-5 или полученную способом по п.12.

14. Применение аспарагиназы по любому из пп.1-5 или композиции по п.13 при получении пищевого продукта.

15. Применение аспарагиназы по любому из пп.1-5 или композиции по п.13 для снижения количества акриламида, образующегося при термической обработке пищевого продукта на основе содержащего аспарагин исходного материала.

16. Способ обработки пищевого продукта с целью уменьшения в нем количества аспарагина, включающий по меньшей мере одну стадию нагревания, который включает добавление одного или нескольких ферментов аспарагиназы по любому из пп.1-5 или композиции по п.13 в промежуточную форму данного пищевого продукта в данном способе получения, при этом фермент добавляется перед стадией нагревания в количестве, эффективно снижающем уровень аспарагина в данной промежуточной форме пищевого продукта.

17. Применение аспарагиназы по любому из пп.1-5 или композиции по п.13 в производстве лекарственного средства для лечения опухолей.