BRPI0810481B1 - Asparaginases, sequência de ácido nucléico, constructo de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para a produção de uma asparaginase e composição - Google Patents

Asparaginases, sequência de ácido nucléico, constructo de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para a produção de uma asparaginase e composição Download PDF

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Abstract

NOVAS ASPARAGINASES E USOS DESTAS A presente invenção relaciona-se a uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5. Além disso, a invenção relaciona-se a polipeptídeos de asparaginase recém identificados de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 e a variantes desses e a sequências de polinucleotídeos que codificam tais novas variantes de asparaginase. Além disso, a invenção relaciona-se ao uso dessas novas variantes de asparaginase em processos industriais.

Description

Campo da invenção
A invenção relaciona-se às variantes do polipeptídeo de asparaginase recém identificadas e às sequências de polinucleotídeos que compreendem genes que codificam essas novas asparaginases. A invenção apresenta a sequência de aminoácidos da proteína funcional de comprimento total e equivalentes funcionais do gene ou da sequência de aminoácidos. A invenção também está relacionada aos métodos de utilização dessas proteínas variantes em processos industriais. Também estão incluídas na invenção células transformadas com um polinucleotídeo de acordo com a invenção adequado para a produção dessas proteínas e células, em que uma proteína de acordo com a invenção é modificada geneticamente para aumentar ou reduzir sua atividade e/ou seu nível de expressão. A invenção também está relacionada aos métodos de utilização destas proteínas em processos industriais.
Fundamentos da invenção
Recentemente, foi publicada a ocorrência de acrilamida em inúmeros produtos alimentícios aquecidos (Tareke e cols. Chem. Res. Toxicol. 13, 517-522 (2000)). Uma vez que a acrilamida é considerada como provavelmente carcinogênica para animais e humanos, esse achado causou preocupações em todo o mundo. Pesquisas adicionais revelaram que quantidades consideráveis de acrilamida são detectáveis em vários alimentos comuns preparados assados, fritos e cozidos, e foi demonstrado que a ocorrência de acrilamida nos alimentos era o resultado do processo de aquecimento.
Uma via para a formação de acrilamida a partir de aminoácidos e açúcares redutores como um resultado da reação de Maillard foi proposta por Mottram e cols. Nature 419: 448 (2002). De acordo com essa hipótese, a acrilamida pode ser formada durante a reação de Maillard. Durante o processo de assar e tostar, a reação de Maillard é responsável principalmente pela cor, aroma e sabor. Uma reação associada à de Maillard é a degradação de Strecker de aminoácidos, e uma via para acrilamida foi proposta. A formação de acrilamida tornou-se detectável quando a temperatura excedeu 120°C, e a mais alta taxa de formação foi observada por volta de 170°C. Quando asparagina e glicose estavam presentes, os mais altos níveis de acrilamida puderam ser observados, enquanto glutamina e ácido aspártico resultaram apenas em quantidades residuais.
O limite oficial de migração na Comunidade Européia para acrilamida que migra em alimentos a partir de plásticos que fazem contato com o alimento é determinado como sendo de 10 ppb (10 microgramas por quilograma). Embora nenhum limite oficial seja já determinado para acrilamida que se forma durante o cozimento, o fato de que muitos produtos excedem esse valor, especialmente cereais, produtos de panificação e produtos com base em batata ou milho, causa preocupação.
Várias matérias-primas derivadas de plantas são conhecidas por conter níveis substanciais de asparagina. Em batatas, a asparagina é o aminoácido livre dominante (940 mg/kg, que corresponde a 40% do conteúdo total de aminoácidos), e na farinha de trigo a asparagina está presente em um nível de cerca de 167 mg/kg, que corresponde a 14% dos aminoácidos livres totais (Belitz e Grosch in Food Chemistry - Springer New York, 1999). O fato de que a acrilamida é formada principalmente de asparagina (combinada com açúcares redutores) pode explicar os altos níveis de acrilamida em produtos de plantas fritos, assados em forno ou torrados. Portanto, no interesse da saúde pública, há uma necessidade urgente por produtos alimentícios que tenham níveis substancialmente menores de acrilamida ou, preferivelmente, sejam desprovidos dela.
Várias soluções para diminuir o teor de acrilamida foram propostas, seja por alteração de variáveis do processamento, por exemplo, temperatura ou duração da etapa de aquecimento, ou por prevenção por meio químico ou enzimático da formação de acrilamida ou por remoção da acrilamida formada.
Em vários pedidos de patente, o uso de asparaginase para diminuir o nível de asparagina e assim a quantidade de acrilamida formada foi revelado. Asparaginases adequadas para esse objetivo foram produzidas a partir de várias fontes fúngicas, como, por exemplo, Aspergillus niger em WO 2004/030468 e Aspergillus oryzae em WO 04/032648.
Embora todas as L-asparaginases catalisem a mesma conversão química, isso não significa que elas sejam adequadas para a mesma aplicação. Várias aplicações apontarão diferentes demandas sobre as condições sob as quais as enzimas devem operar. Os parâmetros físicos e químicos que podem influenciar a taxa de uma conversão enzimática são a temperatura (que tem um efeito positivo sobre as taxas de reação química, mas pode ter um efeito negativo sobre a estabilidade da enzima), o teor de umidade, o pH, a concentração de sal, a integridade estrutural da matriz do alimento, a presença de ativadores ou inibidores da enzima, a concentração do substrato e produtos etc.
Portanto, existe uma necessidade contínua por melhores asparaginases para várias aplicações que tenham melhores propriedades.
Objetivo da invenção
É um objetivo da invenção o fornecimento de novos polipeptídeos de variantes de asparaginase e polinucleotídeos que codificam tais variantes. Um objetivo adicional é o de fornecer cepas recombinantes que produzem tais variantes de asparaginase. Além disso, um método para identificação de variantes é parte da invenção, bem como métodos de confecção e uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a invenção.
Sumário da invenção
A invenção fornece novos variantes de polipeptídeo que possuem atividade de asparaginase. Em particular, a invenção fornece uma asparaginase variante que possui a sequência de aminoácidos apresentada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4, e variantes adicionais desta que possuem pelo menos 85% de identidade para pelo menos um deles. Tipicamente, estas variantes adicionais da invenção serão equivalentes funcionais do polipeptídeo do Id. de Seq. N°: 2 ou do Id. de Seq. N°: 4. O termo “equivalente funcional” é aqui usado para estabelecer que esses polipeptídeos equivalentes funcionais devem ter pelo menos atividade de asparaginase.
A presente invenção também fornece uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH tem pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude. No contexto da presente invenção, a amplitude do perfil de atividade de pH é a amplitude da faixa de pH (calculada em unidades de pH) em que a enzima exibe 50 a 100% de sua atividade máxima. A amplitude do perfil de atividade de pH da enzima pode ser calculada como indicado nos exemplos. A asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5 pode ser isolada de fontes naturais ou pode ser uma enzima asparaginase artificial. Em uma modalidade preferida, a asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH tem pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude, é uma asparaginase de acordo com uma asparaginase variante que possui a sequência de aminoácidos apresentada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4, e variantes adicionais desta que possuem pelo menos 85% de identidade para pelo menos um deles.
Em uma modalidade da invenção, a invenção fornece for um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos como mostrada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4 ou uma variante, por exemplo, um equivalente funcional, de qualquer um deles.
Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um domínio funcional de um polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 ou uma variante, por exemplo, um equivalente funcional, de qualquer um deles.
Além disso, a invenção fornece novos polinucleotídeos que codificam as novas variantes de polipeptídeo de acordo com a invenção.
Além disso, a invenção fornece uma sequência de ácidos nucléicos que codifica a asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH tem pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude.
A invenção também está relacionada a vetores que compreende uma sequência de polinucleotídeos de acordo com a invenção e iniciadores, sondas e fragmentos que podem ser usados para amplificar ou detectar um polinucleotídeo de acordo com a invenção.
Em uma modalidade preferida adicional, é fornecido um vetor é em que uma sequência de polinucleotídeos de acordo com a invenção é ligada funcionalmente a pelo menos uma sequência reguladora adequada à expressão da sequência de aminoácidos codificada em uma célula hospedeira adequada, como um fungo filamentoso, por exemplo, Aspergillus. A invenção também fornece métodos para a preparação de polinucleotídeos e vetores de acordo com a invenção.
A invenção também está relacionada às células hospedeiras produzidas de forma recombinante que contêm polinucleotídeos variantes (heterólogos) de acordo com a invenção.
Em outra modalidade, a invenção fornece células hospedeiras recombinantes em que a expressão de uma asparaginase variante de acordo com a invenção está aumentada significativamente ou em que a atividade da asparaginase produzida está aumentada.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma célula hospedeira produzida de forma recombinante que contém um polinucleotídeo de acordo com a invenção e, consequentemente, em, que a célula é capaz de produção de uma asparaginase variante funcional de acordo com a invenção, preferivelmente uma célula capaz de superexpressar uma asparaginase variante de acordo com a invenção, por exemplo, uma cepa de Aspergillus niger que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção.
Ainda em outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo variante purificado. Os polipeptídeos de acordo com a invenção incluem os polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos de acordo com a invenção. É especialmente preferido um polipeptídeo variante de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 ou uma variante, por exemplo, um equivalente funcional, de qualquer um deles.
Proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo de acordo com a invenção são estão dentro do escopo da invenção.
A invenção também fornece métodos de produção dos polipeptídeos variantes de acordo com a invenção.
A invenção também está relacionada ao uso da asparaginase variante de acordo com a invenção em qualquer processo industrial, como aqui descrito.
Descrição das figuras
FIG. 1. Alinhamento do Id. de Seq. N°: 2 e do Id. de Seq. N°: 4 com a asparaginase do tipo selvagem de A. niger, como revelado no Id. de Seq. N°: 3 de WO 2004/030468.
Descrição detalhada da invenção
Por toda a presente especificação e nas reivindicações em anexo, as palavras “compreende” e “inclui” e variações como “compreendem”, “que compreende”, “incluem” e “que incluem” devem ser interpretadas de modo inclusivo. Ou seja, essas palavras devem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, quando o contexto permitir.
A presente invenção está relacionada a uma sequência de asparaginase variante que tem a sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4 e às variantes adicionais destes.
A seguir, serão apresentadas as especificidades de ambas as sequências de polipeptídeos.
A sequência do Id. de Seq. N°: 2 compreende as seguintes substituições, quando comparada com uma sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468: T25A, E28T, F30Y, A35S, F53L, D63S, S64A, S65D, S66N, S74A, V771, V791, L80Q, 581T, S88E, E106P, 1108V, D111S, 1114L, 5117A, K119T, R122E, E126D, A131S, 1161V, 5168A, E181Q, T189P, 5190A, M197L, A205V, Y208F, V210A, T211S, M224V, Y228N, E231A, M2321, 1233V, T236K, F238Y, F240Y, V250T, A251T, F252V, 1254V, T255R, E259S, F267Y, E270Q, H273Q, N279S, S282D, S283N, Q286K, A293S, G297S, T299S, S301 G, N303S, E304D, E307D, V3091, 1310A, N311 S, R312K, L313H, E314S, V3171, Q319L, M321T, V324G, L330T, Y345F, S351A, S360A, Q361E, N364G, 1365F, T366K, A369R, D370E, L374K, G375V e D377V.
A sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de A. niger, como revelado em WO 2004/030468, é revelada como o Id. de Seq. N°: 3 (sequência de aminoácidos). A asparaginase apresentada no Id. de Seq. N°: 2 do presente pedido é temporariamente chamada ASN001.
Uma variante da sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 2, por exemplo, um equivalente funcional, pode compreender um ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Ou seja, quando uma variante da sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 2 é alinhada com a sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 2, a variante pode compreender um ou mais de:
Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 25 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 28 no Id. de Seq. N°: 2; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 30 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 35 no Id. de Seq. N°: 2; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 53 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 63 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 64 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 65 no Id. de Seq. N°: 2; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 66 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 74 no Id. de Seq. N°: 2; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 77 no Id. de Seq. N°: 2; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 79 no Id. de Seq. N°: 2; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 80 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 81 no Id. de Seq. N°: 2; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 88 no Id. de Seq. N°: 2; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 106 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 108 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 111 no Id. de Seq. N°: 2; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 114 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 117 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 119 no Id. de Seq. N°: 2; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 122 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 126 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 131 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 161 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 168 no Id. de Seq. N°: 2; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 181 no Id. de Seq. N°: 2; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 189 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 190 no Id. de Seq. N°: 2; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 197 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 205 no Id. de Seq. N°: 2; Phe na posição (na variante) que corresponde à posição 208 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 210 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 211 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 224 no Id. de Seq. N°: 2; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 228 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 231 no Id. de Seq. N°: 2; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 232 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 233 no Id. de Seq. N°: 2; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 236 no Id. de Seq. N°: 2; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 238 no Id. de Seq. N°: 2; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 240 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 250 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 251 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 252 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 254 no Id. de Seq. N°: 2; Arg na posição (na variante) que corresponde à posição 255 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 259 no Id. de Seq. N°: 2; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 267 no Id. de Seq. N°: 2; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 270 no Id. de Seq. N°: 2; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 273 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 279 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 282 no Id. de Seq. N°: 2; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 283 no Id. de Seq. N°: 2; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 286 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 293 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 297 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 299 no Id. de Seq. N°: 2; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 301 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 303 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 304 no Id. de Seq. N°: 2; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 307 no Id. de Seq. N°: 2; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 309 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 310 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 311 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 312 no Id. de Seq. N°: 2; His na posição (na variante) que corresponde à posição 313 no Id. de Seq. N°: 2; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 314 no Id. de Seq. N°: 2; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 317 no Id. de Seq. N°: 2; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 319 no Id. de Seq. N°: 2; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 321 no Id. de Seq. N°: 2; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 324 no Id. de Seq. N°: 2; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 330 no Id. de Seq. N°: 2; Phe na posição (na variante) que corresponde à posição 345 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 351 no Id. de Seq. N°: 2; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 360 no Id. de Seq. N°: 2; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 361 no Id. de Seq. N°: 2; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 364 no Id. de Seq. N°: 2; Phe na posição (na variante) que corresponde à posição 365 no Id. de Seq. N°: 2; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 366 no Id. de Seq. N°: 2; Arg na posição (na variante) que corresponde à posição 369 no Id. de Seq. N°: 2; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 370 no Id. de Seq. N°: 2; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 374 no Id. de Seq. N°: 2; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 375 no Id. de Seq. N°: 2; ou Val na posição (na variante) que corresponde à posição 377 no Id. de Seq. N°: 2;
Um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender dois, três, quatro, cinco, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, como pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80 ou todos os seguintes aminoácidos: Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, 232, Val na posição 233, 238, Tyr na posição 240, 251, Val na posição 252, 255, Ser na posição 259, 270, Gln na posição 273, 282, Asn na posição 283, 293, Ser na posição 297, 301, Ser na posição 303, 307, Ile na posição 309, 311, Lys na posição 312, 314, Ile na posição 317, 321, Gly na posição 324, 345, Ala na posição 351, 361, Gly na posição 364, 366, Arg na posição 369, 374, Val na posição 375 posições sendo definida 2.
Consequentemente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender qualquer combinação de dois ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2. Preferivelmente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender todos de Ala na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254, 255, 259, 267, 270, 273, 279, 30 65 66 88 106 35, 53 74, 77, 79 80, 81 63, 64 282, 283, 286, 293, 297, 299, 301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366, 369, 370, 374, 375 e 377 podem ser identificadas por alinhamento da sequência do polipeptídeo de variante com aquela do Id. de Seq. N°: 2 usando, por exemplo, o alinhamento com GAP para a sequência mais homóloga encontrada pelo programa GAP (veja abaixo para detalhes do programa). As posições na variante que correspondem às posições 25, 28, 30, 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 7 7, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254, 255, 259, 267, 270, 273, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366, 369, 370, 374, 375 e 377 no Id. de Seq . N° : 2 podem, assim, ser identificadas, e são denominadas como aquelas posições definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
A sequência do Id. de Seq. N°: 4 compreende as seguintes substituições, quando comparada com uma sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468: A35S, F53L, D63S, S64A, S65D, S66N, S74A, V771, V791, L80Q, S81T, S88E, E106P, 1108V, D111S, 1114L, S117A, K119T, R122E, E126D, 1161V, S168A, E181Q, T189P, 5190A, M197L, A205V, Y208F, T211S, M224V, Y228N, E231A, M2321, 1233V, T236K, F238Y, V250T, A251T, 1254V, T255R, E259S, F267Y, E270Q, N279D, S282D, S283N, Q286K, A293S, G297S, T299S, T300S, 5301 G, N3035, E304D, V3091, N3115, R312T, L313H, E3145, V3171, M321T, V324G, L330P, V333E, H340Q, Y345F, S360A, N364G, T366E, A369R, D370E, L374K, G375V, T376G e D377V.
Além disso, a sequência do Id. de Seq. N°: 4 compreende uma eliminação de quatro aminoácidos em comparação com a sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468, ou seja, o Id. de Seq. N°: 4 aqui revelado não compreende os aminoácidos que correspondem a D336, T337, A338 e T339 na sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468 e aqui denominada Id. de Seq. N°: 3 (sequência de aminoácidos). A asparaginase apresentada no Id. de Seq. N°: 4 do presente pedido é temporariamente chamada ASN002.
Uma variante da sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 4, por exemplo, um equivalente funcional, pode compreender um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição variante da sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 4 é alinhada com a sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 4, a variante pode compreender um ou mais de:
Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 35 no Id. de Seq. N°: 4; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 53 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 63 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 64 no Id. de Seq. N°: 4; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 65 no Id. de Seq. N°: 4; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 66 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 74 no Id. de Seq. N°: 4; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 77 no Id. de Seq. N°: 4; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 79 no Id. de Seq. N°: 4; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 80 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 81 no Id. de Seq. N°: 4; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 88 no Id. de Seq. N°: 4; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 106 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 108 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 111 no Id. de Seq. N°: 4; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 114 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 117 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 119 no Id. de Seq. N°: 4; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 122 no Id. de Seq. N°: 4; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 126 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 161 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 168 no Id. de Seq. N°: 4; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 181 no Id. de Seq. N°: 4; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 189 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 190 no Id. de Seq. N°: 4; Leu na posição (na variante) que corresponde à posição 197 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 205 no Id. de Seq. N°: 4; Phe na posição (na variante) que corresponde à posição 208 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 211 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 224 no Id. de Seq. N°: 4; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 228 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 231 no Id. de Seq. N°: 4; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 232 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 233 no Id. de Seq. N°: 4; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 236 no Id. de Seq. N°: 4; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 238 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 250 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 251 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 254 no Id. de Seq. N°: 4; Arg na posição (na variante) que corresponde à posição 255 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 259 no Id. de Seq. N°: 4; Tyr na posição (na variante) que corresponde à posição 267 no Id. de Seq. N°: 4; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 270 no Id. de Seq. N°: 4; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 279 no Id. de Seq. N°: 4; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 282 no Id. de Seq. N°: 4; Asn na posição (na variante) que corresponde à posição 283 no Id. de Seq. N°: 4; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 286 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 293 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 297 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 299 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 300 no Id. de Seq. N°: 4; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 301 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 303 no Id. de Seq. N°: 4; Asp na posição (na variante) que corresponde à posição 304 no Id. de Seq. N°: 4; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 309 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 311 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 312 no Id. de Seq. N°: 4; His na posição (na variante) que corresponde à posição 313 no Id. de Seq. N°: 4; Ser na posição (na variante) que corresponde à posição 314 no Id. de Seq. N°: 4; Ile na posição (na variante) que corresponde à posição 317 no Id. de Seq. N°: 4; Thr na posição (na variante) que corresponde à posição 321 no Id. de Seq. N°: 4; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 324 no Id. de Seq. N°: 4; Pro na posição (na variante) que corresponde à posição 330 no Id. de Seq. N°: 4; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 333 no Id. de Seq. N°: 4; Gln na posição (na variante) que corresponde à posição 336 no Id. de Seq. N°: 4; Phe na posição (na variante) que corresponde à posição 341 no Id. de Seq. N°: 4; Ala na posição (na variante) que corresponde à posição 356 no Id. de Seq. N°: 4; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 360 no Id. de Seq. N°: 4; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 362 no Id. de Seq. N°: 4; Arg na posição (na variante) que corresponde à posição 365 no Id. de Seq. N°: 4; Glu na posição (na variante) que corresponde à posição 366 no Id. de Seq. N°: 4; Lys na posição (na variante) que corresponde à posição 370 no Id. de Seq. N°: 4; Val na posição (na variante) que corresponde à posição 371 no Id. de Seq. N°: 4; Gly na posição (na variante) que corresponde à posição 372 no Id. de Seq. N°: 4; ou Val na posição (na variante) que corresponde à posição 373 no Id. de Seq. N°: 4.
Um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender duas, três, quatro, cinco, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, como pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70 ou todos os seguintes aminoácidos:
Val na posição 371, Gly na posição 372 ou Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4. Consequentemente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender qualquer combinação de dois ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53,
Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, posição 106, Val na posição 108, posição 114, Ala na posição 117, posição 122, Asp na posição 126, posição 168, Gln na posição 181, posição 190, Leu na posição 197, posição 208, Ser na posição 211, posição 228, Ala na posição 231, posição 233, Lys na posição 236, posição 250, Thr na posição 251, posição 255, Ser na posição 259, posição 270, Asp na posição 279, posição 283, Lys na posição 286, posição 297, Ser na posição 299, posição 301, Ser na posição 303, posição 309, Ser na posição 311, posição 313, Ser na posição 314, posição 321, Gly na posição 324, posição 333, Gln na posição 336, posição 356, Gly na posição 360, posição 365, Glu na posição 366, posição 371, Gly na posição 372 ou Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Preferivelmente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender todos de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Aquelas posições em um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção que correspondem às posições 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356, 360 , 362, 365, 36 6, 370, 371, 372 e 373 podem ser identificadas por alinhamento da sequência do polipeptídeo de variante com aquela do Id. de Seq. N°: 4 usando, por exemplo, o alinhamento com GAP para a sequência mais homóloga encontrada pelo programa GAP (veja abaixo para detalhes do programa). As posições na variante que correspondem às posições 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356, 360, 362, 365, 366, 370, 371, 372 e 373 no Id. de Seq. N°: 4 podem, assim, ser identificadas, e são denominadas como aquelas posições definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Além disso, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção tipicamente não compreenderá um ou mais, por exemplo, dois, três ou todos os aminoácidos que correspondem a Asp 336, Thr 337, Ala 338 e Thr 339 na sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468. Ou seja, quando um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção é alinhado com uma sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468, ele tipicamente não compreenderá um ou mais dos aminoácidos que correspondem àqueles encontrados nas posições 336, 337, 338 e 339 da sequência de A. niger do tipo selvagem.
Em outra modalidade, a invenção também fornece uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH de pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude. Em uma modalidade preferida, a asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH de pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude, é uma asparaginase de acordo com uma asparaginase variante que possui a sequência de aminoácidos apresentada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4, e variantes adicionais desta que possuem pelo menos 85% de identidade para pelo menos um deles.
Polinucleotídeos
Como apresentado acima, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam uma asparaginase variante que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 (temporariamente chamado ASN001) ou com o Id. de Seq. N°: 4 (temporariamente chamado ASN002), e variantes adicionais destes, como equivalentes funcionais. Dessa forma, a invenção fornece um polinucleotídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 1 ou com o Id. de Seq. N°: 3 e polinucleotídeos variantes adicionais.
Para uma melhor compreensão, o Id. de Seq. N°: 1 é a sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2; o Id. de Seq. N°: 3 é a sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 4.
A invenção fornece sequências de polinucleotídeos que compreendem o gene que codifica asparaginases de acordo com a invenção, bem como sua sequência codificadora. Consequentemente, a invenção está relacionada a uma sequência de ácidos nucléicos que compreende: a) uma sequência de DNA que codifica a asparaginase de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4; b) uma sequência de DNA que codifica uma asparaginase que possui pelo menos 85% de identidade com o polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4; c) uma sequência de DNA que possui pelo menos 80% de identidade com uma sequência de DNA de acordo com (a) ou (b); d) uma sequência de DNA que hibridiza com estringência elevada com uma fita complementar de uma sequência de DNA de acordo com (a) ou (b); e) uma subsequência de uma sequência de DNA de acordo com (a), (b), (c) ou (d) que tem pelo menos 100 nucleotídeos; ou f) uma fita complementar de uma sequência de DNA de acordo com (a), (b), (c), (d) ou (e).
A invenção também está relacionada a um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um domínio funcional de um polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4. A seguir isso será descrito com mais detalhe os polipeptídeos de acordo com a invenção. Tipicamente, em relação ao Id. de Seq. N°: 2, um domínio desse tipo compreenderá um aminoácido ou aminoácidos que correspondem a um ou mais de Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Em uma modalidade da invenção, a sequência de ácidos nucléicos de acordo com a invenção codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma sequência de aminoácidos que possui um ou mais truncamentos, e/ou pelo menos uma substituição, eliminação e/ou inserção de um aminoácido, quando comparada com a sequência de aminoácidos 1 a 378 do Id. de Seq. N°: 2. Um polipeptídeo desse tipo tipicamente compreenderá um ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2. Tipicamente, em relação ao Id. de Seq. N°: 4, um domínio desse tipo compreenderá um aminoácido ou aminoácidos que correspondem a um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Em uma modalidade da invenção, a sequência de ácidos nucléicos de acordo com a invenção codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma sequência de aminoácidos que possui um ou mais truncamentos, e/ou pelo menos uma substituição, eliminação e/ou inserção de um aminoácido, quando comparada à sequência de aminoácidos 1 a 374 do Id. de Seq. N°: 4. Um polipeptídeo desse tipo tipicamente compreenderá um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, ao Id. de Seq. N°: 4.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que codifica uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude. Em uma modalidade preferida, a referida molécula de ácido nucléico que codifica uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5 é um ácido nucléico que compreende: a) uma sequência de DNA que codifica a asparaginase de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4; b) uma sequência de DNA que codifica uma asparaginase que possui pelo menos 85% de identidade com o polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4; c) uma sequência de DNA que possui pelo menos 80% de identidade com uma sequência de DNA de acordo com (a) ou (b); d) uma sequência de DNA que hibridiza com estringência elevada com uma fita complementar de uma sequência de DNA de acordo com (a) ou (b); e) uma subsequência de uma sequência de DNA de acordo com (a), (b), (c) ou (d) que tem pelo menos 100 nucleotídeos; ou f) uma fita complementar de uma sequência de DNA de acordo com (a), (b), (c), (d) ou (e).
Como aqui usados, os termos “gene” e “gene recombinante” referem-se às moléculas de ácido nucléico que incluem uma estrutura de leitura aberta que codifica uma asparaginase variante como aqui descrita, por exemplo, uma variante de asparaginase de Aspergillus niger do tipo selvagem. Um gene pode incluir sequências codificadoras, sequências não codificadoras, íntrons e sequências reguladoras. Ou seja, um “gene”, como aqui usado, pode se referir a uma molécula de ácido nucléico isolada, como aqui definida. Consequentemente, o termo “gene”, no contexto do presente pedido, não se refere apenas às sequências de ocorrência natural. Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser gerada com a utilização de técnicas padronizadas de biologia molecular bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, juntamente com as informações de sequências aqui fornecidas.
Por exemplo, com o uso de técnicas sintéticas padronizadas, a molécula de ácido nucléico necessária pode ser sintetizada de novo. Um processo sintético desse tipo tipicamente será um processo automatizado. Essas técnicas são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Alternativamente, uma molécula de ácido nucléico da invenção pode ser gerado por uso de mutagênese sítio- dirigida de uma molécula de ácido nucléico existente, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico do tipo selvagem. A mutagênese sítio-dirigida pode ser realizada usando diversas técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Em um método desse tipo, aqui mencionado simplesmente como forma de exemplo, a PCR é realizado em um modelo de plasmídeo usando “iniciadores” oligonucleotídeos de que contêm a mutação desejada. Como os iniciadores são as extremidades de fitas recém sintetizadas, caso haja uma não combinação durante um primeiro ciclo na ligação da fita de DNA de modelo, após aquela primeira rodada, a fita baseada no iniciador (que contém a mutação) estaria em uma concentração igual ao modelo original. Após ciclos sucessivos, ela cresceria exponencialmente e, após 25, ultrapassaria o número original, fita não mutada na região de 8 milhões: 1, resultando em uma solução quase homogênea de fragmentos mutados amplificados. O DNA de modelo pode então ser eliminado por digestão enzimática, por exemplo, com o uso de uma enzima de restrição que cliva somente DNA metilada, como Dpn1. O modelo, que é derivado de uma preparação alcalina de plasmídeo de lise e, portanto, é metilado, é destruído nessa etapa, mas o plasmídeo mutado é preservado, pois foi gerado in vitro e, consequentemente, não é metilado.
Em um método desse tipo, mais de uma mutação pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucléico em uma única reação de PCR, por exemplo, pela utilização de um ou mais oligonucleotídeos, cada um compreendendo uma ou mais não combinações. Alternativamente, mais de uma mutação pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucléico pela realização de mais de uma reação de PCR, cada reação introduzindo uma ou mais mutações, de forma que os ácidos nucléicos alterados são introduzidos no ácido nucléico de uma forma seqüencial, repetitiva.
Um ácido nucléico da invenção pode ser gerado com o uso de cDNA, mRNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeo não combinados adequados de acordo com a técnica de mutagênese sítio- dirigida descrita acima. Uma molécula de ácido nucléico derivada dessa forma pode ser clonada em um vetor adequado e caracterizada por sequência de análise de DNA.
Uma sequência de ácidos nucléicos da invenção pode compreender uma ou mais eliminações, ou seja, lacunas, em comparação com a sequência do tipo selvagem da sequência de asparaginase do tipo selvagem obtida de Aspergillus niger, como revelado em WO 2004/030468 e/ou com a sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4. Estas eliminações/lacunas também podem ser geradas com o uso de mutagênese sítio-dirigida utilizando-se oligonucleotídeos apropriados. As técnicas para a geração destas eliminações são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Além disso, oligonucleotídeos que correspondem ou que podem hibridizar para sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padronizadas, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.
Além disso, moléculas de ácido nucléico complementares são incluídas na presente invenção. Uma molécula de ácido nucléico que é complementar a outras sequências de nucleotídeos é aquela que é suficientemente complementar à outra sequência de nucleotídeos, de tal forma que possa hibridizar para a outra sequência de nucleotídeos formando, dessa forma, um dúplex estável.
Um aspecto da invenção pertence às moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo da invenção ou um equivalente funcional deste, como um fragmento ou domínio biologicamente ativo, bem como moléculas de ácido nucléico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo da invenção e fragmentos dessas moléculas de ácido nucléico adequadas para uso como iniciadores de PCR para a amplificação ou mutação de moléculas de ácido nucléico como, por exemplo, para a preparação de moléculas de ácido nucléico da invenção.
Um “polinucleotídeo isolado” ou um “ácido nucléico isolado” é um DNA ou RNA que não é imediatamente contiguo a ambas as sequências codificadoras com as quais ele é imediatamente contiguo (uma na extremidade 5’ e uma na extremidade 3’) no genoma de ocorrência natural do organismo do qual é derivado. Dessa forma, em uma modalidade, um ácido nucléico isolado inclui algumas ou todas as sequências não codificadoras 5' (por exemplo, promotoras) que são imediatamente contiguas com a sequência codificadora. Portanto, o termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus que se replica autonomamente, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição), independente de outras sequências. Ele também inclui um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica um polipeptídeo adicional que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursores químicos ou outras substâncias químicas (quando sintetizados quimicamente). Além disso, um “fragmento de ácido nucléico isolado” é um fragmento de ácido nucléico que não é de ocorrência natural como um fragmento e não seria encontrado no estado natural.
Como aqui usados, os termos “polinucleotídeo” ou “molécula de ácido nucléico” visam incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucléico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferivelmente é DNA de fita dupla. O ácido nucléico pode ser sintetizado com o uso de análogos ou derivados de oligonucleotídeos (por exemplo, nucleotídeos inosina ou fosforotioato). Esses oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para a preparação de ácidos nucléicos que possuem capacidades de pareamento de bases alteradas ou resistência aumentada às nucleases.
Outra modalidade da invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolado que é anti-senso a uma molécula de ácido nucléico da invenção, por exemplo, a fita codificadora de uma molécula de ácido nucléico que tem a sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 1 ou no Id. de Seq. N°: 3. Também estão incluídos dentro do escopo da invenção são as fitas complementares das moléculas de ácido nucléico aqui descritas.
Identidade e homologia
Os termos “homologia” ou “percentual de identidade” são aqui usados de forma intercambiável. Para os objetivos dessa invenção, é aqui definido que, para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucléicos, as sequências são alinhadas objetivando uma comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas na sequência de um primeiro aminoácido ou ácido nucléico para um alinhamento ótimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos). Os resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeo na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, (% de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (ou seja, posições superpostas) x 100). Preferivelmente, as duas sequências têm o mesmo comprimento.
Uma comparação de sequências pode ser realizada ao longo de todos os comprimentos das duas sequências que estão sendo comparadas ou ao longo de um fragmento das duas sequências. Tipicamente, a comparação será realizada ao longo do comprimento total das duas sequências que estão sendo comparadas. No entanto, a identidade de sequência pode ser realizada ao longo de uma região de, por exemplo, vinte, cinqüenta, cem ou mais resíduos de aminoácido contíguos.
Aqueles habilitados na técnica saberão que estão disponíveis diversos programas de computador para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e determinação do percentual de identidade entre duas sequências podem ser obtidas com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou de ácidos nucléicos é determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP na suíte de programas GCG da Accelrys (disponível em http://www.accelrys.com/produtos/gcg/), com o uso de uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Aqueles habilitados na técnica perceberão que esses diferentes parâmetros produzirão resultados levemente diferentes, mas que a percentagem de identidade geral das duas sequências não é significativamente alterada quando do se usam algoritmos diferentes.
As sequências de proteína ou sequências de ácidos nucléicos da presente invenção também podem ser usadas como uma “sequência pesquisada” para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas BLASTN e BLASTP (versão 2.0) de Altschul, e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de proteína em BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTP, pontuação = 50, wordlength = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para se obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e cols., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3.389-3.402. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTP e BLASTN) podem ser usados. Veja a página inicial do “National Center for Biotechnology Information” em http://www.ncbi.nlm.nih.pov/.
Hibridização
Um polinucleotídeo da invenção e o complemento da sequência apresentada no Id. de Seq. N°: 1 ou no Id. de Seq. N°: 3 podem tipicamente hibridizar em um nível significativamente acima do nível de fundo. A hibridização de fundo pode ocorrer, por exemplo, por causa de outros cDNAs presentes em uma biblioteca de cDNA. O nível de sinal gerado pela interação entre um polinucleotídeo da invenção e o complemento da sequência codificadora do Id. de Seq. N°: 1 ou do Id. de Seq. N°: 3 é tipicamente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 100 vezes tão intenso quanto as interações entre outros polinucleotídeos e a sequência do Id. de Seq. N°: 1 ou do Id. de Seq. N°: 3. A intensidade da interação pode ser medida, por exemplo, por marcação radioativa.
Como aqui usados, os termos “hibridizar” e “que hibridiza” visam descrever as condições para hibridização e lavagem sob as quais as sequências de nucleotídeos pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, por exemplo, pelo menos cerca de 95% homólogos entre eles, por exemplo, pelo menos cerca de 98% homólogos entre eles, como pelo menos cerca de 99% homólogos entre eles, como determinado ao longo de uma região de pelo menos cerca de 20, por exemplo, pelo menos cerca de 50, como pelo menos cerca de 100, por exemplo, pelo menos cerca de 200, mais preferivelmente pelo menos cerca de 300 nucleotídeos contíguos ou mais, preferivelmente sobre o comprimento total das sequências a serem comparadas, tipicamente permanecem hibridizados entre eles.
Um exemplo não limitante preferido destas condições de hibridização são hibridização em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por um ou mais lavagens em 1 X SSC, SDS 0,1% a 50°C, preferivelmente a 55°C, preferivelmente a 60°C e, ainda mais preferivelmente, a 65°C.
Condições altamente estringentes incluem, por exemplo, hibridização a 68°C em 5x SSC/5x solução de Denhardt / SDS 1,0%, e lavagem a 0,2x SSC/SDS 0,1% em temperatura ambiente. Alternativamente, a lavagem pode ser realizada a 42°C.
Aqueles habilitados na técnica saberão quais as condições que devem ser aplicadas para condições de hibridização estringentes e altamente estringentes. Diretrizes adicionais em relação a estas condições são facilmente disponíveis na técnica, por exemplo, em Sambrook e cols., 1989, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel e cols. (eds.), 1995, “Current Protocols in Molecular Biology”, (John Wiley & Sons, N.Y.).
Evidentemente, um polinucleotídeo que hibridiza somente para uma sequência poli A (como o trato poli (A) do terminal 3' de mRNAs), ou para um trecho complementar de resíduos T (ou U), seria incluído em um polinucleotídeo da invenção usado para hibridizar especificamente para uma porção de um ácido nucléico da invenção, já que um polinucleotídeo desse tipo hibridizaria para qualquer molécula de ácido nucléico que contenha um trecho de poli (A) ou o complemento deste (por exemplo, praticamente qualquer clone de cDNA de fita dupla).
Qualquer combinação dos graus de identidade de sequência e tamanhos mínimos mencionados acima pode ser usada para definir polinucleotídeos da invenção, com combinações mais estringentes (ou seja, identidade de sequência maior ao longo de comprimentos mais longos) sendo preferidas.
Vetores
Outro aspecto da invenção pertence aos vetores, preferivelmente vetores de expressão, que contêm um ácido nucléico que codifica uma asparaginase variante da invenção, por exemplo, a proteína de asparaginase do Id. de Seq. N°: 2 ou do Id. de Seq. N°: 4 ou um equivalente funcional de qualquer um deles.
Como aqui usado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissômicos) são integrados no genoma da célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e assim são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui referidos como “vetores de expressão”. Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável nesta especificação uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção visa incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem a funções equivalentes.
Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma adequada à expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que é ligada operacionalmente à sequência de ácidos nucléicos a ser expressa. Em um vetor de expressão recombinante, “ligado operacionalmente” deve significar que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) de uma forma que permita a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo “sequências reguladoras” visa incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinal de poliadenilação). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva ou indutível de uma sequência de nucleotídeos em vários tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em certa célula hospedeira (por exemplo, sequências reguladoras tecido-específicas). Será observado por aqueles habilitados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão desejado da proteína etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, codificados por ácido nucléicos como aqui descritos (por exemplo, a asparaginase variante de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 ou uma variante de qualquer um deles, por exemplo, um equivalente funcional ou fragmento, ou uma proteína de fusão que compreende um ou mais destas variantes).
Os vetores de expressão recombinante da invenção podem ser desenhados para expressão de proteínas variantes da invenção em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, uma proteína da variante da invenção pode ser expressa em células de bactéria como E. coli, células de inseto (com o uso de vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamíferos. Células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, com o uso das sequências reguladoras de promotor T7 e polimerase T7.
Vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossômicos, epissômicos e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, epissoma de levedura, elementos cromossômicos de levedura, vírus como baculovírus, papova vírus, vaccínia vírus, adenovírus, poxvírus falsos, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações destes, como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, como cosmídeo e fagomídeos.
O inserto de DNA pode ser operacionalmente ligado a um promotor adequado, como o promotor PL de fago lambda, os promotores lac, trp, tac de E. coli, , os promotores de SV40 precoces e tardios, e promotores de LTRs retrovirais, entre outros. Outros promotores adequados serão conhecidos por aqueles habilitados. Em uma modalidade específica, são preferidos promotores que sejam capazes de direcionar um alto nível de expressão de asparaginase em fungos filamentosos. Tais promotores são conhecidos na técnica. As construções de expressão podem conter sítios para iniciação e terminação da transcrição e, na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução. A porção codificadora dos transcritos maduros expressos pelas construções incluirá um AUG de iniciação de tradução no início e um códon de terminação adequadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.
O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas e eucarióticas adequadas por meio de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Como aqui usados, os termos “transformação” e “transfecção” devem se referir a diversas técnicas reconhecidas para introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, transdução, infecção, lipofecção, transfecção catiônica mediada por lipídeo ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, e cols. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis e cols., “Basic Methods in Molecular Biology” (1986) e em outros manuais de laboratório.
Para transfecção estável de células de mamífero, sabe- se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência farmacológica, como G418, higromicina e metotrexato. O ácido nucléico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido na célula hospedeira no mesmo vetor que aquele que codifica uma proteína da variante da invenção, ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármaco (por exemplo, células que incorporam o gene de marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrem).
A expressão de proteínas em procariotas é freqüentemente realizada em E. coli com vetores que contêm promotores constitutivos ou indutíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Vetores de fusão adicionam inúmeros aminoácidos a uma proteína por eles codificada, por exemplo, ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente a três objetivos: 1) aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) ajudar na purificação da proteína recombinante por ação como um ligante em purificação por afinidade. Freqüentemente, em vetores de expressão de fusão, é introduzido um sítio de clivagem proteolítica na junção da porção de fusão e a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subseqüente à purificação da proteína de fusão.
Como indicado, os vetores de expressão preferivelmente contêm marcadores selecionáveis. Tais marcadores selecionáveis incluem resistência à diidrofolato redutase ou neomicina para cultura de células eucarióticas e resistência à tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiro adequados incluem células de bactéria, como E. coli, Streptomyces Salmonella typhimurium e certas espécies de Bacillus; células fúngicas como espécies de Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. oryzae e A. nidulans, leveduras como Kluyveromyces, por exemplo, K. lactis e/ou Pichia, por exemplo, P. pastoris; células de inseto como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animal como CHO, COS e de melanoma de Bowes; e de células de plantas. Meios de cultura e condições adequados para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica.
Vetores preferidos para uso em bactérias são, por exemplo, revelados em WO-A1-2004/074468, que são aqui englobados por referência. Outros vetores adequados serão facilmente aparentes para o profissional habilitado.
Promotores bacterianos conhecidos adequado para uso na presente invenção incluem os promotores revelados em WO-A1- 2004/074468, que são aqui incorporados por referência.
A transcrição do DNA que codifica uma variante da presente invenção por eucariotas superiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Intensificadores são elementos de ação cis de DNA, comumente de cerca de 10 a 300 bp que agem para aumentar a atividade transcricional de um promotor em um dado tipo de célula hospedeira. Exemplos de intensificadores incluem o intensificador SV40, que está localizado no lado remoto da origem de replicação em bp 100 a 270, o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado remoto da origem de replicação e intensificadores de adenovírus.
Para a secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplasmático, no espaço periplasmático ou no ambiente extracelular, um sinal de secreção adequado pode ser incorporado no polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser endógenos ao polipeptídeo ou eles podem ser sinais heterólogos.
Uma variante da invenção pode ser expressa de tal forma que ela possa incluir regiões funcionais heterólogas adicionais, por exemplo, sinais de secreção. Uma variante da invenção também pode compreender, por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, adicionados ao N-terminal do polipeptídeo, por exemplo, para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante subseqüente manuseio e estocagem. Além disso, as porções do peptídeo podem ser adicionadas a uma variante da invenção para facilitar a purificação, por exemplo, pela adição de resíduo de histidina ou um tag T7.
Polipeptídeos de acordo com a invenção A invenção fornece uma asparaginase que é: a) um polipeptídeo que possui uma sequência amino, como mostrada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4; b) um polipeptídeo que possui pelo menos 85% de identidade com um polipeptídeo de acordo com (a); c) um polipeptídeo que pode ser obtido a partir de um polipeptídeo definido em (a) ou (b) por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; d) um polipeptídeo que é codificado por uma sequência de ácidos nucléicos do Id. de Seq. N°: 1 ou Id. de Seq. N°: 3 que codifica o polipeptídeo maduro ou uma subsequência deste que tem pelo menos 100 nucleotídeos.
Tipicamente, em relação ao Id. de Seq. N°: 2, um polipeptídeo de acordo com (b), (c) ou (d) compreende um ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Um polipeptídeo da invenção pode compreender dois ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N° : 2. Mais preferivelmente, um polipeptídeo da invenção pode compreender todos aqueles aminoácidos nas posições determinadas, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Em relação ao Id. de Seq. N°: 4, um polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 ou Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Um polipeptídeo da invenção pode compreender dois ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 ou Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Mais preferivelmente, um polipeptídeo da invenção pode compreender todos aqueles aminoácidos nas posições determinadas, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Em outra modalidade, a invenção também fornece uma asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude. Em uma modalidade preferida a asparaginase que possui a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5 é uma asparaginase que é: a) um polipeptídeo que possui uma sequência amino, com mostrado em qualquer um do Id. de Seq. N°:2 ou Id. de Seq. N°:4; b) um polipeptídeo que possui pelo menos 85% de identidade com um polipeptídeo de acordo com (a); c) um polipeptídeo que pode ser obtido a partir de um polipeptídeo definido em (a) ou (b) por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; d) um polipeptídeo que é codificado por uma sequência de ácidos nucléicos do Id. de Seq. N°: 1 ou Id. de Seq. N°: 3 que codifica o polipeptídeo maduro ou uma subsequência deste que tem pelo menos 100 nucleotídeos.
Além disso, um peptídeo ou polipeptídeo que compreende um equivalente funcional dos polipeptídeos acima é compreendido pela presente invenção. Os polipeptídeos acima são coletivamente abrangidos pelos termos “um polipeptídeo de acordo com a invenção” ou “uma variante de acordo com a invenção”.
Os termos “peptídeo” e “oligopeptídeo” são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido), e cada termo pode ser usado de modo intercambiável como o contexto necessitar para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos ligados por ligações de peptidil. A palavra “polipeptídeo” é aqui usada para cadeias que contêm mais de sete resíduos de aminoácido. Todas as fórmulas de oligopeptídeo e polipeptídeo ou sequências nesta especificação são escritas da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para o terminal carboxi. O código de aminoácidos de uma letra aqui usado é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Por polipeptídeo “isolado” ou proteína “isolada”, entende-se um polipeptídeo ou proteína removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas recombinantemente produzidos expressos em células hospedeiras são considerados isolados para os objetivos da invenção, assim como polipeptídeos recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada como, por exemplo, o método de purificação de etapa única revelado em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Uma variante de polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser recuperada e purificada a partir de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos na técnica. Mais preferivelmente, cromatografia de troca iônica ou cromatografia líquida de alta performance (“HPLC”) é empregada para purificação.
Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células de bactéria, levedura, planta superior, inseto e mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou não glicosilados. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns casos como resultado de processos mediados por hospedeiro.
Proteína fragmentos
A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeo de acordo com a invenção. Tais fragmentos são considerados como englobados no termo “uma variante da invenção”.
Fragmentos biologicamente ativos de uma polipeptídeo da invenção incluem polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas da sequência de aminoácidos de uma proteína da variante da invenção (por exemplo, a sequência de aminoácidos do Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 4), que incluem menos aminoácidos que a proteína de comprimento total, mas que exibem pelo menos uma atividade biológica da proteína de comprimento total correspondente. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína da variante da invenção. Preferivelmente, fragmentos biologicamente ativos terão pelo menos atividade de asparaginase. Um fragmento biologicamente ativo de uma proteína da invenção pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões da proteína são eliminadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto a uma ou mais das atividades biológicas da forma nativa de um polipeptídeo da invenção. Tipicamente, em relação ao Id. de Seq. N°: 2, um fragmento de proteína da invenção compreenderá um ou mais e Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Um fragmento de proteína da invenção pode compreender dois ou mais de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 e Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N° : 2. Mais preferivelmente, um fragmento de proteína da invenção pode compreender todos aqueles aminoácidos nas posições determinadas, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Tipicamente, em relação ao Id. de Seq. N°: 4, um fragmento de proteína da invenção compreenderá um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Um fragmento de proteína da invenção pode compreender dois ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4. Mais preferivelmente, um fragmento de proteína da invenção pode compreender todos aqueles aminoácidos nas posições determinadas, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
A invenção também apresenta fragmentos de ácido nucléico que codificam os fragmentos biologicamente ativos acima (cujos fragmentos biologicamente ativos são, eles mesmos, variantes da invenção).
Proteínas de fusão
As variantes da invenção, como proteínas da presente invenção ou equivalentes funcionais destas, por exemplo, porções e fragmentos biologicamente ativos destas, podem ser ligadas operacionalmente a um polipeptídeo que não está de acordo com a invenção (por exemplo, sequências de aminoácidos heterólogas) para formar proteínas de fusão. Um polipeptídeo não de acordo com a invenção neste contexto refere-se a um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que correspondem a uma proteína que não é substancialmente homóloga a uma asparaginase variante da invenção.
Em uma proteína de fusão, a variante da invenção pode corresponder a uma sequência de comprimento total ou a um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade preferida, uma proteína de fusão da invenção compreende pelo menos duas porções biologicamente ativas. Na proteína de fusão, o termo “ligado operacionalmente” visa indicar que o polipeptídeo variante e o polipeptídeo não de acordo com a invenção estão fundidos in-frame entre eles. O polipeptídeo não de acordo com a invenção pode ser fundido ao terminal N ou ao terminal C do polipeptídeo variante.
Por exemplo, em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão em que a sequência/s variante/a é/são fundida/s ao C-terminal das sequências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de uma variante recombinante de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a proteína de fusão é uma variante da invenção que contém uma sequência de sinal heteróloga em seu N-terminal. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero e levedura), a expressão e/ou secreção de uma variante da invenção pode ser aumentada através do uso de uma sequência de sinal heteróloga.
Em outro exemplo, a sequência secretora gp67 da proteína de envelope de baculovírus pode ser usada como uma sequência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e cols., eds., John Wiley & Sons, 1992). Outros exemplos de sequências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as sequências secretoras de melitina e fosfatase alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California). Ainda em outro exemplo, sequências de sinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinal secretor phoA (Sambrook e cols., supra) e o sinal secretor A de proteína (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).
Uma sequência d sinal pode ser usada para facilitar a secreção e isolação de uma variante da invenção. Sequências de sinal são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, que são geralmente clivados a partir da proteína madura durante a secreção em um ou mais eventos de clivagem. Tais peptídeos se sinal contêm sítios de processamento que permitem a clivagem da sequência de sinal a partir das proteínas maduras uma vez que elas passam através da via secretora. A sequência de sinal pode direcionar a secreção da variante, como de um hospedeiro eucariótico em que o vetor de expressão é transformado, e a sequência de sinal pode ser então subseqüentemente ou concomitantemente clivada. A variante da invenção pode ser então facilmente purificada a partir de meio extracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, a sequência de sinal pode ser ligada à variante de interesse com o uso da sequência, o que facilita a purificação, como com um domínio de GST. Portanto, por exemplo, a sequência que codifica a variante da invenção pode ser fundida a uma sequência de marcador, como a sequência que codifica um peptídeo, que facilita a purificação da variante fundida da invenção. Em certas modalidades preferidas desse aspecto da invenção, a sequência de marcador é um peptídeo de hexa- histidina, como o tag fornecido em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, vários dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa- histidina fornece purificação conveniente da proteína de fusão. O tag de HA é outro peptídeo útil para a purificação que corresponde a um epitopo derivado de proteína de hemaglutinina de influenza, que foi descrito por Wilson e cols., Cell 37:767 (1984), por exemplo.
Uma proteína de fusão da invenção pode ser produzida por técnicas padrão de DNA recombinante. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificam para as diferentes sequências de polipeptídeos são ligados juntos em estrutura de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, pelo emprego de terminal blunt-ended ou stagger-ended para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais adequados, preenchimento de extremidades coesivas como adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejadas, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais que incluem sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser realizada com o uso de iniciadores âncora, que produzem protuberâncias complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subseqüentemente anelados e reamplificados para gerar uma sequência de genes quimérica (veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel e cols. John Wiley & Sons: 1992). Além disso, são comercialmente disponíveis vários vetores de expressão que já codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucléico que codifica variante pode ser clonado em tal vetor de expressão de modo que a porção de fusão é ligada em estrutura à referida variante.
Equivalentes funcionais
Os termos “equivalentes funcionais” e “variantes funcionais” são usados de modo intercambiável nessa. Equivalentes funcionais de acordo com a invenção são fragmentos de DNA isolados que codificam um polipeptídeo que exibe uma função particular das variantes de asparaginase de Aspergillus niger como aqui definido. Um equivalente funcional de um polipeptídeo de acordo com a invenção é um polipeptídeo que exibe pelo menos uma função de uma variante asparaginase de Aspergillus niger como aqui definido. Equivalentes funcionais, portanto, também englobam fragmentos biologicamente ativos e são englobados no termo “a variante” da invenção.
Preferivelmente, um polipeptídeo equivalente funcional em relação ao Id. de Seq. N°: 2 da invenção compreende um posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Consequentemente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender duas, três, quatro, cinco, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, como pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80 ou todos de Ala na posição 25, Thr na posição 28, Tyr na posição 30, Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Ser na posição 131, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ala na posição 210, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Tyr na posição 240, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 252, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Gln na posição 273, Ser na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Asp na posição 307, Ile na posição 309, Ala na posição 310, Ser na posição 311, Lys na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Leu na posição 319, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Thr na posição 330, Phe na posição 345, Ala na posição 351, Ala na posição 360, Glu na posição 361, Gly na posição 364, Phe na posição 365, Lys na posição 366, Arg na posição 369, Glu na posição 370, Lys na posição 374, Val na posição 375 ou Val na posição 377, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 2.
Preferivelmente, um polipeptídeo equivalente funcional em relação ao Id. de Seq. N°: 4 da invenção compreende um ou mais de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Consequentemente, um polipeptídeo de asparaginase variante da invenção pode compreender duas, três, quatro, cinco, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, como pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70 ou todos de Ser na posição 35, Leu na posição 53, Ser na posição 63, Ala na posição 64, Asp na posição 65, Asn na posição 66, Ala na posição 74, Ile na posição 77, Ile na posição 79, Gln na posição 80, Thr na posição 81, Glu na posição 88, Pro na posição 106, Val na posição 108, Ser na posição 111, Leu na posição 114, Ala na posição 117, Thr na posição 119, Glu na posição 122, Asp na posição 126, Val na posição 161, Ala na posição 168, Gln na posição 181, Pro na posição 189, Ala na posição 190, Leu na posição 197, Val na posição 205, Phe na posição 208, Ser na posição 211, Val na posição 224, Asn na posição 228, Ala na posição 231, Ile na posição 232, Val na posição 233, Lys na posição 236, Tyr na posição 238, Thr na posição 250, Thr na posição 251, Val na posição 254, Arg na posição 255, Ser na posição 259, Tyr na posição 267, Gln na posição 270, Asp na posição 279, Asp na posição 282, Asn na posição 283, Lys na posição 286, Ser na posição 293, Ser na posição 297, Ser na posição 299, Ser na posição 300, Gly na posição 301, Ser na posição 303, Asp na posição 304, Ile na posição 309, Ser na posição 311, Thr na posição 312, His na posição 313, Ser na posição 314, Ile na posição 317, Thr na posição 321, Gly na posição 324, Pro na posição 330, Glu na posição 333, Gln na posição 336, Phe na posição 341, Ala na posição 356, Gly na posição 360, Glu na posição 362, Arg na posição 365, Glu na posição 366, Lys na posição 370, Val na posição 371, Gly na posição 372 e Val na posição 373, as referidas posições sendo definidas com referência ao Id. de Seq. N°: 4.
Proteína funcional ou equivalentes de polipeptídeo podem conter substituições de um ou mais aminoácidos de qualquer um do Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 4 ou substituições, inserções ou eliminações de aminoácidos não essenciais. Consequentemente, um aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4 sem alterar substancialmente a função biológica. Além disso, aminoácidos conservado entre as proteínas de acordo com a presente invenção e outras asparaginases não são provavelmente passiveis de alteração.
As substituições de aminoácidos podem ser feitas a qualquer um do Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 4, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30 ou mais substituições, para fornecer uma variante funcional da invenção.
Equivalentes funcionais de ácido nucléico podem conter tipicamente mutações silenciosas ou mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. Portanto, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína de asparaginase variante que contém mudanças nos resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica particular. Tais proteínas variantes diferem na sequência de aminoácidos de qualquer um do Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 4, ainda retendo pelo menos uma atividade biológica dessa. Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico isolada compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína, em que a proteína compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente homóloga de pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogos à sequência de aminoácidos em Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4.
Uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica uma variante da invenção que é homóloga, tipicamente substancialmente homóloga, à proteína de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 pode ser criada por introdução de uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos nas sequências codificadoras de nucleotídeos de acordo com a invenção de modo que uma ou mais aminoácido substituições, eliminações ou inserções são introduzidas na proteína codificada. Tais mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese PCR-mediada.
Como aqui definido, o termo “substancialmente homólogo” refere-se a um primeiro aminoácido ou sequência de nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral similar) a um segundo aminoácido ou sequência de nucleotídeos de modo que o primeiro e o segundo aminoácido ou sequências de nucleotídeos tenham um domínio comum. Por exemplo, aminoácido ou sequências de nucleotídeos que contêm um domínio comum que tem cerca de 60%, preferivelmente 65%, mais preferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou mais são aqui definidos como suficientemente idênticos.
As moléculas de ácido nucléico que correspondem a, ou seja, que codificam, variantes de asparaginase da invenção podem ser isoladas com base em sua homologia aos ácidos nucléicos da invenção aqui revelados com o uso dos cDNAs aqui revelados.
Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que podem ser introduzidas mudanças por mutação nas sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção assim levando a mudanças na sequência de aminoácidos da proteína resultante sem alterar substancialmente a função de tal proteína.
Em outro aspecto da invenção, são fornecidas melhores proteínas variantes de asparaginase. Melhores proteínas variantes de asparaginase são proteínas em que pelo menos uma atividade biológica é melhorada, por exemplo, em comparação à asparaginase do tipo selvagem, como aquela de A. niger.
Em particular, proteínas variantes da invenção podem ter melhor atividade específica em um dado pH em comparação à asparaginase do tipo selvagem como aquela de A. niger como revelado no Id. de Seq. N°: 3 de WO 2004/030468 ou pode ter uma melhor resposta ao pH, por exemplo, ser mais alcalifílica ou acidofílica, em comparação à asparaginase do tipo selvagem como aquela de A. niger como revelado no Id. de Seq. N°: 3 de WO 2004/030468. Por exemplo, as proteínas variantes da invenção podem ter a atividade específica em pH de pelo menos 5 que é maior em comparação à atividade específica da asparaginase do tipo selvagem de A. niger como revelado no Id. de Seq. N°: 3 de WO 2004/030468 medido sob as mesmas condições. Por exemplo, a asparaginase do tipo selvagem de A. niger como revelado no Id. de Seq. N°: 3 de WO 2004/030468 tem um pH ótimo de pH 4 a pH 5. Uma proteína da variante da invenção pode ser mais alcalifílica que tal enzima do tipo selvagem, ou seja, pode, por exemplo, ter um pH ótimo de pH 6 ao pH 7. Uma variante pode ser mais acidofílica que a asparaginase do tipo selvagem.
Em outra modalidade, as proteínas variantes da invenção podem ter a amplitude do perfil de atividade de pH que é pelo menos 3,5, preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5 unidades de pH de amplitude.
Tais proteínas podem ser obtidas por introdução aleatória de mutações em toda ou parte da sequência codificadora da invenção, como por mutagênese de saturação. Os mutantes resultante podem ser então expressos recombinantemente e rastreados para atividade biológica. Por exemplo, a técnica fornece ensaios padrão para a medição da atividade enzimática de asparaginase e assim melhores proteínas podem ser facilmente selecionadas.
Em uma modalidade preferida a asparaginase variante da invenção tem uma sequência de aminoácidos de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4. Em outra modalidade, uma variante da invenção é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 e tipicamente também retém pelo menos um atividade biológica do polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4, embora possa diferir na sequência de aminoácidos devido à mutagênese como acima descrito.
Em uma modalidade preferida adicional, uma asparaginase variante da invenção tem uma sequência de aminoácidos codificada por um fragmento de ácido nucléico isolado capaz de hibridizar a um ácido nucléico de acordo com a invenção, preferivelmente sob condições de hibridização altamente rigorosas.
Consequentemente, uma asparaginase variante da invenção é preferivelmente uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homóloga à sequência de aminoácidos mostrada no Id. de Seq. N°: 2 ou no Id. de Seq. N°: 4 e retém pelo menos uma atividade funcional do polipeptídeo de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4.
As variantes da invenção, por exemplo, equivalentes funcionais de uma proteína de acordo com a invenção, também podem ser identificados, por exemplo, por rastreamento de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, da proteína da invenção para atividade de asparaginase. Em uma modalidade, uma biblioteca variada de variantes é gerada por mutagênese combinatória no nível de ácido nucléico. Uma biblioteca variada de variantes pode ser produzida por, por exemplo, ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em sequências de gene de modo que um conjunto degenerado de sequências de proteínas potenciais é expressível como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para apresentação de fago). Há vários métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes potenciais dos polipeptídeos da invenção a partir de uma sequência de oligonucleotídeos degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e cols. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura e cols. (1984) Science 198:1056; Ike e cols. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
Além disso, bibliotecas de fragmentos da sequência que codifica um polipeptídeo da invenção podem ser usadas para gerar uma população variada de polipeptídeos para rastreamento de uma seleção subseqüente de variantes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de sequência codificadora pode ser gerada por tratamento de um fragmento de PCR de filamento duplo da sequência codificadora de interesse com uma nuclease sob condições em que ocorre fissura apenas por volta de uma por molécula, desnaturação do DNA de filamento duplo, renaturação do DNA para formar um DNA de filamento duplo que pode incluir pares senso/anti-senso de diferentes produtos com fissura, remoção de porções de filamento único de duplexes reformados por tratamento com S1 nuclease, e ligação da biblioteca de fragmento resultante em um vetor de expressão. Por este método, pode ser be derivada uma biblioteca de expressão que codifica fragmentos N-terminais e internos de vários tamanhos da proteína de interesse.
Várias técnicas são conhecidas na prática para rastreamento de produtos de gene de bibliotecas combinatórias feitas por mutações em ponto de truncamento, e para rastreamento de bibliotecas de cDNA para produtos de gene que têm uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente usadas, que são passíveis de análise de alto rendimento para rastreamento de grandes bibliotecas de gene tipicamente incluem clonagem da biblioteca de gene em vetores de expressão replicáveis, transformação de células adequadas com a biblioteca resultante de vetores, e expressão dos genes combinatórios sob condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita a a isolação do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese em conjunto recorrente (REM), uma técnica que melhora a freqüência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de rastreamento para identificar variantes da proteína da invenção (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave e cols. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Os fragmentos de um polinucleotídeo de acordo com a invenção também podem compreender polinucleotídeos que não codificam polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeos podem funcionar como marcadores ou iniciadores para uma reação de PCR.
Ácidos nucléicos de acordo com a invenção independente de se eles codificam polipeptídeos funcionais ou não funcionais podem ser usados como marcadores de hibridização ou iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR). Os usos das moléculas de ácido nucléico da presente invenção que não codificam um polipeptídeo que tem atividade de asparaginase incluem, entre outros, (1) hibridização in situ (por exemplo, FISH) a extensões cromossômicas de metáfase para fornecer uma localização cromossômica precisa de um gene que codifica asparaginase como descrito em Verma e cols., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (2) análise de Northern blot para detectar expressão de mRNA de asparaginase em tecidos específicos e/ou células; e (3) marcadores e iniciadores que podem ser usados como uma ferramenta diagnóstica para análise da presença de um ácido nucléico hibridizável a tal marcador ou iniciador em uma amostra biológica dada (por exemplo, tecido).
Também é englobado pela invenção um método de obtenção de um equivalente funcional de um polinucleotídeo da invenção. Tal método exige a obtenção de um marcador rotulado que inclui um ácido nucléico isolado que codifica toda ou uma porção da sequência de proteína de acordo com o Id. de Seq. N°: 2 ou com o Id. de Seq. N°: 4 ou uma variante dessa; rastreamento de uma biblioteca de fragmento de ácido nucléico com o marcador rotulado sob condições que permitam a hibridização do marcador aos fragmentos de ácido nucléico na biblioteca, assim formando dúplices de ácido nucléico, e preparação de uma sequência de gene de comprimento total a partir do fragmentos de ácido nucléico em qualquer dúplex rotulado para obter uma sequência relacionada a um polinucleotídeo da invenção.
Células hospedeiras
Em outra modalidade, a invenção apresenta células, p or exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucléico englobado pela invenção. Uma “célula transformada” ou “célula recombinante” é uma célula em que (ou em um ancestral da qual) foi introduzido, por meio de técnicas de DNA recombinante, um ácido nucléico de acordo com a invenção. Tanto células eucarióticas quanto procarióticas são incluídas, por exemplo, bactéria, fungos, levedura e outras, especialmente preferidas são as células de fungos filamentosos, em particular Aspergillus niger.
Pode ser escolhida uma célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto codificado pela sequência de ácidos nucléicos incorporada em um modo específico, desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem facilitar o funcionamento ótimo da proteína codificada.
Várias célula hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para processamento pós- tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens de células ou sistemas de hospedeiro adequados familiares para aqueles habilitados na técnica de biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidos para assegurar a modificação desejada e correta e processamento da proteína estranha expressa. Para esse fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.
As células hospedeiras também incluem, sem limitação, linhagens de células de mamífero como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e linhagens de células de plexo coróide.
Se desejado, uma linhagem de células estavelmente transfectada pode produzir uma variante de acordo com a invenção. Inúmeros vetores adequados para transfecção estável de células de mamífero são disponíveis ao público, métodos para a construção de tais linhagens de células são também publicamente conhecidos, por exemplo, em Ausubel e cols. (supra).
Uso de uma asparaginase variante da invenção em processos industriais A presente invenção também revela uma composição que compreende a asparaginases de acordo com a invenção. A composição pode compreender opcionalmente outros ingredientes, por exemplo, outras enzimas. As variantes de asparaginase de acordo com a invenção ou composições que compreendem as referidas asparaginases podem ser usadas na produção de um produto alimentício. Em uma modalidade da invenção as variantes de asparaginase de acordo com a invenção ou composições que compreende as referidas asparaginases podem ser usadas para reduzir a quantidade de acrilamida formada em um produto alimentício termicamente produzido com base em uma matéria prima que contém asparagina. Elas podem, por exemplo, ser usadas em um processo para a produção de um produto alimentício que envolve pelo menos uma etapa de aquecimento, que compreende a adição de uma ou mais enzimas de asparaginase a uma forma intermediária do referido produto alimentício no referido processo de produção segundo o qual a enzima é adicionada antes da referida etapa de aquecimento em uma quantidade que é eficaz na redução do nível de asparaginase que está presente na referida forma intermediária do referido produto alimentício. Tal processo é revelado e WO04/030468 cujo processo e todas as suas preferências são aqui incorporados por referência. Também em WO04/026043 são descritos processos adequados em que a asparaginase de acordo com a invenção pode ser usada. Os processos revelados em WO04/026043 e todas as preferências reveladas em são aqui incorporados por referência.
Uma forma intermediária do produto alimentício é aqui definida como qualquer forma que ocorra durante um processo de produção antes da obtenção da forma final do produto alimentício. A forma intermediária pode compreender as matérias primas individuais e/ou mistura dessas e/ou misturas com aditivos e/ou auxiliares de processamento, ou forma subseqüentemente processada desses. Por exemplo, para o produto alimentício pão, as formas intermediárias compreendem, por exemplo, trigo, farinha de trigo, a mistura inicial desses com outros ingredientes do pão como, por exemplo, água, sal, levedura e composições para melhoria do pão, a massa misturada, a massa trabalhada, a massa levedada e a massa parcialmente assada. Por exemplo, para vários produtos com base em batata, flocos ou grânulos de batata desidratados são produtos intermediários, e massa de milho é um produto intermediário para tortilla chips.
O produto alimentício pode ser feito de pelo menos uma matéria prima que é de origem em planta, por exemplo, batata, tabaco, café, cacau, arroz, cereal, por exemplo, trigo, milho, centeio, milho, cevada, "groats", fagópiro e aveia. O trigo deve englobar aqui e a seguir todas as espécies conhecidas do gênero Triticum, por exemplo, aestivum, durum e/ou spelta. Além disso, produtos alimentícios feitos a partir de mais de uma matéria prima ou intermediário são incluídos no escopo dessa invenção, por exemplo, produtos alimentícios que compreendem tanto trigo (farinha e/ou amido) quanto batata. Exemplos de produtos alimentícios em que o processo de acordo com a invenção pode ser adequado são quaisquer produtos com base em farinha, por exemplo, pão, produtos de confeitaria, bolos, pretzels, bagels, bolo “Dutch honey”, biscoitos, pão de gengibre, bolo de gengibre e pão crocante, e quaisquer produtos com base em batata, por exemplo, batatas fritas, pommes frites, batatas chips, croquetes.
As matérias primas como acima citadas são conhecidas por conter quantidades substanciais de asparagina que está envolvida na formação de acrilamida durante uma etapa de aquecimento do processo de produção. Alternativamente, a asparagina pode ser originada de outras fontes diferentes das matérias primas, por exemplo, de hidrolisados de proteína, como extratos de levedura, hidrolisado de soja, hidrolisado de caseína e outros, que são usados como um aditivo no processo de produção do alimento. Um processo de produção preferido é o cozimento do pão e outros produtos assados a partir de farinha de trigo e/ou farinhas de outras origens cereais. Outro processo de produção preferido é a fritura das batatas chips a partir de fatias de batata.
As etapas de aquecimento preferidas são aquelas em que pelo menos uma parte do produto alimentício intermediário, por exemplo, a superfície do produto alimentício, é exposta a temperaturas em que a formação de acrilamida é promovida, por exemplo, 110°C ou mais, 120°C ou mais de temperaturas. A etapa de aquecimento no processo de acordo com a invenção pode ser realizada em fornos, por exemplo, em uma temperatura entre 180-220°C, como para assar o pão e outros produtos assados, ou em óleo como a fritura de batatas chips, por exemplo, a 160-190°C.
Em outro aspecto, a invenção fornece produtos alimentícios que podem ser obtidos pelo processo da invenção como aqui descrito anteriormente ou pelo uso da nova asparaginase como aqui descrito anteriormente para produzir produtos alimentícios. Esses produtos alimentícios são caracterizados por reduzir significativamente os níveis de acrilamida em comparação com os produtos alimentícios obtidos por processos de produção que não compreendem a adição de uma ou mais enzimas em uma quantidade que é eficaz na redução do nível de aminoácidos que estão envolvidos na formação de acrilamida durante a referida etapa de aquecimento. O processo de acordo com a invenção pode ser usado para obter uma diminuição do teor da acrilamida do produto alimentício produzido preferivelmente em mais de 50%, mais preferivelmente mais de 20%, ainda mais preferivelmente 10% e mais preferivelmente mais de 5% comparado a um produto alimentício obtido com o processo convencional.
Uma aplicação adicional para as variantes de asparaginase de acordo com a invenção é o emprego na terapia de tumores em animais e humanos. O metabolismo das células tumorais requer L-asparagina, que pode ser rapidamente degradada por asparaginases. A asparaginase de acordo com a invenção também pode ser usada como um adjunto no tratamento de algumas leucemias humanas. A administração de asparaginase em animais experimentais e humanos leva à regressão de certos linfomas e leucemias. Portanto, em uma modalidade a invenção relaciona-se a asparaginases ou uma composição de acordo com a invenção para uso como medicamento, por exemplo, no tratamento de tumores, por exemplo, no tratamento de linfomas ou leucemias em animais ou humanos.
As variantes de asparaginase de acordo com a invenção podem ser convenientemente produzidas em microorganismos. Nos processos acima, é vantajoso usar asparaginases que sejam obtidas por técnicas de DNA recombinante. Tais enzimas recombinantes têm inúmeras vantagens, como a produção em um menor custo, alto rendimento, livre de agentes contaminantes como bactérias ou vírus, mas também livre de toxinas bacterianas ou que contaminam outras atividades da enzima. A invenção é aqui ilustrada pelos exemplos não limitante a seguir.
EXEMPLOS
Materiais e Método s Ensaio de asparaginase para medir a dependência ao pH na faixa de pH=4 a pH=9 A atividade de asparaginase foi medida com o uso de L- asparagina como substrato. A quantidade de amônia que foi liberada pela ação da enzima foi medida de acordo com a reação de Berthelot. Reagentes prontos para o uso fenolnitroprusside e hipoclorito alcalino foram obtidos a partir de Sigma. 100 μl de amostra de enzima foram misturados com 2.000 μl 100 mM L-asparagina em uma mistura de 50 mM ácido cítrico e 50 mM tampão de pirofosfato de sódio do pH desejado. Depois de incubação a 37°C por 30 minutos a reação foi interrompida pela adição de 400 μl 25% ácido tricloroacético, depois do que 2.500 μl de água foram adicionados. Durante a incubação a temperatura foi fixada a 37°C a menos que indicado de outro modo.
Deve ser compreendido pela pessoa habilitada na técnica que a dosagem da enzima foi escolhida em uma tal maneira que depois da incubação sob as condições acima foi obtido um sinal significativamente acima do valor de fundo mas ainda dentro de uma escala em que os sinais obtidos são proporcionais à quantidade de enzima adicionada. Preferivelmente a reação foi de ordem zero.
Depois de interromper a reação, 4 μl da mistura de incubação foram adicionados a 156 μl de água. Subsequentemente 34 μl de solução de fenol/nitroprusside (Sigma P6994) e 34 μl solução alcalina de hipoclorito (Sigma A1727) foram adicionados. Depois de 676 segundos de incubação a 37°C, a extinção foi medida a 600 nm. As leituras foram corrigidas para o sinal de base por inclusão dos vazios apropriados. Uma amostra com enzima inativada (TCA) foi usada como um vazio. Os ensaios foram feitos em um autoanalyzer, por exemplo, um Konelab Arena 30 (Thermo Scientific). A atividade foi determinada com o uso de uma linha de calibragem feita por traçado da absorvência medida a 600 nm versus as concentrações conhecidas de sulfato de amônio de uma série padrão. A atividade foi expressa em unidades, em que uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um micromol de amônia de L-asparagina por minuto sob condições definidas de ensaio.
Ensaio de asparaginase para medir a dependência de pH na faixa de pH=4 a pH=8 O método foi executado do mesmo modo que o método acima descrito para medição da dependência ao pH e da atividade para a faixa de pH=4 a pH=9, com a diferença de que 100 μl de amostra de enzima foram misturados com 2.000 μl 100 mM L-asparagina em 50 mM de tampão fosfato/ácido cítrico do pH desejado. Em todos os ensaios a atividade das amostras de asparaginase foram expressas em unidade/ml.
Exemplo 1
Fermentação, isolação e purificação de asparaginases de acordo com a invenção As asparaginases da invenção foram obtidas pela construção de plasmídeos de expressão que contêm uma sequência de DNA que codifica a asparaginase da invenção, transformação de uma cepa de Aspergillus niger com o plasmídeo e crescimento das cepas de Aspergillus niger como descrito em WO2004/030468.
Depois de crescimento de Aspergillus niger que contém os plasmídeos de expressão adequados, sobrenadantes livres de células foram preparados por centrifugação do caldo de fermentação a 5.000 x g por 30 minutos a 4°C. Se necessário os sobrenadantes foram filtrados também sobre um filtro de
Miracloth (Calbiochem cat# 475855) e um filtro de microfibra de vidro GF/A Whatmann (150mm 0), respectivamente, para remover quaisquer sólidos. Para remover qualquer material fúngico os sobrenadantes podem ser ajustados ao pH=5 com 4N KOH e filtrados de modo estéril sobre um filtro de 2 μm (do topo ao fundo) com sucção. Os sobrenadantes foram estocados até o uso a 4°C ou congelados a -20°C se necessário.
No caso em que as impurezas eram mais de 60% p/p asparaginase foi purificada por cromatografia de troca aniônica iônica iniciando a partir dos sobrenadantes livres de células ou ccUF dessalgado por meio de uma coluna PD-10 (Amersham Biosciences). O material dessalgado foi aplicado a uma coluna Mono-Q ou Q-Sepharose equilibrada em 20mM tampão de histidina pH 5,96. Depois de lavagem extensiva as asparaginases foram eluídas da coluna com o uso de um gradiente de 0 a 1M NaCl.
A pureza das frações do sobrenadante que contêm a atividade de asparaginase ou das frações de asparaginase purificada (determinada em mg proteína/ml) foi checada por cromatografia de exclusão por tamanho analítica (HP-SEC: Cromatografia de exclusão por tamanho de alta performance, TSKgel 3000SW-XL, coluna 300*7,8 mm; faixa de peso molecular 10-300 kDa, 100mM tampão de fosfato pH 7 e pH 5,96). Todos os fluxos foram a 1 ml/min (exceto por injeção de amostra na coluna Q-Sepharose, que foi a 5 ml/min). A detecção das proteínas eluídas foi feita a 280 nm. A concentração da asparaginase de tipo selvagem de Aspergillus niger eluída foi calculada a partir da extinção a 280 nm (A280) com o uso de um coeficiente de extinção molar de 10.240 M-1.cm-1 (A2801cm,1mg/ml= 0,28, em que A2801cm,1mg/ml é a extinção a 280 nm medida com um comprimento de 1 cm e na concentração de proteína pura de 1mg/ml). A medição de A280 foi realizada em um espectrofotômetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, The Netherlands). Para asparaginases que correspondem ao Id. de Seq. N°: 4 (ASN002) e asparaginase que corresponde a Id. de Seq. N°: 2 (ASN001) respectivamente 8960 M-1.cm-1 (A2801cm, 1mg/ml = 0,25) e 11.520 M-1.cm-1 (A2801cm, 1mg/ml= 0,31) foram usadas. No caso de impurezas que absorvem a 280nm a concentração de asparaginase foi corrigida com base na cromatografia HP-SEC por multiplicação de A280 medido da amostra de asparaginase pela proporção da área sob o pico de asparaginase e a área total dos picos que absorvem a 280 nm. Quando os picos de asparaginase não eram claramente separados de outros picos foram tomadas as alturas dos picos em vez das áreas dos picos.
Exemplo 2 Performance de asparaginase de acordo com a invenção Atividade específica como uma função do pH
A atividade específica das variantes de asparaginase foi determinada em pH=4, pH=5, pH=6, pH=7, pH=8 a 37°C em 50mM de tampão fosfato/citrato com o uso de sobrenadantes livres de célula. A atividade específica da enzima, é aqui definida como a atividade determinada para uma amostra da enzima em unidades/mg de polipeptídeo da enzima pura. A atividade específica de asparaginase é assim a atividade determinada para uma amostra de asparaginase em unidades/mg de polipeptídeo de asparaginase pura.
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Tabela 1: A atividade específica das variantes em relação à asparaginase do tipo selvagem (wt) de A.niger (WO2004/030468) com o uso de asparagina como um substrato nos valores indicados de pH. Para cada pH a atividade 5 específica do tipo selvagem é ajustada a 100%. A atividade foi determinada em 37°C. Para determinação da atividade específica da asparaginase, a concentração no sobrenadante foi derivada de uma medição de A280 com a aplicação de uma correção para 10 quaisquer impurezas com base em cromatografia HP-SEC como indicado em materiais e métodos.
Em relação ao do tipo selvagem o pH ótimo das variantes ASN002 (Id. de Seq. N°: 4) e ASN001 (Id. de Seq. N°: 2) trocou do pH=4 para o pH=6. Além do pH ótimo tornou- 15 se muito mais amplo, em particular na faixa alcalina. As variantes ASN002 (Id. de Seq. N°: 4) e ASN001 (Id. de Seq. N°: 2) mostram para todos os valores de pH medidos além de pH=4 uma atividade específica substancialmente maior comparada à atividade do tipo selvagem. A dependencia da atividade de pH e o pH ótimo A dependência da atividade de asparaginase foi determinada em 50mM tampão fosfato/citrato na faixa de pH de pH=4 ao pH=8 com o uso de sobrenadantes livres de células. O pH em que a mais alta atividade foi observada para uma variante é chamado o pH ótimo para a referida variante. Na tabela 2 a atividade máxima observada para uma variante é ajustada a 100% e as atividades das referidas variante em outros valores de pH são mostradas como percentagem da atividade máxima observada para a referida variante.
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Tabela 2: A dependência de pH da atividade de asparaginase para as variantes comparada à asparaginase de A.niger de tipo selvagem (wt) (WO2004/030468). A mais alta atividade que foi observada para cada asparaginase foi ajustada a 100%. A atividade foi determinada com o uso de sobrenadante livre de células a 37°C. A tabela 2 mostra que o pH ótimo foi trocado para um pH maior. Em adição, a atividade em pH alcalino é significativamente melhorada para as variantes, o que torna essas variantes muito úteis para aplicacões que necessitem da atividade de aspargainase sob condições alcalinas. Amplitude do perfil de atividade de pH das variantes A característica mais marcante de ASN002 e ASN001 é que as duas asparaginases exibem um perfil de atividade em pH extremamente amplo na faixa de pH mais útil, pH=4 a pH=9, o que não foi observado para qualquer aparaginase anteriormente. Para estabelecer a amplitude di perfil de atividade de pH a atividade foi determinada no pH=4 ao pH=9, com o uso de um tampão de ácido cítrico/pirofosfato. A amplitude do perfil de atividade em pH é a amplitude da faixa de pH, calculada em unidades de pH, em que a enzima exibe 50% a 100% de sua atividade máxima. A amplitude do perfil de atividade em pH é determinada por traçado da atividade contra o pH. A amplitude da faixa de pH calculada em unidades de pH, para a qual a enzima exibe pelo menos 50% de sua atividade máxima define a amplitude do perfil de atividade em pH da referida enzima. Quando uma linha é desenhada paralela ao eixo do pH em metade da atividade máxima, o perfil de atividade em pH cruza em dois valores de pH com essa linha. Os dois valores de pH de interseção, um para o limbo ácido e um para o limbo alcalino do perfil de atividade em pH, define a amplitude do perfil de atividade em pH. Nos valores de pH intermediários a atividade é pelo menos 50% da atividade máxima. A atividade máxima é definida como a mais alta atividade que é observada quando do traçado da atividade versus pH. O pH que corresponde a mais alta atividade é o pH ótimo da referida enzima.
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Tabela 3: amplitude do perfil de atividade de pH de ASN002 e ASN001 comparada à asparaginase de A.niger do tipo selvagem (WO 2004/030468) e de A.oryzae do tipo selvagem (WO 2004/032648). A atividade foi determinada em 37°C. Atividade na faixa de pH pH=4 ao pH=9 foi medida com o uso de mistura de L-asparagina de tampão 50 mM ácido cítrico e 50 mM pirofosfato de sódio do pH desejado como descrito na seção materiais e métodos. As amostras da enzima usadas foram na faixa de 1,5-12 unidades/ml. A Tabela 4 mostra a relação total pH-atividade como determinado para a faixa de pH=4 ao pH=9.
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Tabela 4: Relação da atividade de pH para ASN002 e ASN001 comparada à asparaginase do tipo selvagem de A.niger (WO 2004/030468) e A.oryzae (WO 2004/032648). A mais alta atividade que foi observada para cada asparaginase foi ajustada a 100% para cada asparaginase. A atividade foi determinada a 37°C. A atividade na faixa de pH=4 ao pH=9 foi medida com o uso de mistura de L-asparagina de tampão 50 mM ácido cítrico e 50 mM pirofosfato de sódio do pH desejado como descrito na seção materiais e métodos. As amostras da enzima usadas foram na faixa de 1,5-12 unidades/ml. Estabilidade das variantes Separadamente da atividade em um pH dado, a performance de uma enzima é também criticamente dependente de sua termo-estabilidade durante a conversão. Para verificar a termo=estabilidade das variantes mais ativas, o ensaio de atividade foi realizado a 60°C. em um ensaio a reação da enzima foi interrompida após 10 minutos, em um segundo ensaio a reação foi interrompida após 30 minutos. A dosagem da enzima no ensaio de 30 minutos foi um-terço da dosagem no ensaio de 10 minutos. Se as enzimas são estáveis sob as condições aplicadas a atividade observada deve ser similar. No caso de ocorrer inativação espera-se que a atividade diminua depois de tempo de ensaio mais longo. Os resultados são mostrados na tabela 5.
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Tabela 5: A estabilidade das variantes. O ensaio foi realizado a 60°C, dosagem de enzima no ensaio de 30 minutos foi um-terço da dosagem no ensaio de 10 minutos que corresponde com uma incubação de 10 minutos e 30 minutos de 5 tempo de incubação respectivamente.
A Tabela 5 indica que a estabilidade das variantes é muito a asparaginase de Aspergillus niger do tipo selvagem. Em pH6, pH=7, pH=8 as variantes ASN002 e ASN001 são totalmente ativas a 60°C e mostram apenas uma pequena redução na atividade após 30 minutos de incubação. Como uma consequência a atividade aumentada pode ser totalmente usada na conversão de asparagina ao ácido aspártico. Em particular em valores de pH medidos na região neutra e alcalina, a performance das variantes é significativamente melhorada.

Claims (8)

1. Asparaginase caracterizada por ser um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer de Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 4.
2. Asparaginase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter um pH ótimo entre 6 e 7.
3. Sequência de ácido nucléico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA de Id. de Seq. N°: 1 ou Id. de Seq. N°: 3.
4. Constructo de ácido nucléico caracterizado por compreender a sequência de ácidos nucléicos, como definida na reivindicação 3, operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle capazes de direcionar a expressão de uma asparaginase em um hospedeiro de expressão adequado.
5. Vetor de expressão recombinante caracterizado por compreender o constructo de ácido nucléico, como definido na reivindicação 4.
6. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender o vetor de expressão, como definido na reivindicação 5, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, fúngica ou de levedura.
7. Método para a produção de uma asparaginase caracterizado por compreender o cultivo da célula hospedeira, como definida na reivindicação 6, em um meio CSM compreendendo, por litro, 150 g de maltose*H2O, 60 g de Sytone (peptona), 1 g de NaH2PO4*H2O, 15 g MgSO4*7H2O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon (antiespumante), 20 g MES, 1 g L-arginina em pH 6,2 a 34°C e 170 rpm durante 3 a 5 dias e recuperação da asparaginase por centrifugação.
8. Composição caracterizada por compreender a asparaginase, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou obtida pelo método, como definido na reivindicação 7.
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