RU2560597C2 - Аспарагиназа, полученная из базидомицетов - Google Patents
Аспарагиназа, полученная из базидомицетов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2560597C2 RU2560597C2 RU2013106310/10A RU2013106310A RU2560597C2 RU 2560597 C2 RU2560597 C2 RU 2560597C2 RU 2013106310/10 A RU2013106310/10 A RU 2013106310/10A RU 2013106310 A RU2013106310 A RU 2013106310A RU 2560597 C2 RU2560597 C2 RU 2560597C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- asparagine
- asparaginase
- enzyme
- food
- glutamine
- Prior art date
Links
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 title claims abstract description 88
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 title claims abstract description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 title description 32
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 title description 30
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 80
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 46
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 240000006499 Flammulina velutipes Species 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 235000013606 potato chips Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 claims description 3
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000012020 french fries Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000533293 Sesbania emerus Species 0.000 claims description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011850 desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000012046 side dish Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 46
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 46
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000016640 Flammulina velutipes Nutrition 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 4
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 3
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 2
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 2
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N Ala-Cys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- XPBVBZPVNFIHOA-UVBJJODRSA-N Ala-Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 XPBVBZPVNFIHOA-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- AYKKKGFJXIDYLX-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AYKKKGFJXIDYLX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CASGONAXMZPHCK-FXQIFTODSA-N Asp-Asn-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)CN=C(N)N CASGONAXMZPHCK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BOXNGMVEVOGXOJ-UBHSHLNASA-N Asp-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N BOXNGMVEVOGXOJ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000751139 Beauveria bassiana Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 101100462378 Danio rerio otpb gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N Gln-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N Gly-Gln-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DTRUBYPMMVPQPD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010054320 Lignin peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OVAOHZIOUBEQCJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010059896 Manganese peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- UEHNWRNADDPYNK-DLOVCJGASA-N Phe-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N UEHNWRNADDPYNK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- GYEPCBNTTRORKW-PCBIJLKTSA-N Phe-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GYEPCBNTTRORKW-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N Phe-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- 101710180958 Putative aminoacrylate hydrolase RutD Proteins 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N Ser-Cys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CO MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- KJMOINFQVCCSDX-XKBZYTNZSA-N Ser-Gln-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KJMOINFQVCCSDX-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- JZRYFUGREMECBH-XPUUQOCRSA-N Ser-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O JZRYFUGREMECBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- CURFABYITJVKEW-QTKMDUPCSA-N Thr-Val-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O CURFABYITJVKEW-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- NAQBQJOGGYGCOT-QEJZJMRPSA-N Trp-Asn-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NAQBQJOGGYGCOT-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N Tyr-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 235000021152 breakfast Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000020788 dietary exposure Nutrition 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003309 forest litter Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000015074 other food component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013573 potato product Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
- A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый фермент аспарагиназу, полученную из Basidiomycete. Изобретение относится также к способу гидролиза одного из L-аспарагина или L-глутамина, включающего обработку субстрата, содержащего одно из L-аспарагина или L-глутамина, ферментом аспарагиназой. Изобретение относится также к способу уменьшения образования акриламида в пищевом веществе, содержащем L-аспарагин, включающему нанесение на пищевое вещество, содержащее L-аспарагин фермента аспарагиназы и нагревание вещества, содержащего L-аспарагин. Изобретение позволяет расширить арсенал ферментов, относящихся к аспарагиназам, а также уменьшить образование канцерогенного акриламида в термически обработанной пище. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к ферменту аспарагиназе, получаемому из грибов класса базидиомицетов (Basidiomycetes), в частности Flammulina velutipes (опенок зимний). Кроме того, раскрываются способы гидролиза L-аспарагина и L-глутамина. Также раскрывается способ уменьшения образования акриламида в веществе, содержащем L-аспарагин.
Уровень техники
Применение фермента аспарагиназы в технологии пищевых продуктов берет начало от открытия того, что при температурной (тепловой) обработке пищи аспарагин в присутствии восстанавливающих углеводов частично превращается в акриламид. Поскольку углеводы, так же как и аминокислоты, повсеместно встречаются в пище, существует постоянный риск образования канцерогенного и генотоксичного акриламида во время тепловой обработки пищи. Температурной обработкой является, например, выпекание, жарение, обжаривание целиком или обжаривание во фритюре. Начало образования акриламида во время тепловой обработки пищи наблюдается при температурах, превышающих 120°С. Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам (JECFA) констатировал, что воздействие акриламида из рациона питания может затрагивать здоровье человека, принимая во внимание его генотоксичность и канцерогенность.
(См. www.inchem.org/documents/jecfa/jeceval/jec_41.htm viewed on 1 July 2010.)
Особенно важное значение это имеет в пищевой промышленности в отношении многочисленного разнообразия продуктов, например, хлеба, булок, закусок, печенья, готовых завтраков (хлопьев), жареных зерен (таких как какао и кофе), экструдированных и резаных картофельных продуктов, которые объективно нуждаются в тепловой обработке.
Тепловая обработка пищи необходима для обеспечения качества пищи. Например, реакция потемнения (реакция Майларда) обеспечивает характерный аромат и цвет пищи. Более того, безопасность в отношении микробов и длительный срок хранения достигаются благодаря тепловой обработке пищи.
Было бы желательно обеспечить селективное удаление L-аспарагина до тепловой обработки пищи.
Как сообщалось, генетическая инженерия картофеля с использованием антисмыслового гена аспарагинсинтазы и клубень-специфических промоторов уменьшает, но не полностью устраняет аспарагин из клубней картофеля (Rommens 2007); по общему мнению, полное исключение аспарагина является летальным для растения.
Ферменты представляют собой идеальные селективные (избирательные) средства для того, чтобы модифицировать пищевые составляющие (компоненты пищи) без воздействия на другие составляющие пищи. Каталитическое действие ферментов на пищу отличается высокой субстратной специфичностью плюс специфичностью реакции и мягкими физическими условиями действия ферментов. Действие фермента на пищу является в большей мере экологически безопасным в связи с тем, что не задействованы органические растворители и тяжелые металлы ("зеленая химия"; "белая биотехнология"). Использование ферментов для модификации компонентов пищи позволяет изменить отдельный компонент пищи, в то же время избегая каких-либо побочных реакций, которые впоследствии могут приводить к образованию токсичных соединений в пище.
Однако в настоящее время отсутствует ферментативная технология, которая может рассматривать вопрос о селективном гидролизе белок-связанной аминокислоты, такой как аспарагин пищевого белка, даже без сохранения при этом обычных структурных и органолептических свойств соответствующего питательного вещества.
Например, было бы желательным гидролизовать свободный и мобильный аспарагин в пище до аспарагиновой кислоты. После этого аспарагин не может служить в качестве молекулы-предшественника для образования акриламида при термической обработке пищи.
Аспарагиназа (ЕС 3.5.1.1; L-аспарагин аминогидролаза) представляет собой фермент, катализирующий гидролиз L-аспарагина до аспарагиновой кислоты с выделением аммиака. По существу, фермент аспарагиназа действует на азот-углеродную связь в линейных амидах, а не на пептидные связи L-аспарагина.
L-аспарагин был первой открытой аминокислотой (в 1806 г.в соке спаржи лекарственной Asparagus officinalis), при этом L-аспарагин является универсальным для всех живых клеток. Соответственно, фермент аспарагиназа встречается в природе в большом количестве у животных от прокариотических микроорганизмов до позвоночных; см. Halpern, Y.S. and Grossowicz, N., Hydrolysis of amides by extracts from mycobacteria, Biochem. J. 65:716-720 (1957); Но, Р.Р.K., Frank, B.H. and Burck, P.J., Crystalline L-Asparaginase from Escherichia coli В., Science 165:510-512 (1969); Suld, H.M. and Herbut, P.A., Guinea pig serum and liver L-asparaginases - Comparison of serum and papain-digested liver L-asparaginase. J. Biol. Chem. 245:2797-2801 (1970). Первыми подробно исследованными аспарагиназами были тетрамерные аспарагиназы из E.coli, состоящие из 326 аминокислот (Jackson, R. Ch. and Handschumacher, R. E., Escherichia coli L-asparaginase. Catalytic activity and subunit nature, Biochemistry, 1970, 9 (18), pp 3585-3590).
До недавнего времени L-аспарагиназу использовали в качестве цитостатика для борьбы с клетками лейкоза и мастоцитомы (Herbert F. Oettgen, L-asparaginase: Ein neues Prinzip in der Chemotherapie maligner Neoplasien, Annals of Hematology, 1969, 19(6), 351-356).
Совсем недавно сообщалось о выделении фермента аспарагиназы из бактерий (Helicobacter pylori, Scotti et al. 2010; Pyrococcus furiosus, Greiner-Stoeffele and Struhalla, 2008) и плесневых грибов (Aspergillus niger. Van der Laan et al. 2008; Aspergillus oryzae, Matsui et al. 2008). Добавление двух и трехвалентных катионов и различных аминокислот и свободных тиолов (Elder et al. 2007), или альфа-амилазы (de Boer, 2006) или хлористого кальция в сочетании с фосфорной или лимонной кислотой (Elder et al. 2005) было заявлено для поддержки некоторой активности фермента аспарагиназы.
Глутаминаза является ферментом, родственным аспарагиназе. Глутаминазу выделяют из молочнокислых бактерий, поскольку они встречаются, например, в кишечной флоре кур (Thongsanit et al. 2008; Lactobacillus rhamnosus, Weingand-Ziade et al. 2003), из дрожжей (Zygosaccharomyces rouxii, Iyer and Singhal 2010), из морских грибков (Beauveria bassiana, Sabu et al. 2002) или опять же из плесневых грибов Aspergillus (Prasanth et al. 2009).
Применение фермента аспарагиназы в технологии пищевых продуктов является согласованным совсем недавно. В 2007 г. ферментный препарат превентаза (DSM) был введен на европейский рынок. Фермент превентаза (DSM) продуцируется рекомбинантным плесневым грибом, Aspergillus niger. Конкурирующий с аспарагиназой фермент, называемый Acrylaway (Novozymes), получают из родственных видов плесневых грибов Aspergillus oryzea с помощью погруженной периодической ферментации с подпиткой из генетически модифицированного штамма, несущего ген, кодирующий фермент аспарагиназу из Aspergillus oryzae. Оба штамма Aspergilli (Aspergillus niger и Aspergillus oryzae) описываются как имеющие продолжительный опыт безопасного промышленного использования, поскольку широко распространены в природе и обычно используются для производства ферментов пищевого качества.
При выпекании фермент аспарагиназу, как правило, смешивают с тестом перед тепловой обработкой пищи (например, выпеканием), чтобы устранить образование акриламида. При приготовлении картошки фри может применяться погружение кусочков картофеля в раствор или обрызгивание раствором аспарагиназы. Такая обработка может быть очень эффективной. Сообщалось о снижении уровней акриламида в готовом продукте при производстве картофельных чипсов от 1688 мкг/кг до 60 мкг/кг в сравнении с необработанными картофельными чипсами (Corrigan (2008)). Предполагается, что осуществимо уменьшение образования акриламида до >99,9% (Elder et al. 2004).
Безопасность изделия в отношении применения аспарагиназы в продуктах питания не является проблемой, так как фермент будет термоинактивироваться при тепловой обработке пищи перед стадией упаковки. Поэтому фермент аспарагиназа едва ли будет вступать в контакт с потребителем в своей активной форме.
Ферменты, полученные из базидомицетов
Большая часть из 1000 съедобных грибов относится к классу Basidiomycota (Базидиомицеты). Базидомицеты часто называются высшими грибами. Базидомицеты размножаются посредством образования булавовидных (столбчатых) клеток, несущих четыре мейоспоры. Своим названием базидомицеты обязаны своему строению (лат. Basidium = столб, базидий). Базидомицеты высоко ценятся во всем мире за их богатый вкус, высокое содержание белка и волокон и одновременно низкую калорийность. Кроме того, в Азии многим базидиальным грибам приписывают целебные для здоровья и заживляющие свойства.
Сапрофитные базидомицеты обычно заселяют древесные остатки в лесу, лесные почвы, лесную подстилку и упавшие деревья. Вегетативные клетки распространяются в подпочвенной области, образуя длинные нитевидные клетки (гифы). Для того чтобы выжить на в высшей степени стойком органическом веществе на земле, трехмерной сети лигнина, они обладают необыкновенно мощным набором оксидоредуктаз. К числу оксидоредуктаз относятся лигнинпероксидаза, марганцевая пероксидаза, универсальная пероксидаза, H2O2 продуцирующие оксидазы, такие как глюкозоксидаза и фенолоксидазы типа лакказы. Также обнаружены гликозидазы, такие как целлюлазы, которые помогают расщеплять целлюлозу древесины.
Поскольку в древесине лиственных и хвойных деревьев не содержится значительного количества белка и аминокислот, проявление активности аспарагиназы у грибов, растущих в этой отдельной природной среде обитания, не должно рассматриваться.
Культурные сорта Flammulina velutipes из базидомицетов также известны под названием «энокитаке», фламуллина бархатистоножковая или опенок зимний. Flammulina velutipes образует длинные, тонкие, белые плодовые тела, которые используются в Азиатской кухне как универсальные грибы. Грибы традиционно используются свежими, консервированными в герметичной упаковке для супов, салатов и других блюд. Грибы могут быть охлажденными примерно в течение одной недели.
Цель изобретения
Цель настоящего изобретения - предоставить фермент аспарагиназу с высокой активностью и высокой устойчивостью при работе (устойчивым рабочим состоянием).
Дополнительная цель изобретения - уменьшить образование акриламида в пищевом продукте путем применения фермента аспарагиназы.
Раскрытие изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к аспарагиназе, полученной из базидомицетов. В частности, базидомицетов Flammulina velutipes.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к способу гидролиза, по меньшей мере, одного из L-аспарагина или L-глутамина. Способ включает обработку вещества, содержащего, по меньшей мере, одно из числа L-аспарагина или L-глутамина, аспарагиназой, полученной из базидомицетов.
В следующем аспекте настоящее изобретение имеет отношение способу уменьшения образования акриламида в веществе, содержащем L-аспарагин. Способ включает применение к веществу, содержащему L-аспарагин, фермента аспарагиназы, полученной из базидомицетов. Далее способ включает нагревание вещества, содержащего L-аспарагин.
Вещество, содержащее, по меньшей мере, одну аминокислоту L-аспарагин или L-глутамин, может быть пищевым продуктом.
Кроме того, изобретение имеет отношение к продуктам, полученным способами настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на некоторые варианты осуществления, как показано на следующих фигурах:
фиг.1 показывает зависимость от времени внутриклеточного образования фермента аспарагиназы грибов Flammulina velutipes, выращенных в погруженной культуре;
фиг.2 показывает зависимость от времени внеклеточного образования фермента аспарагиназы грибов Flammulina velutipes, выращенных в погруженной культуре;
фиг.3 показывает геномную (А) и кодирующую (В) нуклеотидные последовательности и аминокислотную последовательность (С) фермента аспарагиназы грибов Flammulina velutipes. Первые 19 аминокислот называются сигнальной последовательностью;
фиг.4 показывает устойчивость к действию соли фермента аспарагиназы из Flammulina velutipes, экспрессированной в E.coli как в гетерологичном хозяине и использованной в виде неочищенного (сырого) фермента;
фиг.5 показывает устойчивость к рН фермента аспарагиназы из Flammulina velutipes, экспрессированной в E.coli как в гетерологичном хозяине и использованной в виде неочищенного фермента;
фиг.6 показывает оптимальное значение рН для аспарагиназы из Flammulina velutipes;
фиг.7 показывает устойчивость к температуре фермента аспарагиназы из Flammulina velutipes, экспрессированной в E.coli как в гетерологичном хозяине и использованной в виде неочищенного фермента;
фиг.8 показывает а) исследование активности с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) и b) разделение фермента аспарагиназы Flammulina velutipes с помощью денатурирующего PAGE;
фиг.9 показывает температурный оптимум для аспарагиназы Flammulina velutipes.
Осуществление изобретения
С целью полного понимания настоящего изобретения и его преимуществ приводится подробное описание изобретения во взаимосвязи с фигурами.
Следует учесть, что различные аспекты настоящего изобретения только иллюстрируют конкретные способы употребления и использования изобретения и не ограничивают рамки изобретения, когда принимаются во внимание вместе с пунктами формулы изобретения и следующим подробным описанием.
В настоящем изобретении термин фермент аспарагиназа относится к ферменту, способному гидролизовать и L-аспарагин и L-глутамин.
Цель настоящего изобретения - значительно уменьшить образование канцерогенного акриламида в термически обработанной пище путем совмещенного ферментативного гидролиза предшественника акриламида L-аспарагина с помощью фермента аспарагиназы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения раскрывается способ производства фермента аспарагиназы. Аспарагиназу, обладающую высокой устойчивостью при работе, получают из мицелия базидомицетов Flammulina velutipes.
Штамм Flammulina velutipes является коммерчески доступным из коллекций культур, таких как DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Германия) или CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Нидерланды).
Использование мицелия базидомицетов Flammulina velutipes обеспечивает большие преимущества в отношении удобства производства и культивирования, поскольку не требуется собирать плодовые тела в диких местах. При широком использовании этого вида базидомицетов Flammulina velutipes в качестве продукта питания отсутствует очевидный риск для здоровья или безопасности.
Грибы базидомицеты вида Flammulina velutipes можно легко вырастить в погруженной культуре с минимальными требованиями в отношении добавок к среде. Должны присутствовать органический источник углерода, источник азота и источник фосфора; эти источники, как правило, обеспечиваются обычными смесями, такими как дрожжевой экстракт или смесь глюкозы с неорганическими аммониевыми и фосфатными солями. Также добавляют смеси второстепенных элементов и микроэлементов, рекомендованных для всех питательных сред микроорганизмов. Культивирование Basidiomycetes Flammulina velutipes предпочтительно осуществляют в погруженной культуре в течение от 3 до 20 дней, предпочтительно в течение от 6 до 15 дней. В большинстве случаев температура во время культивирования Basidiomycetes Flammulina velutipes находится в пределах от 10 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С. Значение рН примерно от 4 до 8 является типичным, при этом предпочтительным является значение рН примерно от 5 до 7. Кроме того, типичными для этого метода являются условия слабого освещения.
Способ производства биомассы и фермента аспарагиназы работает при умеренных (нежестких) условиях и является экологически безвредным в противоположность методам предшествующего уровня техники.
Ферментативная активность аспарагиназы сначала определяется внутри клеток, как показано на фиг.1, и затем определяется и в питательной среде, как показано на фиг.2.
Использование питательной среды облегчает осуществление способа, также как выделение и накопление фермента аспарагиназы с помощью известных в данной области техники методов. Такими методами могут быть ультрафильтрация, осаждение или абсорбция. Благодаря этому можно получить и затем использовать для технического гидролиза не содержащий клетки концентрированный культуральный супернатант фермента аспарагиназы. Хотя фермент аспарагиназу можно выделить с помощью известных в данной области техники методов, нет необходимости это делать, так как полученный неочищенный препарат фермента аспарагиназы может использоваться далее в настоящем способе.
В процессе погруженного культивирования Flammulina velutipes был обнаружен пик (максимум) внутриклеточной активности фермента аспарагиназы приблизительно через одну неделю. Выделение во внеклеточное пространство начиналось через 12 дней и достигало пика приблизительно через 14 дней.
Активность окрашивания полиакриламидного геля, полученного при электрофорезе в нативных условиях, подтвердила каталитическую специфичность, на фиг.8 видны активные полосы очищенного фермента с массой 13 и 74 кДа, что указывает на присутствие не только мономерной, но и олигомерной формы.
В том случае, когда необходима максимальная чистота аспарагиназы, может использоваться рекомбинантный продукт из Bacillus subtilis. Для получения рекомбинантных штаммов необходимо знать полную аминокислотную последовательность фермента. Полная аминокислотная последовательность аспарагиназы показана на фиг.3, на которой представлена полная последовательность всех 123 аминокислотных остатков, полученная из полной последовательности структурного гена, состоящего из 372 пар оснований. Перед кодирующей областью находится сигнальная последовательность, состоящая из 18 пар оснований.
Апарагиназу добавляют к субстрату. Под добавлением аспарагиназы к субстрату имеется в виду, что аспарагиназа контактирует с субстратом. Это может включать, например, разбрызгивание, погружение или покрытие субстрата ферментом. Субстрат предпочтительно является пищевым веществом, которое содержит одно из числа L-аспарагина или L-глутамина. В большинстве случаев аспарагиназа наносится на субстрат в миллимолярных концентрациях приблизительно от 1 до 200, предпочтительно в миллимолярных концентрациях от 10 до 20 в зависимости от специфической активности. Фермент аспарагиназа может добавляться в виде чистого белка. Альтернативно фермент аспарагиназа может изготавливаться для специального применения в соответствии с предполагаемым использованием путем добавления к ферменту аспарагиназе таких ингредиентов, как лактоза, глицерин или альбумин с целью облегчить дозирование. Промышленно произведенный фермент аспарагиназа или изготовленный для специального применения фермент аспарагиназа может иметь форму таблеток, гранулята, стабилизированной жидкости или пастообразного препарата.
Для получения субстрата со значительно более низкими уровнями аспарагина или глутамина по сравнению с субстратом до обработки проводится гидролиз субстрата. Можно использовать стандартные условия проведения гидролиза, которые могут быть легко определены специалистом в данной области техники.
Поскольку на активность фермента аспарагиназы не оказывает действия химическая среда, в которой присутствует фермент, субстратом для обработки могут быть, например: напитки, бобы какао, сыр, кофейные зерна, кондитерские изделия, десерты, тесто, гарниры, картофель фри, фруктовые напитки, мясные продукты, продукты лечебного питания, питательные добавки, корм для домашних животных, картофельные чипсы, соусы, закуски, супы.
В частности, субстратом является любое изделие, предназначенное для потребления человеком или животным.
Степень гидролиза аспарагина в субстрате можно оценить или путем измерения уменьшения аспарагина, аспарагиновой кислоты или увеличения аммиака, или после обработки пищи путем измерения уровня остаточного акриламида.
Преимущество, предоставленное изобретением, состоит в том, что полученный в результате новый фермент аспарагиназа обладает явно выраженным сродством (высокой аффинностью) и демонстрирует улучшенную эффективность при гидролизе L-аспарагина.
Еще более неожиданными являются отличные технические свойства аспарагиназы в отношении функциональной устойчивости, что дает возможность ее использования в процессах при повышенной температуре и ионной силе и при разных условиях рН (фиг.4-7). Не требуется дополнительных ко-субстратов за исключением воды.
Новый фермент аспарагиназа обладает хорошей устойчивостью к рН и широким оптимумом рН в пределах между рН 5,5 и 9, смотри фиг.5 и 6. В этом интервале находится значение рН большинства продуктов питания.
Устойчивость при работе (функциональная устойчивость) фермента аспарагиназы не уменьшается даже при температурах вплоть до 55°С, см. фиг.7.
Изоэлектрическая точка мономера и олигомера аспарагиназы находится около 5,2, что было определено с помощью гель-электрофореза с изоэлектрическим фокусированием. Молекулярные массы мономера и олигомера аспарагиназы составляют 12,8, как установлено из полной последовательности, и около 74 для агрегированной формы, как установлено с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), смотри фиг.8.
Уникальная последовательность фермента аспарагиназы, показанная на фиг.3, была определена с помощью ESI-MS анализа. Наиболее высокая степень гомологии первоначально полученных пептидов была обнаружена с карбоксилазой/металлопептидазой (Е-значение>30), липазой/эстеразой/деацетилазой (Е-значение>100) и пепсин-подобной аспарагиновой/гликозидгидролазой (Е-значение>14). В целом неоднородные результаты и низкие Е-значения показывают, что этот фермент аспарагиназа в действительности является новым и не имеет прецедента. Это объясняется уникальным источником, видом базидиомицетов.
Далее настоящее изобретение описывается путем пояснения в следующих неограничивающих примерах.
Примеры
В следующих примерах были использованы уже указанные материалы и методы.
Материалы и методы
Культивирование Flammulina velutipes
Все среды и оборудование перед применением подвергались автоклавированию, а на всем протяжении процедуры применяли стандартные методы стерилизации. Flammulina velutipes поддерживали на стандартных агаровых чашках (30,0 г л-1 глюкоза-моногидрат; 4,5 гл-1 аспарагин-моногидрат; 1,5 г л-1 KH2PO4; 0,5 г л-1 MgSO4; 3,0 г л-1 дрожжевого экстракта; 15,0 г л-1 агар-агар; 1,0 млл-1 раствора микроэлементов, содержащего 0,005 г л-1 CuSO4·5H2O; 0,08 г л-1 FeCl3·6H2O; 0,09 г л-1 ZnSO4·7H2O; 0,03 г л-1 MnSO4·H2O и 0,4 г л-1 EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Значение рН среды перед стерилизацией доводили до рН 6 с помощью 1 М NaOH.
Прекультуры готовили гомогенизацией 10×10 мм агаровой пробки (plug) с мицелием Flammulina velutipes в 100 мл стерильного стандартного питательного раствора при помощи Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, Mullheim, Германия). Погруженные культуры поддерживали при 24°С и 150 об/мин. После культивирования в течение 5 дней, 50 мл прекультуры переносили в 250 мл основной культуральной среды, состоящей из минимальной среды (1,5 г л-1 KH2PO4; 0,5 г л-1 MgSO4; 1,0 мл л-1 раствора металлических микроэлементов) и 40 г л-1 глютена или 10 мМ глутамина, соответственно.
Получение фермента аспарагиназы из Flammulina velutipes
После 18 дней культивирования культура была профильтрована и супернатант, содержащий внеклеточный фермент аспарагиназу (200 мл) was reversed foamed [1]. Ретентат концентрировали ультрафильтрованием при помощи MWCO 10,000 кДа (Millipore, Bedford, MA) и разделяли с использованием эксклюзионной хроматографии на Сефарозе 6 с помощью 200 мМ Трис/HCl рН 7,5.
Определение активности
10 мМ L-глутамин или ЮмМ L-аспарагин в 0,1 М фосфате калия рН 7,0, соответственно, предварительно нагревали до 37°С. Итоговый анализ начинали добавлением 50 мкл нативного или 10 мкл рекомбинантного фермента в общий реакционный объем 150 мкл и останавливали через 10-20 минут добавлением 20 мкл 3% ТСА или нагреванием при 95°С в течение 10 мин. Контрольный эксперимент проводили без аминокислот. Образование продукта отслеживали с помощью HPLC. Одну единицу активности фермента вычисляли как количество фермента, необходимого для выработки 1 мкМ глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты, соответственно, при 37°С за минуту.
ВЭЖХ осуществляли, используя С18 Nucleodur Pyramid, 5 мкм, 4 мм ID колонку, метанол в качестве элюента А, 0,1 М натрий ацетат плюс 0,044% триэтиламин (рН довели до значения 6,5 с помощью HCl) в качестве элюента В, о-фталдиальдегид в качестве агента для дериватизации, и флуоресцентный детектор.
Свободный белок
Концентрацию белка в супернатанте после гидролиза оценивали по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Оптимальная температура и значение рН
Определение оптимальной температуры и значения рН фермента аспарагиназы осуществляли с помощью растворов фермента, собранных во время культивирования или после того, как рекомбинантный белок был доступен в растворимой форме. Был проверен оптимум рН в пределах от рН 4 до 9 (0,1 М ацетат натрия рН 4, 5; 0,1 М фосфат калия рН 6, 7, 8; 0,1М карбонат натрия рН 9) при 37°С. Определение оптимальной температуры проводили в пределах от 20 до 70°С при оптимальном значении рН.
Устойчивость к температуре и рН
Для определения устойчивости к рН 10 мкл рекомбинантного фермента инкубировали в течение 16 час при 37°С в 40 мкл соответствующего вышеуказанного буфера. Добавили 100 мкл 10 мМ глутамина в 0,1 М фосфате калия (рН 7) и реакцию инкубировали в течение 20 минут при 37°С. Контрольный эксперимент проводили без субстрата. Реакцию останавливали при 95°С в течение 10 минут. Произведенную глутаминовую кислоту подсчитывали после ВЭЖХ-анализа, как описано выше.
Для исследования температурной устойчивости 10 мкл рекомбинантного фермента инкубировали в течение 1 часа при соответствующей °С в 40 мкл 0,1М калий-фосфатного буфера (рН 7). После этого добавили 100 мкл 10 мМ глутамина в 0,1М фосфате калия (рН 7) и смесь инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Контрольный эксперимент проводили без субстрата. Реакцию останавливали при 95°С в течение 10 минут. Произведенную глутаминовую кислоту вычисляли после ВЭЖХ-анализа, как описано выше.
Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) триптических пептидов.
Пептидазные полосы были вырезаны из SDS-полиакриламидных гелей, высушены и «переварены» (обработаны) трипсином. Полученные пептиды были экстрагированы и очищены в соответствии со стандартными протоколами. Масс-спектрометр Qtof II (Micromass, Великобритания), снабженный наноструйным источником ионов (nanospray ion source) и покрытыми золотом капиллярами был использован для ионизации распылением (ESI) MS пептидов. Для проведения экспериментов с индуцированной столкновениями диссоциацией множество заряженных родительских ионов выборочно пропускали из квадрупольного масс-анализатора в реакционную ячейку (25-30 eV). Полученные в результате дочерние ионы отделяли с помощью ортогонального времяпролетного масс-анализатора. Отпечатки пептидных масс (фингерпринтинг) полученные с помощью тандемного ESI-MS анализа использовали для идентификации межвидовых белков в публичных базах данных первичных последовательностей белков.
Нативная-PAGE и денатурирующая SDS-PAGE
SDS-PAGE-исследование проводили на 12% полиакриламидном разделяющем геле. Образцы готовили, смешивая 20 мкл раствора фермента аспарагиназы и 20 мкл загрузочного буфера [0,1 М Трис/HCl (рН 6.8); 0,2 М DTT, 4% SDS, 20% глицерин; 0,2% бромфеноловый синий], и кипятили в течение 15 минут. После электрофореза при 20 мА на гель, гели окрашивали серебром или кумасси бриллиантовым голубым. Для определения молекулярного веса использовали маркерные белки от 250 до 10 кДа (BioRad, Германия).
Нативный PAGE проводили в неденатурирующих условиях. Образцы готовили, смешивая 1:1 (об/об) с загрузочным буфером [0,05М Трис/HCL (рН 6,8); 2% SDS, 10% глицерин; 0,1% бромфеноловый синий]. После электрофореза при 10 мА на гель и при 8°С, гели 2 раза промыли в 2,5% Тритоне Х-100. Процедура окрашивания основывается на дезаминировании L-глутамина глутаминазой с получением L-глутамата. Окисление L-глутамата глутаматдегидрогеназой связано с восстановлением тетразолиевого красителя до окрашенного нерастворимого формазана. Раствор, окрашивающий глутаминазу, содержал 15 мМ L-глутамина, 0,5 г мл-1 глутаматдегидрогеназы из бычьей печени; 0,1 М фосфата калия рН 7; 2 мг мл-1 NAD; 0,04 мг мл-1 феназинметосульфата и 2 мг мл-1 нитросинего тетразолия. Активность фермента выглядела после инкубации при 37°С как фиолетовые полосы.
Изоэлектрическое фокусирование
IEF полиакриламидный гель-электрофорез проводили на системе Multiphor II (Pharmacia LKB, Швеция) используя готовые гели Servalyt™ Precotes™ с фиксированным градиентом рН от 3 до 10 (Serva, Германия) при 3500 V час (2000 V, 6 mA, 12 W). Изоэлектрические точки аспарагиназы были вычислены как равные 5 при использовании испытуемой смеси белков отр1 3,5 до 10,7 (Serva, Германия). Гели окрашивали серебром, кумасси или на активность, как описано выше.
Подготовка РНК
РНК получали из 500 мг мицелия, хранящегося в RNALater® (Invitrogen) с использованием набора NucleoSpin® RNA Plant Kit (Macherey-Nagel, Duren, Германия).
Синтез кДНК
5 мкг общей РНК смешивали с 25 пмоль 3'ПЦР (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 30*Т VN) и доводили объем до 11 мкл DEPC-обработанной Н2О. Смесь инкубировали при 70°С в течение 5 мин и затем охлаждали на льду в течение 2 мин. Добавили 4 мкл 5х реакционного буферного раствора, 2 мкл dNTP смеси (10 мМ каждый); 0,5 мкл RiboLock™ и 20 пмоль SMART IIA (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG), смешали и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После добавления 200 U RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase смесь инкубировали при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали нагреванием при 70°С в течение 5 мин.
Синтез комплементарной цепи проводили, смешивая 2,5 мкл 10х Long PCR buffer, 2 мкл dNTP смеси (2,5 мМ каждый); 25 пмоль 5'PCR (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT), 25 пмоль 3'PCR, 1 мкл DMSO, 1 U Long PCR Enzyme Mix, 3 мкл ss cDNA и ddH2O до 25 мкл.
Реакционную смесь инкубировали при 94°С в течение 5 мин, а потом проводили 30 циклов амплификации при 94°С в течение 20 сек и 68°С в течение 6 мин, окончательную элонгацию проводили при 68°С в течение 20 минут.
Ферменты и реагенты были куплены у компании Fermentas, St. Leon-Rot, Германия. Олигонуклеотиды были синтезированы Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Германия.
Поиск последовательности
Вырожденные праймеры были выведены из пептидных последовательностей. ПЦР-реакции проводили, смешав 2,5 мкл 10х TrueStart™ Taq-buffer, 2 мкл dNTP смеси (2,5 мМ каждый), 2 мкл 25 мМ MgCl2, 25 пмоль прямого праймера, 25 пмоль обратного праймера, 0,8 мкл DMSO, 0,625 U TrueStart™ Taq DNA Polymerase, 1 мкл ds кДНК и ddH2O до 25 мкл.
Touchdown ПЦР [2] проводили путем инкубирования реакционной смеси при 95°С в течение 5 минут, затем проводили 12 циклов при 95°С в течение 30 сек, (72°С - 1°С/цикл) в течение 60 сек и 72°С в течение 90 сек. Следующие 25 циклов проводили при температуре отжига 60°С. Окончательную элонгацию проводили при 72°С в течение 20 минут.
Результаты ПЦР-реакций анализировали с помощью гель-электрофореза (1% агароза (Serva, Heidelberg, Германия), растворенная в ТАЕ-буфере (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ EDTA рН 8). Для обнаружения ДНК после охлаждения раствора агарозы примерно до 50°С к нему было добавлено 0,05%о SYBRSafe™ (Invitrogen).,
Выделение ДНК из агарозных гелей проводили с помощью набора NucleoSpin Extract II Kit (Macherey-Nagel).
Фрагменты ДНК дотировали в вектор pCR2.1® ТА-Vector (Invitrogen), смешивая 1 мкл вектора, 1 мкл 10х буферного раствора для Т4 ДНК-лигазы, 5 U T4 ДНК-лигазы, 0,5 мкл 5 мМ АТФ и 6,5 мкл ДНК-вставки. Реакционную смесь инкубировали при 25°С в течение двух часов.
Для трансформации 5 мкл лигазной смеси добавляли к 50 мкл химически компетентных клеток Е.coli TOP10 (Invitrogen), инкубировали на льду в течение 20 мин, проводили тепловой шок при 42°С в течение 45 сек и переносили обратно на лед. Сразу добавили 500 мкл среды SOC (Invitrogen). Клетки встряхивали при 200 об/мин и 37°С в течение 60 мин, а затем высевали на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл X-Gal (Roth). Засеянные чашки инкубировали при 37°С в течение ночи.
Отбор положительных клонов проводили при помощи скрининга рекомбинантов методом ПЦР. Реакционную смесь составляли, как указано выше, но использовали праймеры М13 uni (-21) (TGTAAAACGACGGCCAGT) и М13 rev (-29) (CAGGAAACAGCTATGACC). Матрицу вносили путем ресуспендирования материала колоний в реакционной смеси.
Реакционную смесь инкубировали при 95°С в течение 5 минут, а затем проводили 40 циклов амплификации при 95°С в течение 30 сек, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин/kb. Окончательную элонгацию осуществляли при 72°С в течение 20 мин.
Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора NucleoSpin Plasmid DNA Kit (Macherey-Nagel). Секвенирование проводили при помощи прибора Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Германия).
Для получения полной последовательности из установленных фрагментов ДНК аспарагиназы были получены специфические праймеры и спарены с праймерами 5'PCR или 3'PCR, соответственно. Реакции ПЦР проводили, как указано выше, при температуре отжига 55°С и стадии элонгации 1 мин при 72°С.
Амплификация полной последовательности аспарагиназы достигалась с помощью праймеров FvNase_5' (ATGAAATCTTTTGCCCTCTTCG) и FvNase_3' (TCAAGCAAAGTGATGAAGG) при температуре отжига 55°С и стадии элонгации 1 мин при 72°С.
Для подтверждения последовательности геномную ДНК получали из мицелия, используя набор Genomic DNA Purification Kit (Fermentas). Полная последовательность аспарагиназы была амплифицирована и секвенирована.
Анализ ДНК и аминокислотной последовательности
Установление N-концевой сигнальной последовательности проводили путем анализа при помощи Signal P 3.0 [3]. Гомологию последовательности исследовали методом поиска в базе данных GenBank с помощью программы BLAST [4].
Гетерологичная экспрессия в Е.coli
Для клонирования аспарагиназы был амплифицирован ген из плазмидной ДНК с фланкирующими рестриктными сайтами EcoRI и BamHI с помощью ПЦР с использованием праймеров FvNase_EcoRI (ATAGAATTCATGAAATCTTTTGCCCTCTTC) и FvNase_BamHI (ATAGGATCCTCAAGCAAAGTCGATGAA). Была составлена генная кассета и лигирована в вектор экспрессии X-Zyme's pCTP2 с получением экспрессионного конструкта pCTP2-Aspa. Штаммы E.coli DH5alpha и JM105, трансформированные рСТР2-Aspa, выращивали в LB-среде при 37°С до OD600 нм 0,7, индуцировали (синтез белка) добавлением 0,5 мМ IPTG и дополнительно культивировали в течение ночи. Клетки ресуспендировали в Трис-буфере рН 7,5, лизировали обработкой ультразвуком, а клеточный дебрис (обломки) удаляли центрифугированием. Очистке аспарагиназы способствовала обработка сульфатом аммония.
Рекомбинантная аспарагиназа из Bacillus Subtilis
Секреция белков из бактерий является АТФ-зависимым процессом, который вовлекает перемещение пре-белка и последующее протеолитическое расщепление пре-белка на внешней поверхности мембраны до зрелого фермента. Сигнальная последовательность содержит всю информацию, необходимую для направления белка к мембране для транслокации.
Несмотря на то, что секреция в Bacillus subtilis изучена не так хорошо как секреция в Е.coli, в целом предполагается, что механизмы этих процессов аналогичны (Saier, М.Н., Jr., Wemer, Р.K. and Muller, М. 1989, Microbiol. Rev 53:333-366; Overhoff, В., Klein, М., Spies, М. and Freudi, R., 1991, Mol. Gen. Genet. 228:417-423). Одним из отличий между двумя наборами секретируемых белков является длина их сигнальных пептидов, которые обычно на 20 аминокислот длиннее в грамположительных, чем в их соответствующих грамотрицательных аналогах. Таким образом, общая стратегия экспрессии гетерологичных белков в грамположительных организмах, таких как Bacillus subtilis, подразумевает совмещение целевого белка с секреторным аппаратом хозяина (Mountain, А., 1989, Bacillus, С. Harwood, ed., Plenum Press, New York, 73-114). Стандартные протоколы, использующие вышеуказанные методы, известны в данной области техники и были использованы для сверх-экспрессии рекомбинантной аспарагиназы Bacillus subtilis.
Пример 1. Культивирование Flammulina velutipes
Все среды и оборудование перед применением подвергались автоклавированию, а на всем протяжении процедуры применяли стандартные методы стерилизации. Flammulina velutipes поддерживали на стандартных агаровых чашках (30,0 г л-1 глюкоза-моногидрат; 4,5 гл-1 аспарагин-моногидрат; 1,5 г л-1 KH2PO4; 0,5 г л-1 MgSO4; 3,0 г л-1 дрожжевого экстракта; 15,0 г л-1 агар-агар; 1,0 млл-1 раствора микроэлементов, содержащего 0,005 г л-1 CuSO4·5H2O; 0,08 г л-1 FeCl3·6H2O; 0,09 г л-1 ZnSO4·7H2O; 0,03 г л-1 MnSO4·H2O и 0,4 г л-1 EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Перед стерилизацией значение рН среды доводили до рН 6 с помощью 1 М NaOH.
Прекультуры готовили гомогенизацией 10×10 мм агаровой пробки с мицелием Flammulina velutipes в 100 мл стерильного стандартного питательного раствора при помощи Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, Mullheim, Германия). Погруженные культуры поддерживали при 24°С и 150 об/мин. После культивирования в течение 5 дней, 50 мл прекультуры переносили в 250 мл основной культуральной среды, состоящей из минимальной среды (1,5 г л-1 KH2PO4; 0,5 г л-1 MgSO4; 1,0 мл л-1 раствора металлических микроэлементов) и 40 г л-1 глютена или 10 мМ глутамина, соответственно.
Пример 2. Получение фермента от Flammulina velutipes
После 18 дней культивирования культура была профильтрована и супернатант, содержащий внеклеточный фермент аспарагиназу (200 мл) was reversed foamed, при этом аспарагиназа и другой белок являются единственными белками, оставшимися в супернатанте. Остаток жидкости концентрировали с помощью ультрафильтрации (MWCO 10,000), а оба белка разделили с помощью эксклюзионной хроматографии на Сефарозе 6.
Большая часть исходно присутствующей гидролитической активности была извлечена, означая, что этот протокол дает пригодный концентрат ферментного препарата только в течение двух стадий.
Пример 3. Гидролиз L-аспарагина с использованием нативного фермента
100 мкл 10 мМ аспарагина в 0,1 М K2HPO4/KH2PO4 буфере (рН 7,0) предварительно нагревали при 37°С в течение 5 минут. Реакцию начинали добавлением 50 мкл раствора фермента. После инкубации в течение 20 мин при 37°С и 400 об/мин в термошейкере, реакцию останавливали добавлением 20 мкл ТСА. Контрольный эксперимент проводили без субстрата. Содержание аспарагиновой кислоты количественно определяли с помощью ВЭЖХ после ОРА-дериватизации, и различия между образцами и контролем использовали для подсчета активности фермента.
Данные расчетов указывают на быстрый ферментативный гидролиз субстрата L-аспарагина.
Пример 4. Гидролиз L-глутамина с использованием нативного фермента
100 мкл 10 мМ глутамина в 0,1 М K2HPO4/KH2PO4 буфере (рН 7,0) предварительно нагревали при 37°С в течение 5 минут. Реакцию начинали добавлением 50 мкл раствора фермента. После инкубации в течение 20 мин при 37°С и 400 об/мин в термошейкере, реакцию останавливали добавлением 20 мкл ТСА (трихлоруксусная кислота). Контрольный эксперимент проводили без субстрата. Содержание глутаминовой кислоты количественно определяли с помощью ВЭЖХ после ОРА-дериватизации, и различия между образцами и контролем использовали для подсчета активности фермента.
Эти расчетные данные указывают на полезную побочную активность аспарагиназы по отношению к субстрату L-глутамину.
Пример 5. Гидролиз L-аспарагина с использованием рекомбинантного фермента
140 мкл 10 мМ аспарагина в 0,1 М K2HPO4/KH2PO4 буфере (рН 7,0) предварительно нагревали при 37°С в течение 5 минут. Реакцию начинали добавлением 10 мкл раствора рекомбинантного фермента, разбавленного водой в 200 раз. После инкубации в течение 10 минут при 37°С и 400 об/мин в термошейкере, реакцию останавливали нагреванием до 95°С в течение 10 минут. Контрольный эксперимент проводили без субстрата. Содержание аспарагиновой кислоты количественно определяли с помощью ВЭЖХ после ОРА-дериватизации, и различие между образцом и контролем использовали для подсчета активности фермента. Активность фермента рекомбинантной аспарагиназы в отношении аспарагина составляла 43,3 kU л-1.
Пример 6. Гидролиз L-глутамина с использованием рекомбинантного фермента
140 мкл 10 мМ глутамина в 0,1 М K2HPO4/KH2PO4 буфере (рН 7,0) предварительно нагревали при 37°С в течение 5 мин. Реакцию начинали добавлением 10 мкл раствора рекомбинантного фермента, разбавленного водой в 200 раз. После инкубации в течение 10 мин при 37°С и 400 об/мин в термошейкере, реакцию останавливали нагреванием до 95°С в течение 10 мин. Образцы сравнения были приготовлены без субстрата. Содержание глутаминовой кислоты было количественно измерено с помощью ВЭЖХ после ОРА-дериватизации, и различие между образцом и образцом сравнения использовали для подсчета активности фермента. Активность рекомбинантной аспарагиназы в отношении глутамина составляла 4,3 kU л-1.
Таким образом, при наличии подробного описания настоящего изобретения следует понимать, что подробное описание не предназначается для ограничения рамок изобретения. То, что должно быть защищено патентом на изобретение, устанавливается в следующих пунктах формулы изобретения.
SEQUENCE LISTING
<110> Nestec SA
<120> Asparaginase from Basidiomycetes
<130> P39867/EP
<140> PCT/EP2011/055375
<141> 2011-04-06
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> Flammulina velutipes
<400> 1
Met Lys Ser Phe Ala Leu Phe Val Pro Leu Ile Val Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Asn Ser Ala Val Val Thr Phe Ser Thr Gly Leu Gly Cys Asn Ser Val
20 25 30
Ser Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Gly Asn Phe Cys Ala Asp Pro Pro Gly
35 40 45
Asp Trp Ser Ser Val Gly Phe Ser Glu Ile Gly Gly Asp Asn Arg Val
50 55 60
Thr Val His Asn Gln Asn Ser Cys Thr Pro Ala Ser Gln Val Gly Gln
65 70 75 80
Gly Phe Gly Pro Ala Cys Trp Asn Gln Gly Ala Thr Lys Leu Arg Ser
85 90 95
Ala Trp Val Ala Cys Pro Gly Gln Arg Leu Ala Glu Asn Gly Thr Ile
100 105 110
Val Asp Asp Asp Gly Ala Phe Ile Asp Phe Ala
115 120
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer sequence
<400> 2
attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 3
aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 4
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 5
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 6
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 7
atgaaatctt ttgccctctt cg 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 8
tcaagcaaag tgatgaagg 19
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 9
atagaattca tgaaatcttt tgccctcttc 30
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 10
ataggatcct caagcaaagt cgatgaa 27
<210> 11
<211> 477
<212> DNA
<213> Flammulina velutipes
<400> 11
atgaaatctt ttgccctctt cgtccctctc atcgttgctg ctgtcgtcaa cagcgccgtg 60
gtcacctttt ccaccggcct tggctgcaac tctgtctcgc agacctaccg tggcaactgc 120
aacttctgcg ctgacccacc cggcggtagg tctacttcac attgatccct atagctcgat 180
gctcatctca tctactagac tggagctcag tcggcttttc tgagatcgga ggcgacaacc 240
gcgtcaccgt tcataaccag aacagctgca cccccgcttc gcaggtcggc caaggctttg 300
gaccggcctg ctggaaccaa ggcgctacca agcttcgttc tgcttgggtt gcgtgccctg 360
gacagaggtg agtcggttct ctgcagcttc ttcttttggt ttactaacga tgccactaga 420
ctcgctgaga acggtaccat cgtcgacgac gacggcgcct tcatcgactt tgcttga 477
<210> 12
<211> 372
<212> DNA
<213> Flammulina velutipes
<400> 12
atgaaatctt ttgccctctt cgtccctctc atcgttgctg ctgtcgtcaa cagcgccgtg 60
gtcacctttt ccaccggcct tggctgcaac tctgtctcgc agacctaccg tggcaactgc 120
aacttctgcg ctgacccacc cggcgactgg agctcagtcg gcttttctga gatcggaggc 180
gacaaccgcg tcaccgttca taaccagaac agctgcaccc ccgcttcgca ggtcggccaa 240
ggctttggac cggcctgctg gaaccaaggc gctaccaagc ttcgttctgc ttgggttgcg 300
tgccctggac agagactcgc tgagaacggt accatcgtcg acgacgacgg cgccttcatc 360
gactttgctt ga 372
Claims (8)
1. Фермент аспарагиназа, полученный из Basidiomycete, имеющий аминокислотную последовательность:
2. Фермент аспарагиназа по п. 1, где базидомицеты представляют собой Basidiomycete Flammulina velutipes.
3. Фермент аспарагиназа по любому из предшествующих пунктов, находящийся в твердой, жидкой или промежуточной форме (состоянии) между твердой и жидкой формой.
4 Способ гидролиза одного из L-аспарагина или L-глутамина, включающий:
- обработку субстрата, содержащего одно из L-аспарагина или L-глутамина, ферментом аспарагиназой по любому из пп. 1-3.
4 Способ гидролиза одного из L-аспарагина или L-глутамина, включающий:
- обработку субстрата, содержащего одно из L-аспарагина или L-глутамина, ферментом аспарагиназой по любому из пп. 1-3.
5. Способ по п. 4, в котором вещество, содержащее одно из L-аспарагина или L-глутамина, представляет собой продукт, потребляемый человеком или продукт, потребляемый животным.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором вещество выбирают из напитков, какао-бобов, сыра, кофейных зерен, кондитерских изделий, десертов, теста, гарниров, картофеля фри, фруктовых напитков, мясных продуктов, продуктов лечебного питания, питательных добавок, корма для домашних животных, картофельных чипсов, соусов, закусок или супов.
7. Способ уменьшения образования акриламида в пищевом веществе, содержащем L-аспарагин, включающий:
- нанесение на пищевое вещество, содержащее L-аспарагин фермента аспарагиназы по любому из пп. 1-3; и
- нагревание вещества, содержащего L-аспарагин.
- нанесение на пищевое вещество, содержащее L-аспарагин фермента аспарагиназы по любому из пп. 1-3; и
- нагревание вещества, содержащего L-аспарагин.
8. Способ по п. 7, в котором нагревание происходит, по меньшей мере, до 120°С.
9. Способ по п. 7 или 8, в котором источником L-аспарагина является продукт, потребляемый человеком, или продукт, потребляемый животным.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP10169405 | 2010-07-14 | ||
| EP10169405.7 | 2010-07-14 | ||
| PCT/EP2011/055375 WO2012007192A1 (en) | 2010-07-14 | 2011-04-06 | Asparaginase from basidiomycetes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013106310A RU2013106310A (ru) | 2014-08-20 |
| RU2560597C2 true RU2560597C2 (ru) | 2015-08-20 |
Family
ID=44275917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013106310/10A RU2560597C2 (ru) | 2010-07-14 | 2011-04-06 | Аспарагиназа, полученная из базидомицетов |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20130209608A1 (ru) |
| EP (1) | EP2593473B1 (ru) |
| JP (1) | JP2013539358A (ru) |
| CN (1) | CN103003297B (ru) |
| AU (1) | AU2011278657B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013000768A2 (ru) |
| CA (1) | CA2802126A1 (ru) |
| CL (1) | CL2012003490A1 (ru) |
| DK (1) | DK2593473T3 (ru) |
| ES (1) | ES2585280T3 (ru) |
| IL (1) | IL223085A (ru) |
| MX (1) | MX340937B (ru) |
| NZ (1) | NZ603773A (ru) |
| PL (1) | PL2593473T3 (ru) |
| RU (1) | RU2560597C2 (ru) |
| UA (1) | UA113391C2 (ru) |
| WO (1) | WO2012007192A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201301160B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794225C1 (ru) * | 2022-03-11 | 2023-04-13 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ГЕН tsA, КОДИРУЮЩИЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ L-АСПАРАГИНАЗУ ИЗ АРХЕИ THERMOCOCCUS SIBIRICUS, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ И СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭТОГО ФЕРМЕНТА |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9427008B2 (en) | 2012-09-06 | 2016-08-30 | Mycotechnology, Inc. | Method of myceliation of agricultural substates for producing functional foods and nutraceuticals |
| US9068171B2 (en) | 2012-09-06 | 2015-06-30 | Mycotechnology, Inc. | Method for myceliating coffee |
| WO2015033344A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods and kits for inhibiting pathogenicity of group a streptococcus (gas) or group g streptococcus (ggs) |
| US10231469B2 (en) | 2014-03-15 | 2019-03-19 | Mycotechnology, Inc. | Myceliated products and methods for making myceliated products from cacao and other agricultural substrates |
| US9572364B2 (en) | 2014-08-26 | 2017-02-21 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of mycelial liquid tissue culture |
| ES2886643T3 (es) | 2014-08-26 | 2021-12-20 | Mycotechnology Inc | Métodos para la producción y el uso de cultivo tisular líquido micelial |
| US10709157B2 (en) | 2014-08-26 | 2020-07-14 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of mycelial liquid tissue culture |
| WO2016138476A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Mycotechnology, Inc. | Methods for lowering gluten content using fungal cultures |
| MX2018012324A (es) | 2016-04-14 | 2019-05-22 | Mycotechnology Inc | Metodos para la produccion y uso de composiciones alimenticias con alta proteina micelizada. |
| US11166477B2 (en) | 2016-04-14 | 2021-11-09 | Mycotechnology, Inc. | Myceliated vegetable protein and food compositions comprising same |
| US10806101B2 (en) | 2016-04-14 | 2020-10-20 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of myceliated high protein food compositions |
| CN109750069A (zh) * | 2017-11-01 | 2019-05-14 | 北京中科伊品生物科技有限公司 | 生产l-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及l-赖氨酸的生产方法 |
| WO2020061502A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | The Better Meat Company | Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2221868C2 (ru) * | 2001-08-22 | 2004-01-20 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora |
| WO2008128975A1 (en) * | 2007-04-20 | 2008-10-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel asparaginases and uses thereof |
| US20090170157A1 (en) * | 2007-03-09 | 2009-07-02 | Novozymes A/S | Asparaginases |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5638192B2 (ru) * | 1973-01-26 | 1981-09-04 | ||
| JPS6212720A (ja) * | 1985-07-10 | 1987-01-21 | Yasahiro Morita | アロエ霊芝の製造法 |
| JPS6360915A (ja) * | 1986-09-01 | 1988-03-17 | Masao Nashiro | 脱毛防止兼育毛剤 |
| JP3819540B2 (ja) * | 1996-06-07 | 2006-09-13 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド |
| US7037540B2 (en) | 2002-09-19 | 2006-05-02 | Frito-Lay North America, Inc. | Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods |
| JP2004283062A (ja) * | 2003-03-20 | 2004-10-14 | Riken Vitamin Co Ltd | 加熱調理された加工食品 |
| TW200726843A (en) * | 2005-07-13 | 2007-07-16 | Botan Bioscience Corp | Methods for the administration of FV and related compositions |
| MX2009011179A (es) * | 2007-04-20 | 2010-01-20 | Dsm Ip Assets Bv | Variantes de enzimas asparaginasas y sus usos. |
-
2011
- 2011-04-06 DK DK11712561.7T patent/DK2593473T3/en active
- 2011-04-06 RU RU2013106310/10A patent/RU2560597C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-06 WO PCT/EP2011/055375 patent/WO2012007192A1/en active Application Filing
- 2011-04-06 BR BR112013000768A patent/BR112013000768A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-04-06 CN CN201180034717.2A patent/CN103003297B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-06 JP JP2013518993A patent/JP2013539358A/ja active Pending
- 2011-04-06 MX MX2012014701A patent/MX340937B/es active IP Right Grant
- 2011-04-06 ES ES11712561.7T patent/ES2585280T3/es active Active
- 2011-04-06 EP EP11712561.7A patent/EP2593473B1/en not_active Not-in-force
- 2011-04-06 CA CA2802126A patent/CA2802126A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-06 AU AU2011278657A patent/AU2011278657B2/en not_active Ceased
- 2011-04-06 NZ NZ603773A patent/NZ603773A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-06 PL PL11712561.7T patent/PL2593473T3/pl unknown
- 2011-04-06 US US13/810,134 patent/US20130209608A1/en not_active Abandoned
- 2011-06-04 UA UAA201301816A patent/UA113391C2/uk unknown
-
2012
- 2012-11-15 IL IL223085A patent/IL223085A/en not_active IP Right Cessation
- 2012-12-10 CL CL2012003490A patent/CL2012003490A1/es unknown
-
2013
- 2013-02-13 ZA ZA2013/01160A patent/ZA201301160B/en unknown
-
2014
- 2014-09-04 US US14/477,448 patent/US9410138B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2221868C2 (ru) * | 2001-08-22 | 2004-01-20 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora |
| US20090170157A1 (en) * | 2007-03-09 | 2009-07-02 | Novozymes A/S | Asparaginases |
| WO2008128975A1 (en) * | 2007-04-20 | 2008-10-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel asparaginases and uses thereof |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794225C1 (ru) * | 2022-03-11 | 2023-04-13 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ГЕН tsA, КОДИРУЮЩИЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ L-АСПАРАГИНАЗУ ИЗ АРХЕИ THERMOCOCCUS SIBIRICUS, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ И СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭТОГО ФЕРМЕНТА |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201301160B (en) | 2014-07-30 |
| BR112013000768A2 (pt) | 2016-05-24 |
| MX340937B (es) | 2016-08-01 |
| IL223085A0 (en) | 2013-02-03 |
| ES2585280T3 (es) | 2016-10-04 |
| MX2012014701A (es) | 2013-01-28 |
| UA113391C2 (uk) | 2017-01-25 |
| EP2593473B1 (en) | 2016-05-25 |
| CL2012003490A1 (es) | 2014-02-14 |
| IL223085A (en) | 2016-09-29 |
| RU2013106310A (ru) | 2014-08-20 |
| PL2593473T3 (pl) | 2016-11-30 |
| DK2593473T3 (en) | 2016-08-01 |
| JP2013539358A (ja) | 2013-10-24 |
| AU2011278657B2 (en) | 2015-05-14 |
| EP2593473A1 (en) | 2013-05-22 |
| CA2802126A1 (en) | 2012-01-19 |
| US9410138B2 (en) | 2016-08-09 |
| US20150093472A1 (en) | 2015-04-02 |
| AU2011278657A1 (en) | 2012-12-06 |
| NZ603773A (en) | 2014-05-30 |
| CN103003297B (zh) | 2016-06-01 |
| CN103003297A (zh) | 2013-03-27 |
| US20130209608A1 (en) | 2013-08-15 |
| WO2012007192A1 (en) | 2012-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2560597C2 (ru) | Аспарагиназа, полученная из базидомицетов | |
| US11324235B2 (en) | Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process | |
| Yao et al. | Characterization of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus velezensis BS2 isolated from sea squirt jeotgal | |
| Eisele et al. | The first characterized asparaginase from a basidiomycete, Flammulina velutipes | |
| US6309868B1 (en) | Cloning of the prolyl-dipeptidyl-peptidase from Aspergillus oryzae | |
| JP6932354B2 (ja) | セレノネインの製造方法 | |
| Sun et al. | Purification and biochemical characteristics of the extracellular protease from Pediococcus pentosaceus isolated from Harbin dry sausages | |
| JP7130554B2 (ja) | 核酸系調味料の製造方法 | |
| US11299722B2 (en) | Modified lipase and use thereof | |
| EP2126060B1 (en) | Novel lysyl oxidases | |
| Jose et al. | Purification and characterization of highly active LasB protease from Pseudomonas aeruginosa MCCB 123 | |
| Oh et al. | Isolation, purification, and enzymatic characterization of extracellular chitosanase from marine bacterium Bacillus subtilis CH2 | |
| Magboul et al. | Purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus curvatus DPC2024 | |
| WO2022270590A1 (ja) | ラッカーゼ | |
| DK2139996T3 (en) | Peptidases FROM Basidiomycetes | |
| Benito et al. | Genetic characterization and expression of the novel fungal protease, EPg222 active in dry-cured meat products | |
| WO2024071388A1 (ja) | 酵素剤及びその応用 | |
| EP4249590A1 (en) | Thermotolerant protein glutaminase | |
| Xie | Formation of taste-active metabolites in sourdough fermentation and the fermentation of plant-based cheese analogues | |
| KR20100119527A (ko) | 바실러스 속 미생물을 포함하는 식품 첨가제 | |
| JPH08298987A (ja) | 新規エンドペプチダーゼ | |
| JP2003125784A (ja) | 新規チロシン脱炭酸酵素 | |
| WO2002083905A1 (fr) | $g(b)-glucosidase présentant une excellente résistance au glucose | |
| NZ717021B2 (en) | Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180407 |