CN111278970A - β-淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

一种具有β‑淀粉酶活性的变异多肽，和制造所述酶以及在烘焙、洗涤剂、个人护理产品中、在织物处理中、在纸浆和纸处理中、在乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆中使用酶；在油田和采矿工业中将所述酶用作降粘剂的方法。

Description

β-淀粉酶
序列表
本申请包括根据“按照专利合作条约(PCT)在国际专利申请中呈现核苷酸和氨基酸序列表的标准(Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino AcidSequence Listings in International Patent Applications Under the PatentCooperation Treaty(PCT))”ST.25以ASC II文本(.txt)文件呈计算机可读形式(CRF)的核苷酸和氨基酸序列表。序列表在以下鉴别出，并且以全文引用的方式并且出于所有目的并入本申请的本说明书中。
文件名 创建日期 大小(字节)
170325序列表.txt 2018年10月10日 29.3KB(30,022字节)
技术领域
数千年来，面包一直是人类营养的主食。面包通常是通过将面粉、水、盐、酵母和/或其它食品添加剂组合来制作面团或糊状物而制成的；然后将面团烘焙，制作面包。已知酶在烘焙中有用，因为酶对烘焙过程的作用可能与化学替代物相比类似或更好。可以使用几种不同的酶来制作面包，例如，已知淀粉酶有助于随着时间的流逝维持新鲜感(抗老化或硬度)并且随着时间的流逝维持弹性。然而，烘焙业仍需要历经比现有时间更长的时间可以提供新鲜面包的淀粉酶，或随着时间流逝可以提供比新鲜面包还要好的面包的淀粉酶。解决这一问题的一个解决方案是具有满足或超过这些工业要求的β-淀粉酶活性的变异多肽。另外，β-淀粉酶可以在动物饲料、洗涤剂、个人护理产品、织物处理、纸浆和纸处理中、在乙醇生产中、在木质纤维素乙醇生产中、在糖浆生产中使用或在油田和采矿工业中用作降粘剂。
发明内容
一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽由与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％一致的核酸序列编码。
一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽选自由以下组成的群组：(a)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(b)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ IDNO：3的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(b)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(d)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：5中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：5的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ IDNO：5的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(e)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；并且(f)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：7中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：48、51、56、57、59、60、80、115、133、137、139、151、173、175、177、178、179、185、187、204、207、211、229、233、235、237、238、247、251、252、253、262、305、231、318、351、354、396、398、401、430、431、470、472、478、484、485、488、490、495、496、497、500、508、522、531、536、540，或针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
所述变异多肽，其中所述至少一个单氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
所述变异多肽，其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
所述变异多肽，其中所述至少一个单氨基酸修饰是包含以下的氨基酸取代：K16Q、D19I、D19L、K24D、K24E、D25P、L27Q、L27H、L27C、I28A、K48Q、E48D、D51I、D51L、K56D、K56E、D57P、D57K、L59Q、L59H、L59C、I60A、E80D、C83S、S83C、T101N、Q105L、N107S、C115S、S115C、N119D、T133N、Q137L、N139S、A141R、N143D、S145N、S146P、Y147H、N151D、K153E、Y155H、H155Y、S172T、A173R、N175D、W175R、S177N、S178P、G179D、Y179H、K185E、Y187H、H187Y、A197T、K201E、G203I、S204T、I205M、A206H、W207R、G211D、S215D、F219W、S220W、S220C、C220S、C220L、C220W、Q221M、A229T、N230K、K233E、G235I、I237M、A238H、S247D、F251W、S252L、S252W、S252C、C252S、C252L、C252W、Q253M、N262K、N262G、V273*、A280S、S280A、H286Y、Y286H、V305*、A312S、S312A、Y318H、H318Y、T319S、S319T、C322S、S322C、T351S、S351T、C354S、S354C、A364P、S366H、N369P、A396P、S398H、S398P、D399M、N401P、S430P、D431M、N438Y、N738S、Y440N、S446P、N452D、T453K、A456S、G458D、P463T、P463L、N464D、Y465N、W468C、N470Y、N470S、Y472N、P476L、S478P、N484D、T485K、A488S、G490D、S490T、P495T、P495L、N496D、Y497N、S499P、W500C、T504N、P508L、S508T、S522T、S531P、T536N、S540T或其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽选自由以下组成的群组：(i)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(12)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(ii)所述变异多肽是与如SEQ ID NQ：3中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(l2)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(iii)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(l2)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(iv)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：5中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：5的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、C220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、C220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(l1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、C220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、C220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、C220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)C220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(l2)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、C220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(vi)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(l1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(l2)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(vii)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：7中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D51I、L59C、A173R、A396P、N401P、S430P；(b1)D51I、L59C、I60A、S177N、G235I、S252L、A396P、N401P、S430P；(c1)D51I、L59H、Q253M；(d1)D57K、A396P、N401P、S430P；(e1)D57K、A396P、N401P、S430P；(f1)D57K、G235I、A396P、N401P、S430P；(g1)D57K、I60A、S252L、Q253M、A396P、N401P；(h1)D57K、L59C、G235I、A396P、N401P、S430P；(i1)D57K、L59C、G235I、A396P、N401P、S430P；(j1)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P；(k1)D57K、L59C、I60A、A173R、A396P、N401P、S430P；(11)D57K、L59C、160A、A173R、A396P、N401P、S430P；(m1)D57K、L59C、S177N、S252L、A396P、N401P、S430P；(n1)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P；(o1)D57P、L59H、160A、Q253M；(p1)G235I、A396P、N401P、S430P；(q1)K56E、D57K、L59C、A396P、N369P；(r1)K56E、D57K、L59C、I60A、A173R、A396P、N401P、S430P；(s1)K56E、D57P、L59H、A173R、G235I、S252L、S430P；(t)K56E、L59H、I60A、S252L、A396P、N401P、S430P；(u1)N175D、A229T；(v1)S252L、A396P、N401P、S430P；(w1)T133N、D431M；(x1)D57K、A396P、N401P、S430P、P495T；(y1)D57K、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(z1)D57K、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；(a2)D57K、A396P、N401P、S430P、A488S；(b2)D57K、A396P、N401P、S430P、N470Y、Y472N；(c2)D57K、A396P、N401P、S430P、G490D；(d2)D57K、A396P、N401P、S430P、S540T；(e2)D57K、A396P、N401P、S430P、T540N；(f2)D57K、A396P、N401P、S430P、S522T；(g2)D57K、A396P、N401P、S430P、S531P；(h2)D57K、A396P、N401P、S430P、N484D；(i2)D57K、A396P、N401P、S430P、N470S；(j2)D57K、A396P、N401P、S430P、I485K；(k2)D57K、A396P、N401P、S430P、S478P；(12)D57K、A396P、N401P、S430P、W500C；(m2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、K185E、K233E；(n2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、E48D、N175Y、S178P、K233E；(o2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、N139S、S204T、W207R；(p2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、Q137L、N151D；(q2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、P495T；(r2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(s2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；(t2)D57K、L59C、K185E、K233E、S252L、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(u2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、P495T；(v2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(w2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，并且所述变异多肽在与SEQ ID NO：2的β-淀粉酶相比时酶活性、热稳定性、pH稳定性或其任何组合有所增加。
所述变异多肽，其中所述变异多肽是全长氨基酸序列的片段，并且所述片段具有β-淀粉酶活性。
一种变异多肽，其包含至少一种变异多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有β-淀粉酶活性。
一种组合物，其包含变异多肽。
一种组合物，其包含变异多肽和至少第二酶。
包含变异多肽和至少第二酶的组合物，其中所述第二酶选自由以下组成的群组：第二β-淀粉酶、脂肪酶、α-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
一种制造所述变异多肽的方法，其包含：提供编码变异多肽的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化到表达宿主中，培育所述表达宿主以产生所述变异多肽，并且纯化所述变异多肽。
一种制造所述变异多肽的方法，其中所述模板核酸是如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列的变异核苷酸，其中所述变异核苷酸是与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致的核酸序列，其中所述变异核苷酸编码具有β-淀粉酶活性的多肽。
一种制造所述变异多肽的方法，其中所述表达宿主选自由以下组成的群组：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。
一种制造所述变异多肽的方法，其中所述细菌表达系统选自大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。
一种制造所述变异多肽的方法，其中所述酵母表达系统选自念珠菌(Candida)、毕赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。
一种制造所述变异多肽的方法，其中所述真菌表达系统选自青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、镰刀霉(Fusarium)、毁丝霉(Myceliopthora)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、嗜热真菌(Thermomyces)和木霉(Trichoderma)。
一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将变异多肽中的一种添加到所述面团中，并且将其烘焙。一种制备面团或烘焙产品的方法，其包含：提供所述变异多肽，提供面团，使所述变异多肽与所述面团接触，以及任选地烘焙所述面团以产生烘焙产品。
一种使用变异多肽的方法，其用于处理淀粉。一种处理淀粉的方法，其包含：提供变异多肽，提供淀粉，使变异多肽与淀粉接触，其中变异多肽使淀粉水解。
一种使用变异多肽的方法，其用于清洁或洗涤织物、硬表面或餐盘。一种用于清洁或洗涤织物、硬表面或餐盘的方法，其包含：提供变异多肽，提供织物、硬表面或餐盘，使变异多肽与织物、硬表面或餐盘接触，其中变异多肽清洁或洗涤织物、硬表面或餐盘。
一种使用变异多肽的方法，其用于制作乙醇。一种制作乙醇的方法，其包含：提供变异多肽，提供原料，使变异多肽与原料接触，其中变异多肽将原料水解成糖，引发糖产生乙醇。
一种使用变异多肽的方法，其用于处理油井。一种处理油井的方法，其包含：提供变异多肽，提供油井压裂流体；使变异多肽与油井压裂流体接触，其中变异多肽使油压裂流体水解。
一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于处理包含的纸浆或纸。一种处理纸浆或纸的方法，其包含：提供变异多肽，提供纸浆或纸，使变异多肽与纸浆或纸接触，其中变异多肽使纸浆或纸水解。
一种使用变异多肽的方法，其用于饲喂动物。一种制作动物饲料的方法，其包含：提供变异多肽，提供动物饲料，使变异多肽与动物饲料接触，其中变异多肽是动物饲料的一部分。
一种使用变异多肽的方法，其用于制作糖浆。一种制作糖浆的方法，其包含：提供变异多肽，提供糖，使变异多肽与糖接触，其中变异多肽使糖水解以产生糖浆。
附图说明
图1展示变异β-淀粉酶的pH概况。
图2展示20天试验的面包硬度和弹性的结果。
具体实施方式
酶是包含氨基酸序列的生物分子，其中所述酶催化反应。基于国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(the Nomenclature Committee of the International Unionof Biochemistry and Molecular Biology；IUBMB)的建议，酶名称对于所属领域技术人员是已知的。酶名称包括：EC(酶委员会)编号、建议名称、替代名称(如果存在)、催化活性和其它因素。酶也称为多肽、蛋白质、肽、氨基酸序列，或由SEQ ID NO鉴别。酶的替代名称可以互换使用。
已知不同类别的酶适用于烘焙，包括：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)；β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(E.C.3.2.1.60)，也称为外麦芽四糖水解酶、G4-淀粉酶；葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(E.C.3.2.1.133)，也称为产麦芽糖α-淀粉酶；内-1，4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)；氧化还原酶；磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)、磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)；磷脂酶C(E.C.3.1.4.3)；磷脂酶D(E.C.3.1.4.4)；半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)、植酸酶(Phytase)(EC 3.1.3.8；3.1.3.26；和3.1.1.72)和蛋白酶。酶用作食品成分、食品添加剂和/或处理助剂。
β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)在多糖中预形成(1-＞4)-α-D-糖苷键的水解，以从链的非还原端去除连续的麦芽糖单元。通过逆转作用于淀粉、糖原和产生β-麦芽糖的相关多糖和寡糖。这种酶广泛用于制造焦糖、麦芽糖、麦芽糊精和酿造啤酒、酒精和醋的发酵工业。β-淀粉酶的特征在于高等植物和微生物来源，例如来自微生物来源的β-淀粉酶是：嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(美国专利4,970,158)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)(Matsunaga，Okada和Yamagat，H.和Tsukagishi，N.1987，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》(169)1564-1570)和美国专利8,486,682。来自微生物来源的其它β-淀粉酶是：热硫梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)(Kitaoto，1988，Kitamoto，N.，Yamagata，H.，Kato，T.，Tsukagoshi，N.和Udaka，S.1998.《细菌学杂志》(170)5848-5854)、美国专利申请公开案2012/0225164、WO2015/021600、WO2015/021601、EP0337090A1和热硫化氢嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)JP01218589。基于源自热硫梭菌的β-淀粉酶，研发出耐酸性β-淀粉酶(CN103695386和CN 103881993)。
另外，在包括以下的专利和公开的专利申请中公开淀粉酶：WO2002/068589、WO2002/068597、WQ2003/083054、WO2004/042006、WO2008/080093、WO2013/116175和WO2017/106633。
用于食品处理和烘焙的市售淀粉酶包括：来自AB酶(AB Enzymes)的
Figure BDA0002465373960000191
可购自DSM的
Figure BDA0002465373960000192
和
Figure BDA0002465373960000193
可购自杜邦(DuPont)的
Figure BDA0002465373960000194
Max-LIFETM、
Figure BDA0002465373960000195
和
Figure BDA0002465373960000196
和可购自诺维信(Novozymes)的
Figure BDA0002465373960000197
和
Figure BDA0002465373960000198
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)为水解酶，其已知用以使脂质中的酯键裂解。脂肪酶包括磷脂酶、三酰基甘油脂肪酶和半乳糖脂酶。已从植物、哺乳动物和微生物体中鉴别出脂肪酶，包括但不限于：假单胞菌、弧菌(Vibrio)、不动杆菌(Acinetobacter)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、色素杆菌(Chromobacterium)、来自茄镰孢菌(Fusarium solani)的角质酶(Cutinase)(FSC)、南极假丝酵母A(Candida antarctica A)(CalA)、米根霉(Rhizopusoryzae)(ROL)、疏棉嗜热霉菌(Thermomyces lanuginosus)(TLL)、米氏假根毛霉(Rhizomucor miehei)(RML)、黑曲霉(Aspergillus Niger)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、禾秆镰孢菌(Fusarium culmorum)脂肪酶。
另外，多种脂肪酶、磷脂酶和半乳糖脂酶已公开于专利和公开的专利申请中，所述专利和公开的专利申请包括但不限于：WO1993/000924、WO2003/035878、WO2003/089620、WO2005/032496、WO2005/086900、WO2006/031699、WO2008/036863和WO201I/046812。
用于食品处理和烘焙的市售脂肪酶包括但不限于：LIPOPANTM、NOOPAZYME、LIPOPANMAX、LIPOPAN Xtra(可购自诺维信)；PANAMORE、CAKEZYME和BAKEZYME(可购自DSM)；以及GRINDAMYL EXEL 16、GRINDAMYL POWERBAKE和TS-E 861(可购自杜邦/丹尼斯克(Danisco))。
“亲本”多肽氨基酸序列是用于向序列中引入突变(例如，通过引入一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其组合)，从而产生亲本多肽氨基酸序列的“变体”的起始序列。亲本包括：野生型多肽氨基酸序列或合成产生的多肽氨基酸序列，其用作引入(其它)变化的起始序列。
“变异多肽”是指在其氨基酸序列中与其亲本不同的酶。根据IUPAC关于单个字母或三个字母的氨基酸缩写的建议，使用单氨基酸分子的命名法和缩写来描述变异多肽。
通过提供原始氨基酸，然后提供氨基酸序列内的位置编号来描述“取代”。举例来说，氨基酸残基24的取代是指在位置24处的亲本的氨基酸可以被19个其它氨基酸残基中的任一者取代。另外，可以通过提供原始氨基酸，然后提供氨基酸序列内的位置编号，然后提供特定取代的氨基酸来描述取代。举例来说，将位置120处的组氨酸用丙氨酸取代称为“His120Ala”或“H120A”。取代的组合通过在氨基酸残基之间插入逗号来描述，例如：K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；在与亲本多肽相比时表示七个不同氨基酸残基取代的组合。在氨基酸变化的情况下具有取代的变体也可以应用于核酸修饰，例如通过取代。
具有氨基酸取代的变异多肽，其中所述取代可以是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”或“相关氨基酸”意指用与亲本氨基酸序列相比在相同位置处具有类似特性的不同氨基酸残基置换氨基酸序列中的一个氨基酸残基。保守氨基酸取代的一些实例包括但不限于用不同的带正电氨基酸残基置换带正电氨基酸残基；用不同的极性氨基酸残基置换极性氨基酸残基；用不同的非极性氨基酸残基置换非极性氨基酸残基、用不同的碱性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基或用不同的芳香族氨基酸残基置换芳香族氨基酸残基。相关氨基酸的列表在下表中给出(参见例如Creighton(1984)《蛋白质(Proteins.)》W.H.Freeman andCompany(Eds))。
保守氨基酸取代的实例；
残基 保守取代 残基 保守取代
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gin；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
WIPO标准ST.25(1998)提供，氨基酸残基应在序列表中使用以下三个字母的符号表示，其中首字母大写。下表提供氨基酸标识符以及使用标准遗传标准编码氨基酸的相应DNA密码子的综述。编码氨基酸残基的DNA密码子可以视所用生物体而不同，并且应用略微不同的遗传密码翻译表。NCBI维持这类非标准密码翻译表的汇编。作为参考，参见例如https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi。
Figure BDA0002465373960000211
Figure BDA0002465373960000221
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以是“成熟多肽”。成熟多肽意指呈其最终形式的酶，所述形式包括任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、N端修饰、C端修饰、信号序列缺失。成熟多肽可以视表达系统、载体、启动子和/或产生方法而变化。
“酶活性”意指酶发挥的至少一种催化作用。酶活性表示为每毫克酶的单位数(比活性)，或每分子酶每分钟转化的底物分子数(分子活性)。酶活性可以由酶的实际功能来指定，例如通过催化肽键的水解裂解而发挥蛋白水解活性的蛋白酶、通过酯键的水解裂解而发挥脂解活性的脂肪酶等。
在酶的储存或操作使用期间，酶活性发生变化。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作期间酶活性随时间变化的保持率。
为了确定和量化在一定条件下随时间推移储存或使用的酶的催化活性的变化，在限定条件下在时间为0(100％)时并且在稍后的某个时间点(x％)测量“初始酶活性”。通过比较所测量的值，可以确定酶活性的潜在损失的程度。酶活性损失的程度决定酶的稳定性或非稳定性。
影响酶的酶活性和/或储存稳定性和/或操作稳定性的参数是例如pH、温度和氧化物质的存在：
变异多肽可在宽的pH范围内在约pH 4.0到约pH 12.0的范围内在任何单个点下具有活性。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在pH 4.0到pH 11.0、pH 4.0到pH 10.0、pH 4.0到pH9.0、pH 4.0到pH 8.0、pH 4.0到pH 7.0、pH 4.0到pH 6.0或pH 4.0到pH 5.0的范围内具有活性。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH9.0、pH 9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH 9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5、pH 10.6、pH 10.7、pH 10.8、pH 10.9、pH 11.0、pH 11.1、pH 11.2、pH 11.3、pH 11.4、pH 11.5、pH 11.6、pH 11.7、pH 11.8、pH 11.9、pH12.0、pH 12.1、pH 12.2、pH 12.3、pH 12.4和pH 12.5、pH 12.6、pH 12.7、pH 12.8、pH 12.9和更高pH下具有活性。
“pH稳定性”是指蛋白质在特定pH范围内起作用的能力。通常，大多数酶都在较高或较低pH范围的条件下起作用。
变异多肽可以在烘焙过程期间在任何时间所用的宽的温度范围内具有活性，其中所述温度是约20℃到约60℃的范围内的任一点。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在20℃到55℃、20℃到50℃、20℃到45℃、20℃到40℃、20℃到35℃、20℃到30℃或20℃到25℃的温度范围下具有活性。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在至少19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃的温度或更高温度下具有活性。
“热稳定性(thermal stability/thermostability)”是指蛋白质在一定温度范围内起作用的能力。通常，大多数酶具有其起作用的有限温度范围。除了在中等范围温度(例如室温)下起作用的酶外，还存在能够在非常高或非常低的温度下起作用的酶。热稳定性的特征在于称为T50值(也称为半衰期，见上文)的内容。T50指示与未经历热处理的参考样品相比，在一定时间内热失活一段时间后仍有50％残留活性的温度。
“耐热性(thermal tolerance/thermotolerance)”是指蛋白质在暴露于特定温度(例如非常高或非常低的温度)后起作用的能力。耐热蛋白可能不会在暴露温度下起作用，但一旦恢复到有利的温度就会起作用。
“纯化的”意指材料呈相对纯的状态，例如至少约90％纯的、至少约95％纯的或至少约98％或99％纯的。优选地，“纯化的”意指材料呈100％纯的状态。
通过体外化学或酶促合成来产生“合成”或“人工”化合物。变异核酸可利用针对宿主生物体(例如酵母细胞宿主或其它选定表达宿主，或与亲本蛋白序列相比，具有氨基酸修饰(例如取代)的变异蛋白序列)的最佳密码子使用来产生，例如以使多肽的特性最佳化。
术语“非天然存在”是指(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶、蛋白质、细胞、生物体或在其原始环境或来源中不存在的其它材料，尽管其可能最初源自其原始环境或来源，并且然后源自在实验室条件下复制的非天然存在的过程。
“序列一致性”、“序列一致性％”、“一致性％”或“序列比对”意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并且基于比较计算为百分比。这一计算结果可以描述为“一致百分比”或“ID百分比”。
通常，序列比对可用于通过两种不同途径之一来计算序列一致性。在第一种途径中，在最终序列一致性计算中，将单个位置的不匹配和单个位置的缺口两者都计为不一致位置。在第二种途径中，在最终序列一致性计算中，将单个位置的不匹配项计为不一致位置；然而，在最终序列一致性计算中，单个位置的缺口不计为(忽略)不一致位置。换句话说，在第二种途径中，在最终序列一致性计算中忽略缺口。这两种途径之间的差异(将缺口计为不一致位置对比在单个位置忽略缺口)会导致两个序列之间的序列一致性值发生变化。
序列一致性由程序确定，所述程序产生比对，并且在最终序列一致性计算中将单个位置的不匹配和单个位置的缺口都计为不一致位置，计算一致性。举例来说，程序Needle(EMBOS)，所述程序已实施Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch，1970，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443-453)，并且所述程序通过首先产生第一个序列与第二序列之间的比对，然后计数比对长度上一致位置的数目，然后将一致残基的数目除以比对长度，然后将这一数字乘以100以产生序列一致性％[序列一致性％＝(一致残基数/比对长度)×100)]来计算序列一致性。
可以从成对比对计算出序列一致性，所述成对比对展示全长上的两个序列，因此展示出其全长上的第一序列和第二序列(“全局序列一致性”)。举例来说，程序Needle(EMBOSS)产生这样的比对；序列一致性％＝(一致残基数/比对长度)×100)]。
可以从仅展示第一序列或第二序列的局部区域的成对比对计算序列一致性(“局 部一致性”)。举例来说，程序Blast(NCBI)产生这样的比对；序列一致性％＝(一致残基数/比对长度)×100)]。
计算序列比对，将单个位置的不匹配计为最终序列一致性计算中的不一致位置；然而，在最终序列一致性计算中，将单个位置的缺口不计为(忽略)不一致位置。序列比对通过使用Needleman和Wunsch的算法(《分子生物学杂志》(1979)48，第443-453页)产生。优选地，程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite；EMBOSS))与程序默认参数(缺口开放＝10.0，缺口延伸＝0.5和矩阵＝EBLOSUM62)一起使用。然后，可以从展示全长上的两个序列的比对中计算序列一致性，因此展示其全长中的第一序列和第二序列(“全局序列一致性”)。举例来说：一致性％＝(一致残基数/比对长度)×100)]。
将变异多肽描述为与各个亲本酶的氨基酸序列至少n％一致的氨基酸序列，其中“n”是10与100之间的整数。变异多肽包括在与亲本酶的全长氨基酸序列相比时至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的酶，其中酶变体具有酶活性。如本文所用，“片段”或“子序列”是多核苷酸或氨基酸序列的一部分。片段或子序列可以保留或编码与其相关的序列的至少一种功能活性。
“功能片段”是指仅分别包含全长核酸或全长氨基酸序列的一部分但仍具有相同或类似活性和/或功能的任何核酸或氨基酸序列。片段占原始序列的至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。与原始核酸或原始氨基酸序列相比，功能片段分别包含连续的核酸或氨基酸。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以是超过一种β-淀粉酶的杂合体。“杂合体”或“嵌合”或“融合蛋白”意指第一变异多肽β-淀粉酶的结构域与第二β-淀粉酶的结构域合并形成杂合体淀粉酶，并且杂合体具有淀粉酶活性。具有β淀粉酶活性的变异多肽的结构域可以与市售淀粉酶的结构域组合，所述市售淀粉酶例如来自AB酶的
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可购自DSM的
Figure BDA0002465373960000262
和
Figure BDA0002465373960000263
可购自杜邦的
Figure BDA0002465373960000264
Max-LIFETM、
Figure BDA0002465373960000265
和
Figure BDA0002465373960000271
和可购自诺维信的
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和
Figure BDA0002465373960000273
另外，来自各种淀粉酶的结构域可以再合并到单一酶中，其中所述酶具有淀粉酶活性。
工业酶通常是使用细菌、真菌或酵母表达系统产生的重组蛋白。“表达系统”还指宿主微生物体、表达宿主、宿主细胞、生产生物体或生产菌株，并且这些术语中的每一个可以互换使用。表达系统的实例包括但不限于：黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、疏棉嗜热霉菌、尖镰孢菌、异孢镰刀菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、假单胞菌、优选荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、甲醇酵母(Pichia pastoris)(也称为法夫驹形氏酵母(Komagataellaphaffii)、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophile)(C1)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、木霉、优选里氏木霉(Trichoderma reesei)和酵母、优选酿酒酵母(preferably Saccharomyces cerevisiae)。使用上文所列的表达系统产生具有β-淀粉酶活性的变异多肽。
术语“异源”(或外源或外来或重组)多肽是：(a)对于宿主细胞不是天然的多肽。这类异源多肽的蛋白序列是合成的非天然存在的“人造”蛋白序列；(b)对于宿主细胞是天然的多肽，在所述宿主细胞中已经进行结构修饰，例如缺失、取代和/或插入以改变天然多肽；或(c)对于宿主细胞是天然的多肽，其表达经过定量地改变，或其表达由基因组位置引导，所述基因组位置由于通过重组DNA技术(例如更强启动子)对宿主细胞的DNA进行操纵而不同于天然宿主细胞。
术语“异源”(或外源或外来或重组)多核苷酸是指：(a)对于宿主细胞不是天然的多核苷酸；(b)对于宿主细胞不是天然的多核苷酸，在所述宿主细胞中已经进行结构修饰，例如缺失、取代和/或插入以改变天然多核苷酸；(c)对于宿主细胞是天然的多核苷酸，其表达由于通过重组DNA技术(例如更强启动子)对多核苷酸的调节元件进行操纵而定量地改变；或(d)对于宿主细胞是天然的，但是由于通过重组DNA技术进行遗传操纵而未整合到其天然遗传环境中的多核苷酸。
关于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列，术语“异源”用来表征两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列不在彼此特定的组合中天然存在。
“载体”意指适于携带外来多核苷酸序列以转移到另一细胞中或在给定细胞内稳定或短暂表达的任何种类的构建体。术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，例如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如噬菌体)、细菌噬菌体、杆状病毒、柯斯质粒(cosmid)、福斯质粒(fosmid)、人工染色体或和对相关特定宿主具有特异性的任何其它载体。还包括低复本数或高复本数载体。外来多核苷酸序列通常包含编码序列，其可以称为“相关基因”。相关基因可以包含内含子和外显子，这视宿主细胞的起源或目标的种类而定。
如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列的变异核苷酸，其中变异核苷酸是与如SEQID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致的核酸序列，其中变异核苷酸编码具有β-淀粉酶活性的酶变异多肽。
一种制造具有β-淀粉酶活性的变异多肽的方法，其包含：提供模板核酸序列，其中所述模板核酸是如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列的变异核苷酸，其中所述变异核苷酸是与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致的核酸序列，其中所述变异核苷酸编码具有β-淀粉酶活性的多肽。
将模板核酸序列转化到表达宿主中
培育表达宿主以产生变异多肽，并且纯化变异多肽。
模板核酸是如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列的变异核苷酸，其中所述变异核苷酸是与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致的核酸序列，其中所述变异核苷酸编码具有β-淀粉酶活性的多肽。
具有β-淀粉酶活性的多肽变体可以单独或以酶的混合物形式使用或配制。
配制物可以是固体形式，例如粉末、冻干制剂、细粒、片剂、条棒、晶体、胶囊、丸剂、丸粒；或呈液体形式，例如呈水溶液、气溶胶、凝胶、糊状物、浆料、水性/油性乳剂、乳膏、胶囊或呈囊泡或胶束悬浮液。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以与至少一种其它酶组合使用。其它酶可以来自相同类别的酶，例如包含第一β-淀粉酶和第二β-淀粉酶的组合物。其它酶也可以来自不同类别的酶，例如包含具有β-淀粉酶活性的变异多肽和脂肪酶的组合物。与至少一种其它酶的组合可以是包含至少三种酶的组合物。这三种酶可以具有来自相同类别酶(例如第一淀粉酶、第二淀粉酶和第三淀粉酶)的酶；或者所述酶可以来自不同类别的酶，例如具有β-淀粉酶活性的变异多肽、脂肪酶和木聚糖酶。
第二酶包含：α-淀粉酶；β-淀粉酶，葡聚糖1，4-a-麦芽四糖水解酶，也称为外麦芽四糖水解酶、G4-淀粉酶；葡聚糖1，4-a-麦芽糖水解酶，也称为产麦芽糖α-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶；内-1，4-β-木聚糖酶；木聚糖酶、纤维素酶、氧化还原酶；磷脂酶A1；磷脂酶A2；磷脂酶C；磷脂酶D；半乳糖脂酶、三酰基甘油脂肪酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、转谷氨酰胺酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、蛋白酶或其任何组合。所述酶组合是具有β-淀粉酶活性的变异多肽和脂肪酶，或所述酶组合是β-淀粉酶、脂肪酶和木聚糖酶。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可以在组合物中。所述组合物包含具有β-淀粉酶活性的变异多肽。
所述组合物包含具有β-淀粉酶活性的变异多肽和第二酶。
优选地，第二酶选自由以下组成的群组：第二β-淀粉酶、脂肪酶、α-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
所述组合物可用于制备烘焙产品。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可用于制备面团或由面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将变异酶中的一种添加到面团中，并且将其烘焙。
面包包括但不限于：面包卷、圆面包、糕点、蛋糕、扁面包、批萨饼、口袋面包、威化饼、派皮馕、亚美尼亚脆饼(lavash)、皮塔饼、佛卡恰(focaccia)、酸面团、面条、曲奇、油炸(甜甜圈)玉米饼、薄饼、可丽饼、油炸面包丁和饼干。面包也可以是可食用的容器，例如杯子或椎体。烘焙面包通常涉及混合成分以形成面团、揉捏、发酵、塑形、烘焙、冷却和储存。用于制作面团的成分通常包括面粉、水、盐、酵母和其它食品添加剂。
面粉通常由小麦制成，并且可以出于不同目的进行碾磨，所述目的例如制作面包、糕点、蛋糕、饼干、意大利面和面条。小麦粉的替代品包括但不限于：杏仁粉、椰子粉、奇亚粉、玉米粉、大麦粉、斯佩耳特小麦粉(spelt flour)、大豆粉、大麻粉、土豆粉、藜麦、特夫粉(teffflour)、黑麦粉、苋菜粉(amaranth flour)、竹芋粉(arrowroot flour)、鹰嘴豆(chick pea/garbanzo)粉、腰果粉、亚麻粉、夏威夷果(macadamia)粉、小米粉、高粱粉、米粉、木薯粉和其任何组合。已知面粉类型在全世界不同地区与不同国家之间有所不同。
处理面粉或面团可包括添加无机物质、有机物质，例如脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、蛋白质和坚果。面粉或面团可以在烘焙之前通过冷却、加热、辐射、聚结或冻干进行预处理。另外，面粉或面团可以在烘焙之前通过添加酶或微生物体(例如酵母)进行预处理。
酵母将糖分解为二氧化碳和水。通常衍生自酿酒酵母的多种烘焙用酵母是所属领域技术人员已知的，包括但不限于：奶油酵母、压缩酵母、蛋糕酵母、活性干酵母、速溶酵母、耐高渗酵母、速发酵母、去活化酵母。其它种类的酵母包括营养酵母、啤酒用酵母、蒸馏用酵母和葡萄酒酵母。
甜味剂包括但不限于：液态糖、糖浆、白(粒化)糖、棕(原始)糖、蜂蜜、果糖、右旋糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜和人工甜味剂。
乳化剂包括但不限于单酸甘油酯的二乙酰基酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、乙氧基化单酸甘油酯和二酸甘油酯(EMG)、聚山梨醇酯(PS)和丁二酰化单酸甘油酯(SMG)。
可以与烘焙方法一起使用的其它食品添加剂包括：脂质、油、黄油、人造奶油、起酥油、乳脂、甘油、鸡蛋、乳制品、非乳制品替代品、增稠剂、防腐剂、着色剂和酶。
在烘焙过程期间，可以单独添加用于烘焙的成分或添加剂。成分或添加剂也可以与超过一种成分或添加剂合并以形成预混合物，并且然后在烘焙过程期间添加预混合物。面粉或面团混合物可以在烘焙之前制备，包括准备好的烤箱面团、包装好的面团或包装好的面糊。
可以对面包产品进行修改，以满足特殊的饮食要求，例如无糖、无麸质、低脂或其任何组合。所述酶可以延长面团类产品的贮存期或提供抗微生物(无霉菌)作用。
具有β-淀粉酶活性的变异多肽可适用于其它工业应用。具有β-淀粉酶活性的变异多肽在洗涤剂、个人护理产品中、在织物处理中、在纸浆和纸处理中、在乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆的生产中使用；在油田和采矿业中用作降粘剂。
“烘焙产品”包括例如以下的烘焙产品：面包、脆面包卷、三明治面包、圆面包、法式长棍面包(baguette)、拖鞋面包(ciabatta)、牛角面包(croissant)、面条、以及精美的面包制品、如甜甜圈、布里欧修brioche、史多伦(stollen)、蛋糕、玛芬蛋糕(muffin)等。
“面团”定义为面粉、盐、酵母和水的混合物，可以在烘焙之前将其揉捏、模制、塑形或卷起。另外，也可以使用其它成分，例如糖、人造奶油、鸡蛋、牛奶等。所述术语包括用于制备焙烤制品的面团，例如面包、面包卷、三明治面包、法式长棍面包、拖鞋面包、牛角面包、甜酵母面团等。
“面包体积”是通过使用激光扫描仪(例如Micro Stable System的VolscanProfiler)测量体积以及比体积而确定的烘焙制品的体积。所述术语还包括通过测量某些烘焙制品的长度、宽度和高度确定的体积。
范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应解释为是对本公开的范围的固定限制。因此，范围的描述视为已经具体地公开所述范围内所有可能的子范围以及个别的数值。举例来说，对例如1到6的范围的描述应视为已经具体地公开所述范围内的子范围(例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等)以及个别的数，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
通过以下结合附图的说明书，本公开的其它目的、优势和特征将变得显而易见。
在以下描述中，阐述众多具体细节以提供对本公开的透彻描述。然而，对于所属领域的技术人员将显而易见的是，可在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实践本公开的方法。在其它情况下，没有描述所属领域技术人员众所周知的熟知特征和程序，以避免混淆本公开。
实例1：PAHBAH分析
使用如Lever M.(1972、)“(比色测定碳水化合物的新反应(A new reaction forcolorimetric determination of carbohydrates.)”《分析生物化学(Anal.Biochem.)》47，273-279中所述的4-羟基苯酰肼方法与以下修改来测量β-淀粉酶和变异酶的淀粉水解的定量。在65℃下使112uL的1％土豆支链淀粉与12.5uL稀释酶反应，并且在10分钟时取样品。然后反应物通过混合到100ul 1％PAHBAH试剂中淬灭。将反应物加热到95℃维持6分钟，冷却到室温，并且在BioTek板读取器中在410nm下读取溶液吸收率。
实例2：残留活性
通过比较如在82℃或88℃下热激之前和之后使用PAHBAH分析所测量的每种酶的活性来计算残留活性。在82℃或88℃下将样品加热10分钟之后，在65℃下使用PAHBAH分析测试之前将样品冷却到室温。
实例3：ThermoFluor分析
每种β-淀粉酶变体的熔点(Tm)使用如Lo，MC；Aulabaugh，A；Jin，G；Cowling，R；Bard，J；Malamas，M；Ellestad，G(2004年9月1日)“针对在药物发现中的命中鉴定基于荧光的热偏移分析的评估(Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays forhit identification in drug discovery)”《分析生物化学》332(1)：153-9.：10.1016/j.ab.2004.04.031，PMID 15301960中所述的ThermoFluor分析与以下修改以高通量方式测量。在pH 6的50mM乙酸钠、5X SYPRO橙和酶上清液中的50μl反应物以每分钟1℃经历50℃到98℃的热匀变。使用BioRad CFX 384实时PCR机监测染料荧光。使用所供应的CFX Manager软件分析熔融曲线数据。
实例4：变异β-淀粉酶的表达
通过构建含有编码多核苷酸序列的表达质粒，将质粒转化到甲醇酵母(法夫驹形氏酵母)中，并且以以下方式生长所得表达菌株，获得具有β-淀粉酶活性的变异多肽。表达菌株的新鲜甲醇酵母细胞通过将序列确认菌株的甘油库存铺展到含有博莱霉素(Zeocin)的酵母提取蛋白胨右旋糖(YPD)琼脂板上获得。2天后，使用来自这些板的细胞将生产菌株的起始种子培养物接种到100mL缓冲甘油复合培养基(BMGY)中，并且在30℃和225-250rpm下生长20-24小时。通过将合适的量转移到装有挡板的发酵罐中的2-4L BMMY培养基中来扩大种子培养物的规模。发酵在30℃下并且在由平叶片轮叶提供的1100rrp的搅拌下进行48-72小时。在发酵的初始分批阶段之后，每当培养物中的溶解氧水平降到30％以下时，就添加灭菌过滤的甲醇作为饲料。或者，每3小时以起始分批培养物的0.5％v/v添加饲料。将最终的发酵液在4℃下以7000×g离心30分钟，以获得无细胞上清液。
具有β-淀粉酶的变异多肽如下鉴别：通过SDS-PAGE或毛细电泳法分析上清液的相关蛋白质表达。
实例5：变异β-淀粉酶
亲本酶选自KITAMOTO，“编码热硫梭菌的嗜热性B-淀粉酶的基因的克隆和定序(Cloning and Sequencing of the Gene Encoding Thermophilic B-amylase ofClostridium Thermosulfurogenes)”(1988)《细菌学杂志(J.Bacteriology)》第170卷，第5848-5854页；NCBI_P19584.1是AAA23204.1，并且在本申请中鉴别为SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其由核酸序列SEQ ID NO.：2编码。在实验室中对亲本酶进行工程改造，以产生具有改进的酶特征的非天然存在的β-淀粉酶变异酶。改进的特征包括热稳定性、pH、酶活性或其任何组合。
变异多肽酶以亲本酶开始形成，并且使用如至少US6562594、US6171820和US6764835中所述的亲本酶的基因位点饱和诱变(GSSM)、易错PCR和/或如美国专利9476078中所述的修剪式多位点组合装配(TMSCA)使其进化。
在与亲本酶相比时，β-淀粉酶变异酶可以是氨基酸插入、缺失或取代。取代可以是不同氨基酸的一个氨基酸残基；取代可以是保守氨基酸取代，或者取代可以是类似氨基酸残基。另外，取代可以位于氨基酸序列的超过一个位点处。举例来说，β-淀粉酶变体可以具有至少两个氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸残基143和197处。另外，可以对亲本酶进行多次取代。举例来说，β-淀粉酶变体可以在氨基酸残基编号203、364、369和398处具有氨基酸取代。亲本酶的氨基酸序列的结构变化和具有单点氨基酸取代或氨基酸取代的组合以及在与亲本酶相比时具有改进的酶活性、热稳定性、pH和其任何组合的变异多肽的功能性改进的额外实例展示于下表1中。
表1：
Figure BDA0002465373960000351
Figure BDA0002465373960000361
Figure BDA0002465373960000371
实例6：变异β-淀粉酶的pH
具有β-淀粉酶活性的变异多肽和酶的pH概况使用BCA分析确定：底物是来自土豆的1％支链淀粉(西格玛(Sigma)第A8515号批号SLBS5819)；反应缓冲剂是50mM伯瑞坦罗宾逊缓冲液(Britton Robinson Buffer)，总共125μL；冻干粉酶；稀释酶12.5μL；波长读数560nm；在60℃下pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、8.0。在开始反应之前，在热循环仪中对10个PCR条/管进行预升温10分钟。在PCR中孵育112.5μl(缓冲液)：在适当温度下在任何给定缓冲液中1％支链淀粉最少10分钟。通过添加12.5μL酶稀释液来引发反应。在每个时间点(TP)，将10uL等分试样反应物放入BCA溶液板中。一旦取得所有时间点，就将BCA挡板在80℃下加热30分钟，冷却。将100μL研发的BCA溶液转移到96孔平底板中，并且在560nm下读数。结果展示于下表2和图1中。
表2：
Figure BDA0002465373960000381
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Figure BDA0002465373960000401
实例7：烤小麦面包
具有β-淀粉酶活性的变异多肽的烘焙性能在以直接方法产生的小麦面包中进行测试。将1000g 550型面粉(Vogtmühlen Illertissen)、30g压缩酵母、20g盐、20g糖、20g人造奶油、60ppm抗坏血酸、150ppm
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CS 30(真菌木聚糖酶、纤维素酶、真菌α-淀粉酶)、8g
Figure BDA0002465373960000403
55(蒸馏单甘油酸酯)和580g水在Kemper SP 15螺旋形混合器中以速度1混合4.5分钟并且以速度2混合2.25分钟，直到最终面团温度为28℃。静置15分钟后，将面团分成500g的块，搓圆并且醒发15分钟。之后，将面团块模制，放入烘焙罐中，并且在35℃下在85％的相对湿度下醒发80分钟。醒发后的面团块在柜式烤箱中在255℃/240℃的下部和上部加热下烘焙25分钟，并且注入蒸汽15秒。
将变异多肽酶样品以27ppm到325ppm的剂量添加到面粉中。对面团特性和最终烘焙制品的影响与阴性对照(无酶)、Nonovayl 10,000和Novamyl 3D进行比较。
通过激光扫描仪(Stable Micro Systems VolScan Profiler，VolScan 600)测量面包条来确定体积作用。阴性对照定义为0％。面团特性由熟练的高级烘焙师进行触觉评估，并且与阴性对照比较来进行描述。
将准备好的烘焙面包包装并且密封在塑料袋中。另外，将其部分地在85℃下巴氏灭菌90分钟。新制，并且在定义的储存时间后，通常在1、10、20天后，通过使用质地分析仪(Stable Micro Systems，TA.XTplus Texture Analyzer)通过质地概括分析确定对面包屑特性的作用。因此，在测量之前，从面包条的中间切出25毫米厚的切片。结果如下表3和图2中所示。
Figure BDA0002465373960000411
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Claims (26)

1.一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽由与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％一致的核酸序列编码。
2.一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽选自由以下组成的群组：(a)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ IDNO：2的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(b)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：3的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(b)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(d)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：5中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：5的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：5的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(e)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：16、19、24、25、27、28、48、83、101、105、107、119、141、143、145、146、147、153、155、172、175、179、197、201、203、205、206、215、219、220、221、230、273、280、286、319、322、364、366、369、398、399、438、440、446、452、453、456、458、463、464、465、468、476、490、499、504、508，或针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；并且(f)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：7中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽在以下氨基酸残基位置编号处具有针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的至少一个单氨基酸修饰：48、51、56、57、59、60、80、115、133、137、139、151、173、175、177、178、179、185、187、204、207、211、229、233、235、237、238、247、251、252、253、262、305、231、318、351、354、396、398、401、430、431、470、472、478、484、485、488、490、495、496、497、500、508、522、531、536、540，或针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
3.根据权利要求2所述的变异多肽，其中所述至少一个单氨基酸修饰是氨基酸取代、插入、缺失或其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
4.根据权利要求3所述的变异多肽，其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
5.根据权利要求3所述的变异多肽，其中所述至少一个单氨基酸修饰是包含以下的氨基酸取代：K16Q、D19I、D19L、K24D、K24E、D25P、L27Q、L27H、L27C、I28A、K48Q、E48D、D51I、D51L、K56D、K56E、D57P、D57K、L59Q、L59H、L59C、I60A、E80D、C83S、S83C、T101N、Q105L、N107S、C115S、S115C、N119D、T133N、Q137L、N139S、A141R、N143D、S145N、S146P、Y147H、N151D、K153E、Y155H、H155Y、S172T、A173R、N175D、W175R、S177N、S178P、G179D、Y179H、K185E、Y187H、H187Y、A197T、K201E、G203I、S204T、I205M、A206H、W207R、G211D、S215D、F219W、S220W、S220C、C220S、C220L、C220W、Q221M、A229T、N230K、K233E、G235I、I237M、A238H、S247D、F251W、S252L、S252W、S252C、C252S、C252L、C252W、Q253M、N262K、N262G、V273*、A280S、S280A、H286Y、Y286H、V305*、A312S、S312A、Y318H、H318Y、T319S、S319T、C322S、S322C、T351S、S351T、C354S、S354C、A364P、S366H、N369P、A396P、S398H、S398P、D399M、N401P、S430P、D431M、N438Y、N738S、Y440N、S446P、N452D、T453K、A456S、G458D、P463T、P463L、N464D、Y465N、W468C、N470Y、N470S、Y472N、P476L、S478P、N484D、T485K、A488S、G490D、S490T、P495T、P495L、N496D、Y497N、S499P、W500C、T504N、P508L、S508T、S522T、S531P、T536N、S540T或其任何组合，并且所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
6.一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽选自由以下组成的群组：(i)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(12)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(ii)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(l1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、128A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、128A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(12)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(iii)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(l2)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(iv)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：5中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：5的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、C220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、C220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(11)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、C220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、C220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、C220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)C220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(12)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、C220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、C220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(vi)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：6中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D19I、L27C、A141R、A364P、N369P、S398P；(b1)D19I、L27C、I28A、S145N、G203I、S220L、A364P、N369P、S398P；(c1)D19I、L27H、Q221M；(d1)D25K、A364P、N369P、S398P；(e1)D25K、A364P、N369P、S398P；(f1)D25K、G203I、A364P、N369P、S398P；(g1)D25K、I28A、S220L、Q221M、A364P、N369P；(h1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(i1)D25K、L27C、G203I、A364P、N369P、S398P；(j1)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P；(k1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(l1)D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(m1)D25K、L27C、S145N、S220L、A364P、N369P、S398P；(n1)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P；(o1)D25P、L27H、I28A、Q221M；(p1)G203I、A364P、N369P、S398P；(q1)K24E、D25K、L27C、A364P、N369P；(r1)K24E、D25K、L27C、I28A、A141R、A364P、N369P、S398P；(s1)K24E、D25P、L27H、A141R、G203I、S220L、S398P；(t1)K24E、L27H、I28A、S220L、A364P、N369P、S398P；(u1)N143D、A197T；(v1)S220L、A364P、N369P、S398P；(w1)T101N、D399M；(X1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463T；(y1)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(z1)D25K、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(a2)D25K、A364P、N369P、S398P、A456S；(b2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438Y、Y440N；(c2)D25K、A364P、N369P、S398P、G458D；(d2)D25K、A364P、N369P、S398P、S508T；(e2)D25K、A364P、N369P、S398P、T504N；(f2)D25K、A364P、N369P、S398P、S490T；(g2)D25K、A364P、N369P、S398P、S499P；(h2)D25K、A364P、N369P、S398P、N452D；(i2)D25K、A364P、N369P、S398P、N438S；(j2)D25K、A364P、N369P、S398P、T453K；(k2)D25K、A364P、N369P、S398P、S446P；(12)D25K、A364P、N369P、S398P、W468C；(m2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、K153E、K201E；(n2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、E48D、N143Y、S146P、K201E；(o2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N107S、S172T、W175R；(p2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、Q105L、N119D；(q2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463T；(r2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(s2)D25K、L27C、S220L、A364P、N369P、S398P、P463L、Y465N、W468C；(t2)D25K、L27C、K153E、K201E、S220L、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；(u2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、P463T；(v2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、N438Y、N464D、P476L；和(w2)D25K、L27C、G203I、Q221M、A364P、N369P、S398P、S398P、P463L、Y465N、W468C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性；(vii)所述变异多肽是与如SEQ ID NO：7中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，其中所述变异多肽具有针对SEQ ID NO：7的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，并且所述组合选自由以下组成的群组：(a1)D51I、L59C、A173R、A396P、N401P、S430P；(b1)D51I、L59C、I60A、S177N、G235I、S252L、A396P、N401P、S430P；(c1)D51I、L59H、Q253M；(d1)D57K、A396P、N401P、S430P；(e1)D57K、A396P、N401P、S430P；(f1)D57K、G235I、A396P、N401P、S430P；(g1)D57K、I60A、S252L、Q253M、A396P、N401P；(h1)D57K、L59C、G235I、A396P、N401P、S430P；(i1)D57K、L59C、G235I、A396P、N401P、S430P；(j1)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P；(k1)D57K、L59C、I60A、A173R、A396P、N401P、S430P；(11)D57K、L59C、I60A、A173R、A396P、N401P、S430P；(m1)D57K、L59C、S177N、S252L、A396P、N401P、S430P；(n1)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P；(o1)
D57P、L59H、I60A、Q253M；(p1)G235I、A396P、N401P、S430P；(q1)K56E、D57K、L59C、A396P、N369P；(r1)K56E、D57K、L59C、I60A、A173R、A396P、N401P、S430P；(s1)K56E、D57P、L59H、A173R、G235I、S252L、S430P；(t)K56E、L59H、I60A、S252L、A396P、N401P、S430P；(u1)N175D、A229T；(v1)S252L、A396P、N401P、S430P；(w1)T133N、D431M；(x1)D57K、A396P、N401P、S430P、P495T；(y1)D57K、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(z1)D57K、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；(a2)D57K、A396P、N401P、S430P、A488S；(b2)D57K、A396P、N401P、S430P、N470Y、Y472N；(c2)D57K、A396P、N401P、S430P、G490D；(d2)D57K、A396P、N401P、S430P、S540T；(e2)D57K、A396P、N401P、S430P、T540N；(f2)D57K、A396P、N401P、S430P、S522T；(g2)D57K、A396P、N401P、S430P、S531P；(h2)D57K、A396P、N401P、S430P、N484D；(i2)D57K、A396P、N401P、S430P、N470S；(j2)D57K、A396P、N401P、S430P、T485K；(k2)D57K、A396P、N401P、S430P、S478P；(12)D57K、A396P、N401P、S430P、W500C；(m2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、K185E、K233E；(n2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、E48D、N175Y、S178P、K233E；(o2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、N139S、S204T、W207R；(p2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、Q137L、N151D；(q2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、P495T；(r2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(s2)D57K、L59C、S252L、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；(t2)D57K、L59C、K185E、K233E、S252L、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(u2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、P495T；(v2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、N470Y、N496D、P508L；(w2)D57K、L59C、G235I、Q253M、A396P、N401P、S430P、P495L、Y497N、W500C；其中所述变异多肽具有β-淀粉酶活性。
7.一种具有β-淀粉酶活性的变异多肽，其中所述变异多肽是与如SEQ ID NO：2中所阐述的氨基酸序列至少80％一致、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列，并且所述变异多肽在与SEQ ID NO：2的β-淀粉酶相比时酶活性、热稳定性、pH稳定性或其任何组合有所增加。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽，其中所述变异多肽是全长氨基酸序列的片段，并且所述片段具有β-淀粉酶活性。
9.一种变异多肽，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的至少一种变异多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有β-淀粉酶活性。
10.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽和第二酶。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述第二酶选自由以下组成的群组：第二β-淀粉酶、脂肪酶、α-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。
13.一种制造变异多肽的方法，其包含：提供编码根据权利要求1至7中任一项所述的多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化到表达宿主中，培育所述表达宿主以产生所述变异多肽，并且纯化所述变异多肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述模板核酸是如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列的变异核苷酸，其中所述变异核苷酸是与如SEQ ID NO：1中所阐述的核酸序列至少80％一致的核酸序列，其中所述变异核苷酸编码具有β-淀粉酶活性的多肽。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述表达宿主选自由以下组成的群组：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细菌表达系统选自大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述酵母表达系统选自念珠菌(Candida)、毕赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述真菌表达系统选自青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、镰刀霉(Fusarium)、毁丝霉(Myceliopthora)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、嗜热真菌(Thermomyces)和木霉(Trichoderma)。
19.一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽中的一种添加到所述面团中，并且将其烘焙。
20.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于处理淀粉。
21.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于清洁或洗涤织物、硬表面或餐盘。
22.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于制备乙醇。
23.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于处理油井。
24.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于处理纸浆或纸。
25.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于饲喂动物。
26.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的变异多肽的方法，其用于制备糖浆。
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