ES2585280T3 - Asparaginasa de basidiomicetos - Google Patents

Abstract

Una enzima asparaginasa, con la secuencia de aminoácidos: MKSFALFVPL IVAAVVNSAV VTFSTGLGCN SVSQTYRGNG NFCADPPGDW SSVGFSEIGG DNRVTVHNQN SCTPASQVGQ GFGPACWNQG ATKLRSAWVA CPGQRLAENG TIVDDDGAFI DFA.

Description

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como diana, a una aparato secretor del huésped (véase, a dicho efecto, Mountain, A., 1989, Bacillus, C. Harwood, ed., Plenum Press, New York, 73 -114). Los protocolos estándar, mediante la utilización de las técnicas las cuales se han descrito anteriormente, arriba, son técnicas conocidas en el arte de la técnica especializada, y éstas se utilizaron para las sobreexpresión de asparaginasa recombinante, mediante Bacillus subtilis.

Ejemplo 1 – Cultivo de Flammulina velutipes

La totalidad de los medios y del equipamiento, se sometieron a tratamiento de autoclave, previamente a su uso, y se aplicaron durante la totalidad del procedimiento. Se procedió a mantener el Flammulina velutipes, en placas de agar estándar (30,0 g L-1 de glucosa monohidratada; 4,5 g L-1 de asparagina monihidratada; 1,5 g de L-1 KH2PO4; 0,5 g de L-1 MgSO4; 3,0 g L-1 de extracto de levadura; 15,0 g L-1 de agar agar; 1,0 ml L-1 de una solución de trazas de metales (oligoelmentos), la cual contenía 0,005 g L-1 de CuSO4 -5H2O, 0,08 g L-1 de FeCl3 · 6H2O, 0,09 g L-1 de ZnSO4 · 7H2O, 0,03 g L-1 de MnSO4 · H2O y 0,4 g L-1 de EDTA. El pH del medio, se ajustó a un valor de 1, con 1 M NaOH, previamente a la esterilización.

Se procedió a preparar los precultivos, mediante la homogeneización de un tampón de agar de 10 x 10 mm, más micelio de Flammulina velutipes, en 100 ml de una solución de una de nutrición, estándar, mediante la utilización de un instrumento del tipo Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, Mullheim, Alemania). Los cultivos sumergidos, se mantuvieron a una temperatura de 24 °C, y a 150 r. p. m. (revoluciones por minutos). Después de un cultivo, durante un transcurso de tiempo de 5 días, se procedió a transferir 50 ml de precultivo, al interior de 250 del medio de cultivo principal, consistente en medio mínimo (1,5 g L-1 de KH2PO4; 0,5 g L-1 de MgSO4; 1,0 ml L-1 de solución de elementos de trazas – oligoelementos) y 40 g L-1 de gluten ó 10 mM de glutamina, respectivamente.

Ejemplo 2 – Preparación de las enzimas, a partir de Flammulina velutipes

Después de 18 días de cultivo, se procedió a filtrar el cultivo, y el sobrenadante que contenía la enzima extracelular (200 ml), se sometió a espumado inverso [1], siendo, la asparaginasa y otra proteína, las únicas proteínas restantes en el sobrenadante. Se procedió, a continuación, a concentrar el líquido restante, mediante la utilización de un proceso de autofiltración (MWCO – corte de peso molecular -10.000)(MWCO, de sus iniciales en idioma inglés, correspondientes a Molecular wigth cut – off), y ambas proteínas, se separaron, vía cromatografía de exclusión de tamaño, en una Superosa 6.

La mayor parte de la actividad hidrolítica originalmente presente, se recuperó, indicando ello el hecho consistente en que, este protocolo, proporcionaba un concentrado de enzimas de utilidad, únicamente mediante dos etapas.

Ejemplo 3 – Hidrólisis de la L-asparaginasa, mediante la utilización de una enzima nativa

Se procedió precalentar 100 µl de 10 mM asparagina, en un tampón 0,1 M de K2HPO4 / KH2PO4 (pH 7,0), a una temperatura de 37 °C, durante un transcurso de tiempo 5 minutos. La reacción, se inició mediante la adición de 50 µl de solución enzimática. Después de un tiempo de incubación de 20 minutos, a una temperatura de 37 °C, y de una velocidad angular correspondiente a 400 r. p. m. (revoluciones por minuto), en el agitador térmico, se procedió a parar el ensayo, mediante la adición de 20 µl de TCA (ácido trifluoroacético). A continuación, se procedió a llevar a cabo un experimento de control, sin substrato. Se procedió a medir, de una forma cuantitativa, los contenidos de ácido aspártico, mediante procedimiento de HPLC, después de una derivatización con OPA, y se utilizó la diferencia entre la muestra y el control, para calcular entonces la actividad de la enzima.

La evidencia analítica, indicaba una hidrólisis enzimática del substrato L-asparagina.

Ejemplo 4 – Hidrólisis de la L-glutamina, mediante la utilización de una enzima nativa

Se procedió precalentar 100 µl de 10 mM glutamina, en un tampón 0,1 M de K2HPO4 / KH2PO4 (pH 7,0), a una temperatura de 37 °C, durante un transcurso de tiempo 5 minutos. La reacción, se inició mediante la adición de 50 µl de solución enzimática. Después de un tiempo de incubación de 20 minutos, a una temperatura de 37 °C, y de una velocidad angular correspondiente a 400 r. p. m. (revoluciones por minuto), en el agitador térmico, se procedió a parar el ensayo, mediante la adición de 20 µl de TCA. A continuación, se procedió a llevar a cabo un experimento de control, sin substrato. Se procedió a medir, de una forma cuantitativa, los contenidos de ácido glutámico, mediante procedimiento de HPLC, después de una derivatización con OPA, y se utilizó la diferencia entre la muestra y el control, para calcular entonces la actividad de la enzima.

Esta evidencia analítica, indicaba una actividad secundaria de la asparaginasa, hacia el substrato L-glutamina.

Ejemplo 5 – Hidrólisis de la L-asparagina, mediante la utilización de una enzima recombinante

Se procedió precalentar 140 µl de 10 mM asparagina, en un tampón 0,1 M de K2HPO4 / KH2PO4 (pH 7,0), a una temperatura de 37 °C, durante un transcurso de tiempo 5 minutos. La reacción, se inició mediante la adición de 50 µl de solución de enzima recombinante, diluida, a un valor de 200 veces, con agua. Después de un tiempo de

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