CN111935981A

CN111935981A - 变体麦芽糖α-淀粉酶

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Publication number: CN111935981A
Application number: CN201980024319.9A
Authority: CN
Inventors: 宙克·安妮琳·普赛斯; 阿洛伊修斯·威廉默斯·鲁道夫斯·休伯图斯·泰尼森; 芮妮·马赛尔·德钟; 杰罗恩·哥德罗伊吉; 赫尔马·阿丽娜·斯托尔泽-拉格韦奇
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-11-13
Also published as: US11944104B2; WO2019193102A1; BR112020020252A2; EP3772966A1; US20210161158A1; ZA202005561B; MX2020010422A

Abstract

本发明涉及一种具有麦芽糖α‑淀粉酶活性的变体多肽，其中所述多肽包含当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的，并且其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及一种制备面团或烘焙产品的方法，其中使用所述变体多肽。

Description

变体麦芽糖α-淀粉酶

技术领域

本发明涉及一种具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽，一种生产麦芽糖α-淀粉酶的方法，一种包含麦芽糖α-淀粉酶的预混物或面团，以及一种制备其中使用了麦芽糖α-淀粉酶的面团或烘焙产品的方法。

背景技术

麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽水解酶E.C.3.2.1.133)由于其减少淀粉回生的能力而在烘焙行业中广泛用作抗老化剂。

WO99/43794公开了麦芽糖α-淀粉酶的变体，其中所述变体具有不同的物化特性，例如改变的最佳pH或改善的热稳定性。WO/9943794还公开了在蛋白质结构中包含三个钙离子的麦芽糖α-淀粉酶。由于钙对于所述酶的麦芽糖α-淀粉酶活性至关重要，因此在所述酶用于例如烘焙过程期间钙浓度的差异可影响麦芽糖α-淀粉酶的性能。

WO2006/032281公开了一种使用具有改善的蔗糖耐受性的变体麦芽糖α-淀粉酶制备具有至少10重量％的蔗糖含量的面团或基于面团的产品的方法。

WO2014/131842公开了具有α-淀粉酶活性的多肽变体，其中所述变体在不同pH值下具有改变的蔗糖耐受性或改变的热稳定性。

需要具有麦芽糖α-淀粉酶活性的其他多肽，所述多肽的性能对钙浓度更不敏感。

发明内容

本发明涉及一种具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包含当与SEQ IDNO:1的氨基酸序列比对时包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的，并且其中所述多肽包含与所述根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

例如，如本文所公开的多肽是具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽，其中在将所述多肽在含有50mM NaCl和0.05％BSA和2mM EDTA的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中在87.4℃的温度下孵育10分钟后，所述多肽具有至少40％的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。所述残留麦芽糖α-淀粉酶活性是与所述孵育(即将所述多肽在含有50mM NaCl和0.05％BSA和2mM EDTA的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中在87.4℃的温度下孵育10分钟)之前的麦芽糖α-淀粉酶活性相比而言的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。

令人惊讶地，发现与参考多肽相比，包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代基T288P的变体多肽具有降低的热稳定性对钙离子的依赖性。这被发现是有利的，因为Ca²⁺浓度可能由于局部水和可能包含或不包含钙离子的用于制备烘焙产品的其他成分的硬度(钙浓度)的差异而在用于制备烘焙产品的过程中变化。

如本文所公开的参考多肽可以是不包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G以及任选的另一氨基酸取代T288P的多肽，所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的。参考多肽可为包含或含有SEQ ID NO:1的多肽。参考多肽可以是包含或含有SEQ ID NO:1的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽，所述多肽可包含氨基酸取代F188L、D261G和/或T288P。发现具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽的热稳定性对钙离子的依赖性降低在烘焙应用中是有利的，因为用于制备烘焙产品的水可取决于水的来源和制备烘焙产品的位置而具有不同钙离子浓度。

还发现，与用参考多肽制备的面包相比，用如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽制备的面包表现出改善的特性，例如降低的面包心(crumb)硬度和/或降低的面包心回弹性减少和/或更稳定的面包心回弹性。

本发明还涉及一种包含编码根据本发明的变体多肽的核酸序列的重组宿主细胞，以及一种制备如本文所公开的多肽的方法，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养宿主细胞，以及制备所述多肽，以及任选地回收所述多肽。

本发明还涉及本发明的变体多肽或包含根据本发明的多肽的组合物在预混物、面团或烘焙产品的制备中的用途。

还公开了一种包含面粉和如本文所公开的多肽的预混物。

本发明还涉及一种包含根据本发明的多肽或如本文所公开的组合物或预混物的面团，以及一种制备面团的方法，所述方法包括将如本文所公开的多肽添加至所述面团中。

本发明还涉及一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙包含如本文所公开的多肽的面团。

定义

术语‘烘焙产品’是指从面团制备的烘焙食物产品。

烘焙产品(无论是白色、棕色还是全谷物类型的)的示例包括通常呈面包条或面包卷形式的面包、法式长棍型面包、糕点、羊角面包、奶油蛋卷、意大利面包(panettone)、意大利面、面条(煮用面条或炒用面条)、皮塔饼和其他扁面包、墨西哥面饼、炸玉米饼、蛋糕、煎饼、饼干(尤其是软饼)、甜甜圈(包括酵母发酵型甜甜圈)、百吉饼、派皮、馒头、薄脆饼干、布朗尼蛋糕、大块蛋糕(sheet cake)、零食(例如，脆饼干(pretzel)、墨西哥炸玉米片、加工零食(fabricated snacks)、加工薯片(fabricated potato crisps))。

术语“面团”在本文中被定义为面粉和其他成分的混合物。通常，面团硬到足以揉捏或滚动。面团可以是新鲜的、冷冻的、预制的(prepared)或预烘焙的(parbaked)。面团往往由基本的面团成分制成，所述基本的面团成分包括(谷物)面粉(例如小麦粉或米粉)、水和任选的盐。对于发酵产品，主要使用发面酵母，并且任选地可以使用化学发酵化合物，例如酸(生成化合物)和碳酸氢盐的组合。可以制成面粉的谷物包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、双粒小麦、硬质小麦和卡姆小麦。本文中的术语面团还包括面糊。面糊是一种半液体混合物，其薄到足以从勺子落下或倾倒，是一种或多种面粉与液体(例如水、牛奶)或用于制备各种食物(包括蛋糕)的蛋类的组合。

术语“预混物”在本文中被定义为以其常规含义来理解，即作为通常包括面粉的烘焙剂的混合物，其不仅可以用于工业面包烘焙厂/设施中，而且还可以用于零售面包店中。可以通过将具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽或如本文所公开的酶组合物与例如面粉、淀粉或盐的成分混合来制备预混物。

如本文所用的术语“控制序列”是指在特定生物体内或体外参与编码序列表达的调节的组分。控制序列的示例是转录起始序列、终止序列、启动子、前导序列、信号肽、前肽、前原肽或增强子序列；夏因-达尔加诺序列(Shine-Delgarno sequence)、阻遏物或激活物序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定化细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。

如本文所用，术语“内源”是指天然存在于宿主中的核酸或氨基酸序列。

术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

“表达载体”包含编码多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至适当的控制序列(例如启动子，以及转录和翻译终止信号)以用于在体外表达和/或翻译。表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，该表达载体可以方便地经历重组DNA程序并且可以引起多核苷酸的表达。载体的选择将通常取决于载体与要导入载体的细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制载体，即这样的载体，所述载体作为染色体外实体存在，所述载体的复制独立于染色体复制，为例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是这样的载体，所述载体当被引入宿主细胞时整合到基因组中并与其所整合到的染色体一起复制。整合克隆载体可以整合在宿主细胞的染色体中的随机或预定靶基因座处。载体系统可以是单一载体或质粒或两种或更多种载体或质粒，所述载体或质粒一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。优选用于细菌的载体例如在WO-A1-2004/074468中公开。

如本文所定义的“宿主细胞”是适用于遗传操纵并且可以在可用于工业生产目标产物(例如根据本发明的多肽)的细胞密度下培养的生物体。宿主细胞可以是在自然界中发现的宿主细胞，或来源于亲本宿主细胞的遗传操纵或经典诱变后的宿主细胞。有利地，宿主细胞是重组宿主细胞。宿主细胞可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、植物、动物、或昆虫宿主细胞。

核酸或多核苷酸序列在本文中定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。术语“核酸”和“多核苷酸序列”在本文中可互换使用。核酸或多核苷酸序列在本文中定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。

术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并含有多于五个氨基酸残基的分子。如本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且还可以指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。可任选地修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化等)多肽以增加官能性。在某些条件下在特定底物存在下表现出活性的多肽可称为酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，可以产生编码给定多肽的多种核苷酸序列。

本文所用的术语“分离的多肽”是指从与所述多肽天然相关的至少一种组分(例如其他多肽材料)中取出的多肽。分离的多肽可以不含任何其他杂质。如通过SDS-PAGE或任何其他适用于此目的并且为本领域技术人员所已知的分析方法所测定的，分离的多肽可以为至少50％纯，例如至少60％纯、至少70％纯、至少75％纯、至少80％纯、至少85％纯、至少80％纯、至少90％纯，或至少95％纯、96％纯、97％纯、98％纯、99％纯、99.5％纯、99.9％纯。分离的多肽可以由重组宿主细胞产生。

“成熟多肽”在本文中定义为这样的多肽，所述多肽处于其最终形式下并且在将mRNA翻译成多肽并对所述多肽进行翻译后修饰后获得。翻译后修饰包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化，以及通过切割去除前导序列(例如信号肽、前肽和/或前原肽)。根据SEQ ID NO:1的多肽，例如包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至686的多肽，是成熟的多肽。

“成熟多肽编码序列”是指编码成熟多肽的多核苷酸。

术语“启动子”在本文中被定义为这样的DNA序列，所述DNA序列结合RNA聚合酶并将所述聚合酶引导至核酸序列的正确下游转录起始位点以启动转录。合适的细菌启动子例如在WO-A1-2004/074468中公开。

当关于核酸或蛋白质使用时，术语“重组”是指该核酸或蛋白质如果与其天然形式相比则已经通过人工干预进行了序列修饰。当涉及细胞(例如宿主细胞)时，术语“重组”表示该细胞的基因组如果与其天然形式相比则已经通过人为干预进行了序列修饰。术语“重组”与“经遗传修饰的”同义。

序列同一性或序列同源性在本文中可互换使用。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：比对中对应位置(其显示两个序列中的相同氨基酸或相同核苷酸)的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸序列和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来执行此类搜索。可以用得分＝100、字长＝12的NBLAST程序来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用得分＝50、字长＝3的XBLAST程序来执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用空位BLAST，如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

通过体外化学或酶促合成来产生“合成分子”，诸如合成核酸或合成多肽。所述合成分子包括但不限于用所选宿主生物体的最佳密码子使用制备的变体核酸。

可以优选根据WO2006/077258和/或WO2008000632中描述的方法，来优化合成核酸的密码子使用，该等专利以引用方式并入本文。WO2008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样的一种方法，在所述方法中，编码已经关于多肽的密码子使用(特别是所使用的密码子对)进行修饰的多肽的核苷酸序列，被优化以获得编码所述多肽的核苷酸序列的改善表达和/或所编码多肽的改进产生。密码子对被定义为编码序列中的一组两个紧接三联体(密码子)。本领域技术人员应知道，密码子使用需要根据宿主物种进行调整，可能导致相对于SEQ ID NO:2具有显著同源性偏差，但仍然编码根据本发明的多肽的变体。

如本文所用，术语“变体”或“突变体”可互换地使用。它们可以指多肽或核酸。变体包括在相对于参考序列的一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。可以通过例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其他重组方法来产生变体。核酸的变体基因可以通过本领域已知的技术人工合成。

发明详述

本发明涉及一种具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽，其中所述多肽包含当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时包含或含有氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的，并且其中所述多肽包含与所述根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。如本文所公开的变体多肽可以是分离的、纯的或合成的变体多肽。

如本文所公开的多肽可为具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽，其中在将所述多肽在含有50mM NaCl和0.05％BSA和2mM EDTA的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中在87.4℃的温度下孵育10分钟后，所述多肽与热处理前的麦芽糖α-淀粉酶活性相比具有至少40％的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。优选地，如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽是这样的多肽，在将所述多肽在含有50mM NaCl和0.05％BSA和2mM EDTA的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中在87.4℃的温度下孵育10分钟后，所述多肽与热处理前的麦芽糖α-淀粉酶活性相比具有至少45％、50％、55％或至少60％的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽可以是如本文所公开的变体多肽。

令人惊讶地发现，与参考多肽相比，如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽具有降低的热稳定性对钙离子的依赖性。

在一个实施方式中，具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽是这样的多肽，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时包含氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P，其中氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的。

令人惊讶地发现，与参考多肽相比，如本文所公开的多肽的麦芽糖α-淀粉酶活性具有降低的热稳定性对钙离子的依赖性。

如本文所用的热稳定性对钙离子的依赖性可以通过以下方式确定：在将多肽在EDTA存在下，例如在2mM或10mM的EDTA存在下在70℃至95℃(例如75℃至90℃、例如77℃至89℃)的温度下孵育10分钟后，测量如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。将如本文所公开的变体多肽的残留活性与参考多肽的残留活性进行比较，以确定降低的依赖性。

具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽的热稳定性对钙离子的依赖性还可以通过以下方式确定：确定已经使用具有不同钙浓度的水用具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽制备的面包的面包心硬度。将用如本文所公开的变体多肽制备的面包的面包心硬度与用参考多肽制备的面包的面包心硬度进行比较，以确定相对依赖性，例如降低的依赖性。

如本文所公开的参考多肽可以是不包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G以及任选的另一氨基酸取代T288P的多肽，所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的。参考多肽可以是包含SEQ ID NO:1的多肽，或包含SEQ ID NO:1并且包含氨基酸取代F188L、D261G和T288P的多肽，其中氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1定义的。

如本文所公开的多肽可以是具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的，其中所述变体多肽与不具有氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的参考多肽相比具有降低的热稳定性对钙离子的依赖性。

如本文所公开的变体多肽可在一个或多个另外的氨基酸位置处包含另外的取代、缺失和/或插入。例如，如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或更多个另外的氨基取代、缺失和/或插入，由此所述多肽仍然具有如本文所公开的多肽的活性或功能。

在一个实施方式中，如本文所公开的包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的变体多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。如本文所公开的多肽可以是合成多肽。如本文所公开的多肽是成熟多肽。

氨基酸在本文中以本领域技术人员已知的其单字母代码提及，并且可见于Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press,ColdSpring Harbor,NY,2001中。举例来说，在本文中辨识的位置F188L/I、S200N、D261G和T288P处的氨基酸的三字母代码和全名为：F＝Phe＝苯丙氨酸，L＝Leu＝亮氨酸；I＝Ile＝异亮氨酸；S＝Ser＝丝氨酸；N＝Asn＝天冬酰胺；D＝Asp＝天冬氨酸；G＝Gly＝甘氨酸；T＝Thr＝苏氨酸；P＝Pro＝脯氨酸。

如本文所公开的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽是被分类为EC3.2.1.133的麦芽糖α-淀粉酶。麦芽糖α-淀粉酶的示例例如在WO91/04669中公开。

本文还公开了一种包含如本文所公开的多肽的组合物。如本文所公开的组合物可包含载体、辅料、辅助酶或其他化合物。通常，组合物或制剂包含这样的化合物，具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽可以与所述化合物一起配制。如本文所用的辅料是与如本文所公开的多肽一起配制的无活性物质，例如奶粉、麸质、蔗糖或乳糖、甘油、山梨糖醇、抗坏血酸、调味剂或盐(例如氯化钠)。包含如本文所公开的多肽的组合物中的辅助酶可以例如是α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶(例如磷脂酶)、葡糖氧化酶、淀粉葡萄糖苷酶和/或半纤维素酶(例如木聚糖酶)。

包含如本文所公开的多肽的组合物可以是液体组合物或固体组合物。液体组合物往往包含水。当配制成液体组合物时，所述组合物通常包含降低水活度的组分，例如甘油、山梨糖醇或氯化钠(NaCl)。包含如本文所公开的多肽的固体组合物可包含含有酶的颗粒，或者所述组合物包含在液体基质(如脂质体)或凝胶(如藻酸盐或角叉菜胶)中的包封的多肽。

用于制备包含如本文所公开的多肽的组合物的方法可包括：喷雾干燥包含所述多肽的发酵培养基，或将如本文所公开的多肽粒化或包封，以及制备所述组合物。有许多本领域已知的将多肽或酶包封或粒化的技术(参见例如G.M.H.Meesters，“Encapsulation ofEnzymes and Peptides”，第9章，N.J.Zuidam和

(编辑)，“EncapsulationTechnologies for Active Food Ingredients and food processing”2010)。

在一个方面中，公开了一种编码根据本发明的变体多肽的核酸序列。如本文所公开的核酸可以是SEQ ID NO:2的核酸的分离的、纯的、重组的、合成的或变体的核酸。变体核酸序列可以例如与SEQ ID NO:2有至少70％、80％、85％、90％、95％或96％、97％、98％或99％的序列同一性或可以包含SEQ ID NO:2。

本文还公开了一种表达载体，所述表达载体包含如本文所公开的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至指导所述核酸序列表达的一个或多个控制序列。

有几种本领域技术人员已知的用于将核酸插入核酸构建体或表达载体中的方法，参见例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，CSHLPress,Cold Spring Harbor,NY,2001。可能需要用控制序列(例如启动子和终止子序列)来操纵编码本发明多肽的核酸。

本文还公开了一种包含如本文所公开的核酸序列或如本文所公开的表达载体的重组宿主细胞。

用于表达如本文所公开的多肽的合适的重组宿主细胞包括真菌，例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma sp.)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)或里氏木霉(T.reesei)；或酵母，例如酵母属(Saccharomyces sp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)或毕赤酵母属(Pichia sp.)，例如酿酒酵母(S.cereviseae.)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)；或细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，以及芽孢杆菌属(Bacillussp.)，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。

在如本文所公开的一个方面中是一种制备如本文所公开的多肽的方法，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养如本文所公开的宿主细胞，以及制备所述多肽，以及任选地回收所述多肽。本领域技术人员知道如何取决于所使用的宿主细胞来执行制备具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽的方法。合适的发酵培养基通常包含碳和氮源。通常，发酵培养基的pH值可介于4与8之间。培养宿主细胞的合适温度往往介于20℃与60℃之间，例如介于25℃与50℃之间。

宿主细胞可以在摇瓶中，或者在体积为0.5或1升或更大的发酵罐中培养至10至100立方米或更大。取决于宿主细胞的需要，可以有氧或无氧地执行培养。

有利地，从发酵培养基中回收或分离本文所公开的多肽。从发酵培养基回收或分离多肽可以例如通过离心、过滤和/或超滤来执行。

本文还公开了根据本发明的变体多肽或如本文所公开的组合物在预混物、面团或烘焙产品的制备中的用途。

在一个方面中，本公开涉及如本文所公开的变体多肽或如本文所公开的组合物用于降低面包的面包心硬度的用途。如本文所用的降低面包心硬度被定义为例如在面包储存时减少面包心硬度的增加。发现与用参考多肽制备的面包的面包心硬度相比，用如本文所公开的变体多肽制备的面包的面包心硬度在面包制备期间更少受钙的存在影响。如本文所公开的变体多肽的用途或组合物的用途可进一步包括减少面包的面包心回弹性的降低。

因此，本公开涉及一种用于减少面包的面包心硬度增加和/或减少面包的面包心回弹性降低的方法，所述方法包括在面包制备期间使用如本文所公开的变体多肽。在面包制备期间使用如本文所公开的变体多肽通常包括将所述变体多肽添加到面团中，以及烘焙所述面团。

确定与用参考多肽制备的面包相比，面包的面包心硬度降低和/或面包的面包心回弹性降低减少。在面包储存后，例如在室温下储存1至21天，例如2至14天，例如3至7天，例如4至6天后，确定面包心硬度降低和/或面包心回弹性降低减少。还可在0℃至8℃(例如1℃至6℃)的温度下储存1至10天(例如2至8天、或3至7天)后，确定面包心硬度降低和/或面包心回弹性降低减少。

本文还公开了一种预混物，所述预混物包含面粉，以及根据本发明的变体多肽，或如本文所公开的组合物。

本文还公开了一种面团，所述面团包含根据本发明的多肽、如本文所公开的组合物、或如本文所公开的预混物。

还公开了一种制备面团的方法，所述方法包括将根据本发明的多肽、或如本文所公开的组合物或如本文所公开的预混物添加至面团中。制备面团的方法是本领域中公知的。

本公开还涉及一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙如本文所公开的面团。烘焙产品可以是如上文所定义的任何合适的烘焙产品。用于烘焙面团以制备面包的方法是本领域技术人员已知的。制备烘焙产品的方法包括以下步骤：制备面团；将如本文所公开的多肽、组合物或预混物添加至面团中；以及制备烘焙产品。令人惊讶地，发现与用如上文所定义的参考多肽制备的面包相比，以如本文所公开的方法制备的烘焙产品(例如面包)表现出改善的特性，例如降低的面包心硬度增加和/或减少的面包心回弹性降低。

实施例

分子生物学技术

技术人员已知的分子生物学技术是根据Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001执行的。在热循环仪上根据制造商的说明使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY,Aspoo,Finland)执行聚合酶链式反应(PCR)。

材料与方法

酶

MAM 10000可以在DSM商购获得。

菌株和质粒

枯草芽孢杆菌菌株BS154(CBS 363.94)(ΔaprE、ΔnprE、amyE-、spo-)描述于Quax和Broekhuizen 1994Appl Microbiol Biotechnol.41:425-431中。

多用途整合表达载体pDBC1描述于WO2015118126A1中。

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(更名为嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))C599(NCIB 11873)描述于WO91/04669中。用突变合成地制备编码麦芽糖α-淀粉酶的基因，以编码修饰F188L、S200N、D261G和T288P(与SEQID NO:1相比)，并且在两端处附接BsmBI位点，从而制成ROM1模块(SEQ ID NO:2)。

类似地，制备编码野生型麦芽糖α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的基因和编码具有修饰F188L、S200N和D261G或F188L、D261G和T288P(与SEQ ID NO:1相比)的麦芽糖α-淀粉酶的基因。

枯草芽孢杆菌噬菌体SP01的启动子PE4(在此表示为P15启动子)描述于Lee等人，1980,Mol.Gen.Genet.180:57-65和Stewart C.R.等人(1998)Virology.246(2):329-340中。将该启动子与RSE(RK41_SWITCH缺失、EP2186880)和RBS S16组合。该片段是合成制备的，并且在两端处均附接Bsm BI位点(SEQ ID NO:3)。

DNA构建体和转化

使用StarGate型IIS限制酶克隆系统(IBA,GmbH,Gottingen,Germany)装配含有载体pDBC1、P15启动子模块和ROM1模块的最终整合构建体，所述StarGate型IIS限制酶克隆系统是根据制造商的说明使用的。选择Bsm BI位点的突出端以仅允许模块的一次装配。将反应混合物用于转化枯草芽孢杆菌菌株BS154。在含有壮观霉素(100g/ml)的琼脂平板中选择转化体。pDBC1上的amyE 5'和3'区将构建体靶向至基因组amyE基因座。双重交叉转化体仅为抗壮观霉素的，而不希望的单交叉转化体还是抗红霉素的。另外，使用以下引物组合通过PCR检查克隆：位于amyE基因座的5'端(正好位于pDBC1中存在的侧翼序列外部)的正向引物(SEQ ID NO:4)和位于ROM1模块的5'端的反向引物(SEQ ID NO:5)。在正确的克隆中，扩增了990nt的片段。

在摇瓶中表达麦芽糖α-淀粉酶变体

将具有ROM1模块的枯草芽孢杆菌菌株置于2*TY琼脂平板上，并在37℃下生长24小时。在100ml锥形瓶中由1.6％(w/v)的Bacto胰蛋白,、1％(w/v)的酵母提取物和0.5％(w/v)的NaCl组成的20ml 2*TY培养基的预培养物中接种取自平板的枯草芽孢杆菌细胞。将培养物在37℃下以250rpm剧烈振荡16小时，并使用0.2ml培养基接种20ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25％(w/w)的酵母提取物、0.05％(w/w)的CaCl₂、0.075％(w/w)的MgCl₂.6H₂O、15μg/l的MnSO₄.4H₂O、10μg/l的CoCl₂.6H₂O、0.05％(w/w)柠檬酸、0.025％(w/w)的消泡剂86/013(Basildon Chemicals,Abingdon,UK)。为了完成SMM培养基，将均单独制备和灭菌的20ml 5％(w/v)麦芽糖和20ml 200mM磷酸钠缓冲贮存溶液(pH 6.8)添加到60ml SMM预培养基中。将这些培养物在37℃下以250rpm孵育48小时。收获上清液并分析酶活性。根据如下所述的测定测量变体的麦芽糖α-淀粉酶活性。

酶活性测定

基于由Megazyme所述的ceralpha方法(R-CAAR-4,Megazyme,Ireland)测量淀粉酶活性。所述方法利用了非还原端封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷底物(BPNPG7)。在含有50mMNaCl、2mM CaCl₂和0.05％BSA(测定缓冲液)的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中制备适当的酶稀释液。在37℃下将这些稀释液中的10μl添加至90μl的经预热的ceralpha试剂(R-CAAR-4；溶于10ml MQ水中并用8ml苹果酸缓冲液稀释成工作溶液)中。在423秒之后，通过添加75μl170mM Tris溶液来终止孵育。在反应终止后130秒，记录405nm处的吸光度。通过颠倒移液次序来测量空白样品：首先是终止试剂，然后是样品和底物。根据样品与空白孵育之间的Δ吸光度来计算活性。使用设定在37℃孵育温度下的Konelab Arena 30分析仪(Thermo)执行测定。

一单位活性被定义为在测试条件下从底物中释放1nmol/s的对硝基苯酚的所用的酶的量。

面包心的硬度和回弹性

使用质构仪测量面包切片的面包心硬度(或硬度；两者均与柔软度相反)和面包心的回弹性，并由熟练的测试面包师凭经验进行评估。为了评估这些面包心特性，将面包切成厚度为2.5cm的片，并使用质构仪TA-XT Plus(Stable MicroSystems)用以下设置测量硬度：压缩测试模式，3mm/s的预测试速度，1mm/s的测试速度，5mm的距离，10s的保持时间，以及5g的触发力。

面包心硬度是以克为单位记录的压缩期间的最大峰值力。

面包心回弹性是10s保持时间结束时的力与最大力之比。面包心回弹性表示为百分比。

实施例1.EDTA对麦芽糖α-淀粉酶变体的热稳定性的影响

通过将酶样品(0.1-0.3mg/ml)在BioRad热循环仪中在PCR板中在含有50mM NaCl和0.05％BSA以及0.2mM或10mM EDTA的50mM苹果酸缓冲液pH 5.2中在87.4℃下孵育10分钟来评估野生型麦芽糖α-淀粉酶和上述产生的麦芽糖α-淀粉酶变体的热稳定性。在10分钟孵育后，将样品冷却至4℃。

在普通自来水中在87.4℃下处理10分钟后，野生型MAM仅表现出约3％的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。

因此，也以类似的方式在79℃的温度下在如上所述并且含有0或10mM EDTA的苹果酸缓冲液中测试了酶的热稳定性。

如上所述在温度处理之前和之后确定样品中的麦芽糖α-淀粉酶活性。将热处理后的残留活性表示为热处理前的活性的百分比。

表1和表1a以及表2和表2a中的结果表明，在存在EDTA的情况下，包含氨基酸取代S200N的两种MAM变体，即MAM变体1(F188L、S200N、D261G、T288P)和MAM变体2(F188L、S200N、D261G)与MAM变体3和野生型(wt)MAM相比更热稳定。这表明，与MAM变体3和野生型MAM相比，MAM变体1和MAM变体2的热稳定性对于由EDTA进行的钙螯合而言更稳健。

表1.在不存在和存在EDTA的情况下在87.4℃下处理10分钟后的残留麦芽糖α-淀粉酶活性

表2.在不存在和存在EDTA的情况下在79℃下处理10分钟后残留的麦芽糖α-淀粉酶活性

表1和表2中的结果作为在存在EDTA的情况下每种变体的相对残留活性呈现在表1a和表2a中，表示为在不存在EDTA的情况下测量的该变体的残留活性的百分比。

表1a.在存在EDTA的情况下在87.4℃下处理10分钟后的相对残留麦芽糖α-淀粉酶活性，表示为在不存在EDTA的情况下处理后残留活性的百分比

表2a.在存在EDTA的情况下在79℃下处理10分钟后的相对残留麦芽糖α-淀粉酶活性，表示为在不存在EDTA的情况下处理后残留活性的百分比

实施例2.钙对烘焙面包中麦芽糖α-淀粉酶性能的影响

2.1.烘焙面包

按照本领域的技术人员已知的直接面团面包制造工序，根据精益配方(包括100％的面粉、55-60％的水、酵母、盐和基本面包改良剂(以改善面包店中的面团处理))烘焙模烤白面包(white tin bread)。该工序涉及在将所有成分添加到混合机中之后进行单个混合步骤，之后进行发酵、定量(scaling)和整形、醒发(proofing)和烘焙。在储存烘焙的面包后，评估所得面包的面包心硬度。

2.2.面包中麦芽糖α-淀粉酶性能的钙依赖性

测定在使用具有不同钙浓度的水用野生型麦芽糖α-淀粉酶(MAM)和具有氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P的变体MAM的面团制成的面包中的面包心硬度。选择MAM和变体MAM的酶剂量，以将面包的老化降低到与添加50ppm

MAM 10000时相似的程度。

使用水(2mM Ca；对应于普通自来水中的钙水平)、钙耗尽水(软化水，0mM Ca)或富钙水(浓度为10mM Ca)将MAM(

MAM 10000)(0.8单位/g面粉)和具有氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P的变体MAM(0.1单位/g面粉)投配到面包配方中。将钙(CaCl₂.2H₂O(Merck))添加至脱矿质水中，以获得具有2mM和10mM钙的水。如上所述烘焙面包。在烘焙后，将面包在6℃下储存7天。随后，使面包变成室温2小时，然后切成片，并根据上述方法对面包心硬度进行评估。面包的的面包心硬度是面包老化的指示。表3中的结果显示了相对于用含有2mM Ca的水制备的面包的面包心硬度，面包的面包心硬度(％)。

表3中的结果显示，水中的钙浓度几乎不影响用含有氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P的MAM变体制备的面包的硬度。相比之下，当水中不存在钙时，与用存在2或10mM钙的水制备的面包的面包心硬度相比，用野生型MAM制备的面包的面包心硬度要高得多。这表明MAM变体作为面包中的抗老化酶的性能对钙的依赖性更小。

表3.用MAM或MAM变体1和具有0、2或10mM钙的水制成的面包在6℃下储存7天后的面包心硬度(％)。

实施例3.变体麦芽糖α-淀粉酶和野生型麦芽糖α-淀粉酶对模烤白面包的面包心硬度和面包心回弹性的影响

按照本领域技术人员已知的直接面团面包制作工序，使用通常包括100％面粉、59％常规自来水、2.4％酵母、1.6％盐和通常用于改善面包店中的面团处理的基本浓度的抗坏血酸和木聚糖酶的配方来烘焙模烤白面包。此配方中使用的百分比是面包师百分比，相对于所用面粉的量表示(面粉＝100％)。将野生型麦芽糖α-淀粉酶(MAM，0.75单位/g面粉)和具有氨基酸取代F188L、S200N、D261G、T288P的变体MAM(0.1单位/g面粉)添加至面粉中。

面包制作工序涉及在将所有成分添加到混合机中之后进行单个混合步骤，之后进行发酵、定量(成约800g的面团)和整形、醒发和烘焙。在烘焙后，将面包在环境温度下储存7天。随后，如上所述确定面包的面包心硬度和面包心回弹性。

表4中的结果显示，在室温下储存1天、4天或7天后，与用野生型麦芽糖淀粉酶制成的面包相比并且与不使用MAM(空白)制成的面包相比，用包含氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P的MAM变体1制成的面包具有较低的硬度和减少的回弹性降低。

表4.在环境温度下储存几天后，没有使用麦芽糖淀粉酶(空白)或使用野生型MAM或包含氨基酸取代F188L、S200N、D261G和T288P的MAM变体1制成的白面包的面包心的硬度(g)和回弹形(％)。

实施例4.变体麦芽糖α-淀粉酶对全谷物面包品质的影响

按照本领域技术人员已知的直接面团面包制作工序，根据精益配方(包括100％的Acacia面粉、67％的常规自来水、2.4％酵母、1.8％盐、3％含麸质全谷物面包改良剂、0.25％DATEM和0.5％基础面包改良剂(使用百分比，所述百分比表示为相对于面粉量＝100％的面包师百分比)来制备全谷物面包。将包含氨基酸取代F188L、D261G、T288P的MAM变体3和包含F188L、D261G、T288P和S200N的MAM变体1以0.1单位/g面粉投配。

该面包制作工序涉及在将所有成分添加到混合机中之后进行单个混合步骤，之后进行发酵、定量(scaling)和整形、醒发(proofing)和烘焙。在烘焙后，将面包在6℃下储存5天。随后，使面包变成室温2小时，然后切成片，并根据上述方法对面包心硬度和回弹性进行评估。

表4中的结果显示，与用包含氨基酸取代F188L、D261G和T288P的MAM变体3制备的全谷物面包的面包心相比，用包含氨基酸取代F188L、D261G、T288P和S200N的MAM变体1制备的全谷物面包的面包心在6℃下储存5天后具有较低的硬度(以g为单位计)和减少的回弹性降低(以％计)。

表5.在6℃下储存几天后，用包含F188L、D261G和T288P的MAM变体3和包含F188L、D261G和T288P S200N的MAM变体1制成的全谷物面包的面包心硬度(g)和回弹性(％)。

面包还由受过训练的小组成员通过以下方法在感官上进行评估：对在6℃下5天的储存时段后面包心的硬度(与坚度相同，都与柔软度相反)、湿度、粘结性和易碎性进行评分。评分表示所有参与者的平均值。评分范围从1至9，其中1是每个特征的极低值(或不存在)，而9是每个特征的极高值。对于硬度和易碎性，低评分被认为是积极的，而对于湿度和粘结性，消费者期望高的评分。

表6中的结果显示，与用包含氨基酸取代F188L、D261G和T288P的MAM变体3制备的面包相比，用包含氨基酸取代F188L、D261G、T288P和S200N的MAM变体1制成的面包在硬度、湿度、粘结性和易碎性方面得到了更高的得分。

表6.以所有小组成员的平均值给出的对放置5天的用麦芽糖α-淀粉酶变体1：F188L、D261G、T288P和S200N和变体3：F188L、D261G、abd T288P烘焙的全谷物面包的感官评分：

变体	硬度	湿度	粘结性	易碎性

变体1	3.2	4.7	6.0	3.1
					变体3	7.3	3.1	5.3	4.5

实施例5：变体麦芽糖α-淀粉酶对小白面包的硬度和回弹性的影响

按照本领域技术人员已知的直接面团面包制作工序，根据包括100％的面粉、59％的常规自来水、4％酵母、1.8％盐、0.3％丙酸钙和0.5％基本面包改良剂的精益配方(使用百分比，所述百分比表示为相对于面粉量＝100％的面包师百分比)烘焙白面包。将包含氨基酸取代F188L、D261G、T288P的MAM变体3和包含F188L、D261G、T288P和S200N的MAM变体1以8ppm(0.08单位/g面粉)投配。面包制作工序涉及在将所有成分添加到混合机中之后进行单个混合步骤，之后进行发酵、定量(以350g的面团)和整形、醒发和烘焙。将所得面包在室温下储存，并评估面包心的硬度和回弹性。

表7中的结果显示，在环境温度下储存0至8天后，与用包含F188L、D261G和T288P的MAM变体3制备的面包相比，用包含F188L、D261G、T288P和S200N的MAM变体1制备的面包更不坚硬并且表现出减少的回弹性降低。

表7.用包含氨基酸取代F188L、D261G、T288P的MAM变体3和包含F188L、D261G、T288P S200N的MAM变体1制成的较小白面包在储存几天后的面包硬度(g)和回弹性(％)

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 变体麦芽糖α-淀粉酶

<130> 32852-WO-PCT

<150> EP18165871.7

<151> 2018-04-05

<160> 5

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 686

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖α-淀粉酶的成熟多肽

<400> 1

Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile Ile

1 5 10 15

Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys Ser

20 25 30

Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp Gly

35 40 45

Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln Leu

50 55 60

Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp Thr

65 70 75 80

Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg Asp

85 90 95

Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp Thr

100 105 110

Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Phe

115 120 125

Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe Ala

130 135 140

Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr Phe

145 150 155 160

Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser Asn

165 170 175

Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro Ala

180 185 190

Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala Gln

195 200 205

Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp Gly

210 215 220

Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu

245 250 255

Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg

260 265 270

Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr

275 280 285

Val Ile Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu

290 295 300

Asn Asn Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn

305 310 315 320

Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val

325 330 335

Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ala

355 360 365

Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp Thr

370 375 380

Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg Arg

385 390 395 400

Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile Asn

405 410 415

Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly Leu

450 455 460

Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe

465 470 475 480

Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser Ala

485 490 495

Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro Gly

500 505 510

Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly Thr

515 520 525

Val Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser Asn

530 535 540

Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp Val

545 550 555 560

Lys Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn Ile

565 570 575

Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro

580 585 590

Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu

595 600 605

Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln

610 615 620

Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser

625 630 635 640

Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg Ala

645 650 655

Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr Thr

660 665 670

Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 2

<211> 2186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码麦芽糖α-淀粉酶的ROM 1模块，含有氨基酸取代

F188L, S200N, D261G和T288P

<400> 2

agcgcgtctc ctatgaaaaa gaaaacgctt tctttgttcg taggcctgat gctgctgatc 60

ggtttgctgt tctctggttc tcttccatac aacccaaacg ctgctgaagc aagctcaagt 120

gcttctgtaa aaggcgatgt gatttaccaa atcatcatcg accgtttcta tgacggagac 180

actactaaca acaacccagc aaaatcatac ggtctttacg atccgacaaa atcaaaatgg 240

aaaatgtact ggggcggaga tcttgaaggc gttcgtcaaa aacttcctta cctgaaacaa 300

ttaggtgtga cgacgatttg gctgtctcct gttcttgata accttgatac attggcaggt 360

actgacaaca ctggctacca cggctactgg acgagagact tcaaacaaat cgaagaacac 420

ttcggaaact ggacgacatt cgatacgctt gtgaacgatg ctcaccaaaa cggaatcaaa 480

gttatcgttg atttcgttcc aaaccacagc actccattca aagctaacga ttcaacgttc 540

gctgaaggcg gtgctcttta caacaacgga acttacatgg gcaactactt tgatgatgca 600

acaaaaggct acttccacca caacggagat atttctaact gggatgaccg ttatgaagct 660

caatggaaaa acctgactga tccggcaggc ttcagccttg ctgatcttaa ccaagaaaac 720

ggaacgattg ctcaatacct gacagacgct gctgttcaat tagttgctca cggtgcagac 780

ggacttcgca ttgacgctgt aaaacacttc aacagcggct tctcaaaatc acttgctgac 840

aaactttacc aaaagaaaga tattttcctt gttggtgaat ggtacggaga tggcccaggt 900

actgcaaacc accttgaaaa agttcgttac gcaaacaaca gcggagtaaa cgtgcttgat 960

ttcgatttaa acccagtgat ccgtaatgta ttcggaacat tcactcaaac gatgtacgat 1020

ttgaacaaca tggtgaacca aacaggaaat gaatacaaat acaaagaaaa cctgattaca 1080

ttcatcgaca accatgatat gtctcgtttc ctttctgtaa acagcaacaa agcaaacctt 1140

caccaagctc ttgcattcat tttaacttct cgcggaactc caagcattta ctacggaact 1200

gaacaataca tggcaggcgg aaatgatcct tacaaccgcg gaatgatgcc tgctttcgac 1260

acaacaacta ctgcattcaa agaagtatca acgcttgctg gtctaagacg caacaacgct 1320

gctattcaat acggaactac tactcaacgc tggatcaaca acgacgttta catctacgaa 1380

cgcaaattct tcaacgatgt tgtgcttgtt gcaatcaacc gtaatacaca atcttcttac 1440

agcatttctg gtcttcaaac ggctcttcct aacggttctt acgctgatta cctaagcgga 1500

cttcttggcg gaaacggcat ttctgtttca aacggttctg ttgcttcttt cacacttgct 1560

cctggtgctg tttctgtttg gcaatactct acttctgctt ctgctcctca aatcggttct 1620

gtagctccaa acatgggcat cccaggaaac gttgtgacga ttgacggaaa aggcttcgga 1680

acaactcaag gtactgtaac gttcggcggc gttactgcaa ctgtaaaaag ctggacttct 1740

aaccgtatcg aagtgtacgt gccgaacatg gctgctggtt tgactgatgt gaaagtaact 1800

gcaggcggcg tttcttcaaa cctttacagc tacaacatcc tttctggtac tcaaacttct 1860

gttgtgttta ctgtgaaatc agctccgccg acaaaccttg gtgataaaat ctacctgact 1920

ggaaacatcc cagagcttgg caactggagc actgatacaa gcggcgctgt taacaacgct 1980

caaggaccgc ttcttgctcc aaactaccct gactggttct acgtattctc tgttcctgct 2040

ggaaaaacaa tccaattcaa attctttatc aaacgtgctg acggcacgat tcaatgggaa 2100

aacggttcaa accatgtggc aacaactcca actggtgcaa ctggtaacat cactgttact 2160

tggcaaaact aataaggaga cgcgct 2186

<210> 3

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BsmBI位点

<400> 3

agcgcgtctc cccgctaaaa attttacaaa aaggtattga ctttccctac agggtgtgta 60

ataatttaat tataaggaca aatgaataaa gattgtatcc ttcggggcag ggtggaaatc 120

ccgaccggcg gtagtaaagc acatttgctt tagagtccgt gacccgtgtg cataagcacg 180

cggtggattc agtttaagct gaagccgaca gtgaaagtct ggatgggaga aggatggacg 240

gtaaataaca aaagaaagga ggtgatcata tgggagacgc gct 283

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 4

Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr

1 5 10 15

Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly

20 25 30

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 5

ggtcatccca gttagaaata tctccgt 27

Claims

1.一种具有麦芽糖α-淀粉酶活性的变体多肽，其中所述多肽包含当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时包含氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G，以及任选的另一氨基酸取代T288P的氨基酸序列，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1确定的，并且其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中与不具有所述氨基酸取代F188L/I、S200N和D261G以及任选的另一氨基酸取代T288P的参考多肽相比，所述多肽的热稳定性具有降低的对钙离子的依赖性。

3.一种任选地根据权利要求1或2所述的具有麦芽糖α-淀粉酶活性的多肽，其中在将所述多肽在含有50mM NaCl和0.05％BSA和2mM EDTA的50mM pH 5.2的苹果酸缓冲液中在87.4℃的温度下孵育10分钟后，所述多肽具有至少40％的残留麦芽糖α-淀粉酶活性。

4.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至3中任一项所述的多肽。

5.一种编码根据权利要求1至3中任一项所述的多肽的核酸序列。

6.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求5所述的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至指导所述核酸序列表达的一个或多个控制序列。

7.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求4所述的核酸序列或根据权利要求6所述的表达载体。

8.一种用于制备根据权利要求1至3中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养根据权利要求7所述的宿主细胞，以及制备所述多肽，以及任选地回收所述多肽。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽或根据权利要求4所述的组合物用于降低面包的面包心硬度的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，所述用途还包括降低面包的面包心回弹性的降低。

11.根据权利要求9至10所述的用途，其中所述面包是白面包或全麦面包。

12.一种预混物，所述预混物包含面粉，以及根据权利要求1至3中任一项所述的多肽或根据权利要求4所述的组合物。

13.一种面团，所述面团包含根据权利要求1至3中任一项所述的多肽、根据权利要求4所述的组合物，或根据权利要求12所述的预混物。

14.一种用于制备面团的方法，所述方法包括将根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，或根据权利要求4所述的组合物，或根据权利要求12所述的预混物添加到所述面团中。

15.一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙根据权利要求13所述的面团。