EA009122B1 - Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения - Google Patents

Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA009122B1
EA009122B1 EA200500519A EA200500519A EA009122B1 EA 009122 B1 EA009122 B1 EA 009122B1 EA 200500519 A EA200500519 A EA 200500519A EA 200500519 A EA200500519 A EA 200500519A EA 009122 B1 EA009122 B1 EA 009122B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
conjugate
group
polyalkylene glycol
factor
peg
Prior art date
Application number
EA200500519A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500519A1 (ru
Inventor
Алекса Л. Мартинес
Мерри Р. Шерман
Марк Г. П. Сэйфер
Л. Дэвид Вильямс
Original Assignee
Маунтейн Вью Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Маунтейн Вью Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Маунтейн Вью Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA200500519A1 publication Critical patent/EA200500519A1/ru
Publication of EA009122B1 publication Critical patent/EA009122B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

Представлены способы получения конъюгатов разнообразных биоактивных компонентов, в особенности протеинов, с водорастворимыми полимерами (например, поли(этиленгликолем) и их производными). Таковые конъюгаты обладают пониженными антигенными и иммуногенными свойствами по сравнению с аналогичными конъюгатами, полученными с использованием поли(этиленгликоля), содержащего метоксил или иную алкоксильную группу. Изобретение также предоставляет конъюгаты, полученные такими способами, составы, включающие в себя такие конъюгаты, комплекты, содержащие такие конъюгаты, или составы и методы применения конъюгатов и составов в диагностических и терапевтических протоколах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к таким областям науки, как биохимия протеинов, фармацевтика и медицина. В частности, изобретение предоставляет способы получения конъюгатов между водорастворимьми полимерами (например, поли(этиленгликолем) и его производными) и биоактивных компонентов, конъюгаты которых обладают пониженными антигенными и иммуногенными свойствами, по сравнению со стандартными конъюгатами из полимерных биоактивных компонентов. Изобретение также предоставляет конъюгаты, полученные такими способами, составы, включающие в себя такие конъюгаты, комплекты, содержащие такие конъюгаты и составы и методы применения конъюгатов и составов при разнообразных профилактических, диагностических и терапевтических обстоятельствах медицины и ветеринарии.
Уровень техники
Двумя ключевыми факторами, сдерживающими развитие рекомбинантных протеинов в качестве лечебных средств, являются их обычно короткое время полужизни в кровотоке, и их потенциальная антигенность и иммуногенность. Термин антигенность, использованный здесь и в целом в материалах, относится к возможности молекулы связываться с предсуществующими антителами, в то время как термин иммуногенность относится к возможности вызывать иммунную реакцию в живом организме, будь то реакция, включающая в себя формирование антител (гуморальная реакция), или же стимуляцию клеточных иммунных реакций. Для введения рекомбинантных терапевтических протеинов, обычно желательно прибегать к внутривенному введению для того, чтобы достичь максимальной активности в кровотоке и свести к минимуму проблемы биологической доступности и распада. Однако полужизни малых протеинов после внутривенного введения обычно оказываются чрезвычайно короткими (см. примеры в Морденти, Дж. и др. (1991) Рйатт Кек 5:1351-1359; Кувабара, Е., и др., (1995) Рйатт Кек 12:14661469). Здоровые почки обычно удерживают в кровотоке протеины с гидродинамическими радиусами, превышающими радиусы сывороточного альбумина, который имеет радиус Стокса, равный с. 36 А и молекулярный вес с. 66,000 дальтон (66 кило-дальтон). Однако малые протеины, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Е) и рибонуклеаза, быстро выводятся из кровотока путем клубочковой фильтрации в почках (Бреннер, Б. М. и др. (1978) Ат. 1. РЬукюБ 234: Е455.-Е460; Венкатачалам, М.А., и др. (1978) С1гс Кек 43:337-347; Вилсон, Г. (1979) 1. Сей. РЬукюБ 74:495-509). В результате, поддержание терапевтически полезных концентраций малых рекомбинантных протеинов в кровотоке проблематично, если вводить их внутривенно. Вследствие этого такие протеины нужно вводить более часто и в более высоких концентрациях. Частое введение доз лекарства приводит к увеличению стоимости лечения, снижает вероятность соблюдения больным режима и схемы лечения и увеличивает риск возникновения побочных явлений, например, иммунных реакций. Как клеточная, так и гуморальная иммунная реакция может привести к снижению концентрации введенного рекомбинантного протеина в кровотоке до такой степени, которая не позволит ввести эффективную дозу, или может привести к побочным явлениям, ограничивающим возможность лечения, например, проявлению анафилактической реакции (Пьюи, К.-Х., и др. (2001) 1. С1ш. Опсо1. 79:697-704).
Альтернативные способы введения, такие как подкожные или внутримышечные инъекции, могут способствовать преодолению некоторых из этих проблем, обеспечивая более постепенное поступление рекомбинантного протеина в кровоток. Однако биологическая доступность может оказаться достаточно низкой, затрудняя достижение эффективной концентрации лекарственного препарата в крови. Дополнительной проблемой, которую можно отнести к низкой биологической доступности препаратов, вводимых подкожно или внутримышечно, является повышенная вероятность распада терапевтического протеина непосредственно в месте инъекции.
Модификация рекомбинантных протеинов путем ковалентного присоединения производных поли(этиленгликоля) (ПЭГ) широко исследуется как средство устранения выше упомянутых недостатков (рассмотрено Шерманом М. Р. и др. (1997) в Полиэтиленгликоль. Области применения в химии и биологии, Харрис, Дж. М., и др., издание Американского химического общества, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 155-169; Робертс, М. Дж.и др. (2002) Αάν. Бгид. Бейу. Кек. 54:459-476). Было продемонстрировано присоединение производных ПЭГ к протеинам для стабилизации последних, улучшения их биологической доступности и/или снижения их иммуногенности в живом организме. (Здесь и в материалах в целом для обозначения ковалентного присоединения производных ПЭГ к протеину или другому субстрату используется термин ПЭГиляция.) При этом ПЭГиляция может значительно возрастать в гидродинамическом радиусе протеинов. При присоединении малого протеина, такого как цитокин или полипептидный гормон, к длинной единой нити ПЭГ (например, имеющей молекулярный вес не менее 18 кДа), получающийся в результате конъюгат имеет больший гидродинамический радиус, чем радиус сывороточного альбумина, и время его выведения через почечные клубочки значительно дольше. Общий эффект ПЭГиляции - снижение протеолиза, ослабление иммунного распознавания и уменьшение скорости почечного очищения - наделяет значительными преимуществами ПЭГилированные белки, используемые в качестве терапевтических средств.
С 1970-х годов предпринимались попытки применять ковалентное присоединение полимеров для совершенствования безопасности и эффективности различных протеинов для использования в фармацев
- 1 009122 тическом производстве (см. например, патент США № 4179337). Некоторые примеры включают в себя сцепление ПЭГ или поли(этиленоксида) (ПЭО) с аденозиндезаминазой (ЕС 3.5.4.4) для использования при лечении тяжелых случаев заболевания комбинированным иммунодефицитом (Дэвис, С. и др. (1981) С11П. Ехр. 1ттипо1 46:649-652; Хершфилд, М. С. и др. (1987) N. Еид1. 1. Меб. 316:589-596). Другие примеры включают в себя сцепление ПЭГ с супероксиддисмутазой (ЕС 1.15.1.1) для лечения воспалительных состояний (Сайфер, М. и др. патенты США № 5006333 и 5080891), и с уратоксидазой (ЕС 1.7.3.3) для удаления избытка мочевой кислоты из крови и мочи (Инада, Ю., Заявка на патент (Япония) 55099189; Келли, С. Дж. и др. (2001) 1 Ат 8ое №р11го1 72:1001-1009; Вилльямс, Л.Д. и др., публикация РСТ АО 00/07629 А3, соответствующая патенту США № 6,576,235; Шерман, М. Р. и др., публикация РСТ АО 01/59078 А2).
ПЭО и ПЭГ являются полимерами, образованными из молекул этиленоксида соединенных ковалентной связью. Эти полимеры имеют следующую общую структуру: К.1-(ОСН2СН2)и-Я2 где Κ2 может быть гидроксильной группой (или химически активным производным от нее), а Κι может быть водородом, как в ПЭГ диоле, метильной группой, как в монометоксильном ПЭГ (мПЭГ), или иной низшей алкильной группой, например, как в изопропоксиПЭГ или т-бутоксиПЭГ. Параметр и в общей структуре ПЭГ указывает количество молекул этиленоксида в полимере, здесь и далее в материалах обозначаемый термином степень полимеризации. ПЭГ и ПЭО могут быть линейными и разветвленными (Фьюк, И. и др. (1994) 1 Сои!го1 Яе1еа8е 30:27-34), или иметь звездообразную структуру (Меррилл, Э. В. (1993) 1. ВютаГег. 8ег Ро1ут. Еб 5:1-11). ПЭГ и ПЭО являются амфипатическими веществами, т.е. они растворимы в воде и в некоторых органических растворителях, и они могут присоединяться к липидосодержащим материалам, включая оболочечные вирусы и мембраны клеток животных и бактерий. Некоторые случайные, блок- или чередующиеся сополимеры этиленоксида (ОСН2СН2) и пропиленоксида, имеющие следующую структуру:
СН2-СН-СН3 \/ О обладают свойствами, достаточно сходными со свойствами ПЭГ для того, чтобы эти сополимеры могли рассматриваться в качестве адекватной замены ПЭГ РЕС в некоторых случаях (см., например, патенты США №№ 4 609 546 и 5 283 317). Для обозначения таких сополимеров в тексте настоящего документа используется термин полиалкиленоксиды и сокращение ПАО, равно как для обозначения сополимеров ПЭГ или ПЭО и полиоксиэтиленовых-оксиметиленовых сополимеров (патент США № 5476653). Использованный здесь термин полиалкиленгликоли и сокращение ПАГ используются для обозначения, в общем, полимеров, пригодных для использования в конъюгатах настоящего изобретения, в частности ПЭГ, и конкретнее ПЭГ, содержащих единственную реакционно-способную группу (монофункционально активированные ПЭГ).
Обычно несколько (например, от 5 до 10) нитей одного или нескольких ПАГ, например, одного или нескольких мПЭГ с молекулярным весом около 5 до 10 кДа, сцепляются с целевым протеином через простейшие аминогруппы (эпсилон-аминогруппы радикалов лизина и альфа-аминогруппа Ν-концевой аминокислоты). Более часто, конъюгаты были синтезированы с содержанием единственной нити мПЭГ более высоким молекулярным весом, например, 12, 20 или 30 кДа. Была продемонстрирована прямая зависимость между плазменным временем полужизни конъюгатов и увеличением молекулярного веса и/или увеличением количества связанных нитей ПЭГ (Кларк, Р. и др. (1996) 1. Вю1. СНет. 271:2196921977). С другой стороны, с увеличением количества нитей ПЭГ, увеличивается вероятность того, что аминогруппа в существенной части биоактивного компонента (в особенности, если биоактивным компонентом является протеин) будет модифицирована, ослабляя ее биологическую функцию (например, ферментативный катализ или рецепторное связывание цитокином). Для больших протеинов, содержащих много аминогрупп, и для ферментов с субстратами низкого молекулярного веса, данный компромисс между повышенной продолжительностью действия и пониженной удельной активностью может быть приемлемым, так как он дает чистое увеличение биологической активности ПЭГ-содержащих конъюгатов в живом организме ίη у1уо. Однако для меньших протеинов, таких как полипептидные гормоны и цитокины, сравнительно высокая степень замены, заметно снижает функциональную активность до такой степени, что сводит к нулю преимущество увеличения срока полужизни в кровотоке (Кларк, Р. и др., выше).
Некоторые из настоящих изобретателей стали первыми, кто на практике осуществили концепции ПЭГиляции и применили их в отношении нескольких протеинов для достижения желаемого сочетания благоприятной фармакокинетики и увеличения активности лекарственного вещества в живом организме. Эти протеины включают в себя фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцита-макрофага (СМ-С8Г - ГМ-КСФ) (Сайфер, М.Г.П. и др. (1997) Ро1ут Ргергшй 38:576-577; Шерман, М.Р. и др. (1997) выше) и рекомбинантный белок млекопитающих (см. публикации РСТ АО 00/07629 и АО 01/59078; Келли, С.Дж. и др. выше; патент США 6576235). Используя ГМ-КСФ в качестве опытного цитокина, некоторые из настоящих изобретателей продемонстрировали, что присоединение одной или двух нитей мПЭГ высокого молекулярного веса (около 36 кДа) оказалось достаточным: для резкого увеличе
- 2 009122 ния активности ГМ-КСФ мышиного/крысиного рекомбинанта в живом организме (Сайфер, М.Г.П. и др. (1997) выше; Шерман, М.Р. и др. (1997) выше). Также были проведены исследования, при которых была модифицирована уратоксидаза рекомбинанта млекопитающих (уриказа). Изучалась возможность применения модифицированной уриказы в качестве средства против трудноизлечимой подагры (см. публикации РСТ XV О 00/07629, соответствующие патенту США № 6576235, и XVО 01/59078. На всю информацию, взятую их этих работ, в настоящем документе даны соответствующие ссылки). При использовании ПЭГ -уриказы для лечения мышей с уриказной недостаточностью (иох-/-), у которых наблюдалась тяжелая нефропатия, вызванная действием мочевой кислоты, было обнаружено, что она является хорошо переносимым, эффективным и в значительной степени неиммуногенным средством. Подверженные воздействию препарата мыши демонстрировали улучшение почечной функции на протяжении всего курса терапии (10 недель). Нарушение почечной деятельности, вызванной действием мочевой кислоты, у них было выражено значительно ниже, чем у мышей с уриказной недостаточностью иох-/-, не подверженных воздействию препарата, что было продемонстрировано микроскопической магнитно-резонансной томографией (Келли, С. Дж. и др. (2001) выше).
Ковалентное присоединение нитей ПЭГ к молекуле полипептида раскрывается в патенте США № 4179337, Дэвиса Ф.Ф. и др., а также в Абучовски, А. и др. (1981) в: Епхутех а§ Бтидк, Хольценберг, Дж.С. и др. изд., 1ойи ΧνίΕ\· аиб 8оп§, Нью-Йорк, стр. 367-383. В данных статьях раскрывается тот факт, что ферменты и другие протеины, модифицированные при помощи мПЭГ, обладают пониженными иммуногенными и антигенными свойствами, и имеют более долгий срок существования в кровотоке по сравнению с соответствующими немодифицированнными протеинами. Получаемые полезные свойства химически модифицированных конъюгатов дают весьма эффективный результат при различных терапевтических применениях. Для осуществления ковалентного присоединения ПЭГ или полиалкиленоксидов к протеину по крайней мере одна из гидроксильных концевых групп полимера должна быть вначале преобразована в химически активную функциональную группу (радикал). Этот процесс часто называется активацией, а получаемый продукт называется активированным ПЭГ или активированным полиалкиленоксидом. Монометоксильный ПЭГ, который с одного конца закрыт инертным, химически устойчивым диметиловым эфиром (метоксильной группой), а с другого конца - функциональной группой (радикалом), химически активной по отношению к аминогруппам на молекуле протеина, наиболее часто используется в подобных методиках. Так называемые разветвленные мПЭГ, которые содержат две и более метоксильные группы, наиболее удаленные от единственной активированной функциональной группы, используются не так часто. В качестве примера можно взять ди-мПЭГ-лизин, в котором карбоксильная группа лизина наиболее часто активируется путем эстерификации (образования сложного эфира) с Ν-гидросукцинимидом (Нэррис, Дж.М., и др., патент США № 5 932 462). Активированные полимеры вступают в реакцию с терапевтическим средством, имеющим нуклеофильные функциональные группы, которые служат местом присоединения. Одна нуклеофильная функциональная группа, обычно используемая в качестве места присоединения, является эпсилон-аминогруппой радикалов лизина. Свободные группы карбоновой кислоты, удобно активируемые карбонильные группы, окисленные углеводные агенты и тиоловые группы, также используются в качестве области интеграции ДНК умеренных фагов и бактериальных хромосом (далее по тексту: мест присоединения).
Гидроксильная группа мПЭГ была активирована хлорангидридом циануровой кислоты, и получившееся в результате соединение было сцеплено с протеинами (Абучовски, А., и др. (1977) 1 Вю1 СНет 252:3582-3586; Абучовски, А., и др. (1981) выше). Тем не менее, использование данного метода имеет свои недостатки, такие как токсичность хлорангидрида циануровой кислоты и ее неспецифическая химическая активность для протеинов, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как растворимые радикалы цистина или тирозина, которые могут быть существенными для выполнения функции.
Для преодоления этих и других недостатков были применены альтернативные активированные ПЭГ, такие как сукцинимидилсукцинатные производные от мПЭГ (88-РЕО - СС-ПЭГ) (Абучовски, А., и др. (1984) Сапсег Вюсйет Вюрйук 7:175-186). В благоприятных условиях СС-ПЭГ быстро вступает в реакцию с протеинами (в пределах 30 мин), давая активные, хотя и широко модифицированные конъюгаты. М. Сайфер и др. в патенте США № 5468478 раскрывают полиалкиленгликоль-моно-Νсукцинимидилкарбонаты и полученные из них конъюгаты. С. Залипски в патенте США № 5612460 раскрывает способы получения полиэтиленгликоль Ν-сукцинимидилкарбонатов. Данная форма полимера (8С-РЕО СК-ПЭГ) легко вступает в реакцию с аминогруппами протеинов, а также с пептидами, имеющими низкий молекулярный вес, и другими материалами, которые содержат свободные аминогруппы, с которыми она образует уретановые связи.
Уретановые (или карбаматные) связи между аминогруппами протеина и ПЭГ также известные в материалах, получают из других производных карбонатов ПЭГ (Бочэмп, С. и др. (1983) Апа1 Вюсйет 131:25-33; Веронезе, П.М. и др. (1985) Арр1. Вюсйет Вю1ес1то1 11:141-152). Химически активные мПЭГ посредники (промежуточные продукты) и методы их использования также известны в материалах для синтеза конъюгатов ПЭГ биоактивных компонентов, связанных посредством амидных связей, сложноэфирных связей, вторичных аминов и тиоэфирных связей, среди прочих.
- 3 009122
Т. Сузуки и др. ((1984) ВюсЫт Вюрйук Лс1а 755:248-255) ковалентно сцепил иммуноглобулин С (ИгГ) с мПЭГ, который был активирован хлорангидридом циануровой кислоты. Они изучали биологические и физико-химические свойства, такие как антигенсвязывающую активность и молекулярное строение, гель-хроматографическое поведение, удельную поверхностную активность, поверхностную способность к агрегации и тепловую способность к агрегации, которые вызывали неспецифическую активацию комплемента конъюгатами ПЭГ -ИгГ. Присоединение ПЭГ к ИгГ увеличило явный радиус Стокса и поверхностную активность ИгГ, и сделало устойчивым ИгГ к нагреву и/или воздействию внутренних поверхностей, в то же время никакой структурной денатурации ИгГ не наблюдалось. Подавление неспецифической способности к агрегации было объяснено, главным образом, стерической затрудненностью ассоциации между ПЭГилированными молекулами ИгГ. Данные результаты указывают на практичность применения мПЭГ-соединенного ИгГ в качестве внутривенного препарата, а также предполагают ценность ПЭГ в качестве стабилизирующей добавки к немодифицированному ИгГ для внутривенного введения. К. А. Шарп и др. ((1986) Апа1 Вюсйет 154:110-117) исследовали возможность получения биоспецифичных аффинных лигандов для разделения клеток в водяных двухфазных полимерных системах на основе антигенов клеточной поверхности. Кроличий ИгГ против эритроцитов человека вступал в реакцию с мПЭГ, активированным хлорангидридом циануровой кислоты с молекулярным весом приблизительно 0,2; 1,9 и 5 кДа при различном молярном отношении ПЭГ к лизиновым группам на протеине. Коэффициент распределения протеина в двухфазной системе, содержащей декстран и ПЭГ, увеличивался с увеличением степени модификации и увеличением молекулярного веса мПЭГ. Сопутствующим симптомом была потеря способности агглютинировать человеческие эритроциты.
Р.Х. Туллис в патенте США № 4904582 раскрывает олигонуклеотидные конъюгаты, где олигонуклеотиды соединены через сшивающий спейсер с гидрофобной функциональной группой, в качестве которой может выступать полиоксиалкиленовая группа. Считается, что полученные в результате этого конъюгаты более эффективны в мембранном транспорте, то есть имеют возможность проходить через мембрану и эффективно модулировать транскрипционную систему. Таким образом, составы могут быть использованы в пробирке и в живом организме для изучения клеточных процессов, защищая млекопитающие организмы-носители от болезнетворных микроорганизмов, облегчая исправление генетических дефектов и т.п.
Излишняя конъюгация полимеров и/или конъюгация, включающая в себя активный центр терапевтической составляющей, при которой обнаруживаются группы, ассоциированные с биологической или физиологической активностью, опять-таки может зачастую выразиться в потере активности, а отсюда и в потере терапевтической эффективности. Такое часто происходит с пептидами с низким молекулярным весом, имеющих малое количество мест присоединения, которые не ассоциированы с биологической или физиологической активностью. Например, И. Бенхар и др. ((1994) Вюсопщд Сйет 5:321-326) экспериментальным путем обнаружил, что результатом ПЭГиляции рекомбинантного одноцепного иммунотоксина стала утрата специфической целевой иммунологической химической активности иммунотоксина. Утрата активности иммунотоксина стала результатом присоединения ПЭГ к двум радикалам лизина в пределах области соединения антигенов иммунотоксина.
Несмотря на то, что ковалентное присоединение ПАГ и ПАО (например, ПЭГ, ПЭО и т.д.) к терапевтическим протеинам делается с целью исключения их иммунологической химической активности, ПЭГилированные протеины остаются слабо иммуногенными. Такая иммуногенность проявляется, по крайней мере, частично в силу того, что ПЭГ и ПАО полимеры сами по себе являются в известной степени антигенными и иммуногенными. Например, кролики были иммунизированы к различным ПЭГ путем парентального введения животным конъюгатов, в которых ПЭГ был соединен с протеиномимуногенным носителем (Рихтер, А.В. и др. (1983) 1п1 Атсй А11егду Арр1 1ттипо1 70:124-131). Кроме того, моноклональное антитело, которое вступает в реакцию с полиэфирной основой ПЭГ, было выведено путем инъецирования мышей мПЭГ-конъюгатом бета-глюкуронидазы и выбором клона гибридома, выделяющего антитело против ПЭГ (Ченг, Т.-Л. и др. (1999) Вюсопщд Сйет 10:520-528; Ченг, Т.-Л. и др. (2000) Вюсопщд Сйет 11:258-266; Пай, Н.-М. и др. (2001) Вю1ес11пк|иек 30:396-402; Роффлер, С. и др., патенты США № 6596849 и 6617118; раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки на их целостность). Другое моноклональное антитело, которое вступает в реакцию с полиэфирной основой ПЭГ, было раскрыто недавно Робертсом, М.Дж. и др. в заявке на патент США № 2003/001704 А1.
Ряд исследователей раскрыли получение линейных или разветвленных неантигенных ПЭГполимеров и производных или конъюгатов от них (см., например, патенты США №№ 5428128; 5621039; 5622986; 5643575; 5728560; 5730990; 5738846; 5811076; 5824701; 5840900; 5880131; 5900402; 5902588; 5919455; 5951974; 5965119; 5965, 566; 5969040; 5981709; 6011042; 6042822; 6113906; 6127355; 6132713; 6177087 и 6180095; см. также публикацию РСТ УО 95/13090 и опубликованную заявку на патент США №№ 2002/0052443, 2002/0061307 и 2002/0098192). В большинстве примеров в вышеупомянутых патентах и заявках на патенты применены полимеры, содержащие одну или несколько нитей мПЭГ, например, ди-мПЭГ-лизин. На сегодняшний день, однако, не существует раскрытия механизма создания неантигенности ПЭГ в таких полимерах или конъюгатах.
- 4 009122
Таким образом, существует необходимость идентификации способов получения ПАО-содержащих (например, ПЭГ - и/или ПЭО-содержащих) конъюгатов, в частности, конъюгатов между такими водорастворимыми полимерами и терапевтическими протеинами, со сниженной, значительно сниженной или не поддающейся обнаружению антигенностью. Подобные конъюгаты будут иметь преимущества, обеспечиваемые полимерным компонентом повышенной стабильности и биологической доступности в живом организме, но не будут вызывать существенной иммунной реакции у животного, которому вводятся такие конъюгаты для терапевтических или диагностических целей.
Краткое оисание изобретения
Настоящее изобретение предназначено для удовлетворения указанной выше потребности и предоставляет способы получения конъюгатов водорастворимых полимеров (например, полиэтиленгликоля и его производных) и биоактивных компонентов, в особенности терапевтических биоактивных компонентов, таких как протеины. Изобретение также предоставляет полимеры и конъюгаты, полученные при помощи этих методов. Такие полимеры и конъюгаты имеют пониженные антигенные и иммуногенные свойства по сравнению с алкоксилсодержащими полимерами и конъюгатами того же биоактивного компонента, полученного с алкоксиПЭГ, например, мПЭГ. Изобретение также предоставляет составы, содержащие такие конъюгаты, комплекты, содержащие такие конъюгаты и составы и методы применения конъюгатов и составов в различных диагностических и терапевтических режимах. В определенном аспекте изобретение предоставляет конъюгат, включающий в себя один или несколько биоактивных компонентов, ковалентно связанных с одним или более линейными или разветвленными монофункционально активированными полиалкиленгликолями, при этом монофункционально активированный полиалкиленгликоль не содержит метоксильную группу, иную алкоксильную группу или арилоксильную группу на каком-либо конце. В определенных вариантах осуществления изобретения конъюгаты обладают сниженной или существенно сниженной антигенностью по сравнению с конъюгатом, полученным с помощью алоксиполиэтиленгликоля, например, мПЭГ, или разветвленного полимера, содержащего мПЭГ, такой как ди-мПЭГ-лизин.
Полиалкиленгликоли, которые особенно подходят для их использования в синтезе конъюгатов изобретения, включают в себя (но не ограничиваются лишь ими) полиэтиленгликоли и сополимеры этиленоксида и пропиленоксида; особо предпочтительными являются ПЭГ, и еще более предпочтительными являются монофункционально активированные ПЭГ (например, ПЭГ, которые активированы лишь на одном конце, включая гидроксиПЭГ-моноальдегиды, гидроксиПЭГ-моновинилсульфоны, химически активные сложные эфиры гидроксиПЭГ-монокарбоновой кислоты и производных гидрокси ПЭГмонофенил карбоната). Другие посредники, которые могут применяться для синтеза производных химически активных полимеров, включают в себя прочие гидроксиПЭГ-монокислоты и гидрокси ПЭГмоноацеталы. В определенных вариантах осуществления изобретения полиалкиленгликоль имеет молекулярный вес приблизительно от 1000 Да до 100 кДа, предпочтительнее приблизительно от 2 до 60 кДа, приблизительно от 2 до 30 кДа; приблизительно от 5 до 20 кДа; приблизительно от 10 до 30 кДа; приблизительно от 10 до 20 кДа; две ветви, каждая с молекулярным весом приблизительно от 2 до 30 кДа; и более предпочтительно две ветви, каждая приблизительно от 18 до 22 кДа. Согласно данному аспекту изобретения конъюгаты могут включать в себя одну или несколько нитей полиалкиленгликоля, в определенных вариантах осуществления изобретения предпочтительны приблизительно от 1 до 10 нитей, приблизительно от 1 до 5 нитей, более предпочтительно приблизительно от 1 до 3 нитей и самым предпочтительным является приблизительно от 1 до 2 нитей; в других вариантах осуществления изобретения предпочтительно приблизительно от 5 до 100 нитей, приблизительно от 10 до 50 нитей и более предпочтительно приблизительно от 6 до 20 нитей на подгруппу биокатализаторных протеинов высокого молекулярного веса. В самом предпочтительном варианте осуществления изобретения, полиалкиленгликоль, примененный в конъюгате, включает в себя одну или две нити монофункционально активированного полиэтиленгликоля (например, химически активного сложного эфира гидроксиПЭГ-одноосновной кислоты, гидроксиПЭГ-моноальдегида, гидроксиПЭГ-моновинилсульфона или производного гидроксиПЭГ-монофенил карбоната), имеющего молекулярный вес приблизительно от 18 до 22 кДа, или приблизительно от 27 до 33 кДа.
Биоактивные компоненты, пригодные для использования в конъюгатах или составах настоящего изобретения, включают в себя (но не ограничиваются лишь ими) различные пептиды, протеины, гликопротеины, органические соединения, аминосодержащие соединения, карбоксилатные соединения, гидроксилсодержащие соединения и тиолсодержащие соединения.
Изобретение также предоставляет способы получения конъюгатов между биоактивным соединением и монофункционально активированным полиалкиленгликолем, например, включающие в себя: (а) получение или подготовку линейного или разветвленного полиалкиленгликоля, содержащего не менее одной инертной блокирующей группы, которая может быть впоследствии удалена, например, одна или несколько трифенилметил групп (тритильные группы); (б) получение производного от полиалкиленгликоля путем его реакции с одним или более соединениями для получения производного при таких условиях, когда полиалкиленгликоль производится с одной деривативной группой (такой как карбоксильная группа) на конце, на котором отсутствует блокирующая группа (ы); (в) удаление блокирующей группы
- 5 009122 (групп) без удаления дериватизационной группы для получения за один или несколько этапов монофункционально активированного полиалкиленгликоля; и (г) контактирование монофункционально активированного полиалкиленгликоля с одним или более биоактивными компонентами при условиях, благоприятствующих ковалентному связыванию биоактивного компонента с монофункционально активированным полиалкиленгликолем. Предпочтительно конъюгаты, полученные такими способами обладают сниженными, значительно сниженными или необнаруживаемыми антигенными и иммуногенными свойствами по сравнению с конъюгатами, произведенными в одинаковой степени с мПЭГ того же размера, той же структуры и связью с биоактивным агентом. Изобретение также предлагает конъюгаты, полученные этими способами. Изобретение также предлагает фармацевтические или ветеринарные составы, включающие в себя конъюгаты изобретения и по крайней мере одну среду или одного носителя, пригодных для использования в фармацевтических или ветеринарных целях. В дополнительных вариантах осуществления, изобретение также предоставляет методы предупреждения, диагностики или лечения физических нарушений у животных (например, у млекопитающих, включая человеческие организмы) с использованием конъюгатов или составов изобретения. Один такой метод включает в себя, например, введение в организм животного, страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению (такому как анемия, артрит, злокачественные опухоли, синдром Альцгеймера, ферментная недостаточность, сердечно-сосудистые заболевания, артериальная гипертензия, инфекционные заболевания, нарушение обмена веществ, неврологические заболевания, нейтропения, синдром Леша-Найхана и их проявления (например, подагра), заболевания или нарушения, связанные с генетически обусловленной недостаточностью, и т.п.), эффективного количества одного или нескольких конъюгатов или составов изобретения, которые могут быть введены животному, в частности млекопитающим, и особенно в человеческий организм, перорально, местно или парентерально, например, внутривенно, внутримышечно или подкожно.
В дополнительных вариантах своего осуществления изобретение предлагает составы, включающие в себя один или несколько конъюгатов изобретения с пониженными антигенными свойствами, которые затем могут включать в себя один или несколько дополнительных компонентов или реагентов, таких как одна или несколько буферных солей, один или несколько углеводородных носителей (фарм. наполнителей), один или несколько протеинов-носителей, один или несколько ферментов, один или несколько детергентов, одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, один или несколько полимеров, таких как ПЭГ и ему подобных. Изобретение также предоставляет комплекты, включающие в себя конъюгаты с пониженным антигенными свойствами и/или составы изобретения.
В дополнительных вариантах своего осуществления изобретение предлагает ПЭГ-липосомы с пониженной иммунологической химической активностью, подготовленные с использованием монофункционально активированного полиалкиленгликоля, у которого отсутствуют метоксильные или иные алкоксильные группы, вместо монофункционально активированного мПЭГ. Другие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения очевидны любому квалифицированному специалисту в свете приведенных ниже чертежей, описания изобретения и пунктов формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показаны результаты конкурентного иммуноферментного твердофазного анализа (ЭЛИЗА). В данном твердофазном анализе, мПЭГ-конъюгат одного протеина был присоединен к аналитическому планшету с 96 лунками, и было замерено ингибирование фиксации антител кролика на мПЭГ конъюгате другого протеина растворами мПЭГ или трет-бутоксиПЭГ.
На фиг. 2а отображены результаты конкурентного анализа ЭЛИЗА, проведенного по методике, описанной для фиг. 1, с использованием ПЭГ различных размеров и структур, содержащих одну или две метоксильные группы. Результаты фиксации антител вычерчены в виде функции молярной концентрации метоксильных групп в каждом препарате.
На фиг. 2Ь отображены те же данные, что на фиг. 2а, вычерченные в виде функции весовой концентрации ПЭГ (микрограмм/мл), вместо молярной концентрации метоксильньгх групп.
На фиг. 3 отображены некоторые данные, взятые из фиг. 1, 2а и 2Ь в таком формате, который демонстрирует прямую зависимость антигенных свойств от количества метоксильных групп на молекулу ПЭГ. Эти препараты включают в себя 10-кило-дальтоновые ПЭГ, у одного из которых отсутствует метоксильная группа (трет-бутоксиПЭГ), один препарат содержит одну метоксильную группу (мПЭГ) и один препарат содержит две метоксильные группы [Ди-(5-кило-дальтон) мПЭГ-лизин]. Фиг. 4 иллюстрирует конкурентный анализ ЭЛИЗА, как описано для фиг. 1, в котором 4,8-кило-дальтон мПЭГ сравнивается с тремя мПЭГ настоящего изобретения, у которых отсутствуют метоксильные группы на концах линейного полимера (обозначено РйаттаРЕС). Сдвиг между кривыми по горизонтальной оси указывает на то, что антигенные свойства всех трех ПЭГ настоящего изобретения приблизительно в 100 раз ниже, чем аналогичные свойства мПЭГ, проявленные при проведении твердофазного анализа с антимПЭГ антителами.
На фиг. 5а отображены результаты исследований, в которых препараты изомера карбонангидразы (СА II) и та же самая карбонангидраза соединенные, в среднем, с 3-4 нитями 5-кило-дальтон мПЭГ, были проанализированы электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ό8-ΡΆΟΕ). Полосы геля 1 и 2 показывают результаты, полученные путем закрашивания для
- 6 009122 протеина с использованием рубинового красителя марки 8ΥΡΚΌ® и фотографирования в темной бленде с освещением на расстоянии 302 нм. Полосы 3 и 4 показывают результаты пятна Вестерн (\Ус51сгп Ыо1) конъюгатов мПЭГ и неПЭГилированного биокатализатора (фермента) соответственно, в котором поликлональные антитела анти-мПЭГ кролика были использованы в качестве первичных антител. Полоса 5 показывает положения предокрашенных протеиновых стандартов.
Фиг. 5б показывает количественное определение интенсивностей полос в геле и пятне Вестерн, показанных на фиг. 5а, полученных с помощью фотоаппарата Кобак и программы цифрового формирования изображения. Горизонтальная ось представляет расстояние перемещения относительно фронта красителя, а вертикальная ось представляет относительную интенсивность протеинового пятна или пятна анти-мПЭГ. Нижняя метка показывает зоны предокрашенных стандартных протеинов с кажущимися молекулярными массами, слева направо: 203,8; 110,9; 68,8; 51,5; 40,2; 28,9; 20,7 и 14,9 кило-дальтон. Вторая метка от низа представляет собой пятно анти-мПЭГ антител ПЭГилированной карбонангидразы. Третья метка от низа представляет закрашенную протеином зону карбонангидразы, и верхняя метка представляет закрашенные протеином зоны мПЭГ конъюгатов карбонангидразы.
На фиг. 6а и 6Ь показаны результаты анализов ЭЛИЗА иммунной сыворотки от групп из трех кроликов, которые были иммунизированы конъюгатами свиной уриказы, содержащими, в среднем, около двух нитей либо мПЭГ, либо гидроксиПЭГ (РйагтаРЕС), на каждую уриказную подгруппу. Были замерены антитела по отношению к уриказе с помощью аналитических планшетов, покрытых свиной уриказой. Были замерены антитела по отношению к ПЭГ с помощью аналитических планшетов, покрытых конъюгатами неродственного протеина, присоединенного к мПЭГ. На фиг. 6а отображены данные от второго кровоизвлечения из кроликов, получивших четыре инъекции ПЭГ-уриказы в неполном адъюванте Фрейнда. На фиг. 6б отображены данные от третьего кровоизвлечения из тех же самых кроликов, после того, как они получили пять инъекций ПЭГ-уриказы в неполном адъюванте Фрейнда.
Подробное описание изобретения
Если не оговорено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей работе, имеют одинаковое значение, известное обычному квалифицированному специалисту в той области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Даже если какие-либо методы или материалы, схожие или равноценные тем, что описываются в настоящей работе, могут использоваться в практике или для проверки настоящего изобретения, описание предпочтительных методов и материалов следует ниже.
Определения
Приблизительно: данный термин употребляется в настоящей работе в отношении любой численной величины, термин приблизительно означает величину в пределах ±10% от заявленной величины (например, приблизительно 50°С охватывает температурный диапазон от 45 до 55°С, включительно; аналогичным образом, приблизительно 100 ммоль охватывает диапазон концентраций от 90 ммоль до 110 ммоль, включительно).
Биоактивный компонент: употребляемый в настоящей работе термин биоактивный компонент, относится к соединению, молекуле, функциональной группе или комплексу, который обладает специфической биологической активностью в живом организме, в лабораторном сосуде или вне живого организма по отношению к клетке, ткани, органу или организму и который может быть связан с одним или несколькими полиалкиленгликолями для образования конъюгатов настоящего изобретения. Подробное описание предпочтительных биоактивных компонентов приводится ниже.
Связанный: употребляемый в настоящей работе термин связанный, относится к связи или соединению, которое может быть ковалентным, например, путем химического сцепления или нековалентным, например, межионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, водородные связи и т.д. Ковалентные связи могут быть, например, сложноэфирными, эфирными, фосфо-сложноэфирными, сложными тиоэфирными, простыми тиоэфирными, уретановыми, амидными, пептидными, имидными, углеродносерными связями, и тому подобное.
Термин связанный шире по своему значению и включает в себя такие термины, как соединенный, компонованный и присоединенный.
Соединенный: термин соединенный, употребляемый в настоящей работе, относится к присоединению, образованному путем ковалентных связей или путем сильных нековалентных взаимодействий, в основном и предпочтительно, путем ковалентных связей. Для соединения биологически активных материалов в настоящем изобретении может быть использован любой метод, обычно применяемый квалифицированными в данной области специалистами.
Заболевание, нарушение, состояние: употребляемые в настоящей работе термины заболевание или нарушение относится к любому неблагоприятному состоянию организма человека или животного, включая опухоли, злокачественные новообразования, аллергические реакции, физическая зависимость (от лекарственного средства, наркотика и т.п.), аутоиммунные реакции, интоксикация или расстройство оптимальной интеллектуальной или телесной функции.
Термин состояния, употребляемый в настоящей работе, включает в себя заболевания и наруше
- 7 009122 ния, но также относится к физиологическим состояниям. Например, фертильность является физиологическим состоянием, но не является заболеванием или нарушением. Вследствие этого составы изобретения, пригодные для предупреждения беременности путем снижения фертильности, описывались бы как воздействие на состояние (фертильности), а не как терапия или лечение нарушения или заболевания. Другие состояния понятны квалифицированному специалисту в данной области.
Действенное количество: употребляемый в настоящей работе термин действенное количество относится к количеству данного конъюгата или состава, которое необходимо или достаточно для достижения желаемого биологического эффекта. Действенное количество данного конъюгата или состава настоящего изобретения будет такое количество, посредством которого достигается этот выбранный результат, и такое количество может быть определено квалифицированным специалистом в соответствии с установленным порядком. Например, действенным количеством для лечения недостаточности иммунной системы может быть такое количество, которое необходимо для того, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящую к проявлению антигенспецифической иммунной реакции при воздействии антигена. Данный термин также является синонимом термина достаточное количество. Действенное количество для каждого отдельного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, на которое оказывается терапевтическое воздействие, конкретный состав, вводимый в организм, размер объекта (испытуемого) и/или степень тяжести заболевания или состояния. Квалифицированный специалист эмпирическим путем может определить действенное количество конкретного конъюгата или состава настоящего изобретения без необходимости проведения лишних экспериментов.
Иммунная реакция: употребляемый в настоящей работе термин иммунная реакция относится к гуморальной иммунной реакции (например, образование антител) и/или клеточная иммунная реакция, ведущая к активации или пролиферации В- и/или Т-лимфоцитов и/или антигенпрезентирующих клеток. В некоторых случаях, однако, иммунные реакции могут иметь низкую интенсивность, и их можно обнаружить только при использовании одного или нескольких веществ согласно настоящему изобретению.
Иммуногенный относится к компоненту, который может стимулировать иммунную систему живого организма таким образом, чтобы одна или несколько функций иммунной системы усилились и были направлены на иммуногенный компонент.
«Один» или неопределенный артикль: если в настоящем описании изобретения употребляются термины один или неопределенный артикль, то они означают не менее одного или один или несколько, если не указано иное.
Полипептид: употребляемый в настоящей работе термин полипептид, относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислоты), линейно скомпонованных при помощи амидных связей (также известных под названием пептидных связей). Он указывает на молекулярную цепочку аминокислот и не имеет отношения к определенной длине продукта. Таким образом, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, пептиды произвольной длины и протеины попадают под определение полипептиды. Данный термин также служит для обозначения продуктов модификаций полипептида после экспрессии, например, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т. п. Полипептид может быть рекомбинирован или получен (выведен) из натурального биологического источника, но необязательно транслирован из предназначенной последовательности оснований нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым образом, включая химический синтез.
Протеин и гликопротеин: употребляемый в настоящей работе термин протеин относится к полипептиду, обычно имеющему размер приблизительно от 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Протеины обычно имеют определенную трехмерную структуру, хотя это вовсе необязательно, и их часто называют свернутыми в отличие от пептидов и полипептидов, которые часто не имеют выраженной трехмерной структуры, а скорее могут принимать большое количество различных конформаций, и их называют несвернутыми. Тем не менее, пептиды также могут иметь выраженную трехмерную структуру. Употребляемый в настоящей работе термин гликопротеин относится к протеину, содержащему не менее одной функциональной группы сахара, присоединенной к протеину через кислородосодержащую или водородосодержащую боковую цепь аминокислоты, например, серина или аспарагина.
Рафинированный: если термин рафинированный употребляется в настоящей работе по отношению к молекуле, то он означает, что концентрация рафинируемой молекулы была увеличена по отношению к молекулам, связанным с ней в естественной среде, или по отношению к среде, в которой она была получена, найдена или синтезирована. Молекулы, соединенные естественным образом, заключают в себе протеины, нуклеиновые кислоты, липиды и сахара, но обычно они не содержат воду, буферные смеси и реагенты, добавляемые для сохранения целостности или упрощения процесса рафинирования рафинируемой молекулы. Например, даже если взятый протеин в общем экстракте растворяется в водном растворителе во время колоночной хроматографии, то молекулы протеина считаются рафинированными путем такой хроматографии, если связанные естественным образом нуклеиновые кислоты, нежелательные протеины и другие биологические молекулы, отделены от молекул целевого протеина. Согласно
- 8 009122 данному определению, материал может иметь чистоту 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% в отношении к содержащимся в нем примесям.
Остаток: употребляемый в настоящей работе термин остаток относится к определенной аминокислоте, обычно обезвоженной в результате ее вовлечения в одну или несколько пептидных связей, в полипептидный остов или боковую цепь.
Лечение: употребляемые в настоящей работе термины лечение, лечить и подвергнутый лечению относятся к профилактике и/или терапии. При использовании в отношении инфекционного заболевания, например, данный термин может означать профилактическое лечение, которое усиливает сопротивляемость объекта к инфицированию болезнетворным организмом или, другими словами, снижает вероятность того, что объект будет инфицирован болезнетворным организмом или проявит признаки болезни, свойственные инфекционному заболеванию, а также лечение после того, как объект уже инфицирован, для борьбы с инфекционным заболеванием, например, для ослабления или устранения инфекционного заболевания, или для предупреждения его прогрессирования.
Обзор
Ряд предыдущих исследователей раскрыли приготовление линейных или разветвленных неантигенных ПЭГ полимеров или их конъюгатов (см. например, патенты США № 5428128; 5621039; 5622986; 5643575; 5728560; 5730990; 5738846; 5811076; 5824701; 5840900; 5880131; 5900402; 5902588; 5919455; 5951974; 5965119; 5965566; 5969040; 5981709; 6011042; 6042822; 6113906; 6127355; 6132713; 6177087 и 6180095; см. также публикации РСТ XVО 95/13090 и опубликованные заявки на патент США № 2002/0052443, 2002/0061307 и 2002/0098192; раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки на их целостность). Однако ПЭГ и конъюгаты в этих предыдущих отчетах остаются, по крайней мере, слабо иммуногенными, что может привести к нежелательным последствиям выработки антител к ПЭГ-компоненту конъюгатов при введении этих конъюгатов организм животного в профилактических, диагностических или терапевтических целях. Такие антитела могут привести к быстрому очищению от биоактивных конъюгатов, содержащих ПЭГ, и, как следствие, к снижению биологической доступности терапевтических составов (Ченг, Т.-Л. и др. (1999), выше), а также вызвать косвенное нарушение иммунного комплекса. Более того, до сих пор не раскрыт механизм придания заявленным ПЭГ или их конъюгатам существенных неантигенных или неиммуногенных свойств.
Настоящее изобретение позволяет преодолеть эти ограничения в данной области. В целом изобретение предоставляет устойчивые составы и методы, применимые для предупреждения, диагностики и лечения множества физических нарушений. Если говорить конкретнее, изобретение предоставляет методы получения химически активных полимеров с пониженными антигенными свойствами и конъюгатов стабилизированных полимеров из протеинов, в частности, терапевтических протеинов, которые обладают пониженной или существенно пониженными антигенными свойствами, или антигенность которых не поддается обнаружению. В других вариантах осуществления изобретение предоставляет конъюгаты, полученные с помощью этих методов изобретения, и составы, в частности лекарственные препараты, включающие в себя такие конъюгаты. В дополнительных вариантах осуществления изобретение предоставляет методы использования таких конъюгатов и составов в целях предупреждения, диагностики и лечения множества физических нарушений. Изобретение также предоставляет комплекты, включающие в себя один или несколько конъюгатов или составов (препаратов) изобретения.
Приготовление конъюгатов с пониженными антигенными свойствами
В одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет методы приготовления конъюгатов с пониженными антигенными свойствами, существенно пониженными антигенными свойствами или не поддающимися обнаружению антигенными свойствами путем ковалентного присоединения водорастворимых полимеров к одному или нескольким биологически активным соединениям или компонентам, таким как один или несколько протеинов, и, в частности, один или несколько терапевтических протеинов. В таких конъюгатах выбранные полимеры сами по себе будут обладать пониженными антигенными свойствами, существенно пониженными антигенными свойствами или не поддающимися обнаружению антигенными свойствами по сравнению со стандартными полимерами, обычно используемыми для приготовления протеино-полимерных конъюгатов. Применяемый в настоящей работе термин пониженные антигенные свойства относится к полимеру (например, к ПАО или ПАГ или ПЭГ, в частности к ПЭГ, и в особенности к монофункционально активированному ПЭГ), или к конъюгату или составу, включающему в себя или синтезированному с использованием такого полимера, где возможность полимера вступать в реакцию с антителами, образованными против более антигенных полимеров (например мПЭГ), была в определенной степени снижена. Предпочтительно снижение антигенных свойств не менее чем на 30% прибл., более предпочтительно снижение не менее чем на 50% прибл., и самым предпочтительным является снижение более чем на 75% прибл., по сравнению с полимерами, обладающими более выраженными антигенными свойствами. Тогда в более широком смысле полимер (или конъюгат или состав, включающий в себя или синтезированный с использованием такого полимера) считается обладающим значительно пониженными антигенными свойствами, если полимер (или конъюгат, или состав) обладает приблизительно или менее 20%, более предпочтительно приблизительно или менее 15% и еще более
- 9 009122 предпочтительно приблизительно или менее 10%, а наиболее предпочтительно приблизительно или менее 1%, антигенных свойств соответствующего антигенного полимера (например мПЭГ). И, наконец, полимер (или конъюгат или состав, включающий в себя или синтезированный с использованием такого полимера) считается обладающим антигенными свойствами, не поддающимися обнаружению, если полимер, конъюгат или состав не имеет поддающихся обнаружению антигенных свойств при проведении анализа известными в отрасли методами (например, ЭЛИЗА или другие методы выявления антигенных свойств, такие, как те, что известны в отрасли и описаны в примерах настоящей работы).
Полимеры
Полиалкиленгликоли, которые наиболее пригодны для использования в приготовлении конъюгатов настоящего изобретения, включают в себя (но не ограничиваются только ими) полиэтиленгликоли и сополимеры этиленоксида и пропиленоксида; особо предпочтительными являются ПЭГ, и еще более предпочтительны монофункционально активированные гидроксиПЭГ (например, гидроксиПЭГ, активированные на единственном конце, включая химически активные сложные эфиры гидроксиПЭГмонокарбоновых кислот, гидроксиПЭГ-моноальдегидов, гидроксиПЭГ-моноаминов, гидроксиПЭГмоногидразидов, гидроксиПЭГ-монокарбазитов, гидроксиПЭГ-моноиодоуксусных амидов, гидроксиПЭГ-мономалеинимидов, гидроксиПЭГ-моноортопиридил дисульфидов, гидроксиПЭГ-монооксимов, гидроксиПЭГ-монофенил карбонатов, гидроксиПЭГ-монофенил диальдегидов, гидроксиПЭГмонотиазолидин-2-тиокетонов, гидроксиПЭГ -тиоэфиров, гидроксиПЭГ-монотиолов, гидроксиПЭГ монотриазинов и гидроксиПЭГ-моновинилсульфонов).
Особенно предпочтительными полимерами для использования при приготовлении конъюгатов настоящего изобретения, которые обладают пониженными антигенными свойствами, существенно пониженными антигенными свойствами или необнаруживаемыми антигенными свойствами, являются монофункционально активированные ПЭГ, которые не содержат метоксильных групп, иных алкоксильных групп или арилоксильных групп. Замена такими монофункционально активированными ПЭГ монофункционально активированных мПЭГ в синтезе конъюгатов настоящего изобретения, придает получаемым в результате конъюгатам неожиданно пониженную антигенность, т.е. пониженную способность взаимодействовать с антителами, развивающимися против мПЭГ конъюгатов того же самого биоактивного компонента. Образующиеся при этом конъюгаты также обладают пониженными иммуногенными свойствами, т.е. сниженной способностью вызывать иммунную реакцию. В одном аспекте изобретения, монофункционально активированные ПЭГ могут быть синтезированы с использованием подходящих обратимо блокированных производных активирующей группы в качестве инициатора полимеризации этиленоксида (Акияма, Ю. и др (2000) Вюсоищд Сйет., 77:947-950). Акияма и др. определяют условия для синтеза моногидроксильного, моноацетального производного ПЭГ, путем использования калия 3,3диэтоксипропанолата в качестве инициатора полимеризации этиленоксида. Так как Акияма и др. 8тсе не выявили наиболее желаемые пониженные антигенные или имуногенные свойства данного интермедиата (посредника), они перешли к преобразованию концевой гидроксильной группы в тиол, прекратив полимеризацию путем добавления метансульфохлорида, при этом получая гетеробифункциональный ПЭГ, вместо производного ПЭГ настоящего изобретения. В качестве дальнейшего доказательства того, что данная группа ученых не увидела ценности монофункционально активированного ПЭГ с концевыми гидроксигруппами, можно считать тот факт, что они опубликовали и запатентовали методы синтеза альтернативных гетеробифункциональных ПЭГ из моногидроксильных, монофункционально активированных ПЭГ, и в некоторых случаях, даже запечатали концы гидроксиПЭГ метоксильными группами. Аналогично, Бентли М. Д. и др. в опубликованной заявке на патент США № 2002/0072573 А1, раскрывают полимерные составы и методы, которые не отображают признания иммунологического преимущества монофункционально активированных полимеров с концевыми гидроксигруппами и настаивают на желательности преобразования концевых гидроксильных групп таких полимеров в метоксильные группы.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения, монофункционально активированные ПЭГ могут быть синтезированы путем управления степенью активации линейных ПЭГ, содержащих гидроксильные группы на обоих концах (ПЭГ диолы), с тем, чтобы ограничить количество бис-активированного ПЭГ до приемлемо низкого уровня, например <5%, предпочтительно <2% или более предпочтительно <1%, в качестве альтернативы методу, показанному в примере 5. В особо предпочтительном аспекте, монофункционально активированные ПЭГ могут быть синтезированы из монофункциональных ПЭГ, из которых может быть удалена инертная блокирующая группа, следуя получению производных из ПЭГ, при этом дериватизирующая группа не удаляется. Примером дериватизированного ПЭГ является ПЭГ-карбоновая кислота, и примерами инертных блокирующих групп, которые могут быть удалены, следуя процессу дериватизации (образования производных), являются арилоксильные группы (Бентли М. Д. и др., публикация РСТ АО 01/26692 А1), тритильные группы (Косиенски, П.Дж., (1994) Рго!есйид Огоирз, Оеогд ТЫете Уегкщ. Штутгарт, стр. 54-58), и трет-бутоксильные группы. трет-БутоксиПЭГкарбоновая кислота может быть активирована, например, с помощью Ν-гидроксисукцинимида. Наконец, трет-бутоксильная группа может быть удалена безводным ацидолизом для получения активированного ПЭГ производного карбоновой кислоты, который имеет гидроксильную группу вместо метоксильной
- 10 009122 группы на наиболее удаленном конце полимера. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения трет-бутоксиПЭГ-карбоновая кислота может быть преобразована в гидроксиПЭГ-карбоновую кислоту путем ацидолиза перед активированием карбоксильной группы Ν-гидроксисукцинимидом. В другом варианте осуществления изобретения трет-бутоксиПЭГ-ацетали ситезируются путем воздействия на трет-бутоксиПЭГ галоацеталом и преобразования продукта в гидроксиПЭГ-ацетал или гидроксиПЭГ-альдегид посредством селективного безводного ацидолиза для удаления третбутоксильной группы. Ацетал может быть преобразован в альдегид (или альдегидгидрат) в ходе подготовки к его присоединению к аминосодержащему соединению путем восстановительного алкилирования (Бентли, М.Д. и др., патент США № 5990237). В другом варианте осуществления изобретения арилоксил защитная группа, которая отдалена от химически активного конца полимера, может быть удалена путем каталитического гидрогенолиза, образуя при этом моноактивированный гидроксиПАГ настоящего изобретения. В качестве альтернативы обратимое блокирование всех концевых гидроксильных групп, кроме одной, как описано в примере 6, может быть применено в синтезе монофункционально активированных гидроксиПАГ.
Полимеры ПАГ, используемые в приготовлении конъюгатов настоящего изобретения, могут быть линейными полимерами, или быть разветвленными в одной или нескольких точках молекулы полимера. Помимо этого полимеры, используемые для образования конъюгатов изобретения, могут быть гомополимерами, в которых множественные звенья единого мономерного типа связаны друг с другом для образования полимера, такого как полиэтиленгликоль, или же они могут быть гетерополимерами или сополимерами (в которых мономерные звенья двух или нескольких структур связаны друг с другом для образования полимера, такого как сополимер этиленоксида и пропиленоксида). Подобные сополимеры могут быть статистическими (случайными) сополимерами, блок-сополимерами или чередующимися сополимерами. Полимеры, используемые в соответствии с изобретением, могут быть инертными или химически активными полимерами. Употребляемый в настоящей работе термин инертные полимеры относится к таким полимерам, которые не присоединяются к протеину ковалентными связями. Примеры таких инертных полимеров включают в себя (но не ограничиваются лишь ими) мПЭГ, который является линейным полимером, состоящим из звеньев этиленоксида с гидроксильной группой на одном конце и метоксильной группой на другом конце, и ПЭГ диол, который является линейным полимером, состоящим из звеньев этиленоксида с гидроксильными группами на обоих концах. Употребляемый в настоящей работе термин химически активные полимеры относится к таким полимерам, которые могут вступать в реакцию с поддающимися растворению нуклеофильными группами, например, тиолгруппами или аминогруппами на биоактивном компоненте (таком как протеин), включая, но не ограничиваясь этим, альфа аминогруппу или эпсилон аминогруппы остатков лизина. Примеры химически активных полимеров включают в себя (но не ограничиваясь этим) ПЭГ, в которых гидроксильная концевая группа была преобразована или заменена электрофильной группой, такой как сукцинимидил пропионовая кислота (как в 8РА-ПЭГ) или п-нитрофенил карбонат (как в №С-ПЭГ), или альдегидом, как в ПЭГ-альдегиде. В дополнение к полиалкиленоксидам, применимые полимеры могут включать в себя поливинилалкоголи, полиоксиэтилен-оксиметилен сополимеры, полиамиды (например, Роуз, К., публикация РСТ XVО 00/12587), поликарбоксилаты, поливинилпирролидоны (фон Шпехт, Б.-У. и др. (1973) Норре-8еу1ег'к Ζ РЬукю1 СЬет 354:1659-1660), поли Ό-аминокислоты и/или поли Ь-аминокислоты, полиакрилоилтетрагидрооксазин (Рока, М., и др. (1996) Ιηΐ. 1. А1БГ. Огдапк 19:730-734) и декстраны (Якунитская, Л. М. и др. (1980) Рг1к1 ВюкЫт М1кгоЫо1 16:232-237). Производные от ПЭГ, ПЭО и других ПАО, которые вступают в реакцию более или менее селективно с разными сторонами целевых биоактивных компонентов, хорошо известны в отрасли. Их можно приобрести у таких поставщиков, как Ийка (Милуоки, штат Висконсин); ΝΟΡ СогрогаБоп (Токио, Япония); 811еаг\га1ег СогрогаБоп (Хантсвилл, штат Алабама), дочернее предприятие №к1аг ТЬегареиНек (Сан-Карлос, Калифорния); 81дта СЬет1еа1 Сотраиу (Сент-Луис, штат Миссури) или 8ииВю, 1пс. (Аньян Сити, Южная Корея).
Активированные формы полимеров, пригодные для использования в методах и составах настоящего изобретения, могут включать в себя любые монофункционально активированные формы полимеров с концевыми гидроксигруппами, которые известны в данной отрасли. Например, пригодны линейные и разветвленные ПАО различных размеров, включая такие, чей молекулярный вес (исключая массу активизирующей группы) находится в пределах приблизительно от 1 до 100 кДа. Подходящие диапазоны молекулярных весов включают в себя (но не ограничиваются ими): приблизительно от 2 до 60 кДа; приблизительно от 2 до 30 кДа; приблизительно от 5 до 20 кДа; приблизительно от 10 до 20 кДа; и от приблизительно 18 до 60 кДа, приблизительно 20 или 30 кДа. Для линейных ПЭГ диапазон молекулярного веса приблизительно от 20 кДа до 30 кДа соответствует степени полимеризации (п) в диапазоне приблизительно от 450 до 680 мономерных звеньев макромолекулы этиленоксида. Следует отметить, что преимущества присоединения терапевтического протеина к полимерам, имеющим этот последний сравнительно высокий диапазон молекулярных весов (т.е. >20-30 кДа) были впервые замечены задолго до признания иммуногенных свойств мПЭГ (Сайфер, М. и др. публикация РСТ νΟ 89/01033, опубликовано 9 февраля 1989 г., раскрытие предметов этого изобретения вошло в настоящий документ путем ссылки на его целостность).
- 11 009122
При желании линейный полимер может иметь химически активную группу на одном или на обоих концах, таким образом создавая химически активный полимер. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, может быть желательным использование сукцинимидилэстера производного монопропионовой кислоты от ПЭГ, как раскрыто в Наррис Дж. М. и др., патент США № 5672662, который полностью включен в настоящую работу путем ссылки, или иных сукцинимид активированных ПЭГ-карбоновых кислот. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения может быть желательным использование либо сукцинимидилкарбонат производных от ПЭГ (СК-ПЭГ), как описано в Сайфер, М. и др., патенты США №№ 5006333; 5080891; 5283317 и 5468478, либо пнитрофенил карбонат производного от ПЭГ, как раскрыто в Келли, С. Дж. и др. (2001) выше; публикации РСТ АО 00/07629 А2, выше и соответствующем патенте США № 6576235, и в публикации РСТ АО 01/59078 А2 выше. Кроме этого, для синтеза полимерных конъюгатов из протеинов могут использоваться другие типы химически активных групп. Эти производные включают в себя (но не ограничены ими) альдегид производные от ПЭГ (Ройер, Г. П., патент США № 4002531; Гаррис, Дж. М. и др., патент США № 5252714), амин, бромфенил карбонат, карбонилимидазол, хлорфенил карбонат, фторфенил карбонат, гидразид, карбазид, иодоацетамид, малеинимид, ортопиридил дисульфид, оксим, фенилглиоксаль, тиазолидин-2- тиокетон, тиоэфир, тиол, триазин и винилсульфон производные от ПЭГ.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, желательно минимизировать образование полимерами, такими как ПЭГ, внутримолекулярных и межмолекулярных связей между цепями во время реакции, в которой полимер присоединяется к биоактивному компоненту для образования конъюгатов настоящего изобретения. Это может быть достигнуто путем использования полимеров, которые активируются только на одном конце (для их обозначения в настоящей работе используется термин монофункционально активированные ПЭГ или монофункционально активированные ПАГ), или полимерных препаратов, в которых процентное соотношение бифункционально активированных полимеров (относится к случаю, когда линейными ПЭГ являются бис-активированные ПЭГ диолы) менее 30%, или предпочтительнее менее 10%, или предпочтительнее всего менее 2% (вес./вес.).
Использование активированных полимеров, которые являются преимущественно монофункциональными, может свести к минимуму образование всего следующего: внутримолекулярные связи между цепями в пределах отдельно взятой молекулы протеина, структур, имеющих форму гантели, в которых одна нить полимера соединяется с двумя молекулами протеина, и больших конгломератов или гелей. При использовании активированных полимеров, вступающих в реакцию с аминогруппами, теоретическое максимальное число нитей полимера, которые могут быть присоединены к одной молекуле протеина, соответствует общему количеству аминогрупп. Действительное количество аминогрупп, которые доступны на поверхности протеина при любых конкретных условиях присоединения к ним полимера, может быть меньше теоретического максимума.
Конъюгаты настоящего изобретения могут включать в себя одну или несколько нитей полиалкиленгликоля, предпочтительно приблизительно от 1 до 100 нитей, приблизительно от 1 до 20 нитей на каждое подзвено терапевтических ферментов, и приблизительно от одной до трех нитей, и предпочтительнее приблизительно от 1 до 2 нитей на каждое подзвено цитокинов рецепторного связывания, стимуляторов роста, протеиновых гормонов и факторов, стимулирующих колониеобразование (КСФ). В самом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения полиалкиленгликоль, используемый в приготовлении конъюгата, включает в себя одну или две нити поли(этиленгликоля) (в частности, карбоксиПЭГ, гидроксиПЭГ, дигидроксиПЭГ или ПЭГ-ацетала). В определенных таких вариантах реализации изобретения линейный или разветвленный полиалкиленгликоль имеет молекулярный вес приблизительно от 1 до 100 кДа, предпочтительно от приблизительно 2 до 60 кДа; приблизительно от 5 до 20 кДа; приблизительно от 10 до 20 кДа; приблизительно от 18 до 60 кДа; и самым предпочтительным является вес приблизительно от 18 до 22 кДа или приблизительно от 27 до 33 Да, если полимер линейный, и общий вес приблизительно от 36 до 44 кДа, если полимер имеет две ветви одинаковой массы.
Биологически активные компоненты
Как было отмечено выше, конъюгаты настоящего изобретения включают в себя один или несколько ПАГ или ПАО, и, в частности, одну или несколько нитей ПЭГ, ковалентно присоединенному к одному и более биоактивным компонентам. Биологически активные компоненты, к которым ковалентно присоединяются один или несколько полимеров (или нитей полимеров), в настоящей работе в отдельности называются равнозначными терминами конъюгированные биоактивные компоненты или модифицированные биоактивные компоненты. В настоящей работе эти термины необходимо отличать от неконъюгированных биоактивных компонентов, исходных биоактивных компонентов или немодифицированных биоактивных компонентов; все эти термины относятся к биоактивным компонентам, к которым ковалентно не присоединялся один или несколько полимеров. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет методы и составы для стабилизирующих растворов биоактивных компонентов, получаемых путем добавления к ним полимеров. Однако следует понимать, что неконъюгированный, немодифицированный или исходный биоактивный компонент может содержать неполимерные конъюгации (парные связи) или модификации, при сравнении с молекулой дикого типа или нативной (натуральной), и все равно он будет считаться неконъюгированным, немодифицированным или исходным в
- 12 009122 соответствии с настоящим изобретением, так как биоактивный компонент будет неконъюгированным, немодифицированным или исходным по отношению к присоединению полимеров.
Термин стабилизация биоактивного компонента (или методы стабилизации или стабилизированный биоактивный компонент) указывает на то, что биоактивный компонент был стабилизирован в соответствии с методами настоящего изобретения (т.е. биоактивный компонент, к которому был ковалентно присоединен или примешан полимер в соответствии с методами настоящего изобретения). Такие стабилизированные биоактивные компоненты будут проявлять определенные измененные биохимические и биофизические характеристики при сравнении с биоактивным компонентом, который не был стабилизирован (т.е. биоактивным компонентом, к которому не был ковалентно присоединен или примешан полимер). Среди таких измененных биохимических и биофизических параметров, в частности для протеинов, таких как ферменты, может быть пониженный аутоцитолиз, и, в частности, сохранение ферментативной активности протеина в течение инкубационного периода при определенных неблагоприятных (агрессивных) условиях окружающей среды и проведения эксперимента. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения измененные биохимические и биофизические параметры могут включать в себя, например, увеличение продолжительности полужизни в кровотоке живого организма, повышенная биологическая доступность и т.п.
Любой компонент (обычно это молекула или макромолекулярный комплекс), обладающий биологической (т.е. физиологической, биохимической или фармацевтической) активностью может быть свободно использован в качестве исходного компонента в настоящем изобретении. Такие биоактивные компоненты включают в себя (но не ограничены только ими) протеины, полипептиды, пептиды, терапевтические вирусы, органические соединения и т.п. Биоактивные компоненты также включают в себя фрагменты, варианты и производные от таких протеинов, полипептидов, пептидов, терапевтических вирусов, органических соединений и т. п., в частности, такие фрагменты, варианты и производные, которые обладают биологической (т. е. физиологической, биохимической или фармацевтической) активностью.
Подходящие органические соединения, пригодные в качестве биоактивных компонентов в настоящем изобретении, включают в себя, без каких-либо ограничений, такие вещества, как таксаны, антрациклин, соединения, включающие даунорубицин, доксорубицин, р-аминоанилиновую горчицу, мелфалан, цитозин арабинозид (Ага-С) и другие антиметаболические соединения, например, гемцитабин и т.д. В качестве альтернативы, биоактивным компонентом может быть сердечно-сосудистое вещество, противоопухолевое средство, антибактериальное средство, противогрибковое средство, такое как нистатин и амфотерицин В, анксиолитическое средство, желудочно-кишечное средство, средство, воздействующее на центральную нервную систему, болеутоляющее средство, средство, влияющее на фертильность, контрацептивное средство, противовоспалительное средство, стероидное средство, средство против урикемии, сосудорасширяющее средство, сосудосужающее средство и т.п.
Подходящие пептиды, полипептиды, ферменты и другие протеины, гликопротеины и им подобные, которые пригодны для использования в качестве биоактивных компонентов в настоящем изобретении, включают в себя любой пептид, полипептид, фермент или другой протеин и т. д., имеющий одну или несколько свободных аминогрупп, тиолгрупп или других групп, к которым может быть присоединен полимер. Такие компоненты включают в себя материалы, обладающие физиологической или фармакологической активностью, а также такие материалы, которые способны катализировать химические реакции в органических растворителях. Представляющие интерес пептиды, полипептиды и протеины включают в себя (но не ограничены ими) гемоглобин, сывороточные протеины, такие как факторы коагуляции крови, например, Факторы VII, VIII и IX, иммуноглобулины, инсулин, цитокины, такие как интерлейкин, например, о ИЛ-1 до ИЛ-18 включительно, интерфероны (например, интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма и типичные интерфероны), колониестимулирующие факторы (КСФ), включая без ограничений СМ-КСФ, С-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), макрофаг колониестимулирующий фактор, тромбопоэтин, фактор роста и развития мегакариоцита, гемопоэтический фактор, тромбоцитарный фактор роста, протеин, активирующий фосфолипазу (РЬАР), фактор, ингибирующий лейкемию ('ΌΡ, также известен в отрасли как §1сс1 Рае!ог - стальной фактор), нейротрофический фактор и факторы стволовых клеток и их пептидные копии. Вещества-антагонисты биоактивных агентов, нейтрализующие рецепторное связывание, сами по себе пригодны для использования в качестве биоактивных компонентов настоящего изобретения. Другие протеины, представляющие общий биологический или терапевтический интерес, включают в себя инсулин, растительные протеины, такие как лектины и рицины, факторы некроза опухоли и связанные протеины, факторы роста, такие как трансформирующие факторы роста, например, ТСР(ТФР)-альфа или ТСР(ТФР)-бета, факторы роста фибробластов, факторы роста эпидермиса, факторы роста клеток печени, гормональные факторы, инсулиноподобные факторы роста, гемопоэтический фактор, пигментные гормональные факторы, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны (АДГ), лактогенный гормон, хорионический гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (ТТУ), лактогенный гормон, тканевой активатор плазминогена, протеины-антагонисты, нейтрализующие рецепторное связывание, и т.п. Большое количество таких протеинов существует как в гликолизированной, так и в негликолизированной формах. Негликолизированные формы могут получаться в результате их изготовления с приме
- 13 009122 нением рекомбинантных способов в прокариотах. Такие негликолизированные продукты находятся среди пептидов и протеинов, которые являются биоактивными компонентами, годными для настоящего изобретения. Представляющие интерес ферменты, включают в себя карбогидрат-специфичные ферменты, протеолитические ферменты, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролитические ферменты, лиазы, изомеразы и лигазы. Не ограничиваясь какими-либо конкретными ферментами, приводим примеры ферментов, представляющих интерес: аспарагиназа, аргиназа, аргинин дезиминаза, аденозиндезаминаза, супероксиддисмутаза, эндотоксиназы, каталаза, химотрипсин, липаза, уриказа, аденозиндифосфатаза, тирозиназа и билирубин оксидаза. Представляющие интерес карбогидрат-специфичные ферменты включают в себя глюкозооксидазы, глюкозидазы, галактозидазы, глюкоцереброзидазы, глюкуронидазы и т.п.
Также пригодными для использования в качестве биоактивных компонентов в конъюгатах настоящего изобретения являются любые соединения, проявляющие биологическую активность в живом организме. Такие соединения неограниченно включают в себя аминокислотные последовательности, нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), пептидные нуклеиновые кислоты (ΓΝΑ^ ПНК), осколки антител, одноцепные связывающие протеины (см. прим. Ладнер Р. С. и др., патент США № 4946778, раскрытие предмета этого изобретения вошло в настоящий документ путем ссылки на него), связывающие молекулы, включая растворимые рецепторы, поликлональные антитела, моноклональные антитела, каталитические антитела (абизмы) и продукты слияния (сращения) антител или их фрагментов.
Протеины или их сегменты могут быть приготовлены или изолированы с применением технологий, известных обычным квалифицированным специалистам в данной области. Такими технологиями являются химический синтез, выращивание клетки, ткани или органа, извлечение из животных источников, получение на основе рекомбинантных ДНК методов. Также рассматриваются трансгенные источники получения аминокислотных последовательностей, полипептидов, протеинов и т. п. Такие материалы могут быть получены от генетически измененных животных, например, мышей, кроликов, свиней, коз и коров, где протеины выражены в молоке, крови или тканях, или в яйцах генетически измененных птиц. Генетически измененные насекомые и грибы, а также бакуловирусные системы выделения также рассматриваются в качестве источников. Более того, мутантные варианты протеинов также входят в рамки настоящего изобретения.
Другими протеинами, представляющими интерес, являются аллергенные протеины, такие как пыльца растений, антиген Е, пчелиный яд, клещевой аллерген и т.п. Упомянутые выше вещества иллюстрируют протеины, подходящие для настоящего изобретения. Необходимо понимать, что другие пептиды, полипептиды, протеины или их фрагменты, которые не упоминаются отдельно в настоящей работе, но имеют одну или несколько свободных аминогрупп или тиолгрупп, пригодных для соединения с одним и более полимерами в соответствии с изобретением, также подразумеваются и не выходят за рамки настоящего изобретения.
В предпочтительном аспекте изобретения, соединение, имеющее возможность полимерного соединения, является биологически активным соединением, пригодным для лекарственного или диагностического применения при лечении животных, например млекопитающих, включая людей, для состояний, для которых такое лечение предназначено. Вышеприведенный список лишь иллюстрирует, а не ограничивает перечень соединений, которые могут быть модифицированы. Квалифицированные специалисты обнаружат, что прочие подобные соединения могут быть модифицированы аналогичным образом, без излишних экспериментов. Следует понимать, что те биологически активные материалы, которые не были особо упомянуты в работе, но имеют одну или несколько свободных нуклеофильных групп, таких как аминогруппы или тиолы, которые доступны для сочленения с одним или несколькими полимерами согласно этому изобретению также подразумеваются и не выходят за рамки настоящего изобретения.
Замечено, что биоактивные компоненты, пригодные для включения в конъюгаты изобретения, могут быть веществами или составами, которые не активны сами по себе, во время нахождения в составе конъюгатов или сразу же после гидролитического высвобождения из конъюгата, но которые становятся активными после прохождения дальнейшей химической обработки или реакции. Например, противоопухолевый препарат, который вводится в кровоток в форме конъюгата настоящего изобретения, может оставаться инертным до вхождения в раковую или опухолевую клетку, где он сразу же активируется химическим процессом, происходящим внутри раковой или опухолевой клетки, например, энзиматической реакцией уникальной или особо эффективной в этой клетке.
Другие соединения, пригодные для использования в качестве биологически активных соединений в конъюгатах и составах настоящего изобретения, включают в себя гидроксил-содержащие соединения, такие как камптотицин и соответствующие ингибиторы топоизомеразы I. Камптотицин представляет собой нерастворимый в воде цитотоксический алкалоид, вырабатываемый деревьями СатрГоГйеса асситта!а, растущими в Китае, и деревьями №111аробу1е5 Гое11ба. растущими в Индии. Камптотицин и соответствующие соединения и его аналоги также известны как потенциальные противораковые и противоопухолевые препараты, проявившие свою активность в лабораторных условиях и в живом организме (см. например патенты США № 4943579, 5004758 и ссылку 32518, раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки). Такие соединения и их производные могут быть получены с использованием известных приемов синтеза без проведения дополнительных экспериментов. Предпоч- 14 009122 тигельными производными кампотицина для использования в данной работе являются те, которые включают в себя 20-ОН или другую гидроксильную группу, обладающую возможностью вступать в реакцию непосредственно с активированными формами полимеров, такими как монофункционально активированные ПЭГ настоящего изобретения. Дополнительные гидроксилсодержащие фрагменты, пригодные для использования в качестве биоактивных компонентов в настоящих конъюгатах, включают в себя таксаны и производные паклитаксела. Для целей настоящего изобретения термин таксан включает в себя все соединения, входящие в таксанового ряда тарпенов. Таким образом, Таксол (паклитаксел), 3'замещенный трет-бутоксикарбониламин производные, (таксотерез) и т.п., а также другие аналоги, которые легко синтезируются стандартными органическими способами, или доступны из коммерческих источников, таких как 81дта (Сент-Луис, штат Миссури), охватываются рамками настоящего изобретения. Данные соединения и их производные признаны в качестве эффективных противоопухолевых препаратов. Множественные исследования указывают на то, что эти препараты проявляют активность против разнообразных злокачественных новообразований и других видов раковых опухолей.
Обычному квалифицированному специалисту из числа младшего персонала понятно, что любой известный и легкодоступный биоактивный компонент пригоден для конъюгации (ковалентной связи) с монофункциональными полимерами, обладающими пониженными антигенными свойствами, значительно пониженными антигенными свойствами или не поддающимися обнаружению антигенными свойствами, согласно настоящему изобретению. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, эти исходные биоактивные компоненты используются для изготовления конъюгатов, в которых один или несколько ПАГ или ПЭГ ковалентно (попарно) соединены с биоактивной молекулой. Места молекул исходных биоактивных компонентов, к которым могут быть успешно присоединены полимеры, включают в себя остатки лизина, найденные на молекулах пептида, чьи радикалы имеют две аминогруппы. Одна из этих аминогрупп (альфа-аминогруппа) участвует в образовании пептидной (амидной) связи (кроме случая, когда лизин является аминоконцевым остатком протеина), оставляя другую аминогруппу (эпсилон-аминогруппу) свободной для попарного соединения с полимером. Другие участки на молекулах пептида или протеина, к которым могут быть успешно присоединены полимеры, включают в себя, среди прочих, альфа-аминогруппу на аминоконцевом остатке полипептида; сульфгидрильные группы цистеин остатков на протеине или пептиде (Брэкстон, С. М., патент США № 5766897), к которым полимеры, активированные винил сульфоном, малеинимидом, иодоацетамидом, бромоацетамидом или ортопиридил дисульфидом, среди прочих тиол-химически активных групп, известных в отрасли, могут быть (попарно) присоединены; гуанидогруппы аргинин остатки на протеине или пептиде (Сано, А. и др., патент США № 5093531), к которым полимеры, активированные фенилдиальдегидом могут быть (попарно) присоединены; альфа-карбоксильная группа С-концевого остатка, бета-карбоксильные группы аспартат остатков на протеине или пептиде и гамма-карбоксильные группы глутаминат остатоков на протеине или пептиде (Салкейн, Т. и др. (1997) РНагт Вез 14:1085-1091), к которым амино или гидразид производные полимера могут быть (попарно) присоединены. Конечно, прочие подходящие места на молекуле протеина или пептида, к которым могут быть успешно присоединены один или несколько полиалкиленоксидов, станут вполне очевидными для любого квалифицированного специалиста, особенно после изучения первичной и третичной структур пептида и описания настоящего изобретения.
Перед присоединением полимера к целевому биоактивному компоненту (например, к протеину), лучше всего сначала рафинировать компонент, чтобы удалить нежелательные примеси; в противном случае, анализ степени модификации исходного компонента может быть осложнен образованием полимерных конъюгатов с фрагментами компонента и другими нежелательными примесями. Рафинирование биоактивного компонента может быть полезным независимо от того, был ли протеин, предназначенный для конъюгации, взят из естественных источников, или же он был получен с помощью рекомбинантных методов, так как нежелательные примеси в препаратах могут появиться от любого из источников. Рафинирование данного биоактивного компонента может быть осуществлено любым известным в отрасли методом, с которым знаком квалифицированный специалист из числа младшего персонала, включая кроме прочего, электрофорез, диализ, солевое экстрагирование (например, фракционирование сульфатом аммония), хроматография (например, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гельхроматография, высокоэффективная жидкофазная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная экспрессхроматография протеинов (ЖЭХП) и т.п.), или сочетанием этих методов. Следует понимать, однако, что рафинирование данного биоактивного компонента не является существенным для приготовления конъюгатов полимер-биоактивных компонентов настоящего изобретения, так как биоактивные компоненты (особенно протеины) в исходных препаратах, также могут быть успешно конъюгированы с полимерами, согласно методам настоящего изобретения.
Присоединение полимеров к биологически активным компонентам
ПАГ, примененные в практике настоящего изобретения, которые, как указано выше, предпочтительно активированы путем вступления в реакцию с образовывающей пару группой, могут быть присоединены к любой из нескольких групп, которые могут присутствовать на молекуле биоактивного компонента, например, к карбоксильным группам или аминогруппам, которые не задействованы в пептидных (амидных) связях, тиолгруппам и фенольным гидроксильным группам. Для определенных пептидов или
- 15 009122 протеинов, желательно, чтобы активированные ПАГ попарно присоединялись к Ν-концевой альфа аминогруппе, и/или к аминогруппам остатков лизина, и/или к сульфгидрильным группам остатков цистеина.
Исходный или рафинированный биологически активный компонент (например, протеин) может быть культивирован с активированным полимером в буферном растворе, имеющем рН в пределах от прибл. И, или более высоком показателе рН, при котором всякая активация протеина, вызванная щелочностью, может быть обращена до прибл. рН 5, или боле низком показателе рН, при котором всякая инактивация протеина, вызванная кислотностью, может быть обращена (см. Аракава, Т. и др. (1990) Βίοροίγшсг5 29:1065-1068). Как известно в отрасли и признается любым квалифицированным специалистом, использование низкого показателя рН для присоединения полимера к протеинам может быть желательным для определенных видов протеинов или химического состава связей. Однако использование более высокого показателя рН может быть предпочтительным для некоторых других типов протеина и определенных химических составов связей, в зависимости от воздействия рН на растворимость и устойчивость протеина, на интенсивность инактивации активированного полимера (происходит ли инактивация спонтанно, или с помощью протеина в качестве катализатора), относительно интенсивности присоединения полимера к целевому протеину в соответствии с методами, известными в отрасли.
Реакция между ПАГ и биоактивным компонентом обычно проводится в растворе, предпочтительно в водном буферном растворе, обеспечивающем уровень рН в пределах от прибл. 5 до прибл. 11. Особо предпочтительными для (попарного) присоединения ПАГ к протеиновому биоактивному компоненту (например, полипептиду, пептиду, протеину или их фрагментам), являются значения рН, находящиеся в пределах приблизительно от 7 до 9, более предпочтительно приблизительно от 7 до 8. В других примерах осуществления изобретения значения рН приблизительно от 4,5 до 6,5 являются предпочтительными. Примерами буферных растворов, обеспечивающих значения рН в этих пределах при 25°С являются, кроме прочих, следующие:
мл 0,1 молярного дигидрофосфата калия + от 5,6 до 46,1 мл 0,1 молярного ΝαΟΗ, разведенного до 100 мл мл 0,025 молярной соли тетраборной кислоты + от 2,0 до 20,5 мл 0,1 молярного НС1, разведенного до 100 мл мл 0,025 молярной соли тетраборной кислоты + от 0,9 до 18,3 мл 0,1 молярного ΝαΟΗ, разведенного до 100 мл мл 0,05 молярного бикарбоната натрия + от 5,0 до 10,7 мл 0,1 молярного ΝαΟΗ, разведенного до 100 мл мл 0,05 молярной уксусной кислоты + от 5,0 до 30 мл 0,1 молярного ΝαΟΗ, разведенного до 100 мл мл 0,05 молярной трис-НС1 + от 10 до 50 мл 0,1 молярной трис-основы, разведенной до 100 мл.
Точная коррекция количества кислоты или основы, требуемого для обеспечения конкретного требуемого показателя рН может быть без труда выполнена квалифицированными специалистами отрасли знаний.
Если в конкретном случае потребуется применение биологического буферного раствора, то можно использовать один из следующих:
гидроксиэтилпиперизинэтансульфокислота (НЕРЕ8), 3-(№морфолино)пропан сульфоновая кислота (ΜΟΡ8), 3-(№морфолино)-2-гидроксипропан сульфоновая кислота (ΜΟΡ8Ο), пиперазинА,№-бис(2-гидроксипропан сульфоновая кислота) (ΡΟΡ8Ο).
Химическая реакция между ПАГ и биоактивным компонентом обычно будет проводиться при условиях, которые не вызовут инактивацию или денатурацию, например, при температурах, при которых биологически активный компонент сохраняет существенную биологическую активность, и не подвергается активации большей, чем это необходимо для обеспечения адекватного смешивания веществ, участвующих в реакции. Предпочтительной температурой для проведения химической реакции между ПАГ и биоактивными протеинами, является температура в пределах приблизительно от 4 до 40°С. Более предпочтительно, если реакция проводится при температуре приблизительно между 4 и 8°С или при комнатной температуре, т.е. приблизительно от 20 до 25°С. Химические реакция между ПАГ и непротеиновыми биоактивными реагентами, например, пептидами и биологически активными органическими веществами, состоящими главным образом из углерода, водорода и кислорода, могут проводиться при более высоких или более низких температурах, которые совместимы с устойчивостью конкретного биоактивного органического вещества, соединяемого (попарно) с ПАГ.
Квалифицированные специалисты без труда поймут, что количество задействованного в реакции ПАГ по отношению к количеству биоактивного компонента, будет зависеть от требуемого объема сочленения полимера с биоактивным компонентом. Например, когда необходимо, чтобы ПАГ вступил в реакцию с конкретной фракцией растворимых остатков лизина (в случаях, когда в качестве биоактивного компонента выступает полипептид), потребуется такая молярная концентрация ПАГ, которая будет, по крайней мере, равной молярной концентрации лизинов, сочленяемых с ПАГ. Несомненно, что если тре
- 16 009122 буется образование производных не на всех растворимых реакционно-активных участках молекулы биоактивного компонента, то, соответственно потребуется меньшее количество ПАГ, участвующего в реакции. В общем, однако, где используется избыток молярной концентрации ПАГ, авторы настоящего изобретения определили, что предпочтительным является избыток молярной концентрации приблизительно в 2-10 раз. Время реакции зависит от ряда факторов, таких как температура, при которой проводится реакция, концентрация веществ, участвующих в реакции, и требуемый размер дериватизации. За ходом реакции можно наблюдать с помощью обычных средств, таких как периодический анализ проб, проводимый путем гель-хроматографии или гель-электрофореза. При желании реакция может быть остановлена обычными средствами, путем добавления низкомолекулярного соединения, имеющего реакционноспособную группу, например, аминоуксусной кислоты (глицина), для удаления излишнего количества аминоактивного ПАГ, или путем хроматографического фракционирования. При комнатной температуре обычно требуется приблизительно от 15 мин до 24 ч для того, чтобы ПАГ вступил в реакцию с фиксирующими группами большинства биоактивных компонентов (например, с лизингруппами полипептидных цепей). При более низких температурах время реакции может быть более долгим. Квалифицированному практику понятно, что время для конъюгации, а также количество и тип ПАГ, не должны быть такими, чтобы инактивировать задействованный биоактивный компонент, т.е. биоактивные компоненты не должны значительно утратить своей биологической активности. Фраза биоактивные компоненты не должны значительно утратить своей биологической активности означает, что ПАГ-конъюгированный биоактивный компонент проявляет не менее приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно не менее 20, 35, 50, 75, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более от уровня своей биологической активности (например, ферментативной активности; способности рецепторного связывания; противоопухолевой активности и т.д.), которая проявляется в лабораторных условиях или в живом организме тем же самым биоактивным компонентом, который не был конъюгирован с ПАГ.
Рафинирование полимер-сочлененного биоактивного компонента может быть осуществлено средствами, обычно используемыми квалифицированными в отрасли специалистами, такими как, например, гель-хроматография, ионообменная хроматография, ультрафильтрация, диализ и т.п. Растворы продукта химической реакции, при желании, могут быть концентрированы при помощи роторного испарителя, и продукт может быть получен в сухом состоянии путем лиофилизации. В зависимости от конкретного используемого биоактивного компонента, и степени его реакции с ПАГ, ожидается, что получающийся в результате продукт присоединения будет пригоден для диагностических или терапевтических целей, демонстрируя, по сравнению с не участвовавшим в реакции биоактивным компонентом, пониженные антигенные и иммуногенные свойства, увеличенный срок жизни в кровотоке, и повышенную устойчивость, при этом сохраняя полезный уровень биологической активности.
Биоактивный компонент может вступать в реакцию с монофункционально активированными разветвленными полимерами полиэтиленгликоля, рассмотренный выше (в частности, с одним или несколькими монофункционально активированными разветвленными дигидроксиПЭГ, например, дигидроксиПЭГ-лизин) в водной реакционной среде, которая может содержать буферный раствор, в зависимости от требуемого показателя рН для нуклеофильного реагента и активированного полимера. Оптимальный показатель рН для реакции - обычно между приблизительно 6,5 и приблизительно 8,5, и предпочтительно приблизительно 7,4 для поддержания растворимости и устойчивости большинства полипептидов. Оптимальный показатель рН для присоединения активированного ПАГ, например, ΝΡΟ-ПЭГ, к уриказе млекопитающих, приблизительно рН 10, в то время как оптимальный рН селективного присоединения некоторых активированных ПАГ к Ν-концевым альфа аминогруппам протеина или пептида, находится в пределах от прибл. 4 до прибл. 7. Оптимальными условиями реакции, необходимыми для поддержания устойчивости биоактивного компонента, реакционной эффективности и т. д., являются те, что находятся в пределах уровня обычного квалифицированного специалиста в данной отрасли знаний. Предпочтительный температурный диапазон находится приблизительно между 4 и 40°С. Температура реакции не должна превышать температуры, при которой нуклеофильный реагент может денатурироваться или разложиться. Предпочтительно, чтобы нуклеофильный реагент вступал в реакцию с избыточным количеством активированного разветвленного полимера. После проведения реакции конъюгат извлекается и рафинируется, например, путем диафильтрации, колоночной хроматографии, сочетанием обоих методов и т. п.
Использование молекулярного моделирования может упростить принципы оптимизации присоединения полимера к протеину. Например, данные кристаллографического анализа с помощью рентгеновских лучей могут быть использованы для создания компьютерных изображений доступных для растворителя поверхностей протеинов (Сейли, Р.А. и др. (1995) Тгеийк ВюсГет 8с1 20:374-376). Структурный анализ, основанный на исследованиях ядерного магнитного резонанса, также может быть полезен в этом отношении. Фракция доступных участков на поверхности, с которыми конкретный активированный полимер может вступать в реакцию, и распределение полимерных нитей среди различных участков, могут быть смоделированы путем выбора соответствующей активирующей группы, молярного отношения полимера к протеину, и соответствующих условий реакции связывания (например, рН, температуры, концентраций веществ, участвующих в реакции, продолжительности культивирования). В некоторых об
- 17 009122 стоятельствах может быть предпочтительнее присоединить полимер к остаткам (радикалам), которые расположены достаточно далеко от активного участка фермента для того, чтобы свести к минимуму возможные неблагоприятные воздействия на биологическую активность. Например, поверхность протеиназа К содержит большое количество потенциальных участков для присоединения полимеров, которые активируются различными химическими составами. Однако предыдущее открытие, сделанное некоторыми авторами настоящего изобретения, заключающееся в том, что большинство доступных для растворителя остатков (радикалов) лизина протеиназы К расположены исключительно в области фермента, который находится сравнительно далеко от каталитического участка, делает использование аминохимически активных полимеров особенно желательным для этого конкретного фермента (см. одну из заявок совместного владения, находящихся одновременно на рассмотрении патентного ведомства на получение патента США № 10/183 607, поданную 28 июня 2002 г, содержание которой включено в настоящую работу путем ссылки на ее целостность). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения (например, в случае ферментов в которых каталитический домен содержит аминогруппы (аналогичные тем, что описаны выше) с которыми активированный полимер может вступать в реакцию) может оказаться предпочтительным прикрыть активный участок от контакта с активированным полимером. В таких случаях фермент может быть связан прочно, но обратимо, с аналогом субстрата или конкурентным ингибитором, достаточно большим, чтобы пространственно затруднить доступ активированного полимера к химически активным остаткам (радикалам), находящимся внутри или вблизи активного участка (см. например, Нари, Л. О. и др. (1991) 1 Рго1ет СНеш 70:385-389). И наоборот, такие аналоги или ингибиторы могут быть связаны с монолитной матрицей, к которой протеин может быть впоследствии адсорбирован. Будучи связанным с получающейся в результате родственной матрицей, протеин может вступать в реакцию с активированным полимером. Данный принцип может минимизировать присоединение химически активного полимера к участкам, где такое присоединение может препятствовать катализу. Селективно модифицированный протеин может быть впоследствии высвобожден из родственной матрицы с применением методов, известных квалифицированным в данной области специалистам (см. Вилчек, М. и др. (1984) Ме11юб5 Επζνιηοΐ 104:3-55). Получаемые конъюгаты могут включать в себя молекулы протеина, к которым протеин присоединяется избирательно, на участках, где он не мешает проявлению протеином биологической активности.
После реакции связывания в разной степени дериватизированные конъюгаты могут быть отделены друг от друга при помощи гель-хроматографии и/или ионообменной хроматографии, как описано у Шермана М.Р. и др. (1997) выше. Например, хроматография на колонке марки 8ирег6ех®75 НЕ 10/30 или колонке марки 8ирег6ех®200 НЕ 10/30 (АтеткГат РГаттааа Вю1ес1Г. Пискатавэй, штат НьюДжерси) позволяет осуществить отделение молекул протеина, которые оказались в разной степени ПЭГилированными, а также отделить их от остатка свободного ПЭГ, и от большинства побочных продуктов реакции связывания (одну из заявок совместного владения, находящихся одновременно на рассмотрении патентного ведомства на получение патента США № 10/183 607, выше).
Составы
Настоящее изобретение предоставляет устойчивые конъюгаты ПЭГилированных биоактивных компонентов с пониженными антигенными свойствами, полученные с применением методов настоящего изобретения. В соответствующих аспектах изобретение также предоставляет (химические) составы, включающие в себя один и или несколько конъюгатов. Составы, в соответствии с данным аспектом изобретения, будут включать в себя один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять, десять и т.д.) вышеописанных конъюгатов изобретения. В некоторых таких аспектах составы могут включать в себя один или несколько дополнительных компонентов, например, одну или несколько буферных солей, один или несколько хаотропных агентов, один или несколько детергентов, один или несколько протеинов (например, один или несколько ферментов), один или несколько полимеров и т. п. Составы данного аспекта изобретения могут быть в любом виде, в том числе в виде твердого вещества (например, сухой порошок), или в виде раствора (в частности, в виде биологически совместимого буферного солевого раствора, содержащего один или несколько конъюгатов настоящего изобретения).
Фармацевтические составы
Определенные составы настоящего изобретения специально разработаны для их использования в качестве лекарственных препаратов в профилактических, диагностических или терапевтических целях. В состав таких препаратов обычно входит один или несколько конъюгатов настоящего изобретения и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или сред для лекарства. Термин фармацевтически приемлемый носитель или среда для лекарства, использованный в целях настоящего изобретения, относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому заполнителю, разбавителю, герметизирующему материалу или вспомогательному средству препарата любого типа, которое переносится реципиентным животным, включая человека или другое млекопитающее, которому вводится лекарственный препарат, не вызывая нежелательных отрицательных последствий, вызванных его добавками.
Лекарственные препараты настоящего изобретения могут вводиться в организм реципиента любым приемлемым способом введения, например, перорально, ректально, парентерально, интрасистемно, ва
- 18 009122 гинально, в брюшную полость, местно (как присыпки, мази, капли или трансдермальный пластырь), трансбуккально, как оральный или назальный аэрозоль или путем ингаляции. Термин парентеральный, использованный в целях настоящего изобретения, относится к такому способу введения лекарственного препарата в организм, как внутривенная, внутримышечная, интраперитонеальная, интрацистернальная, подкожная и внутрисуставная инъекция и инфузия. Лекарственные препараты предоставляемые настоящим изобретением, для парентеральной инъекции могут содержать фармацевтически пригодные стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления (реконструкции) в стерильных инъецируемых растворах или дисперсиях непосредственно перед использованием. Примерами таких пригодных водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей служат вода, этиловый спирт, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), карбоксиметилцеллюлоза и соответствующие смеси из них, растительные масла (например, оливковое масло), и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Требуемое жидкое состояние препарата может поддерживаться, например, с помощью кроющих материалов, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае с дисперсиями, и применением сурфактантов (поверхностно-активных средств).
Такие лекарственные препараты настоящего изобретения могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие компоненты, эмульгирующие вещества и диспергирующие компоненты. Предупреждение воздействия мокроорганизмов может быть обеспечено путем включения различных антибактериальных и противогрибковых компонентов, например, парааминобензойной кислоты, бензилового спирта, хлорбутанола, окситримезиновой кислоты, сорбиновой кислоты и т. п. Также может оказаться желательным включение веществ, изменяющих осмотическое давление крови, таких как сахар, поваренная соль и т.п. Пролонгированное усвоение инъецируемого фармацевтического препарата может быть достигнуто путем включения компонентов, которые сдерживают усвоение, таких как моностеарат алюминия, гидрогели и желатин.
В некоторых случаях для того, чтобы продлить действие лекарственных препаратов, желательно замедлить абсорбцию от подкожного или внутримышечного введения. Этого можно добиться путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, слабо растворимого в водосодержащих жидкостях организма. Интенсивность абсорбции лекарственного препарата тогда зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от его физической формы. В качестве альтернативы, замедленная абсорбция парентально введенного лекарственного препарата, достигается путем растворения или суспендирования в масляном наполнителе.
Инъектируемые формы замедленного всасывания получаются путем образования микроинкапсулированных матриц лекарственного препарата в поддающихся биологическому разложению полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного препарата к полимеру-носителю и природы конкретного используемого полимера-носителя, скоростью высвобождения лекарственно препарата можно управлять. Прмерами других поддающихся биологическому разложению полимеров могут служить биологически совместимые полиортоэфиры и полиангидриды. Препараты замедленного всасывания также готовятся путем заключения лекарственного препарата в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма.
Инъецируемые лекарственные препараты могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через удерживающий микробы/бактерии фильтр, или путем включения стерилизующих веществ в формы стерильных твердых препаратов, которые перед применением могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или иной стерильной инъецируемой среде.
Твердые лекарственные формы для орального введения включают в себя капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активные соединения смешаны не менее чем с одним фармацевтически пригодным наполнителем или носителем, таким как натрий цитрат или дикальцийфосфат и/или а) заполнителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота; б) связывающими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза, и гуммиарабик; в) влагоудерживающими веществами, такими как глицерин; г) расщепляющими веществами, такими как агар-агар, кальций карбонат, картофельный крахмал или крахмал из кассавы, альгиновая кислота, некоторые соли кремниевой кислоты и натрий гидрокарбонат; д) веществами, сдерживающими полимеризацию растворов, такими как парафин; е) добавками, ускоряющими усвоение, такими как соединения четвертичного аммония; ж) увлажняющими средствами, такими как, например, цетиловый спирт и глицеролмоностеарат; з) адсорбирующими веществами, такими как каолин и бентонитовая глина; и и) скользящими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и смеси из них. В случае с капсулами, таблетками и пилюлями, лекарственная форма может также содержать буферные вещества.
Твердые составы сходного типа могут также применяться в качестве заполнителей в мягко- и твердозаполненых желатиновых капсулах, используя такие наполнители (среды) как лактоза (молочный сахар), а также ПЭГ с высоким молекулярным весом и т. п.
Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут изготавливаться с
- 19 009122 покрытиями и в оболочках, например, с тонкокишечными или временно-модулированными и другими видами покрытий, хорошо известных в фармацевтике. При необходимости они могут содержать опалесцирующие компоненты, и также иметь такой состав, который позволяет высвобождаться только, или предпочтительно, активным ингредиентам, в определенных участках желудочно-кишечного тракта, при необходимости, замедленным образом. Примерами заключающих составов, годными для применения, могут служить полимерные материалы и воски (парафины). Активные соединения также могут иметь микроинкапсулированную форму, если это целесообразно, с одним или несколькими инертными наполнителями, упомянутыми выше.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают в себя фармакологически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В добавление к активным соединениям, жидкие лекарственные формы могут содержать обычные применяемые в фармацевтике инертные разбавители, такие как, например, вода или прочие растворители, солюбилизирующие компоненты и эмульсирующие вещества, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, угольно-этиловый эфир, этиловый эфир уксусной кислоты, бензиловый спирт, бензиловый эфир бензойной кислоты, пропиленгликоль, 1,3бутиленгликоль, диметилформамид (ДМФА), масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложный эфир жирной кислоты сорбитана и смеси из них.
В дополнение к инертным разбавителям, пероральные составы могут также включать в себя адъюванты (вспомогательные лекарственные вещества), такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие вещества.
Суспензии, в добавление к активным соединениям, могут содержать суспендирующие средства, такие, например, как этоксилированные изостеариловый спирт, полиоксиэтилен сорбитол и сорбитан, сложные эфиры, микрокристаллическая целлюлоза, алюминий метагидроксид, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси из них.
Местное применение включает в себя нанесение лекарственного средства на кожу или слизистую оболочку, включая поверхности легких и глаз. Препараты для местного применения, включая препараты для ингаляции, могут быть приготовлены в виде сухого порошка, который может быть под давлением или без давления, в случае с порошковыми препаратами, не находящимися под давлением, активные ингредиенты в мелкораспыленной форме могут использоваться в смеси с фармацевтически пригодным инертным носителем большего размера, включающим в себя частицы, имеющие размер, в частности, до 100 микрон в диаметре. Подходящими инертными носителями являются сахара, такие как лактоза и сахароза. Желательно, чтобы не менее 95% (по весу) частиц активного ингредиента имели действительный размер частиц в пределах от 0,01 до 10 мкм.
В других случаях лекарственный препарат может находиться под давлением и содержать сжатый газ, такой как азот или сжиженный газ-вытеснитель (пропеллент). Средва сжиженного пропеллента и, безусловно, весь препарат целиком может быть предпочтительным, так как активные ингредиенты не растворяются в нем в значительной степени. Находящийся под давлением лекарственный препарат может также содержать поверхностно-активный агент. Поверхностно-активный агент может быть жидким или твердым неионогенным поверхностно-активным агентом, или может быть твердым анионогенным поверхностно-активным агентом. Предпочтительно использовать твердый анионогенный поверхностноактивный агент в форме хлористого натрия.
Еще одной формой местного применения является введение препарата через глаз. При данном способе введения конъюгаты или составы настоящего изобретения доставляются в фармацевтически приемлемой офтальмической среде так, чтобы активные соединения находились в контакте с глазной поверхностью в течение продолжительного периода времени, достаточного для проникновения этих соединений в конъюнктиву, корнеальные или внутренние области глаза, например, переднюю камеру глаза, заднюю камеру, стекловидное тело, внутриглазную жидкость, стекловидное тело, роговицу, радужную оболочку/цилиарное тело, хрусталики, сосудистую оболочку/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемой офтальмической средой может быть, например, мазь, растительное масло или обволакивающий материал.
Предпочтительными препаратами для ректального или вагинального введения являются суппозитории (свечи), которые могут быть приготовлены путем смешивания конъюгатов или составов настоящего изобретения с соответствующими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как кокосовое масло, ПЭГ или парафин для суппозиториев, остающимися твердыми при комнатной температуре, но превращающимися в жидкость при температуре тела, растаивая в ректальной или вагинальной полости и высвобождая лекарственные препараты.
Лекарственные препараты, используемые в настоящих терапевтических методах, могут также вводиться в форме липосом, т. е. растворимых жировых капсул. Как известно, лимпосомы обычно получают из фосфолипидов или иных липидных материалов. Липосомы образуются моно- или мультиламеллярными гидратированными жидкими кристаллами, которые диспергируются в водной среде. Может быть использован любой нетоксичный физиологически приемлемый и преобразующийся в ходе обмена веществ липид, способный образовывать липосомы. В дополнение к одному или нескольким конъюгатам
- 20 009122 или составам настоящего изобретения, настоящие лекарственные препараты в липосомной форме могут также содержать один или несколько стабилизирующих веществ, консервантов, наполнителей и т. п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидил холины (лецитины), как натуральные, так и синтетические. Способы формирования липосом известны (см. например, Залипски, С. и др., патент США № 5395619). Липосомы, содержащие фосфолипиды, конъюгированные с ПЭГ, чаще всего фосфатидил этаноламин, присоединенный к мПЭГ, обладают полезными свойствами, включая увеличенную продолжительность жизни в кровотоке млекопитающих (Фишер, Д., патент США № 6132763). Еще более предпочтительно, если гидроксиПЭГ настоящего изобретения может быть заменен мПЭГ в образовании таких ПЭГ-липосом. Самым предпочтительным является замена монофункционально активированных гидроксиПЭГ настоящего изобретения на активированные мПЭГ в синтезе ПЭГдиацилглицерина, который вводится в состав ПЭГ-липосом.
Режимы дозирования
Конъюгаты или препараты настоящего изобретения могут вводиться в искусственных условиях, вне живого организма или в естественных условиях, в клетки для усиления клеточной ответной реакции на активные составы. Обычный квалифицированный специалист знает, что действенные объемы конкретного активного состава, конъюгата или препарата можно определить эмпирическим путем; их можно использовать в чистом виде, или если таковые формы существуют, то в виде фармацевтически приемлемых рецептур или в форме пролекарства (лекарственной форме). Составы, конъюгаты или препараты настоящего изобретения могут вводиться в организм больного животного или человека, если в них существует необходимость, в виде ветеринарных или фармацевтических препаратов в сочетании с одним или несколькими фармацевтически пригодными наполнителями. Понятно, что в случае применения этих препаратов в отношении больного человека, общее дневное, недельное или месячное потребление составов и препаратов настоящего изобретения будет решаться лечащим врачом, в рамках обоснованного медицинского заключения. Терапевтически эффективный уровень дозирования для какого-либо конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая тип и степень клеточной реакции, которая должна быть достигнута; идентичность и/или активность отдельных применяемых составов, конъюгатов или препаратов; возраста, веса тела или площади поверхности тела, общего состояния здоровья, пола, уровня питания и активности пациента; времени введения, способа введения и скорости выведения активных компонентов; продолжительности лечения; других попутно принимаемых лекарств или случайно принятых вместе с составами, конъюгатами или препаратами; и т. п. факторами, которые хорошо известны квалифицированным специалистам в области фармацевтики и медицины. Например, хорошей практикой считается начинать с доз составов, конъюгатов или препаратов настоящего изобретения, меньших, чем требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, а затем постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока желаемый терапевтический эффект не будет достигнут.
Режимы дозирования могут также определяться с учетом специфики каждого отдельного пациента, чтобы обеспечить предустановленную концентрацию данного активного состава в крови, в соответствии с принятыми обычными методиками, например, на основе эксклюзионной, ионообменной или обращенофазовой хроматографии (ВЭЖХ). Отсюда режим дозирования пациенту можно корректировать для достижения относительно постоянного уровня содержания препарата в крови, согласно данным ВЭЖХ, в соответствии с повседневными методами известными персоналу, квалифицированному в медицинской, фармацевтической и/или фармакологической областях знаний.
Использование в диагностических и терапевтических целях
В диагностических целях конъюгат настоящего изобретения может быть использован для определения местонахождения антигенного участка, например, злокачественной опухоли в теле животного, особенно в теле человека, путем введения в организм полимер-конъюгированного антитела настоящего изобретения, в котором конъюгат помечен либо на протеиновом, либо на полимерном компоненте для его обнаружения, например, оптическим, радиометрическим, флуоресцентным или резонантным способом, как это описывается ниже.
Ожидается, что ПАГ-биоактивные сложные конъюгаты (предпочтительно вводимые в качестве препаратов, содержащих такие конъюгаты) настоящего изобретения будут иметь более длительный срок полужизни в кровотоке и обладать пониженными антигенными и иммуногенными свойствами в живом организме. Эти свойства облегчают или улучшают быстрое очищение из кровотока, которое наблюдается, когда большое количество терапевтических препаратов (в частности, биологически активных соединений, таких как те, что используются в качестве компонентов настоящего изобретения) вводится в организм животного, в частности человека или другого млекопитающего, в терапевтических целях. Использование конъюгатов и препаратов настоящего изобретения также уменьшает или избавляет от необходимости повторного введения конкретного биологически активного соединение или компонента, которое в противном случае может вызвать иммунную реакцию у пациента. Иммунные реакции, которые имеются в виду, это те, что нейтрализуют биологическую активность и/или увеличивают скорость выведения биологически активного соединения из кровотока (тем самым, снижая эффективность диагностической или терапевтической процедуры), и те, что оказывают неблагоприятные воздействия на пациента.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения конъюгаты и составы настоящего изо
- 21 009122 бретения могут быть использованы в диагностических или терапевтических методах, например, для диагностики, лечения или предупреждения различных физических нарушений у животных, в частности у млекопитающих, включая человека, предрасположенных к такому нарушению. В таких подходах целью терапии ставится сдерживание или предупреждение развития нарушения, и/или лечение или вызывание симптомов временного исчезновения нарушения, и/или снижение или минимизация побочных эффектов других схем лечения. Отсюда, конъюгаты ПАГ-биоактивного компонента и составы настоящего изобретения могут быть использованы для защиты, подавления или лечения физических нарушений, таких как инфекции или болезни. Термин защита от физического нарушения, использованный в целях настоящего изобретения, охватывает предупреждение, подавление и лечение. Предупреждение включает в себя прием (введение) внутрь конъюгата или состава настоящего изобретения до наступления заболевания или физического нарушения, в то время как подавление включает в себя введение конъюгата или состава до клинического проявления заболевания; отсюда следует, что предупреждение и подавление физического нарушения обычно предпринимается в отношении животного, предрасположенного или подверженного нарушению, но еще не страдающего им. Лечение физического нарушения, однако, включает в себя введение терапевтического конъюгата или состава после проявления заболевания. Следует понимать, что в медицине и ветеринарии не всегда представляется возможным сделать различие между предупреждением и подавлением физического нарушения. Во многих случаях конечное индуктивное событие или события могут быть неизвестны или скрыты, и ни пациент, ни врач могут долгое время не знать об индуктивном событии после его возникновения. По этой причине все стали пользоваться термином профилактика, в отличие от лечения, чтобы охватить оба понятия предупреждение и подавление как здесь определено. Термин защита, используемый в соответствии с методами настоящего изобретения, по этим же соображениям включает в себя профилактику.
Методы согласно этому аспекту настоящего изобретения могут включать в себя одну или несколько стадий, которые позволяют врачу-клиницисту достичь вышеописанных терапевтических целей. Один такой метод настоящего изобретения может включать в себя, например:
(а) выявление животного (предпочтительно млекопитающего, такого как человек), страдающего или предрасположенного к физическому нарушению; и (б) введение в организм животного действенного количества одного или нескольких составов или препаратов настоящего изобретения как описано здесь, в частности, одного или нескольких ПАГ конъюгатов биологически активного компонента (или одного или нескольких лекарственных препаратов, содержащих такие конъюгаты), таким образом, чтобы введение составов или препаратов предупреждало, тормозило или диагностировало развитие, или излечивало или вызывало временное ослабление физического нарушения у животного.
Употребляемое в настоящей работе выражение, что животное предрасположено к физичекому нарушению, определяет такое животное, которое не проявляет совокупности выраженных физических симптомов нарушения, но генетически, физиологически или иным образом подвержено риску развития этого нарушения. В настоящих методах выявление животного (такого как млекопитающее, включая человека), которое предрасположено, подвержено риску или страдает от данного физического нарушения, может быть осуществлено в соответствии со стандартными хорошо известными методами, с которыми знаком обычный квалифицированный врач-клиницист. Такими методами могут быть, например, рентгенологический анализ, биохимический анализ (например, анализ соответствующих уровней конкретных пептидов, протеинов, электролитов и т.д., в препарате (образце), взятом у животного), хирургические методы, изучение генома пациента, семейный анамнез, соматическая пальпация, пробы на патологию или гистологические тесты (например, микроскопическая оценка препаратов или мазков ткани или телесной жидкости, иммунологический пробирный анализ и т.д.), анализ телесных жидкостей (например, крови, сыворотки, плазмы, спинномозговой жидкости, мочи, слюны, семенной жидкости и т.п.), получение изображений (например, рентгенологических, флуоресцентных, оптических, резонантных (например, с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)) и т.д. После выявления животного одним или несколькими перечисленными способами, такое животное может быть подвержено интенсивной и/или упреждающей терапии для предупреждения, подавления, замедления или излечения физического нарушения.
Физические нарушения, которые могут предупреждаться, диагностироваться или лечится конъюгатами, составами и методами настоящего изобретения, включают в себя любые физические нарушения, для которых биологически активный компонент конъюгата может быть использован в целях предупреждения, диагностики или лечения.
Такие нарушения, кроме прочих включают в себя различные виды злокачественных опухолей (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак яичка, лейкоз, лимфоматоз, рак легких, неврологические злокачественные новообразования, рак кожи, рак головы и шеи, рак кости, рак толстой кишки и другие виды гастроинтестинальных злокачественных опухолей, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки и другие карциномы, саркомы, аденомы и миеломы); инфекционные болезни (например, бактериоз, микоз, вирусные заболевания (включая гепатит и ВИЧ/СПИД), инвазионные болезни и т.п.); наследственные нарушения (например, фиброзно-кистозная
- 22 009122 дегенерация, боковой амиотрофический склероз, мышечная дистрофия, синдром Гоше, болезнь Помпе, тяжелое комбинированное иммунодефицитное нарушение и т.п.), анемия, нейтропения, гемофилия и другие нарушения крови; неврологические нарушения (например, рассеянный склероз и болезнь Альцгеймера); энзиматические нарушения (например, подагра, уремия, гиперхолестеринемия и т.п.); нарушения неизвестного происхождения (например, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензия и т.п.); и другие нарушения, имеющие медицинское значение, хорошо известные квалифицированным специалистам из числа младшего персонала. Составы и способы настоящего изобретения могут быть также использованы для предупреждения развития болезни, например в химическом предупреждении превращения предракового патологического изменения в злокачественное патологическое изменение.
Терапевтические методы настоящего изобретения, таким образом, используют один или несколько конъюгатов настоящего изобретения, или один или несколько лекарственных препаратов настоящего изобретения, которые в случае необходимости могут быть введены в организм животного различными способами, включая пероральное, ректальное, парентеральное введение (в том числе, внутривенные, внутримышечные, внутрибрюшные, интрацистернальные, подкожные и внутрисуставные инъекции и инфузии), вагинальное, внутрибрюшное, местное введение (порошки, мази, капли или трансдермальный пластырь), трансбуккальное введение, с помощью оральных и назальных аэрозолей или ингаляций. Согласно изобретению, действенное количество конъюгатов или составов может быть введено (в лабораторных условиях, вне живого организма или в живом организме) в клетки или животным, страдающим от, или предрасположенным к определенному нарушению, таким образом, способствуя предупреждению, замедлению, диагностике или лечению нарушения у животного. Употребленный в целях настоящего изобретения термин действенное количество конъюгата (или состава) относится к такому количеству, при котором конъюгат проявляет биологическую активность биоактивного компонента конъюгата, таким образом способствуя предупреждению, замедлению, диагностике или лечению или исцелению нарушения у животного, которому вводился конъюгат настоящего изобретения. Обычному квалифицированному специалисту ясно, что действенные количества конъюгатов или составов настоящего изобретения могут быть определены эмпирическим путем, в соответствии со стандартными методами, хорошо известными квалифицированным специалистам в области фармацевтики и медицины; см. например, Биэрз, М.Х. и др., изд-я. (1999) Мегск Мапиа1 оГ Ωίαβηοδίδ & Тйегару, издание 17-е , «Мегск аиб Со.», Рахвэй, штат Нью-Джерси; Хардман, Дж.Г. и др. изд-я (2001) «Сообщай аиб Ойтаи'з» Тйе Рйагтасо1од1са1 Ваз15 оГ Тйегареибсз, издание 10-е, «МсСга\\-НП1 РгоГе88Юиа1 РиЫЕЫид», Элмсфорд, штат Нью-Йорк; Спейт, Т.М., и др., изд-я (1997) Ауегу'з Эгид Тгеа1теп1: Ргтар1е5 аиб Ргасбсе оГ С11шса1 Рйагтасо1оду аиб Тйегареибсз, издание 4-е, «В1аск\ге11 8с1еисе, 1ис.», Бостон; Кацунг, Б.Г. (2000) Вашс аиб С11шса1 Рйагтасо1оду, издание 8-е, «Арр1е1ои аиб Ьаиде», Норуолк, штат Коннектикут; ссылки из этих работ и ссылки, цитированные в настоящем изобретении, полностью включены в настоящую работу путем ссылки.
Понятно, что в случае применения этих препаратов в отношении больного человека, общее дневное, недельное или месячное потребление конъюгатов и составов настоящего изобретения будет решаться лечащим врачом, в рамках обоснованного медицинского заключения. Например, положительные результаты достигаются путем введения в организм определенных видов конъюгатов или составов настоящего изобретения соответствующими дозами, в зависимости от того, какое именно биологически активное соединение используется, дозировка которого хорошо известна квалифицированному специалисту из числа младшего персонала, дозировка которого может быть легко определена эмпирическим путем, с проведением единственного типового эксперимента. Согласно этому аспекту настоящего изобретения, конъюгаты и составы могут вводиться единовременно или, разделенными дозами, например, дважды в день, или в неделю, или в месяц. Надлежащие режимы дозировки для различных способов введения (например, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутриглазного, интраназального и т.д.) могут быть также легко определены эмпирическим путем, с проведением единственного типового эксперимента, или быть хорошо известными квалифицированному специалисту из числа младшего персонала, в зависимости от индивидуальности биологически активного компонента.
В дополнительных представлениях конъюгаты и составы настоящего изобретения могут быть использованы для того, чтобы специально нацелить диагностический или терапевтический агент на клетку, ткань, орган или организм, который выражает рецептор, связывает, соединяет или каким-либо иным способом может принять биологически активный компонент конъюгата. Методы, согласно этому аспекту настоящего изобретения могут включать в себя, например, приведение в соприкосновение клетки, ткани, органа или организма с одним или несколькими конъюгатами настоящего изобретения, которые, в свою очередь, дополнительно содержат один или несколько диагностических или терапевтических агентов (предпочтительно ковалентно связанных с компонентом ПАО или ПЭГ конъюгата), таким образом, чтобы конъюгат принимался клеткой, тканью, органом или организмом по какому-либо механизму действия (например, опосредованным рецепторами эндоцитозом, пиноцитозом, фагоцитозом, диализом и т. д.), посредством этого доставляя диагностический или терапевтический агент в клетку, ткань орган или организм. Диагностический или терапевтический агент, использованный в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения может быть, кроме прочих, не менее чем одним агентом, отобранным из нуклеиновой кислоты, органического соединения, протеина, антитела, фермента, гликопротеина, липопро
- 23 009122 теина, элемента, липида, сахарида, изотипической детерминанты, карбогидрата, радиофармацевтического препарата, обнаруживаемого зонда или из их комбинаций, который также может быть помечен, как описывается в настоящем изобретении. Терапевтический агент, используемый в данном аспекте настоящего изобретения может иметь терапевтическое воздействие на целевую клетку (или ткань, орган или организм). При этом виды терапевтического воздействия включают в себя среди прочего исправление дефектного гена или протеина (белка), действие лекарственного средства, токсическое действие, стимуляцию роста, подавление роста, метаболическое действие, катаболическое поражение, анабилическое действие, антивирусной действие, противогрибковое действие, антибактериальное действие, гормональное действие, нейрогуморальное действие, стимуляцию клеточной дифференцировки, сдерживание клеточной дифференцировки, нейромодуляторное действие, антибластомное действие, противоопухолевое действие, действие, стимулирующее или подавляющее выработку инсулина, стимуляция роста костного мозга, стимуляция полипотентных стволовых клеток, стимуляция иммунной системы и любые другие известные виды терапевтического воздействия, которые могут быть обеспечены терапевтическим средством, доставляемым в клетку (или ткань, орган или организм) через систему доставки, согласно данному аспекту настоящего изобретения.
Такие дополнительные лечебные (терапевтические) агенты, которые в дальнейшем могут включать в себя биоактивный конъюгат или состав настоящего изобретения, могут быть выбраны, в том числе, из известных и новых составов и соединений, включая антибиотики, стероиды, цитотоксические средства, вазоактивные лекарственные препараты, антитела и другие терапевтические средства. Неограничивающие примеры таких средств (агентов) влючают в себя антибиотики и другие лекарственные препараты, используемые при лечении бактериального шока, такие как гентамицин, тобрамицин, нафциллин, парентеральный цефалоспорин и т.д.; адреналиновые кортикостероиды и их аналоги, такие как дексаметазон, который смягчает повреждение клеток, вызванное эндотоксинами; вазоактивные лекарственные препараты, такие как блокирующий агент альфа-адренергического рецептора (например, феноксибензамин), агонист бета-адренергического рецептора (например, изопротеренол) и дофамин. Конъюгаты и составы настоящего изобретения также могут быть использованы для диагностики заболевания и наблюдения за ответной реакцией на проводимое лечение. В некоторых таких методах конъюгаты настоящего изобретения могут включать в себя одну или несколько обнаружимых меток (таких, какие описаны в настоящем изобретении). В конкретных методах эти помеченные конъюгаты настоящего изобретения могут быть использованы для обнаружения клеток, тканей, органов или организмов, выражающих рецепторы, или иным способом принимающих биоактивный компонент конъюгатов. В одном примере такого метода клетка, ткань, орган или организм, приведены в контакт с одним или несколькими обнаружимо помеченными конъюгатами настоящего изобретения в условиях, которые способствуют усвоению конъюгата клеткой, тканью или организмом (например, путем присоединения конъюгата к рецептору клеточной поверхности, или путем пиноцитоза или диализа конъюгата в клетку), а затем обнаруживая присоединенный или вошедший в клетку конъюгат, с помощью средств обнаружения, характерных для использованной метки (например, флюоресцентное обнаружение для флюоресцентно помеченных конъюгатов; магнитно-резонансная томография для магнитно помеченных конъюгатов; радиовизуализация для конъюгатов, помеченных радиоизотопными метками; и т. д.). Другие применения таких обнаруживаемо помеченных конъюгатов могут включать в себя, например, получение изображения клетки, ткани, органа или организма, или внутреннего строения животного (включая человеческий организм), путем введения действенного количества помеченной формы одного или нескольких конъюгатов настоящего изобретения, и измерением обнаружимого ионизирующего излучения, связанного с клеткой, тканью, органом или организмом (или животным). Методы обнаружения различных видов меток и их использования в диагностической и терапевтической визуализации хорошо известны обычным квалифицированным специалистам из числа младшего персонала, и их описание приводится в настоящей работе.
В другом аспекте конъюгаты и составы настоящего изобретения могут быть использованы в методах для модулирования концентрации или активности конкретного рецептора биоактивного компонента конъюгата на поверхности клетки, которая выражает такой рецептор. Термин модулирование активности конкретного рецептора означает, что конъюгат после присоединения к рецептору либо активирует, либо подавляет физиологическую активность (например, внутриклеточный сигнальный каскад), опосредованную через этот рецептор. Не намериваясь объяснять конкретную механику регуляторной активности конъюгатов настоящего изобретения, скажем только, что конъюгаты могут противодействовать физиологической активности клеточного рецептора, присоединяясь к этому рецептору через биоактивный компонент конъюгата, и тем самым, блокируя присоединение натурального агониста (например, неконъюгированный биоактивный компонент), и предупреждая активацию рецептора натуральным агонистом, в то же время не включая существенной активации физиологической активности самого рецептора. Методы, согласно этому аспекту настоящего изобретения, могут включать в себя один или несколько этапов, например, контактирование клетки (что может быть проделано в лабораторных условиях или в живом организме) одним или несколькими конъюгатами настоящего изобретения, при таких условиях, при которых конъюгат (т.е. биологически активная часть конъюгата) присоединяется к рецептору биоактивного компонента на поверхности клетки, но не активирует, существенно, рецептор. Такие методы
- 24 009122 могут оказаться полезными во многих диагностических и терапевтических применениях, известных обычному квалифицированному специалисту из числа младшего персонала.
Комплекты
Изобретение также предоставляет комплекты, включающие в себя конъюгаты и/или составы настоящего изобретения, такие комплекты обычно состоят из средства переноски, такого как ящик, картонная коробка, футляр и т.п., внутри которого плотно уложены один или несколько контейнеров, таких как пробирки, трубки, ампулы, колбы и т.п., причем первый контейнер содержит один или несколько конъюгатов и/или составов настоящего изобретения. Комплекты, охваченные данным аспектом настоящего изобретения, могут далее включать в себя один или несколько дополнительных компонентов (например, реагенты и соединения), необходимых для осуществления одного или нескольких практических применений конъюгатов и составов настоящего изобретения, то есть один или несколько компонентов, используемых для диагностики, лечения или предупреждения конкретного заболевания или физического нарушения (например, один или несколько дополнительных терапевтических соединений или составов, один или несколько диагностических реагентов, один или несколько носителей или инертных наполнителей и т. п.), один или несколько дополнительных конъюгатов или составов настоящего изобретения и т.п. Любому квалифицированному специалисту в соответствующих областях понятно, что прочие уместные модификации и адаптации к методам и практическим применениям, описанным в настоящей работе, могут быть сделаны, не выходя из рамок настоящего изобретения или какого-либо варианта его осуществления. После того, как мы подробно описали настоящее изобретение, для лучшего понимания проиллюстрируем его следующими примерами, которые включены в настоящую работу сцелью пояснения, и никоим образом не ограничивают рамки НтШид настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Подготовка и проверка антител к монометоксиПЭГ.
Ранее было заявлено, что кролики могут быть иммунизированы к различным ПЭГ путем иммунизации животных конъюгатами, в которых ПЭГ был (попарно) соединен с протеином-иммуногенным носителем (Рихтер, А.В. и др. (1983) Ιηΐ. Агсй. А11егду. Арр1. 1ттипо1. 70:124-131). Моноклональное антитело, которое вступает в реакцию с полиэфирным остовом ПЭГ было выведено путем инъецирования мышей мПЭГ конъюгатом β-глюкуронидазы и селекцией клонов гибридома, вырабатывающих антитела к ПЭГ (Ченг, Т-Л. и др. (1999), выше.; Ченг, Т.-Л. и др. (2000), выше; Цай, Н.-М., и др. (2001), выше.; Роффлер, С. и др., опубликованная заявка на патент США № 2001/0028881 А1 и патенты США № 6596849 и 6617 118; раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки на их целостность). Другое моноклональное антитело, которое вступает в реакцию с полиэфирным остовом ПЭГ было открыто недавно Робертсом, М. Дж. и др., в заявке на патент США № 2003/001704 А1.
Для того, чтобы развить чувствительные методы для обнаружения ПЭГ в ПЭГ-протеиновых конъюгатах, были приготовлены поликлональные антитела против ПЭГ так, как описано ниже. Исходя из того, что практически все ПЭГ-конъюгаты терапевтических протеинов, описанные с данной области знаний, были синтезированы с мПЭГ, авторы настоящего изобретения исследовали роль метоксильной группы в иммунологической реактивности конъюгатов, содержащих мПЭГ. П-нитрофенилкарбонат производная от 10 кДа мПЭГ была синтезирована на заказ корпорацией «8йеагоа!ег Согрогайоп» (Хантсвилл, штат Алабама), дочерним предприятием «№к!аг Тйегареийсз» (Сан-Карлос, штат Калифорния). Уретансвязанный мПЭГ конъюгат рекомбинантного гена уриказы млекопитающих был приготовлен таким образом, чтобы содержать минимальное количество нитей этого 10 кило-дальтон мПЭГ, необходимого для повышения растворимости протеина при физиологическом нормальном показателе рН (приблизительно две нити ПЭГ или мПЭГ на 35-килодальтон подгруппу уриказы). Данное количество ПЭГ было недостаточным для подавления необычайно высокой иммуногенности уриказы (см. Шерман, М.Р. и др., публикация РСТ АО 01/59078 А2, и Келли С. Дж. и др. (2001) выше, раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки на их целостность). Этот ПЭГ-уриказный препарат был неоднократно введен трем кроликам в адъювант Фрейнда, затем у кроликов отбирали кровь для приготовления иммунной сыворотки, содержащей поликлональные антитела против уриказы, конъюгатов ПЭГуриказы и ПЭГ.
Каждому кролику вводился ПЭГ-уриказный препарат один раз в полный адъювант Фрейнда, и пять раз с интервалами от одной до четырех недель в неполный адъювант Фрейнда. Кровь отбиралась для анализа приблизительно через две недели после каждой из трех последних инъекций. Сыворотка крови готовилась из каждой из девяти проб крови, и небольшие количества сыворотки проверялись на содержание антител против ПЭГ, путем проведения иммуноферментного твердофазного анализа (ЭЛИЗА), с использованием аналитического планшета с 96 лунками, покрытых мПЭГ конъюгатами протеина, не являющимися структурно родственными уриказе.
Каждое пробное кровоизвлечение давало иммунную сыворотку, которая вступала в реакцию с ПЭГ при проведении анализа ЭЛИЗА. Каждый из трех кроликов реагировал на иммунизацию полиэтиленгликолем с качественно одинаковой кинетикой и с одинаковой специфичностью для метоксильной концевой группы мПЭГ, как было установлено в ходе конкурентного анализа ЭЛИЗА. Вначале, анализ методом гибридизации макромолекул путем диффузии через точечные отверстия в матрице был проведен для
- 25 009122 определения чувствительности анти-ПЭГ антител в сыворотках крови кроликов. Растворы ПЭГ различного размера и структур и раствор ПЭГ-уриказы, который использовался для иммунизации кроликов, были точечно нанесены: на поливинилиден дифторид блоттинг-мембрану («1пукгодеп», Карлсбад, штат Калифорния; каталог № Ь82002). После блокировки мембраны 2% раствором (отношение веса к объему) порошка обезжиренного сухого молока, мембрана была выдержана с разбавленным раствором кроличьей антисыворотки к ПЭГ-уриказе, которая была приготовлена, как описывалось выше. Затем разбавленный раствор противокроличьих антител иммуноглобулина Г, полученный от коз и (попарно) присоединенный к щелочной фосфатазе («Са1Ыосйет», Сан-Диего, штат Калифорния; каталог № 401371), был применен в качестве второстепенного антитела. Активность щелочной фосфатазы на пятне была обнаружена с помощью комбинации 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата и нитросиний тетразолия («8|§та». каталог № В-1911), как описано ранее (Блейк, М.С., и др. (1984) Апа1 Вюсйет 136:175-190, раскрытие предметов этих изобретений вошло в настоящий документ путем ссылки на их целостность). С высокой степенью чувствительности и конкретности, кроличьи анти-ПЭГ антитела обнаружили проверяемые (испытуемые) ПЭГ растворы и конъюгат мПЭГ протеина.
Пример 2. Демонстрация роли метоксильной группы в антигенности мПЭГ.
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что анти-ПЭГ антитела, приготовленные как указано в примере 1 были направлены преимущественно против метоксильной концевой группы мПЭГ компонента антигена. На фиг. 1 изображены результаты анализа ЭЛИЗА, в котором 96луночные планшеты были покрыты мПЭГ конъюгатом протеина тРЕС, который структурно не родственен уриказе. После блокирования планшета 2% козьей сывороткой крови, растворы возрастающей концентрации 4,8 кило-дальтон мПЭГ (Ро1утег ЬаЬогаЮпек, каталог № 6570-5010), 10 кило-дальтон мПЭГ (Ишоп СагЫбе, каталог № МРЕС-10,000) или 10 кило-дальтон трет-бутоксиПЭГ (Ро1утег ЬаЬогаЮпек, каталог 29999997), были добавлены и культивированы со слабым раствором 1:1 000 кроличьей антисыворотки, выработанной против конъюгата мПЭГ-уриказы. После удаления раствора объем антиПЭГ антитела, связанного с конъюгатом мПЭГ-протеина на планшете был замерен спектрофотометрически, с использованием пероксидаза-конъюгированным вторичным антителом (козий противокроличий ИгГ, Са1Ьюсйет®, Сан-Диего, штат Калифорния; каталог № 401393), после чего был добавлен субстрат пероксидазы, о-фенилендиамин дихлоргидрат (81дта, Сент-Луис, штат Миссури; каталог № Р9781). Для каждого препарата, начальная скорость реакции (в милли-единицах поглощения в минуту), наблюдаемая в отсутствии конкурента была определена как 100%. Наложение кривых двух растворов мПЭГ наводит на мысль, что длина остова ПЭГ не является доминирующий решающим фактором его антигенности. Кривая для трет-бутокси ПЭГ смещена вправо приблизительно на 2 логарифмические единицы, указывая на то, что трет-бутоксиПЭГ имеет приблизительно в 100 раз меньшее аффинное подобие, чем мПЭГ для антител, вырабатываемых против конъюгата мПЭГ-протеина. В предыдущих неопубликованных экспериментах, проведенных авторами настоящего изобретения, тем не менее, было обнаружено, что трет-бутоксиПЭГ проявляет значительную иммуногенность при конъюгировании (соединении) с иммуногенным протеином. Таким образом, в то время как фиг. 1 демонстрирует очень малую перекрестную реактивность трет-бутоксиПЭГ с антителами, выращенными против мПЭГ, использование трет-бутоксиПЭГ вместо мПЭГ в производстве ПЭГилированных терапевтических протеинов не решает проблемы иммуногенности компонента ПЭГ. Результаты, показанные на фиг. 1, наводят на мысль, что метоксильная группа на мПЭГ является предоминантной антигенной группой на молекуле полимера. Для подтверждения данного предположения антитела, образованные как описано в примере 1, были подвержены конкурентному анализу ЭЛИЗА, проведенному, как описано для фиг. 1, с использованием ПЭГ различных размеров и структур, содержащих одну или две метоксильные группы. На фиг. 2а показаны результаты фиксации (связывания) антител, вычерченные в виде функции молярной концентрации метоксильной группы в каждом препарате. Концентрация конкурента, выражающаяся в 50% ингибировании фиксации (1С50) была рассчитана с помощью уравнения для сигмоидальной кривой с 5-ю параметрами и программы 81дтаР1о1®, (8Р88 8с1епсе, Чигаго, штат Иллинойс).
Как показано на фиг. 2а, следующие ПЭГ были все одинаково антигенны на молярной основе: линейные ПЭГ с одной метоксильной группой (10 кДа мПЭГ), полученные гидролизом мПЭГ-ЛРС (РЕС-8йор), и моно-20 кДа мПЭГ-лизин, синтезированный путем (попарного) присоединения лизина к 20 кДа ЫРС-РЕС (8йеагоа1ег, каталог № М-ЛРС-20,000); линейный ПЭГ с двумя метоксильными группами (Бис-(2 кДа) мПЭГ (81дта-А1бпсй, каталог № 81314)), и большой разветвленный ПЭГ, содержащий две метоксильные группы (Ди-(20 кДа) мПЭГ-лизин (8йеагоа1ег, каталог № РЕС2-ЛН840К)). И наоборот, кривая для разветвленного ПЭГ меньшего размера с двумя метоксильными группами (Ди-(5 кДа) мПЭГ-лизин (8йеагоа1ег, каталог № 2Ζ3Χ0Ε01)) оказалась смещенной влево от усредненных результатов для других препаратов на 0,5-0,6 логарифмических единиц, указывая на то, что данная форма разветвленного мПЭГ в три-четыре раза более антигенна, чем другие препараты, испытанные в ходе данного эксперимента. На фиг. 2б отображены данные фиг. 2а как функция весовой концентрации мПЭГ (микрограмм/мл), вместо молярной концентрации метоксильных групп, выступая в поддержку заключения, что именно метоксильная группа имеет решающее значение для взаимодействия
- 26 009122 мПЭГ с анти-мПЭГ антителами. На фиг. 3 отображена подгруппа данных, содержащихся на фиг. 1, 2а и 2б, в формате, демонстрирующем прямую зависимость антигенных свойств от количества метоксильных групп на молекулу ПЭГ. Эти препараты представляют 10 кДа ПЭГ без метоксильной группы (10 кДа трет-бутоксиПЭГ), с одной метоксильной группой ( 10 кДа мПЭГ), или с двумя метоксильными группами (Ди-(5 кДа) мПЭГ-лизин). Полученные результаты указывают на то, что антигенные свойства этого полимера, а отсюда и конъюгата настоящего изобретения, полученного с этим полимером, находятся в прямой зависимости от количества метоксильных групп, содержащихся на молекуле ПЭГ полимера. Чем больше количество метоксильных групп, тем выше подобие полимера по отношению к антителам, выращенным против мПЭГ-протеин конъюгата.
Взятые вместе эти результаты указывают на то, что полное ингибирование присоединения кроличьих антител к мПЭГ конъюгату может быть достигнуто путем конкуренции с растворами из ПЭГ и особенно из мПЭГ. Более того, возможность растворов их мПЭГ блокировать присоединение кроличьих анти-ПЭГ антител к мПЭГ конъюгатам неродственного протеина взаимосвязано с содержанием в них метоксильных групп. На основании концентрации по весу мПЭГ более низкого молекулярного веса, оказались более сильными конкурентами, чем мПЭГ с более высоким молекулярным весом, как это показано на фиг. 2б. Данное заключение согласуется с тем фактом, что отношение массы метоксильных групп к общей массе полимера снижается по мере увеличения молекулярного веса полимера. Среди испытанных ПЭГ самыми сильными антигенами (на молярной основе) оказались разветвленные ПЭГ, содержащие две метоксильные группы, которые еще иногда называются зонтичными или И-образными ПЭГ (Мартинес, А. и др., патент США № 5 643 575) или Υ-образные ПЭГ (Гринвальд, Р.Б., и др., опубликованная заявка на патент США № 20027 0052443 А1).
Пример 3. Испытание анти-ПЭГ антител полиэтиленгликолями, не содержащими метоксильных групп.
Термин РНагтаРЕС, употребляется в данной работе для обозначения линейных или разветвленных ПЭГ, у которых отсутствует антигенная группа на конце или концах, удаленных от активированных концов, или концов, которые могут быть активированы. Из предыдущих примеров можно сделать заключение, что антигенные свойства полимера, а отсюда и полимерного конъюгата биоактивного агента, являются функцией содержания метоксильной группы в полимере. Для дальнейшего подтверждения этого заключения, были проведены анализы ЭЛИЗА, как описано для фиг. 1, сравнивающие возможности мПЭГ (4,8 кДа мПЭГ) и 12, 20 и 35 кДа РйагтаРЕС, у которых отсутствуют метоксильные группы или иные алкоксильные группы на концах линейных полимеров, к которым присоединяются анти-мПЭГ антитела. Результаты этих анализов приведены на фиг. 4. Смещение трех РйагтаРЕС кривых по отношению к кривой мПЭГ, изображенное на фиг. 4, указывает на то, что антигенность РйагтаРЕС приблизительно в 100 раз ниже, чем антигенность мПЭГ, при проведении количественного анализа с анти-мПЭГ антителами. Отсюда, полимеры, у которых отсутствуют метоксильные группы (например, РйагтаРЕС), обладают пониженной или существенно пониженной антигенностью, по сравнению с полимерами, традиционно используемыми для биоконъюгации лекарственных препаратов, например, мПЭГ.
Как замечено выше, на весовой основе, конкурентные возможности мПЭГ обратно пропорциональны их молекулярным весам. Однако ПЭГ с отсутствующими метоксильными группами обладали лишь прибл. 1% конкурентных возможностей мПЭГ, независимо от их молекулярных весов. Эти результаты поддерживают сделанное заключение о том, что монофункционально реактивные полимеры, у которых отсутствуют метоксильные группы, особенно пригодны для получения полимерных конъюгатов биологически активных агентов, имеющих пониженную, существенно пониженную или нулевую антигенность, по сравнению с конъюгатами, полученными с использованием мПЭГ, особенно разветвленных мПЭГ, таких как ди-мПЭГ-лизин.
Пример 4. Обнаружение ПЭГилированных конъюгатов протеина при помощи Аейеги В1оУ с анти-мПЭГ антителами.
МонометоксиПЭГ конъюгаты карбонангидразы (ЕС 4.2.1.1; СА11) были использованы в качестве моделей при проверке возможности анти-мПЭГ антител обнаруживать ПЭГилированные протеиновые конъюгаты путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Б8-РАСЕ). Устройством для электроблоттинга гели были нанесены на поливинилиден дифторид мембрану, и пятна (блоты) инкубировались с кроличьими анти-мПЭГ антителами (в слабом растворе 1:200), затем последовала инкубация с вторичным антителом (козий противокроличий ИгГ), конъюгированным к щелочной фосфатазе и контакт с субстратом, образующим окрашенный осадок. Данный метод иммунологического обнаружения протеинов или полимер-протеиновых конъюгатов, перенесенных с электрофоретического геля на мембрану, обычно называется АеЧегп Ыо1 (Цанг, В.К.В. и др., (1984) Аиа1 Вюсйет 745:304-307). Методика обнаружения и реагенты были теми же, что описаны для анализа методом гибридизации макромолекул путем диффузии через точечные отверстия в матрице в примере 1. Результаты показаны на фиг. 5а. Полосы 1 и 2 показывают гель, окрашенный для протеина с использованием КиЬу 8Гат рубиново-красного красителя марки 8УРКО® (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидеие, ОК, каталог № 8-12000), сфотографированные цифровым фотоаппаратом Кодак, с применением Оранжевого/Красного фильтра видимого спектра (Мо1еси1аг РгоЬек, каталог № 8-6655) в темной бленде с осве
- 27 009122 щением на расстоянии 302 нм. Полосы 3 и 4 показывают результаты обнаружения методом ШезЮгп Ь1о! тех же самых препаратов. Анти-мПЭГ антитела видны в местах всех ПЭГилированных образцов (полоса 3), но не на немодифицированной карбонангидразе (полоса 4).
На фиг. 5б показано количественное определение интенсивности полос в геле и ШезЮгп Ь1о!, показанные на фиг. 5а, полученные с помощью программного обеспечения Кобак ГО Ншщтц Апа1уз18 (Кобак, Рочестер, штат Нью-Йорк). Горизонтальная ось представляет расстояние миграции относительно фронта красителя, и вертикальная ось представляет относительные интенсивности пятна протеина или пятна анти-мПЭГ. Нижняя метка показывает полосу заранее окрашенных эталонных протеинов марки 8ееВ1ие Р1из2™ ('ЧпуДгодеп Согрогабоп, Карлсбад, штат Калифорния; каталог № ЬС5625), на которой пики под номерами от 1 до 8 указывают на протеины со следующими средними молекулярными массами (в кило-дальтон): 204; 111; 68,8; 51,5; 40,2; 28,9; 20,7 и 14,9 соответственно. Вторая снизу метка является пятном анти-мПЭГ антител ПЭГилированной карбонангидразы. Третья снизу метка представляет протеино-окрашенную полосу карбонангидразы, и верхняя метка показывает протеино-окрашенные мПЭГ конъюгаты карбонангидразы. Количество вышеуказанных пиков на фиг. 5б отражает количество мПЭГ нитей (попарно) присоединенных к карбонангидразе в конъюгате (конъюгатах) в таком пике. ПЭГ0 указывает положение карбонангидразы, к которой присоединен ПЭГ. Взятые вместе эти результаты указывают на то, что анти-мПЭГ антитела способны легко образовывать комплексные соединения с ПЭГилированными протеинами, полученными с химически активной формой мПЭГ, и таким образом, позволяют их точное и выборочное обнаружение. При введении таких конъюгатов в организм животного для диагностических, профилактических или терапевтических целей, возбуждение анти-мПЭГ антител будет способствовать повышенной скорости выведения агента из кровотока, тем самым, ограничивая эффективность действия этих конъюгатов, и потенциально приводя к неблагоприятным эффектам, опосредованным образованием иммунных комплексов.
Пример 5. Синтез РИагтаРЕО-мононитрофенил карбоната.
Требование получения монофункционально активированного РИагтаРЕО из ПЭГ диола таково, что, на определенном этапе синтеза, одна из концевых групп ПЭГ должна обладать свойствами, позволяющими разделять ПЭГ, содержащие различное количество этих концевых групп. Такая группа может быть более гидрофобной, чем любой ПЭГ или активированный ПЭГ, позволяя осуществить сепарацию путем противофазовой хроматографии (КР сИгота!о§гарИу ПФ-хроматография). В противном случае такая группа может быть заряжена, позволяя осуществить сепарацию путем ионообменной хроматографии. Такая группа может быть частью твердой фазы, разрешая выделение фаз из жидкостей, в которых несвязанный ПЭГ растворим. Если активирующая группа может быть использована в качестве основы сепарации, как в случае с ЫРС-ПЭГ, описанном в данном примере 5, тогда присоединение активирующей группы будет единственной необходимой реакцией синтеза. Если удаляемая блокирующая группа, например, трет-бутил или трифенилметил (тритил) группа, обеспечивает основу для сепарации, то блокирующая группа может быть добавлена либо до, либо после присоединения активированной или поддающейся активированию группы, как описано в примере 6. Теоретически этап рафинирования, используемый для изоляции ПЭГ, содержащего требуемое количество блокирующих групп, может быть выполнен в любое время после присоединения блокирующей группы. На практике относительная неустойчивость связей между остовом полимера и блокирующей группой, и между остовом полимера и активирующей (или поддающейся активированию) группой, может диктовать оптимальную последовательность прохождения этапов синтеза. Синтез монофункционально активированного ЫРС-ПЭГ из дигидроксиПЭГ резюмирован в виде следующей диаграммы, в которой РИ обозначает фенильную группу, а п обозначает количество этиленоксид молекул в полимере, которое равно прибл. 227 для 10 кДа ПЭГ.
НО(СН2СН2О)ПН (ПЭГ Диол) ия-Нитрофенил Хлорформиат (О2ЯРЮСОС1) _____ в Пиридине/ Ацетонитриле
НО(СН2СН2О)ПН + О2ПРЮСОО(СН2СН2О)пОСОРйМ)2 +
О2ПР11ОСОО(СН2СН2О)ПН
ОФ Хромотографичесое рафинирование моно-ЫРС-ПЭГ
02ΝΡΗΟΟΟΟ(ΟΗ2 СН2 О)пН
РИагтаРЕО-мононитрофенил карбонат
ПЭГ диолы от нескольких поставщиков, все из которых были помечены, как имеющие молекулярные массы 10 кДа, были проверены на беспримесность и гомогенность. Ни один из них не содержал более 90% ПЭГ с молекулярной массой прибл. 10 кДа. По этой причине 10 кДа ПЭГ диол (Р1ика СИетюа1 Согр., Милуоки, Висконсин, каталог № 81280) был фракционирован от примесей более низкой молекулярной массы путем противофазной хроматографии на колонке АтЬегсИгот Μϋ-Р СО-30080 (7,5 мм х 15 см, ТозоНааз, Монтгомервиль, штат Пенсильвания). ПЭГ был загружен в колонку в виде раствора в 5% (объем/объем) ацетонитрила в воде, и затем был элюирован с линейный градиент от 5 до 35% ацето
- 28 009122 нитрила в воде. Полученные фракции были исследованы при помощи гель-хроматографии на колонке НК10/30 марки ЗиреМех® 200 (АтегкЬат РЬагтас1а ВЫесЬ, Пискатавэй, штат Нью-Джерси) в 20 милли-молярном ацетате натрия, содержащем 150 м-моль №С1, рН 4,6. Фракции из АтЬегсЬгот (янтарь-хром) колонки, в которых более 98% сигнала коэффициента преломления (КП) по причине ПЭГ, находились на максимальном уровне, соответствующеу прибл. 10 кДа ПЭГ, были объединены и высушены в вакууме.
Рафинированный, высушенный ПЭГ диол (530 мг) был соединен с 61,4 мг п-нитрофенил хлорформиатом (АШпсЬ, Милуоки, штат Висконсин, каталог № 16,021-0), растворен в 4 мл ацетонитрила в стеклянной пробирке с завинчивающейся крышкой 13x100 мм, давая окончательные концентрации прибл. 12,5 м-моль ПЭГ диола и прибл. 75 м-моль п-нитрофенил хлорформиата. Был добавлен пиридин (0,25 г), и реакционная смесь культивировалась в течение ночи при температуре 36°С. Реакция была подавлена добавлением смеси с перемешиванием к 33 мл ледяной 0,1 моль соляной кислоте. Раствор был профильтрован для удаления небольшого осадка п-нитрофенола, и затем был диализирован в течение суток на холоде при четырехкратной замене воды по 1 л.
Ацетонитрил был добавлен к диализированному раствору с тем, чтобы довести концентрацию до 5% (объем/объем). Половина смеси, полученная на этапе 1 (24 мл), которая содержала прибл. 265 мг рафинированного 10 кДа ПЭГ диола, была загружена в колонку АтЬегсЬгот, и связанные образцы ПЭГ были элюировны с градиентом от 5 до 65% ацетонитрила в воде. Фракции были исследованы с помощью гель-хроматографии как и до этого, с отслеживанием как коэффициента преломления, так и коэффициента поглощения на расстоянии 280 нм. ДигидроксиПЭГ, который не проявлял признаков поглощения на расстоянии 280 нм, был элюирован в первую очередь, затем последовал ПЭГ-производный с единственной п-нитрофенил группой (моноЧРС ПЭГ), затем диЧРС ПЭГ, для которого коэффициент поглощения на расстоянии 280 нм по отношению к коэффициенту преломления в два раза выше, чем у моно№С-ПЭГ. Две фракции в центре моно-№С-ПЭГ диапазона элюирования были соединены для получения прибл. 110 мг моно-№С-ПЭГ, соответствующим количеству извлечения, равному прибл. 42%. Продукт этапа 2 мог быть высушен для хранения в сушильном шкафу и/или холодильнике, или же использован сразу для (попарного) присоединения к аминосодержащему биологически активному соединению или связывающему агенту, содержащему две или несколько аминогрупп для приготовления разветвленных ПЭГ, например, ди-ПЭГ-лизина, который не содержал бы алкоксильных групп.
Пример 6. Синтез РЬагтаРЕО-моноальдегида из ПЭГ диола.
Синтез монопропиональдегидного производного от РЬагтаРЕО, резюмирован в следующей диаграмме, в которой КО/Ви обозначает калий трет-бутилат, а БЕР обозначает 3,3-диетоксипропильную группу.
НО(СН2СН2О)ПН (ПЭГ Диол) | + С1СН2СН2СН(ОСН2СНЗ)2 + ф КОЙВи в толуоле
ОЕРО(СН2СН2О)ПН + ОЕРО(СН2СН20)„ОЕР + НО(СН2СН2О)„Н ΐ Трифенилметил хлорид (РЬ3СС1) в сухом пиридине
РЕРО(СН2СН2О)ПСРЬ3 + РЕРО(СН2СН2О)пРЕР РЬ3СО(СН2СН2О)
ΐ ОФ хроматографическое
Э φ рафинирование монотритилПЭГмоноацетала
РЕРО (СН2СН2О)„СР11з
+ НС1
НО(СН2СН2О)ПСН2СН2СНО РЬагт аРЕСг-монопропиональдегид
Предпочтительно, чтобы дигидроксиПЭГ, который используется в качестве исходного сырья, на этапе 1 имел молекулярный вес, который был бы в пределах 10% от своего номинального молекулярного веса и обладал бы полидисперсными свойствами <1,05. Полидисперсность определяется как отношение средневесовой молекулярной массы (Мм) к среднечисленной молекулярной массе (Мп). Обе эти характеристики, Мм и Мп, могут быть определены путем гель-хроматографии, используя ПЭГ с точно известными молекулярными массами в качестве эталонов, с помощью программного обеспечения для гельпроникающей хроматографии, такого как ЕΖСЬ^от Е1Ье Сйеп1/Зегуег Зоймаге, Версия 2.8.3 (Зс1епййс ЗоИмаге, 1пс., Плезантон, штат Калифорния). Альтернативно, полидисперсные свойства ПЭГ могут быть измерены времяпролетной масс-спектрометрией с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МАЕБ1-ТОГ) (Мари, А. и др., (2000) Апа1 СЬет 72:5106-5114), с применением программы, например, Уоуадег Зоймаге (Аррйе4 Вюкук^етк, Фостер-Сити, штат Калифорния). Для приготовления фармацевтических препаратов, содержащих ковалентно связанный ПЭГ, исходное сырье ПЭГ должно, предпочтительно, обладать полидисперсными свойствами <1,02, и более предпочтительно, если
- 29 009122 <1,01, при измерении масс-спектрометрией МАЬБ1-ТОЕ. Исходное сырье может быть получено от А1бпс11 СНет1са1 Со., Ника Скеткак (Бух, Швейцария), 811еаг\\'а1ег Согрогабоп или от 8Цта СНет1са1 Со. среди других поставщиков, известных квалифицированным специалистам в данной области знаний. Если исходное сырье недостаточно гомогенно, оно может быть фракционировано с применением методов, описанных в примере 5.
Препарат моно пропиональдегида и дипропиональдегид диэтилацеталь производных от ПЭГ диола может быть синтезирован с использованием 3-хлор-пропиональдегид диэтилацеталь (А1бпс1Г каталог № С6,900-4), как это описано для ацетальдегид диэтилацеталя Харрисом Дж.М. и др., ((1984) !Ро1уш. 8с1. 22:341-352) (см. этап 1). Аналогичные методы также были описаны Бентли М.Д. и др. ((1998) кРНагш. 8с1. 87:1446-1449), и были впоследствии запатентованы Бентли М.Д. и др. (патент США № 5990237).
Достаточное количество трифенилметил хлорида (хлоротрифенил-метана или трифенилхлорметана, РН3СС1, например, А1бпс1Г каталог № Т8,380-1), растворенного в пиридине, добавляется к смеси, полученной на этапе 1 таким образом, чтобы при условиях реакции Рй3СС1 вступал в реакцию со всеми гидроксильными группами исходного сырья ПЭГ, которое не присоединено (попарно) к пропиональдегид диэтилацеталю (Косиенски, П.Дж., выше). Для завершения этапа 2, смесь извлекается после выпадения в осадок путем добавления слабого растворителя для ПЭГ (например, простого эфира), или путем выпаривания растворяющего вещества, или любыми другими известными в отрасли способами.
Извлеченная на этапе 2 смесь растворяется в воде перед или после добавления 5% (объем/объем) ацетонитрила, и раствор загружается в колонку для противофазной хроматографии, где ожидается, на основе принципов, известных в отрасли знаний, что она сможет образовать связи с тритил производными от ПЭГ. Колонка может содержать алкил или алкил производные диоксида кремния или полимерный субстрат, или это может быть полимер на основе стирола (например, АтЬегсНгот МБ-Р СС-300), как в примере 5. ПЭГ диол и тритил производные могут быть элюированы в режиме обратной фазы с увеличением градиента органического растворителя, как описано в примерах, или в режиме вытеснения препарата, путем продолжения загрузки колонки до тех пор, пока не будет элюирована, по крайней мере, какая-то часть требуемых образцов (Агнер, Е. и др., публикация РСТ νθ 00/23798 А1), или в режиме вытеснения (Крамер, С.М., патент США № 6 239 262), или сочетанием этих методов. Обычно производная ПЭГ, у которой отсутствует какая-либо тритильная группа, будет элюировать в первую очередь, монотритил производная будет элюировать во вторую очередь, и дитритил ПЭГ будет элюировать в третью очередь. Оптимальный выход требуемого продукта получается при соотношении этих трех препаратов равном 1:2:1. Для улучшения выхода продукта и/или для улучшения степени чистоты монотритил ПЭГ продукта, может потребоваться подвергнуть часть элюата циркуляционной хроматографии, как это часто применяется в хроматографической технологии. Для завершения этапа 3 часть элюата, содержащая покрайней мере, какое-то количество производного монотритила, сепарируется, концентрируется и высушивается известными способами.
При мягких кислотных условиях и при низкой температуре ацетал может быть преобразован в альдегид, при этом сохраняя большинство тритильных связей на периферийном конце ПЭГ. В некоторых случаях применения данного примера может оказаться эффективным заставить монотритил ПЭГ моноальдегид вступить в реакцию с целевым веществом (функциональной группой) до удаления тритильной группы. Такие варианты осуществления изобретения предусмотрены и включены в настоящее изобретение.
Пример 7. Демонстрация пониженной иммуногенности конъюгатов, полученных с гидроксиПЭГ, по сравнению с метоксиПЭГ.
Следуя всем процедурам, как описано для иммунизации мПЭГ конъюгатами уриказы, как в примере 1, группы из трех кроликов были иммунизированы либо мПЭГ коньюгатами, либо гидроксиПЭГ конъюгатами того же препарата свиной уриказы, каждые конъюгаты содержали, в среднем, приблизительно две нити 10 кДа ПЭГ на подгруппу уриказы. Среднее количество нитей полимера, присоединенных к каждому препарату конъюгатов, было подтверждено как анализом гель-хроматографии (ВЭЖХ), так и 808-РАСЕ, при проведении которых гели были окрашены как для протеина, как в примере 4, так и для ПЭГ, с использованием методов, описанных в одной из заявок на получение патента США совместного пользования, находящихся одновременно на рассмотрении патентного ведомства № 10/183 607; поданной 28 июня 2002 г., которая вошла в настоящее изобретение путем ссылки в ее целостности. Каждому кролику был введен один из препаратов ПЭГ-уриказы однократно в полный адъювант Фрейнда и пять раз, с интервалами от одной до четырех недель, в неполный адъювант Фрейнда. Кровь отбиралась через две недели после четвертого и пятого введения препарата в неполный адъювант Фрейнда. Из отобранной крови были приготовлены иммунные сыворотки. Когда серийные 4-кратные растворы иммунной сыворотки, полученных от этих кроликов, были проверены анализами ЭЛИЗА, как описано в примере 2, то концентрация анти-ПЭГ антител, индуцированых конъюгатами, приготовленными с гидроксиПЭГ оказалась менее 5%, от той концентрации, которая была индуцирована конъюгатами, приготовленными с мПЭГ (см. фиг. 6а и 6б). В противоположность этому индуцирование антиуриказных антител конъюгатами, приготовленными с двумя видами ПЭГ, была одинаковой в двух группах кроликов. Ни одна из
- 30 009122 сывороток первичной иммунизации от этих кроликов не содержала поддающихся обнаружению антиПЭГ антител.
Обсуждение и выводы
В данной отрасли знаний было заявлено, что ПЭГ, заканчивающийся метоксильной группой (мПЭГ) и ПЭГ, заканчивающийся гидроксильной группой (бис-гидроксиПЭГ или ПЭГ диол) являются равнозначащими для использования в биоконъюгации, или, более часто, что мПЭГ и прочие более низкие алкоксил ПЭГ, превосходят ПЭГ диолы. Более того, бис-активированные диолы могут действовать как перекрестносшивающие агенты, что может оказаться нежелательным для получения растворимых биоконъюгатов пролонгированного действия, обладающих низкой иммуногенностью и антигенностью. Как ни удивительно, результаты настоящих исследований указывают на то, что мПЭГ являются существенно антигенными, и что антитела, индуцированные против метоксильной группы мПЭГ, прикрепляются к конъюгатам ПЭГилированного протеина, приготовленного с использованием мПЭГ. Следовательно, неожиданно и противоположно предыдущим заявлениям, мПЭГ не является эквивалентом гидроксиПЭГ, и мПЭГ не является предпочтительным для приготовления полимерных конъюгатов биологически активных компонентов (таких как протеины), которые должны обладать повышенной биологической доступностью, устойчивостью в кровотоке и минимальной иммуногенностью.
На основании данных результатов ясно, что использование монофункционально активированного ПЭГ, не содержащего метоксильной группы или иной алкоксильной группы для синтеза конъюгатов протеина, приводит к получению конъюгатов с пониженной иммунологической реактивностью. Полученные конъюгаты продемонстрировали пониженные антигенные свойства, т. е. пониженную возможность взаимодействовать с антителами, образованными против мПЭГ конъюгатов того же протеина, и пониженные иммуногенные свойства, т.е. пониженную возможность вызывать иммунологическую реакцию против компонента ПЭГ. И как естественный результат, ожидается, что конъюгаты, приготовленные с разветвленными ПЭГ, содержащими две или несколько метоксильных групп, будут более иммуногенными, чем конъюгаты, приготовленные из разветвленных ПЭГ, у которых отсутствуют алкоксильные группы.
И наконец, на основании полученных результатов, ожидается, что использование монофункционально активированного ПЭГ, который не содержит метоксильную группу или иную алкоксильную группу, вместо монофункционально активированного мПЭГ для синтеза ПЭГ-липосом, придаст получаемым в результате ПЭГ-липосомам пониженную иммунологическая реактивность, включая пониженную тенденцию к инициированию активации компонента в крови, и пониженную тенденцию вызывать острое расстройство дыхания или псевдоанафилактические и псевдоаллергические реакции.
Настоящее изобретение описывается со ссылкой на определенные варианты его осуществления. Методы настоящего изобретения аналогичным образом применимы к другим типам протеинов, к другим биологически активным компонентам и к другим реагентам ковалентного связывания молекул. Ввиду этого объем настоящего изобретения не ограничен описанными вариантами его осуществления, но он ограничен только формулой изобретения. Обычные квалифицированные специалисты могут легко понять, что существуют возможности реализации изобретения иными способами, не выходящими за рамки настоящего изобретения. Все такие вариации считаются частью настоящего изобретения.

Claims (139)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат, содержащий один или несколько биологически активных компонентов, ковалентно присоединенных не менее чем к одному линейному или разветвленному полиалкиленгликолю, который не содержит алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и который присоединен к единственному биологически активному компоненту на единственном своем участке.
  2. 2. Конъюгат по п.1, который характеризуется пониженной или существенно пониженной антигенностью по сравнению с конъюгатом, содержащим тот же самый биоактивный компонент или компоненты, присоединенный в том же самом участке или участках на биоактивном компоненте(ах) к такому же количеству полиалкиленгликолей того же размера и линейной или разветвленной структуры, содержащих одну или несколько концевых алкоксильных групп.
  3. 3. Конъюгат по п.1, в котором линейный или разветвленный полиалкиленгликоль выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля и сополимера этиленоксида и пропиленоксида.
  4. 4. Конъюгат по п.3, в котором линейный или разветвленный полиалкиленгликоль является полиэтиленгликолем (ПЭГ).
  5. 5. Конъюгат по п.1, в котором присоединение полиалкиленгликоля к биоактивному компоненту (ам) проводится с использованием химически активного производного от не менее чем одного полиалкиленгликоля, выбранного из группы, состоящей из линейных дигидроксиПЭГ (ПЭГ диолы), гидроксиПЭГмоноацетолов и гидроксиПЭГ-одноосновных кислот.
  6. 6. Конъюгат по п.1, в котором присоединение полиалкиленгликоля к биоактивному компоненту(ам) проводится с использованием химически активного производного от гидроксиПЭГ, отобранного из группы, состоящей из моноальдегида, моноэфира одноосновной кислоты, моноамина, монотиола, моно
    - 31 009122 дисульфида, мнобромфенил карбоната, монохлорофенил карбоната, монофторфенил карбоната, мононитрофенил карбоната, монокарбонилимидазола, моногидразида, монокарбазата, монойодоацетамида, мономалеинимида, моноортопиридил дисульфида, монооксима, монофенил диальдегида, монотиазолидин-2-тиокетоана, тиоэфира, монотриазина и моновинилсульфона.
  7. 7. Конъюгат по п.1, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 1000 (1 кДа) до 100000 Да (100 кДа).
  8. 8. Конъюгат по п.7, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 2 до 60 кДа.
  9. 9. Конъюгат по п.8, в котором полиалкиленгликоль имеет две ветви, каждая из которых с молекулярной массой от 2 до 30 кДа.
  10. 10. Конъюгат по п.9, в котором полиалкиленгликоль имеет две ветви, каждая из которых с молекулярной массой от 5 до 20 кДа.
  11. 11. Конъюгат по п.8, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 10 до 20 кДа.
  12. 12. Конъюгат по п.11, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу 12 кДа.
  13. 13. Конъюгат по п.8, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 18 до 60 кДа.
  14. 14. Конъюгат по п.13, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 18 до 22 кДа.
  15. 15. Конъюгат по п.14 в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу 20 кДа.
  16. 16. Конъюгат по п.13, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 27 до 33 кДа.
  17. 17. Конъюгат по п.1, который включает в себя от 1 до 100 нитей полиалкиленгликоля.
  18. 18. Конъюгат по п.17, который включает в себя от 1 до 5 нитей полиалкиленгликоля.
  19. 19. Конъюгат по п.18, который включает в себя 1 или 2 нити полиалкиленгликоля.
  20. 20. Конъюгат по п.17, который включает в себя от 5 до 100 нитей полиалкиленгликоля.
  21. 21. Конъюгат по п.1, в котором полиалкиленгликоль выбран из группы, состоящей из моногидроксиПЭГ-кислоты и дигидроксиПЭГ-кислоты, такой как дигидроксиПЭГ-лизин.
  22. 22. Конъюгат по п.1, в котором полиалкиленгликоль, если он линейный, имеет гидроксильную группу на дистальном конце, который не прикреплен к биоактивному компоненту(ам) или, если он разветвленный, имеет гидроксильную группу на каждом дистальном конце.
  23. 23. Конъюгат по п.5, в котором полиалкиленгликоль является химически активным производным от линейного дигидроксиПЭГ.
  24. 24. Конъюгат по п.5, в котором полиалкиленгликоль является химически активным производным от гидроксиПЭГ-монокарбоновой кислоты.
  25. 25. Конъюгат по п.1, в котором биоактивный компонент выбран из группы, состоящей из пептида, протеина, гликопротеина, органического соединения, аминосодержащего соединения, карбоксилатного соединения, гидроксилсодержащего соединения и тиолсодержащего соединения.
  26. 26. Конъюгат по п.25, в котором биоактивный компонент выбран из группы, состоящей из пептида, протеина и гликопротеина.
  27. 27. Конъюгат по п.26, в котором пептид, или протеин, или гликопротеин выбран из группы, состоящей из энзима, сывороточного протеина, сывороточного гликопротеина, протеина клеток крови, пигментного протеина, гемоглобина, вирусного протеина, пептидного гормонального фактора, протеинового гормонального фактора, гликопротеинового гормонального фактора, гипоталамического рилизинг-фактора, цитокина, фактора роста, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любой из вышеупомянутой групп.
  28. 28. Конъюгат по п.27, в котором сывороточный протеин выбран из группы, состоящей из альбумина, иммуноглобулина, фактора коагуляции крови, пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеупомянутых сывороточных протеинов.
  29. 29. Конъюгат по п.27, в котором пептидный гормональный фактор или протеиновый гормональный фактор или гликопротеиновый гормональный фактор выбраны из группы, состоящей из антидиуретического гормона, хорионического гонадотропина, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, инсулина, лактогенного гормона, инсулиноподобного фактора роста, гормона роста, тиреостимулирующего гормона, плацентарного лактогена и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеупомянутых гормонов.
  30. 30. Конъюгат по п.27, в котором фактор роста выбран из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, фактора роста эпидермиса, фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста, трансформирующего фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, фактора роста нервов, фактора роста клеток печени, нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора, мозгопроизводного нейротрофического фактора, глиальнопроизводного нейротрофического фактора или костного морфогенетического пептида, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных факторов.
  31. 31. Конъюгат по п.27, в котором цитокин выбран из группы, состоящей из гемопоэтического фактора, иммуноактивного фактора лимфоцитов, фактора стимуляции гепатоцитов, интерферона, фактора некроза опухоли, лейкоз ингибирующего фактора и тромбопоэтина, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных цитокинов.
    - 32 009122
  32. 32. Конъюгат по п.27, в котором энзим выбран из группы, состоящей из карбогидратспецифичного фермента, протеолитического фермента, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролитического фермента, лиазы, изомеразы и лигазы.
  33. 33. Конъюгат по п.32, в котором фермент оксидоредуктазы является уриказой.
  34. 34. Конъюгат по п.32, в котором протеолитический фермент является активатором плазмогена.
  35. 35. Конъюгат по п.26, в котором пептид, протеин или гликопротеин является аллергеном.
  36. 36. Конъюгат по п.1, в котором биологически активное соединение является таксаном или производным от него.
  37. 37. Конъюгат по п.1, в котором биологически активное соединение является антибиотиком или производным от него.
  38. 38. Лекарственный препарат, включающий в себя конъюгат по п.1 и фармацевтически пригодный наполнитель или носитель.
  39. 39. Способ предупреждения физического нарушения у животного, включающий в себя введение эффективного количества конъюгата по п.1 или препарата по п.38.
  40. 40. Способ диагностики физического нарушения у животного, включающий в себя введение эффективного количества конъюгата по п.1 или препарата по п.38.
  41. 41. Способ лечения физического нарушения у животного, включающий в себя введение эффективного количества конъюгата по п.1 или препарата по п.38.
  42. 42. Способ по п.39, в котором животное является млекопитающим.
  43. 43. Способ по п.40, в котором животное является млекопитающим.
  44. 44. Способ по п.41, в котором животное является млекопитающим.
  45. 45. Способ по п.42, в котором млекопитающее является человеком.
  46. 46. Способ по п.43, в котором млекопитающее является человеком.
  47. 47. Способ по п.44, в котором млекопитающее является человеком.
  48. 48. Способ по п.39, в котором физическое нарушение отбирается из группы, состоящей из злокачественного новообразования, артрита, инфекционного заболевания, генетического нарушения, неврологического нарушения, метаболического нарушения, энзиматического нарушения, сердечно-сосудистого заболевания и артериальной гипертензии.
  49. 49. Способ по п.40, в котором физическое нарушение отбирается из группы, состоящей из злокачественного новообразования, артрита, инфекционного заболевания, генетического нарушения, неврологического нарушения, метаболического нарушения, энзиматического нарушения, сердечно-сосудистого заболевания и артериальной гипертензии.
  50. 50. Способ по п.41, в котором физическое нарушение отбирается из группы, состоящей из злокачественного новообразования, артрита, инфекционного заболевания, генетического нарушения, неврологического нарушения, метаболического нарушения, энзиматического нарушения, сердечно-сосудистого заболевания и артериальной гипертензии.
  51. 51. Способ по п.48, в котором злокачественное новообразование отбирается из группы, состоящей из рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака яичка, рака легких, лейкоза, лимфомы, рака толстой кишки, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака костей, неврологического рака, рака головы и шеи, рака кожи и прочих карцином, сарком, аденом и миеломных болезней.
  52. 52. Способ по п.49, в котором злокачественное новообразование отбирается из группы, состоящей из рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака яичка, рака легких, лейкоза, лимфомы, рака толстой кишки, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака костей, неврологического рака, рака головы и шеи, рака кожи и прочих карцином, сарком, аденом и миеломных болезней.
  53. 53. Способ по п.50, в котором злокачественное новообразование отбирается из группы, состоящей из рака молочной железы, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака яичка, рака легких, лейкоза, лимфомы, рака толстой кишки, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака костей, неврологического рака, рака головы и шеи, рака кожи и прочих карцином, сарком, аденом и миеломных болезней.
  54. 54. Способ по п.48, в котором инфекционное заболевание отбирается териоза, микоза, вирусного заболевания и паразитарного заболевания.
  55. 55. Способ по п.49, в котором инфекционное заболевание отбирается териоза, микоза, вирусного заболевания и паразитарного заболевания.
  56. 56. Способ по п.50, в котором инфекционное заболевание отбирается териоза, микоза, вирусного заболевания и паразитарного заболевания.
    отбирается из из из группы, состоящей из бакгруппы, состоящей из бакгруппы, состоящей из бак-
  57. 57. Способ по п.54, ВИЧ/СПИД и гепатит.
  58. 58. Способ по п.55, ВИЧ/СПИД и гепатит.
  59. 59. Способ по п.56, котором вирусное котором вирусное котором вирусное заболевание заболевание заболевание из группы, включающей себя отбирается отбирается из из группы, включающей группы, включающей себя себя
    - 33 009122
    ВИЧ/СПИД и гепатит.
  60. 60. Способ по п.48, в котором генетическое нарушение отбирается из группы, состоящей из бокового амиотрофического склероза, фиброзно-кистозной дегенерадии, наследственного липоидпезаурисмоза, гемофилии и прочих унаследованных нарушений крови, генерализованного гликогеноза и тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД).
  61. 61. Способ по п.49, в котором генетическое нарушение отбирается из группы, состоящей из бокового амиотрофического склероза, фиброзно-кистозной дегенерации, наследственного липоидпезаурисмоза, гемофилии и прочих унаследованных нарушений крови, генерализованного гликогеноза и тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД).
  62. 62. Способ по п.50, в котором генетическое нарушение отбирается из группы, состоящей из бокового амиотрофического склероза, фиброзно-кистозной дегенерации, наследственного липоидпезаурисмоза, гемофилии и прочих унаследованных нарушений крови, генерализованного гликогеноза и тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД).
  63. 63. Способ по п.48, в котором неврологическое нарушение отбирается себя болезнь Альцгеймера и рассеянный (множественный) склероз.
  64. 64. Способ по п.49, в котором неврологическое нарушение отбирается себя болезнь Альцгеймера и рассеянный (множественный) склероз.
  65. 65. Способ по п.50, в котором неврологическое нарушение отбирается себя болезнь Альцгеймера и рассеянный (множественный) склероз.
  66. 66. Способ по п.39,
  67. 67. Способ по п.40,
  68. 68. Способ по п.41,
  69. 69. Способ по п.66,
  70. 70. Способ по п.67,
  71. 71. Способ по п.68,
  72. 72. Способ по п.39,
  73. 73. Способ по п.40,
  74. 74. Способ по п.41,
  75. 75. Способ по п.39,
  76. 76. Способ по п.40,
  77. 77. Способ по п.41,
  78. 78. Способ по п.39,
  79. 79. Способ по п.40,
  80. 80. Способ по п.41,
  81. 81. Способ по п.39,
  82. 82. Способ по п.40,
  83. 83. Способ по п.41,
  84. 84. Способ изготовления конъюгата между биологически активным соединением и полиалкиленгликолем, активированным только на одном конце, включающий в себя:
    (а) получение полиалкиленгликоля, который не содержит какой-либо концевой группы, то есть стабильно связанной алкоксильной группы;
    (б) как вариант, перед преобразованием полиалкиленгликоля по п/п (а) в монофункционально активированный полиалкиленгликоль, защищая все концевые группы кроме одной, путем добавления одной или нескольких удаляемых блокируемых групп, таких как трет-бутоксильная группа(ы), арилоксильная группа (ы) или трифенилметилгруппа(ы) (тритильная группа(ы));
    (в) изготовление монофункционально активированного производного от полиалкиленгликоля, пу из из из группы, группы, группы, включающей включающей включающей в в в в в в в в в в в в в в в в в в котором введение является парентеральным. котором введение является парентеральным. котором введение является парентеральным. котором парентеральное введение является интравенозным. котором парентеральное введение является интравенозным. котором парентеральное введение является интравенозным. котором введение является пероральным. котором введение является пероральным. котором введение является пероральным.
    котором введение является местным. котором введение является местным. котором введение является местным.
    котором введение осуществляется путем ингаляции (вдыхания). котором введение осуществляется путем ингаляции (вдыхания). котором введение осуществляется путем ингаляции (вдыхания). котором введение является ректальным.
    котором введение является ректальным. котором введение является ректальным.
    тем реакции полиалкиленгликоля с дериватирующим соединением или соединениями в условиях, при которых полиалкиленгликоль дериватируется с единственной дериватирующей группой на конце, который не содержит удаляемую блокирующую группу или группы;
    (г) если блокирующая группа была добавлена для защиты концевой группы(групп), как указано в п/п (б), удаление названной блокирующей группы за один или несколько этапов без удаления активирующей группы, присоединенной как указано в п/п (в) выше, для изготовления монофункционально активированного полиалкиленгликоля, в котором дистальный конец или дистальные концы являются гид роксильными группами; и (д) приведение в контакт монофункционально активированного полиалкиленгликоля с не менее чем одним биоактивным компонентом при условиях, благоприятствующих образованию ковалентного связывания монофункционально активированного полиалкиленгликоля с биоактивным компонентом, или (е) в качестве альтернативы, выполнение п/п (д) до выполнения п/п (г).
  85. 85. Способ по п.84, в котором дериватизирующая группа отбирается из группы, состоящей из альдегидной и карбоксильной группы.
  86. 86. Способ по п.84, в котором блокирующая группа отбирается из группы, состоящей из тритильной группы, арилоксильной группы и трет-бутоксильной группы.
    - 34 009122
  87. 87. Способ по п.84, дополнительно включающий в себя отделение линейного моногидроксиПЭГмоноальдегида от соответствующего ПЭГ-диальдегида путем:
    (а) преобразования всех гидроксильных групп на ПЭГ-альдегиде в тритил производные;
    (б) отделения монотритилПЭГ-моноальдегида от ПЭГ-диальдегида и любого дитритилПЭГ путем обращенно-фазовой хроматографии и (в) преобразования монотритилПЭГ-моноальдегида в моногидроксиПЭГ-моноальдегид путем гидролитического удаления тритильной группы в кислотной среде.
  88. 88. Способ по п.87, в котором альдегид или названные альдегиды находятся в форме ацеталпроизводных.
  89. 89. Конъюгат, изготовленный способом по п.84.
  90. 90. Конъюгат по п.89, который обладает пониженной или существенно пониженной антигенностью по сравнению с конъюгатом, включающим в себя тот же самый биоактивный компонент присоединенный в том же самом месте или местах на биоактивном компоненте к тому же количеству молекул полиалкиленгликоля того же самого размера и линейной или разветвленной структуры, которые содержат алкоксильную группу на дистальном конце, если полиалкиленгликоль является линейным, или содержат две или несколько алкоксильных групп на дистальных концах, если полиалкиленгликоль является разветвленным.
  91. 91. Конъюгат по п.89, в котором полиалкиленгликоль выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля и сополимера этиленоксида и пропиленоксида.
  92. 92. Конъюгат по п.89, в котором компонент полиалкиленгликоля выбирается из группы, состоящей из линейного полиэтиленгликоля и разветвленного полиэтиленгликоля.
  93. 93. Конъюгат по п.89, в котором каждый полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 1 до 100 кДа.
  94. 94. Конъюгат по п.93, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 2 до 60 кДа.
  95. 95. Конъюгат по п.94, в котором полиалкиленгликоль имеет две ветви, каждая из которых имеет молекулярную массу от 2 до 30 кДа.
  96. 96. Конъюгат по п.95, в котором полиалкиленгликоль имеет две ветви, каждая из которых имеет молекулярную массу от 5 до 20 кДа.
  97. 97. Конъюгат по п.94, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 10 до 20 кДа.
  98. 98. Конъюгат по п.97, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу 12 кДа.
  99. 99. Конъюгат по п.94, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 18 до 60 кДа.
  100. 100. Конъюгат по п.99, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 18 до 22 кДа.
  101. 101. Конъюгат по п.100, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу 20 кДа.
  102. 102. Конъюгат по п.99, в котором полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от 27 до 33 кДа.
  103. 103. Конъюгат по п.89, который включает в себя от 1 до 100 нитей названного полиалкиленгликоля.
  104. 104. Конъюгат по п.103, который включает в себя от 1 до 5 нитей полиалкиленгликоля.
  105. 105. Конъюгат по п.104, который включает в себя от 1 до 2 нитей полиалкиленгликоля.
  106. 106. Конъюгат по п.103, который включает в себя от 5 до 100 нитей полиалкиленгликоля.
  107. 107. Конъюгат по п.89, в котором монофункционально активированный полиалкиленгликоль, использованный в синтезе конъюгата отбирается из группы, состоящей из гидроксиПЭГ-моноальдегида и химически активного сложного эфира гидроксиПЭГ-одноосновной кислоты.
  108. 108. Конъюгат по п.89, в котором монофункционально активированный полиалкиленгликоль, использованный в синтезе конъюгата, имеет гидроксильную группу на своем дистальном конце, если он линейный, или имеет гидроксильную группу на каждом дистальном конце, если он разветвленный.
  109. 109. Конъюгат по п.89, в котором монофункционально активированный полиалкиленгликоль, использованный в своем синтезе, образован от линейного дигидроксиПЭГ.
  110. 110. Конъюгат по п.89, в котором биоактивный компонент отбирается из группы, состоящей из пептида, протеина, гликопротеина, органического соединения, аминсодержащего соединения, карбоксилсодержащего соединения, гидроксилсодержащего соединения и тиолсодержащего соединения.
  111. 111. Конъюгат по п.110, в котором биоактивный компонент отбирается из группы, состоящей из пептида, протеина и гликопротеина.
  112. 112. Конъюгат по п.111, в котором пептид, протеин или гликопротеин отбирается из группы, состоящей из фермента, сывороточного протеина, сывороточного гликопротеина, протеина клеток крови, пигментного протеина, гемоглобина, вирусного протеина, пептидного гормонального фактора, протеинового гормонального фактора, гликопротеинового гормонального фактора, гипоталамического рилизинг-фактора, цитокина, фактора роста и пептидов и протеинов и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любой из вышеперечисленных групп.
  113. 113. Конъюгат по п.112, в котором сывороточный протеин отбирается из группы, состоящей из альбумина, иммуноглобулина, фактора коагуляции крови, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных сывороточных протеинов.
  114. 114. Конъюгат по п.112, в котором пептидный гормональный фактор, протеиновый гормональный
    - 35 009122 фактор, гликопротеиновый гормональный фактор отбирается из группы, состоящей из антидиуретического гормона, хорионического гонадотропина, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона, инсулина, лактогенного гормона, инсулиноподобного фактора роста, гормона роста, тиреостимулирующего гормона, плацентарного лактогена, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных гормонов.
  115. 115. Конъюгат по п.112, в котором фактор роста отбирается из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, фактора роста эпидермиса, фактора роста фибробластов, инсулиноподобного фактора роста, трансформирующего фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, фактора роста нервов, фактора роста клеток печени, нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора, мозгопроизводного нейротрофического фактора, глиально-производного нейротрофического фактора или костного морфогенетического пептида, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных факторов роста.
  116. 116. Конъюгат по п.112, в котором цитокин выбран из группы, состоящей из гемопоэтического фактора, иммуноактивного фактора лимфоцитов, фактора стимуляции гепатоцитов, интерферона, фактора некроза опухоли, лейкоз ингибирующего фактора и тромбопоэтина, и пептидов, и протеинов, и гликопротеинов, которые имитируют или действуют как антагонисты любого из вышеперечисленных цитокинов.
  117. 117. Конъюгат по п.112, в котором энзим выбран из группы, состоящей из карбогидратспецифичного фермента, протеолитического фермента, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролитического фермента, лиазы, изомеразы и лигазы.
  118. 118. Конъюгат по п.117, в котором фермент оксидоредуктазы является уриказой.
  119. 119. Конъюгат по п.117, в котором протеолитический фермент является активатором плазмогена (урокиназой).
  120. 120. Конъюгат по п.111, в котором пептид, протеин или гликопротеин является аллергеном.
  121. 121. Конъюгат по п.89, в котором биологически активное соединение является таксаном или производным от него.
  122. 122. Конъюгат по п.89, в котором биологически активное соединение является антибиотиком или производным от него.
  123. 123. Лекарственный препарат, включающий в себя конъюгат по п.89 и фармацевтически пригодный наполнитель или носитель.
  124. 124. Набор, включающий в себя конъюгат по п.1.
  125. 125. Набор, включающий в себя лекарственный препарат по п.38.
  126. 126. Набор, включающий в себя конъюгат по п.89.
  127. 127. ПЭГ-липосомный состав, в котором ПЭГ компонент не включает в себя алкоксильную группу на каком-либо из концов и каждая молекула ПЭГ присоединена к единственной молекуле липида на единственном участке на молекуле липида и на названной молекуле ПЭГ.
  128. 128. Состав по п.127, в котором участком присоединения является аминогруппа фосфатидил этаноламина.
  129. 129. Состав по п.127, в котором стороной присоединения является гидроксильная группа диацилглицерина.
  130. 130. Состав по п.127, который обладает пониженной или существенно пониженной иммунологической реактивностью по сравнению с составом ПЭГ-липосомы, включающим в себя не менее одного алкоксиПЭГ или ПЭГ, который присоединен к липиду на более чем одном участке или более чем к одной молекуле липида.
  131. 131. Конъюгат по п.27, в котором фактор роста является колониестимулирующим фактором.
  132. 132. Конъюгат по п.131, в котором колониестимулирующий фактор является фактором, стимулирующим образование колоний гранулоцита-макрофага (ГМ-КСФ); фрагментом, вариантом или их производной или пептидом, протеином или гликопротеином, которые имитируют ГМ-КСФ.
  133. 133. Конъюгат по п.132, в котором ГМ-КСФ, фрагмент, вариант или их производная или пептид, протеин или гликопротеин, которые имитируют ГМ-КСФ, ковалентно присоединены к одной линейной или разветвленной молекуле полиалкиленгликоля, которая не содержит алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и которая присоединена к единственной молекуле ГМ-КСФ.
  134. 134. Конъюгат по п.132, в котором ГМ-КСФ, фрагмент, вариант или их производная или пептид, протеин или гликопротеин, которые имитируют ГМ-КСФ, ковалентно присоединены к двум линейным или разветвленным молекулам полиалкиленгликоля, которые не содержат алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и которые присоединены к единственной молекуле ГМ-КСФ.
  135. 135. Конъюгат по п.112, в котором фактор роста является колониестимулирующим фактором.
  136. 136. Конъюгат по п.135, в котором колониестимулирующий фактор является фактором, стимулирующим образование колоний гранулоцита-макрофага (ГМ-КСФ); фрагментом, вариантом или их производной; или пептидом, протеином или гликопротеином, которые имитируют ГМ-КСФ.
  137. 137. Конъюгат по п.136, в котором ГМ-КСФ, фрагмент, вариант или их производная, или пептид, протеин или гликопротеин, которые имитируют ГМ-КСФ, ковалентно присоединены к одной линейной
    - 36 009122 или разветвленной молекуле полиалкиленгликоля, которая не содержит алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и которая присоединена к единственной молекуле ГМ-КСФ.
  138. 138. Конъюгат по п.136, в котором ГМ-КСФ, фрагмент, вариант или их производная или пептид, протеин или гликопротеин, которые имитируют ГМ-КСФ, ковалентно присоединены к двум линейным или разветвленным молекулам полиалкиленгликоля, которые не содержат алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и которые присоединены к единственной молекуле ГМ-КСФ.
  139. 139. Применение конъюгата по п.1 или лекарственного препарата по п.38 для ветеринарного лечения животных.
EA200500519A 2002-09-30 2003-09-25 Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения EA009122B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41442402P 2002-09-30 2002-09-30
US10/317,092 US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2002-12-12 Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
PCT/US2003/029989 WO2004030617A2 (en) 2002-09-30 2003-09-25 Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500519A1 EA200500519A1 (ru) 2005-12-29
EA009122B1 true EA009122B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=32033300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500519A EA009122B1 (ru) 2002-09-30 2003-09-25 Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения

Country Status (26)

Country Link
US (1) US20040062748A1 (ru)
EP (2) EP2535347A1 (ru)
JP (2) JP5366352B2 (ru)
KR (1) KR101022577B1 (ru)
CN (2) CN1997661B (ru)
AU (1) AU2003275176B8 (ru)
BR (1) BRPI0314831B8 (ru)
CA (2) CA2500389C (ru)
CR (1) CR7776A (ru)
DK (1) DK1572728T3 (ru)
EA (1) EA009122B1 (ru)
EC (1) ECSP055717A (ru)
ES (1) ES2504165T3 (ru)
GE (1) GEP20074016B (ru)
HK (1) HK1083190A1 (ru)
HR (1) HRP20050353B1 (ru)
IL (1) IL167723A (ru)
IS (1) IS2944B (ru)
MA (1) MA27521A1 (ru)
MX (1) MXPA05003394A (ru)
NO (1) NO20052089L (ru)
NZ (1) NZ539133A (ru)
PT (1) PT1572728E (ru)
RS (1) RS20050263A (ru)
TW (1) TWI362942B (ru)
WO (1) WO2004030617A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2677796C2 (ru) * 2013-03-05 2019-01-21 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20010003580A1 (en) 1998-01-14 2001-06-14 Poh K. Hui Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
DK1531791T3 (da) 2002-06-07 2010-11-01 Dyax Corp Forebyggelse og begrænsning af iskæmi
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
WO2004060299A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
CA2519092C (en) 2003-03-14 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. Branched water-soluble polymers and their conjugates
PL1615945T3 (pl) 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
MXPA05012313A (es) 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP1663281B1 (en) * 2003-08-29 2013-12-25 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
KR101439880B1 (ko) 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
NZ556436A (en) 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7858080B2 (en) * 2005-05-20 2010-12-28 Agency For Science, Technology And Research Aldehyde conjugated flavonoid preparations
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US7816484B2 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for making polyethylene glycol carbonates
WO2007102562A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Keio University 新規抗血栓薬
EP2018437A2 (en) * 2006-05-02 2009-01-28 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
ES2516694T3 (es) 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
BRPI0809670A8 (pt) 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA2696208A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
CN103497246B (zh) 2008-02-27 2016-08-10 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2010080833A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2597954T3 (es) 2009-07-27 2017-01-24 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de la coagulación sanguínea
KR101912335B1 (ko) 2009-07-27 2018-10-26 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
NZ623810A (en) 2009-07-27 2015-10-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
RS57870B1 (sr) 2010-01-06 2018-12-31 Dyax Corp Proteini koji vezuju kalikrein plazme
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
CA3065178C (en) 2010-12-13 2022-02-01 Quiapeg Pharmaceuticals Ab Functionalized polymers
BR112013015898A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-26 Baxter International Inc. derivado de ácido graxo solúvel em água, e, métodos para preparar um derivado de ácido graxo e uma proteína terapêutica conjugada.
KR102107695B1 (ko) 2011-01-06 2020-05-07 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
JP5949037B2 (ja) 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
EP3628332A1 (en) 2012-06-12 2020-04-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Conjugates of biologically active molecules to functionalized polymers
BR112016022318A2 (pt) 2014-03-27 2017-10-31 Dyax Corp método, composição farmacêutica para uso no tratamento de doenças de retina e uso de um anticorpo
JP2017516869A (ja) * 2014-06-04 2017-06-22 ジム バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド 皮膚の質を改善するための組成物及び方法
EA201791437A1 (ru) 2014-12-31 2017-12-29 Лантеус Медикал Имэджинг, Инк. Композиции микросфер c инкапсулированным в липиде газом и соответствующие способы
BR112018011622A2 (pt) 2015-12-11 2018-11-27 Dyax Corp método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae
TWI832081B (zh) 2016-05-04 2024-02-11 美商藍瑟斯醫學影像公司 用於形成充氣微球體及成像個體之方法、震盪裝置及電腦可讀軟體
US9789210B1 (en) 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
EP3592393B1 (en) 2017-03-10 2021-12-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
JP2021535920A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 キアペグ ファーマシューティカルズ アクチエボラグ 放出可能なｇｌｐ−１コンジュゲート
CN110376369B (zh) * 2019-07-30 2022-02-15 重庆派金生物科技有限公司 一种抗聚乙二醇抗体的抗原区免疫原性分析方法
EP4052726A4 (en) * 2019-10-29 2023-12-20 National University Corporation Kumamoto University CD4 MIMETIC COMPOUND WITH ANTI-HIV ACTIVITY
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
CN114392237B (zh) * 2021-12-28 2024-02-02 上海允英生物医药科技有限公司 一种冻干病毒制剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2433883C2 (de) * 1973-07-20 1986-03-27 Research Corp., New York, N.Y. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
US4399282A (en) * 1979-07-10 1983-08-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Camptothecin derivatives
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4434228A (en) * 1982-04-20 1984-02-28 Genex Corporation Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
IE64284B1 (en) 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
US4943579A (en) * 1987-10-06 1990-07-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Water soluble prodrugs of camptothecin
US5004758A (en) * 1987-12-01 1991-04-02 Smithkline Beecham Corporation Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells
JP2958019B2 (ja) * 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5364612A (en) * 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6326353B1 (en) * 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
WO1994027498A1 (en) * 1993-05-20 1994-12-08 The Regents Of The University Of California Macromolecular contrast media for mr imaging
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
WO1995000162A1 (en) * 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5824701A (en) * 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
US5622986A (en) * 1993-10-20 1997-04-22 Enzon, Inc. 2'-and/or 7-substituted taxanes
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5728560A (en) * 1996-06-14 1998-03-17 Enzon, Inc. Method of treating CD4+ T cell lymphopenia in immuno-compromised patients
US5804183A (en) * 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
EP1017794A1 (en) * 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
EP0981548A4 (en) * 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6239262B1 (en) * 1998-01-07 2001-05-29 Rensselaer Polytechnic Institute Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems
US5880225A (en) * 1998-02-18 1999-03-09 Arco Chemical Technology, L.P. Process for making polyetherester resins having high aromatic diester
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
EP2158923B1 (en) 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CN1330675A (zh) 1998-08-28 2002-01-09 格莱风科学公司 精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物
AU762616B2 (en) * 1998-10-16 2003-07-03 Biogen Ma Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses
GB9822963D0 (en) 1998-10-20 1998-12-16 Agner Erik Improvements in or relating to chromatography
US6596849B1 (en) * 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
MXPA02003540A (es) 1999-10-08 2003-09-12 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de poli(etilenglicol) heterobifuncionales y los metodos para su preparacion.
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
WO2002080207A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Arizona State University Micro-machined radio frequency switches and method of operating the same
DK1421175T3 (da) * 2001-06-28 2009-03-23 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabiliserede proteinaser
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
EP1498420B1 (en) * 2002-03-29 2017-02-01 Nof Corporation Phospholipid derivative
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2677796C2 (ru) * 2013-03-05 2019-01-21 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом
RU2677796C9 (ru) * 2013-03-05 2019-03-15 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP055717A (es) 2005-08-11
KR101022577B1 (ko) 2011-03-16
TW200416035A (en) 2004-09-01
MXPA05003394A (es) 2005-10-05
IS2944B (is) 2016-04-15
MA27521A1 (fr) 2005-09-01
CN1997661A (zh) 2007-07-11
CA2836959A1 (en) 2004-04-15
NO20052089L (no) 2005-04-28
TWI362942B (en) 2012-05-01
IL167723A (en) 2013-01-31
AU2003275176B8 (en) 2009-01-08
JP5366352B2 (ja) 2013-12-11
EP2535347A1 (en) 2012-12-19
HRP20050353A2 (en) 2006-06-30
BRPI0314831B1 (pt) 2021-01-19
PT1572728E (pt) 2014-09-19
AU2003275176B2 (en) 2008-12-18
EP1572728A4 (en) 2010-03-10
GEP20074016B (en) 2007-01-10
DK1572728T3 (da) 2014-09-22
RS20050263A (en) 2007-08-03
HRP20050353B1 (hr) 2013-07-31
WO2004030617A2 (en) 2004-04-15
CR7776A (es) 2007-10-07
WO2004030617A3 (en) 2005-07-21
HK1083190A1 (en) 2006-06-30
EP1572728B1 (en) 2014-06-25
EA200500519A1 (ru) 2005-12-29
IS7778A (is) 2005-03-30
JP5603823B2 (ja) 2014-10-08
CN1997661B (zh) 2013-12-04
KR20050083702A (ko) 2005-08-26
ES2504165T3 (es) 2014-10-08
US20040062748A1 (en) 2004-04-01
JP2011157379A (ja) 2011-08-18
EP1572728A2 (en) 2005-09-14
BRPI0314831B8 (pt) 2021-05-25
CA2500389C (en) 2015-03-10
CA2836959C (en) 2017-06-06
NZ539133A (en) 2008-03-28
BR0314831A (pt) 2005-08-16
CA2500389A1 (en) 2004-04-15
AU2003275176A1 (en) 2004-04-23
JP2006510601A (ja) 2006-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009122B1 (ru) Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения
US8129330B2 (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
Menacho-Melgar et al. A review of lipidation in the development of advanced protein and peptide therapeutics
JP2006510601A5 (ru)
US6638906B1 (en) Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
JP5460958B2 (ja) タンパク質ポリエチレングリコール（ｐｅｇ）複合体形成を増大させる方法
EA008866B1 (ru) ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
US20220204961A1 (en) Modified ddah polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancing moiety, improved pharmacology and their uses
JP2005528372A (ja) 抗菌ポリマー複合体
JP2006521372A (ja) 生物学的活性物質と生体適合性高分子の１：１接合体、この製造方法とこれを含む薬学組成物
ZA200502707B (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
JP2013512279A (ja) ＩｇＥ媒介性疾患の処置方法
KR20040086521A (ko) 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY