TWI362942B - Compositions comprising conjugates with decreased antigenicity and the pharmaceutical compositions, uses and production thereof;method of producing conjugates and the conjugates produced therefrom;method for separating linear monohydroxypeg-monoaldehyde - Google Patents

Compositions comprising conjugates with decreased antigenicity and the pharmaceutical compositions, uses and production thereof;method of producing conjugates and the conjugates produced therefrom;method for separating linear monohydroxypeg-monoaldehyde Download PDF

Info

Publication number
TWI362942B
TWI362942B TW092127073A TW92127073A TWI362942B TW I362942 B TWI362942 B TW I362942B TW 092127073 A TW092127073 A TW 092127073A TW 92127073 A TW92127073 A TW 92127073A TW I362942 B TWI362942 B TW I362942B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
composition
combination
polyalkylene glycol
peg
Prior art date
Application number
TW092127073A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200416035A (en
Inventor
Alexa L Martinez
Merry R Sherman
Mark G P Saifer
L David Williams
Original Assignee
Mountain View Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mountain View Pharmaceuticals filed Critical Mountain View Pharmaceuticals
Publication of TW200416035A publication Critical patent/TW200416035A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI362942B publication Critical patent/TWI362942B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

1362942 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明屬於蛋白質生化學以及醫藥學及醫學科學的領 域。特定言之，本發明提供由水溶性聚合物（例如聚（乙 二醇）以及其衍生物）和生物活性成份產生結合體之方法 ，相較於標準聚合物-生物活性成份之結合體，該結合體 的抗原性和免疫產生性降低。本發明亦提供由該方法製作 之結合體、包含該結合體之組成物、包含該結合體及組成 物之套組以及在預防、診斷和治療各種醫學和獸醫症狀上 使用此結合體及組成物之方法。 【先前技術】 阻礙重組蛋白質治療劑發展之關鍵因素有二種-一般 循環系統中半生期短及其潛在的抗原性和免疫產生性。在 本文中以及此技藝中，"抗原性"意指分子結合至已存在抗 體的能力，而本文術語之"免疫產生性"意指在活體內喚起 免疫反應之能力，不論該反應是否涉及抗體形成（"體液 的反應"）或剌激細胞的免疫反應。爲了投用重組型治療 性蛋白質，常用靜脈內的（i.v.)注射以令人滿意的達成 最高循環的活性以及極小化生物效性以及降解問題。然而 ，小蛋白質i.v.後之半生期通常很短（參閱例如Mordenti ，J.，et al.，(1991)Pharin Res 8 : 1351-1359; Kuwabara ，T.，et al.，(19 95 )Pharm Res 12 : 1 466- 1469 ) ° 一般而 言健康的腎臟可保持超過血清白蛋白（即Stokes半徑 1362942 .· » 0.36 A以及分子量66,000道耳吞，66kDa)水動力半徑之 血液蛋白質。然而’較小的蛋白質例如：粒細胞集落刺激 ^ 因數（"G-CSF")以及核糖核酸酶可經腎臟絲球體的過濾 從血液中快速地清除（Brenner，B.M.，et al. ( 1978) Am J P h y s i ο 1 2 3 4 : F 4 5 5 - F 4 6 Ο; V e n k a t a c h a 1 a m，Μ. A .，e t al.(1 978 ) Circ Res 43 : 337-347; Wilson，G.，（1 979 ) JGen Physiol 74: 495-509 ) » 結果，不易在 i.v.後使循環 φ中保有適當治療濃度的重組型小蛋白質。因此，必須投用 較高濃度的該蛋白質且注射次數更頻繁。高劑量率會增加 治療成本，減低病人的順從性以及增加副作用的危機，例 如免疫的反應。細胞及體液免疫反應均可減低注射之重組 蛋白質在循環中的濃度，其可排除投用之有效劑量或導致 治療之限制事件例如過敏性反應（Pui，C.-H.，et al.( 200 1 ) J Clin Oncol 19: 697-704 )。 替代路線之治療，例如皮下（s.c.)或肌肉內的（i.m. •)注射，可克服某些此類問題，逐漸的釋放出重組蛋白質 到循環中。然而，其生物效性相當低，難於達成該藥物在 循環中的有效濃度。進一步的問題係相關於s.c.或i.m·投 用藥品之不良的生物效性，其可增加治療性蛋白質在注射 位點降解之或然率。 ' 藉由聚（乙二醇）（"PEG")衍生物共價鍵聯結來修 飾重組蛋白質以改善以上缺點之硏究已廣泛進行（評估於 Shennan，M.R.，et al. ( 1997 ) in ： Poly ( ethylene glycol ):Chemistry and Biological Applications ’ Harris ’ J.M. -6- 1362942 ，et al.，eds. > American Chemical Society，Washington ，D.C.，pp.155-169; Robert.M.J. ; et al. ( 2 0 0 2 ) Adv Drug Deliv Res 54: 459-476)。在活體內將 PEG 衍生物 聯結在蛋白質已顯示可穩定蛋白質，改良其生物效性及/ 或減低其免疫產生性。（PEG衍生物共價聯結於蛋白質或 其它本文之反應受質，在本文中以及技藝上稱爲"PEG化 作用"。）此外，PEG化作用可顯著的增加蛋白質的水動 力半徑。當小蛋白質，例如細胞激動素或多肽荷爾蒙，偶 合至PEG的單一長股（例如，其分子量至少約18kDa) ，產生的結合物比血清白蛋白具有較大的水動力的半徑以 及經由腎絲球體的清除會劇烈地遲緩》PEG化作用的合倂 效應-降低蛋白質水解、降低免疫的辨視以及降低腎的清 除的速率-賦予聚乙二醇化的蛋白質治療劑實質上的優點 〇 自1 9 70以來曾嘗試使用以共價鍵聯結的聚合物改良 醫界所使用的各種不同蛋白質的安全和功效（參閱例如， 美國專利第4，1"79,337號）。一些實施例包含偶合PEG或 聚（環氧乙烷）（PE0)至腺苷脫胺酶（EC 3.5.4.4 )以 應用於治療嚴重的多發性免疫缺乏疾病（Davis，S.，et al. ( 1981) Clin Exp Immunol 46 : 649652; Hershfield， M.S.，et al. ( 1 9 8 7 ) N Engl J Med 3 16： 589-596 )。其 它實施例包含偶合PEG至超氧化物岐化酶（EC 1.15.1.1 )以治療發炎病症（Saifer，M_，et al·之美國專利第 5,006,3 33及5,080,89 1號）以及偶合至尿酸鹽氧化酶（ 1362942 EC 1.7.3.3)以從血液及尿液中除去過量的尿酸（Inada， Y.，日本專利申請案 55-0991 89 : Kelly，S_J.，et al.( 2001 ) JAm Soc Nephrol 1 2: 1 00 1 - 1 009; Williams » L.D. ，et al，PCT公告WO 00/0 7629 A3，對應於美國專利第 t 6,5 76,2 3 5 號；Sherman，M.R.，et al.，PCT 公告 WO 01/59078 A2 )。 PEOs以及PEGs是由共價聯結的環氧乙烷單位所組 φ成的聚合物。此類聚合物有下列的一般構造： R,- ( OCH2CH2)„-R2 其中R2可爲羥基（或其反應性衍生物），R!可爲氫 (如"PEG二醇”）、甲乙基（如單甲氧基 PEG，"mPEG" )、或另一較低碳數烷基團，例如異-丙氧基PEG或第三 丁氧基PEG。PEG構造中的參數η意指聚合物中環氧乙烷 參單位之數目，在本文及在此技藝中稱爲"聚合度"。PEGs 和 PEOs 可爲鏈狀、分支（Fuke，I·，et al· ( 1 994 ) JControl Release 30 : 27-34 )或星形狀（Merrill，E.W.( 1993) JBiomater Sci Polym Ed 5: 1-11) 。PEGs 和 PEOs 是兩性化合物，即彼可溶解於水及某些有機溶劑並可黏附 在內含脂質之材料上，包括病毒被膜及動物和細菌細胞的 細胞膜。某些環氧乙烷（och2ch2)和-環氧丙烷之隨機或 嵌段或交替共聚物帶有下列構造： 1362942 ch2-ch-ch3 \ / o 其性質與PEG很相似，此類共聚物在某些 PEG的適當代替物（參閱例如，美國專利筹 及5,283,317號）。本文術語之"聚環氧夫 "PAOs"意指此類共聚物、PEG或PEO及靠 基亞甲基）共聚物（美國專利第5,476,653 語之"聚烷二醇類"和縮寫"PAGs"—般係指適 合體之聚合物，尤其是指PEGs，更明確的 單一反應性基團的PEGs ("單官能性活化的 通常，數股（例如5至10)之一個或g 如一個或多個mPEG (分子量約5kDa至約 由一級胺基（離氨酸殘基之ε胺基以及N. 胺基）偶合至目標蛋白質。最近，已合成內 (例如 12kDa、20kDa 或 3 OkDa )之 mPEG 。並已說明結合體之血漿半生期與增加分二 PEG偶合的股數有直接相關（Clark，R.，e JBiol Cheni 271 : 21969 21977)。另一方 之股數，則在生物活性成份必需的區域中之 或然率亦會增加（尤其是若生物活性成份是 而損害它的生物功能（例如酵素之催化或受 素之結合）》含有許多胺基之較大蛋白質， 子量受質之酵素，由於內含PEG之結合體 生生物活性之淨增加，因此增加作用持續期 活性之交易是可接受的。然而在較小的蛋白 用途上可作爲 ί 4,609,546 以 宅類”以及縮寫 :(氧基乙烯氧 號）。本文術 用於本發明結 說，是指內含 PEGs")。 务個PAGs，例 1 OkDa )可經 •端胺基酸之α 含較高分子量 單股的結合體 F量及/或增加 ：t al. ( 1 996 ) 面，增力卩PEG 胺基被修飾的 蛋白質），因 體與細胞激動 以及具有低分 在活體內可產 間以及減低比 質中，例如多 1362942 # . # . 1 肽荷爾蒙以及細胞激動素，相對高度之取代可能減少這官 能的活性，抵消延長血液中半生期之優點（Clark，R.，et al·，supra ) ° 本案發明人開拓各種PEG化作用之策略以及施用至
W 許多蛋白質以達成有利的藥物動力學以及增加活體內效能 之令人滿意的組合。此類蛋白質包含粒細胞-巨噬細胞菌 落-刺激因子（"GM-CSF11 ) ( Saifer > M.G.P. > et al.( 1 9 9 7 ) Polynm Preprints 3 8 : 576577; Sherman，M. R. > et al. ( 1 997 ) supra)以及重組型哺乳動物的尿酸分解酶（ 參閱 PCT 公告 WO 0 0/07629 以及 WO 01/59078 ; Kelly， S.J.，et al.，supra :美國專利第 6,576,235 號）》使用 • GM-CSF作爲細胞激動素模型，本案發明人說明那個聯結 ^ —或二種高分子量（約36kDa) mPEG股足以劇烈地增強 '重組型鼠科動物 GM-CSF在活體內之效能（Saifer， M.G.P. » et al. ( 1 997 ) supra; Sherman » M.R. > et al.( • 1 997 ) supra )。 亦有硏究進行重組型哺乳動物的尿酸鹽氧化酶（尿酸 分解酶）之修飾以及探索其治療頑強的痛風之潛力（參閱 PCT公告WO 0 0/0 7629，對應至美國專利第6,576,235號 ，以及WO 0 1/59078，全文在此倂入參考文獻）。當使用 * PEG-尿酸分解酶治療具有明顯的尿酸誘發的腎病之尿酸 ’ 分解酶-缺陷的小鼠（ιι〇Χ·Λ )時，發現耐受性良好、具有 有效性以顯著的非免疫產生性。處理後的小鼠在展示治療 期間（10週）腎功能有改善且實質上有較少的相關於尿 -10- 1362942 酸的腎損害（比起未處理的uuox-Λ小鼠），如微觀的核 磁共振影像（Kelly，S.J.，et al. ( 200 1 ) supra)顯示。 PAG股共價聯結於多肽分子已揭示於美國專利第 4，1 79,3 3 7 號（頒給 Davis，F_F_，et al.)與 Abuchowski ，A.，et al. ( 19 81) in : Enzymes as Drugs，Holcenberg ，J.S.，et al·，eds.，John Wi 1 ey 以及 S on s，N e w Yo r k ，pp.36 7-383。此類參考文獻揭示酵素以及其它蛋白質經 mPEGs修飾後可降低免疫產生性以及抗原性且在中血液 中有較長的生命期（相較於對應的未經修飾之蛋白質）。 此化學修飾之結合體產生之有利的性質在各種治療的用途 上非常有用。 爲了使PEG或聚環氧烷類共價聯結於蛋白質上，必 須先將聚合物至少一個羥基末端基團轉換成反應性官能基 。此方法通常地稱爲”活化"，且這產物則被稱爲"活化的 PEG"或活化的聚環氧烷類。該方法最常用的是—個末端 蓋上無反應性、化性穩定的甲基醚（"甲氧基"）帽子以及 另一個末端具有與蛋白質分子胺基反應性官能基的單甲氧 基PEG »所謂的••分支狀"mPEGs，在單—的活化的官能基 遠端含有兩種或多種甲氧基，通常較少使用。實施例之一 是二-mPEG離氨酸’其離氨酸之羧基團最常用N_羥基琥 拍酿亞fl女之醋化作用活化（Harris，J.M.，et al.，U.S. Patent No. 5,932,462 ) 〇 活化的聚合物可和具有親核官能基作爲聯結位點之治 療劑反應。通常作爲聯結位點的一個親核官能基是離氨酸 1362942 ·，·，，：. 殘基之ε胺基。自由羧基團、適當地活化之羰基團、氧化 的醣類部份和硫醇基可作爲聯結位點β , 已用三聚氰酸氯化物活化的mPEG羥基以及產生的化 ^ 合物然後可和蛋白質偶合（Abuchowski，A. ’ et al.( 1 977 ) JBiol Cheni 252 : 3582-3586; Abuchowski，A.，et al. ( 1981) supra)。然而使用此方法是有缺點，例如三 聚氰酸氯化物具有毒性以及它與蛋白質胺類之外官能基（ φ例如在功能上重要的溶劑可接近的半胱胺酸或酪胺酸殘基 )具有非專一性的反應性。 爲了克服此類以及其它缺點，已引入另一種活化的 PEGs，例如mP EG之琥珀醯亞胺基琥珀酸鹽衍生物（"SS-P E G" ) ( Abuchowski ，A. ， et al. ( 1 9 8 4 ) Cancer *
Biochem Biophys 7 : 175-186)。在溫和的條件下，SS- PEG可和蛋白質迅速反應（在30分鐘之內），產生活性 的、非廣泛修飾之結合體。 • M. Saifer，et al.於美國專利第5,468,478號，揭示聚 烷二醇-單-N-琥珀醯亞胺基碳酸鹽以及其製作之結合體。 S. Zalipsky於美國專利第5，6 1 2，4 6 0號，揭示製備聚（ 乙二醇）-N-琥珀醯亞胺基碳酸鹽之方法。此聚合物（ "SC-PEG")形式可立即和低分子量肽類之蛋白質胺基及 含有自由胺基之其它材料反應，形成胺基甲酸酯鍵結。 蛋白質胺基和PEG之間的胺基甲酸酯（或胺基甲酸 酯）聯結亦是從其它PEG碳酸鹽製作衍生物的已知技藝 (Beauchamp > C. > et al. ( 1 98 3 ) Anal Biochem 13 1： 25- -12- 1362942 33; Veronese ’ F. Μ. ，et al. ( 1 98 5 ) Appl Biochem
Biotechnol 11 : 141-152) »反應性mPEG中間物以及使 用彼之方法亦是經由醯胺鍵結、酯鍵結、二級胺以及硫酯 鍵結聯結合成生物活性成份之PEG結合體的已知技藝。 T. Suzuki et al. ( ( 1 9 8 4 ) Biochim Biophys Aeta 788 :24 8-255 )中指出共價偶合的免疫球蛋白G ( "IgG")至 三聚氰酸氯化物活化的mPEG。彼硏究此生物以及物理化 學的性質，例如抗原-結合活性以及分子結構、大小排除 色層分析的性質、表面活性、經PEG -免疫球蛋白G結合 體誘發的非特異性的補體活化之界面的凝聚性以及熱凝聚 性。PEG偶合至免疫球蛋白G後可增加視Stokes半徑以 及免疫球蛋白G之表面活性和穩定免疫球蛋白G對熱及/ 或曝露至介面之穩定性，且未觀察到免疫球蛋白G在構 造上的變性。非特異性的凝聚性之抑制，主要是因爲聚乙 二醇化的免疫球蛋白G之間的相聯所造成之分子空間性 的抑制。此類結果指出mPEG-偶合的免疫球蛋白G作爲 靜脈內製劑的用途以及亦建議PEG作爲穩定靜脈內未經 修飾之免疫球蛋白G添加物方面的用途。 K.A. Sharp et al. ( ( 1 9 8 6 ) Anal Biochem 154： 110- Π7)硏究製造出在水溶性二相聚合物系統中基於細胞表 面抗原以區別細胞之生物專一性親和配體的可能性。將兔 子抗-人類紅血球免疫球蛋白 G和三聚氰酸氯化活化之 mPEG (分子量大約0.2、1.9以及5kDa)在各種PEG與 蛋白質離氨酸基團莫耳比之下反應。蛋白質在內含右旋聚 -13- 1362942 醣以及PEG之二相系統中其分配係數會隨著mPEG修飾 程度之增加以及分子量增加之程度而增加。同時喪失凝集 ^ 人類紅血球之能力。 R.H. Tullis之美國專利第4,904,5 82號，揭示寡核苷
V 酸是經由聯結臂相聯至厭水性部分（其可爲聚氧伸烷基團 )之寡核苷酸結合體。產生的結合體在膜運輸上更有效率 ，能穿過細胞膜且有效地調控轉錄的系統。此方法中，組 Φ成物可在體外及在活體內用於硏究細胞的生命過程，保護 哺乳動物宿主免於病原體感染、促進基因療法等。 然而硏究中發現，過多的聯結聚合物及/或過多涉及 相關生物活性之治療部分活性部位之聯結，經常導致活性 喪失，因而喪失治療的功效。在較低分子量的肽類中此現 象經常發生，因爲僅有少數的聯結位點和生物活性無關。 例如 I. Benhar et al. ( ( 1994 ) Bioconjug Chem 5 : 3 2 1- 326 )觀察到重組型單一的-鏈免疫毒素之PEG化作用會 •使免疫毒素喪失專一目標之免疫反應性。喪失免疫毒素的 活性，是因爲PEG聯結在免疫毒素抗原結合區域內的二 個離氨酸殘基所產生的結果。 雖然PAGs以及PAOs (例如PEG、PEOs等）共價聯 結於治療性蛋白質後可滅絕其免疫反應性，但聚乙二醇化 的蛋白質仍可保持微弱的免疫產生性。免疫產生性是因爲 (至少部份地）PEG以及PAO聚合物本身有些抗原性以 及免疫產生性。例如，兔子經由注射PEG與免疫產生性 的運載蛋白偶合之結合體後會對用各種PEGs產生免疫性 -14 - 1362942 (Richter ’ A. W.，et al. ( 1 9 8 3 ) Int Arch Allergy Appl Immunol 70: 12413 1 ) ^此外，將小鼠注射mPEG結合之 3-葡萄糖醛酸苷酶以及選擇分泌抗-PEG抗體之雜交瘤細 胞株已發展出和PEG聚醚骨架反應之單株抗體（Cheng， T.-L. > et al. ( 1 999 ) Bioconjug Chem 10 ： 5 20-52 8;
Cheng ’ T.-L·，et al· ( 2000 ) Bioconjug Chem 11 ： 2 5 8-266; Tsai，N.-M.，et al. ( 2001) Biotechniques 3 0 : 3 9 6-402; Roffler，S.，et al·美國專利第 6,596,849 以及 6，617,118號，全文在此倂入參考文獻）。最近已揭示另 -和PEG聚醚主鏈反應之單株抗體，參見Roberts，M.J. ’ et al·，in U. S. Patent Application No. 2003/001 704 Al 許多硏究者已揭示鏈狀或分支狀"非抗原性的"PEG聚 合物及衍生物或其結合體之製劑（參閱例如：美國專利第 5,428,128 ； 5,621,039 ； 5,622,986 ； 5,643,575 ； 5,728,560 ;5,730,990 ； 5,738,846 ； 5,811,076 ； 5,824,701 ； 5,840,900 ； 5,880,131 ； 5,900,402 ； 5,902,588 ； 5,919,455 ：5,951,974 ； 5,965,119 ； 5,965,566 ； 5,969,040 ； 5,981,709； 6,011,042； 6,042,822 ； 6,113,906 ； 6,127,355 ;6,132,713 ; 6，1 77,087,以及 6,1 8 0,0 95 號；亦可參閱 PCT公告WO 95/1 3 090以及發表的美國專利申請案編號 2002/0052443、2002/006 1 307 及 2002/0098 1 92 )。前述的 專利以及專利申請案中大部份的實施例均使用內含一個或 多個mPEG股，例如二-mPEG-離氨酸之聚合物。然而到 1362942 目前爲止並未揭示在該聚合物或結合體中付予PEG非抗 原性的機制》 . 因此’需要一種鑒定生產內含PAO (例如PEG-及/或 .. 內含PE0 )之結合體（尤其是該水溶性聚合物以及治療性 蛋白質的結合體，其抗原性降低、實質上降低或無可偵測 )之方法。該結合體將可有益的提供在活體內增加穩定性 以及生物效性之聚合物成分，但在治療的或臨床檢驗目的 馨下引入結合體不會在動物中引起實質上之免疫反應。 【發明內容】 本發明是因應以上之需要，以及提供以水溶性聚合物 (例如聚（乙二醇）以及其衍生物）與生物活性成份（尤 其是治療的生物活性成份，例如蛋白質）製備結合體之方 法。本發明亦提供該方法製作之聚合物以及結合體，該聚 合物以及結合體具有降低的抗原性和免疫產生性（相較於 •內含烷氧基之聚合物，以及用相同生物活性成份和烷氧基 PEGS，例如mPEG製備的結合體）。本發明亦提供包含 該結合體的組成物、內含該結合體及組成物之套組以及在 各種治療性以及臨床療程中使用此結合體及組成物之方法 〇 特色之一中，本發明提供一種包含以一個或多個生物 * 活性成份共價鍵聯結至至少一個鏈狀或分支狀單官能活化 的聚烷二醇的結合物，其中單官能活化的聚烷二醇在任何 末端上不包含甲氧基、另一個烷氧基團或芳氧基。在某些 -16- 1362942 具體實施例中相較於使用烷氧基聚（乙二醇）（例如 mPEG’或內含mPEG之分支聚合物，例如dimPEG-離氨 酸）製備的結合物，該結合物具有降低的或實質上降低的 抗原性。 尤其適於合成本發明結合體之聚烷二醇類包括（但非 限於）：聚（乙二醇）以及環氧乙烷以及環氧丙烷之共聚 物；尤佳的是PEGs，更明確的說，較佳的是單官能活化 的PEGs (例如在單一末端活化的PEGs，包括：羥基 PEG-單醛類、羥基peg-單乙烯基颯、羥基PEG-單羧基酸 反應性酯類及羥基PEG-單苯基碳酸鹽衍生物）。其它可 用於合成反應性聚合物衍生物中間物包含其它羥基PEG-單價酸以及羥基PEG-單乙縮醛。 在某些具體實施例中，聚烷二醇具有之分子量約 1，000道耳吞至約lOOkDa，較佳者約2kDa至約6 0kDa ; 約2kDa至約30kDa、約5kDa至約20kDa ;約lOkDa至約 30kDa;約l〇kDa至約20kDa:二個分支的各個分子量約 2kDa至約30kDa;更佳者，二個分支的各別分子量約 18kDa至約22kDa。依據本發明此特色的結合體可包含— 股或多股聚烷二醇股，在某些具體實施例中較佳者約1至 約1〇股’約1至約五股，更佳者約1至約三股，最佳者 約1至約二股；在其它具體實施例中較佳者約五至約1〇〇 股’約10至約50股，更佳者約六至約20股/高分子量酵 素蛋白質次單體。尤佳的具體實施例中，用於結合物之聚 烷二醇包含一或二股單官能活化的聚（乙二醇）（例如羥 -17- 1362942 基PEG-單價酸反應性酯、羥基PEG-單醛、羥基PEG-單 乙烯基颯或羥基PEG-單苯基碳酸鹽衍生物）其具有之分 ， 子量約1 8kDa至約22kDa或約27kDa至約33kDa。 I. 應用於本發明結合體或組成物之適當的生物活性成份 包括（但非限於）：各種肽類、蛋白質 '糖蛋白' 有機化 合物、內含胺之化合物、內含羧基之化合物、內含羥基之 化合物以及內含硫醇之化合物。 φ 本發明亦提供由生物活性化合物與單官能活化的聚烷 二醇產生結合體之方法，例如包含：（a)得到或製備鏈 狀或分支狀聚烷二醇，其係包含至少一個可移除的無反應 性阻斷基團，例如一個或多個三苯甲基團（"三苯甲基團" );(b)將彼與至少一個衍生化合物在聚烷二醇與一衍 生基團（例如一個羧基團）於一個無阻斷基團之末端反應 之條件下反應產生衍生的聚烷二醇；（c)於一個或多個 步驟去除阻斷基團而不去除產生的衍生基團產生一個單官 •能活化的聚烷二醇；以及（d )在生物活性成份有利共價 鍵的結合至單官能活化的聚烷二醇之條件下，接觸單官能 活化的聚烷二醇與至少一個生物活性成份。較佳者，當相 較於衍生自相似大小、構造以及聯結至生物活性劑的 mPEG之相同程度的結合體，該方法製作之結合體可降低 、實質上降低或無可偵測的抗原性和免疫產生性。本發明 亦提供該方法製作之結合體。 本發明亦提供醫藥學的或獸醫組成物，其係包含本發 明結合體以及至少一個賦形劑或醫藥學或獸醫可接受的載 -18- 1362942 體》 在其他的具體實施例中，本發明亦提供使用本發明結 合體或組成物預防、診斷或治療動物（例如哺乳動物，包 括人類）身體的病症之方法。該方法包含，例如對患有或 有身體病症（例如：貧血、關節炎、癌症、阿玆海默病、 酵素的缺乏、心血管疾病、高血壓、傳染性疾病、代謝的 疾病、神經學的疾病、中性血細胞減少症、高尿酸血症以 及其併發症（例如痛風）、遺傳缺陷的疾病或病症、及其 類似者）傾向之動物投用有效量之一種或多種本發明結合 體或組成物，以口服地、局部或非經腸地，例如靜脈內地 、肌肉內的或皮下的方式投用至動物（尤其是哺乳動物以 及尤其是人類）。 在其他的具體實施例中，本發明提供包含一種或多種 本發明降低抗原性結合體之組成物，其可進一步的包含一 種或多種額外的成份或試劑，例如一種或多種緩衝劑鹽類 、一種或多種醣類賦形劑、一種或多種運載蛋白、一種或 多種酵素、一種或多種兩性介面活性劑、一種或多種核酸 分子、一種或多種聚合物例如PEG等。本發明亦提供包 含本發明降低抗原性結合體及/或組成物之套組。 在其他的具體實施例中，本發明提供使用單官能活化 的聚烷二醇類，其係缺少甲氧基或其它烷氧基團，而不是 單官能活化的mP EG製備的降低免疫反應性PEG-脂質體。 在下列圖示以及本發明之描述、以及申請專利範圍的指引下 ，對一般熟悉此技藝之專業人士而言本發明其它較佳的具 1362942 體實施例是顯而易見的。 , 【實施方式】 ^ 除非另行定義，本文中所有技藝的及科學的術語與熟 悉此技藝的專業人士常用之術語有相同的意義。雖然與本 發明相似或當量的任何方法及材料均可用於本發明之進行 或測試，較佳的方法以及材料將描述於下。 φ 定義 約：當提到任何數値時，本文術語之"約"意指陳述數 値之：L10%的數値（例如"約50°C"包含溫度從45°C至55°C 之範圍；同樣地"約100毫莫耳濃度"包含從90毫莫耳濃 度至110毫莫耳濃度的範圍）。 生物活性成份：本文術語之"生物活性成份"意指在活 體內、在體外或體外之細胞、組織、器官或生物體內具有 特定的生物活性之化合物、分子、部分或複合體，而且能 #結合至一種或多種聚烷二醇類以形成本發明結合體。較佳 的生物活性成份將描述詳細於下。 結合的：本文術語之"結合的"意指結合或聯結，其可 爲共價鍵的結合，例如經化學地偶合，或非共價鍵的結合 ，例如：離子相互作用、忌水性交互作用、氫鍵等。共價 鍵可爲例如：酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、胺基甲酸酯 、醯胺、肽、醯亞胺、碳-硫鍵結、碳磷鍵結等。本文術 語之"結合的"範圍比較寬以及包括術語例如"偶合的"、M 聯結的"以及”附著的"。 -20- 1362942 偶合的：本文術語之"偶合的"意指經共價鍵或強的非 共價鍵的交互作用而聯結，典型地以及較佳者是經共價鍵 而聯結。熟悉此技藝的專業人士常用之偶合生物活性材料 的任何方法均可用於本發明中。 疾病、病症、症狀：本文術語之"疾病"或"病症"意指 任何人類或動物之不良症狀，包括：腫瘤、癌症、過敏、 成癮、自體免疫性、中毒或最佳的智力的或生體功能受損 。"症狀"用於此包括疾病以及病症且亦意指生理的狀態。 例如，能育性是生理的狀態但不是疾病或病症。本發明組 成物經由降低能育性適用於預防懷孕，因此描述爲治療生 理的狀態（能育性），但不旱治療病症或疾病。其他生理 的狀態則是爲一般熟悉此技藝的專業人士所瞭解的狀態。 有效量：本文術語之"有效量"意指給定的結合體或組 成物欲達成所要求的生物效應之必要或充分的量。有效量 之本發明將給定的結合或組成是可達成選擇結果的用量， 以及該量可經熟悉此技藝的專業人士常規地加以測定。例 如，治療免疫系統缺乏之有效量是導至免疫系統活化的必 需量，於抗原曝露下會造成抗原專一性免疫反應之發展。 此名稱亦和”充分的量"意義相同。在任何特定的用途中有 效量可取決於治療的疾病或症狀、投用的特定組成物、病 人大小、及/或疾病或症狀之嚴重性等因子而變化。一般 熟悉此技藝的專業人士可實驗的測定本發明特定的結合體 或組成物之有效量而不須過度的實驗。 免疫反應：本文術語之"免疫反應"意指體液免疫反應 -21 - 1362942 (即形成抗體）及/或細胞的免疫反應導致B及/或T-淋巴 細胞及/或抗原-呈現細胞之活化或增殖。然而在一些實例 , 中，免疫反應之強度很低以及僅當使用至少一個依據本發 I 明之物質時才可加以偵測。"免疫產生性的"意指能刺激生 物體免疫系統之試劑，而使一種或多種免疫系統之功能增 加並直接的朝向此免疫產生性的試劑。 一、a、或an :本文術語之"一"、"a "或"an "係指"至 φ少一個"或"一個或多個"，除非特別說明。 多肽：本文術語之"多肽”意指由單體（胺基酸）經醯 胺鍵結（亦爲習知的肽鍵）鏈狀聯結組成之分子。意指胺 基酸分子的鏈以及不是特定長度之.產物。因此，二肽、三 肽、寡肽、非特定長度的肽類以及蛋白質均包含於此多肽 定義之內。此術語亦預期的意指此多肽後表現修飾之產物 ，例如糖基化作用、乙醯化、磷酸化等。多肽可爲重組型 或源自天然的生物的來源，但未必一定得轉譯自指定的核 •酸序列。可以任何方式產生，包括化學合成。 蛋白質和糖蛋白：本文術語之蛋白質意指多肽，一般 而言大小約5或更多、10或更多、20或更多、25或更多 、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500 或更多、1，000或更多或2,000或更多個胺基酸。蛋白質一 般而言有定義的三維結構（經常稱爲折疊），雖然彼未必需 要，相反的肽類以及多胜肽經常沒有定義的三維結構，但放 可具有大量不同的構像。以及是稱未折疊。然而肽類亦可有 定義的三維結構。本文術語之糖蛋白意指一種蛋白質，其 -22- 1362942 中內含至少一個醣側鍵，其係經由胺基酸（例如絲胺酸或 天門冬醯胺酸）之含氧或含氮側鏈聯結在蛋白質。 純化：本文術語之"純化"係用於分子，係指相對於天 然環境或其製作、發現或合成的環境中之分子，純化的分 子之濃度已增加。天然的分子包含：蛋白質、核酸、脂質 以及糖，但一般而言不包含水、緩衝溶液、以及添加入維 持分子完整性或協助分子純化的試劑。例如，在粗提物中 即使給定的蛋白質係用管柱層析法之水溶液稀釋，只要從 天然的核酸、非所要求的蛋白質以及其它生物的分子中分 離出主題蛋白質分子，則可稱爲以此色譜法純化此蛋白質 分子。依據此定義，當考慮相對於它的污染物，物質可爲 5%或以上、10%或以上、20%或以上、30%或以上、40% 或以上、50%或以上、60%或以上、70%或以上、80%或以 上、9 0 %或以上、9 5 %或以上、9 8 %或以上、9 9 %或以上、 或1 0 0 %之純度。 殘基：本文術語之”殘基”意指特定的胺基酸，通常爲 渉及一個或多個肽鍵，於多肽主鏈或側鏈脫水的結果。 治療：本文術語之"治療"、"治療"、"處理的”或"治療 "意指預防及/或治療。例如當用於關於傳染病時，本文之 術語意指預防性的治療，其可增加宿主對病源菌感染之抗 性，或換言之減低宿主被病源菌感染或顯示感染症候的可 能性，以及在宿主被感染之後進行治療以對抗感染’例如 :減低或滅絕感染或爲預防其惡化。 1362942 槪述 許多以前的硏究者已揭示鏈狀的或分支狀"非抗原性 . 的"PEG聚合物以及衍生物或其結合體之製劑（參閱例如 . :美國專利第 5,428，128 ; 5，621，039 ; 5，622,986 ; 5,643,575 ； 5,728,560 ； 5，730,990 ; 5，738,846 ; 5,811,076 ； 5,824,701 ； 5,840,900 ； 5,880,131 ； 5,900,402 ; 5,9 0 2,5 8 8 ； 5,9 1 9,455 ； 5,95 1,974 ； φ 5,965,119 ； 5,965,566 ； 5,969,040 ； 5,981,709 ； 6,011，042 ； 6,042,822 ； 6,1 1 3,906 ； 6,1 27,355 ； 6,132,713 ； 6，1 77,0 87,以及 6，1 80,095 號； 亦可參閱 PCT公告WO 95/1 3 090以及發表的美國專利申請案編號 2002/0052443、2002/0061307 及 2002/0098 1 92，全文在此 倂入參考文獻）。然而，PEG以及此類以前報告的結合體 至少仍保有弱的免疫產生性，當結合體引入動物進行預防 性的、臨床檢驗或治療的目的時，可發展出結合體PEG @成分之抗體導致討人厭的結果。該抗體可導致快速的消除 內含生物活性的結合體之PEG，從而降低治療組成物的生 物效性（Cheng，T.-L·，et al. ( 1999) ，supra)，以及 可能誘導出免疫複合體調節的病症。此外，迄今爲止並未 揭示致使申稱的PEGs或結合體在實質上不具抗原性或不 具免疫產生性的機制。 本發明克服此類技術之限制。一般而言，本發明提供 穩定組成物以及方法用於這預防、診斷以及治療各種身體 的病症。更明確的說，本發明提供產生降低抗原性反應性 -24- 1362942 聚合物和蛋白質（尤其是治療性蛋白質）穩定之聚合物結 合體的方法，該結合體帶有降低的或實質上降低的抗原性 或其帶有不可偵測的抗原性。在其它具體實施例中，本發 明提供由此類本發明方法製作之結合體，以及組成物， 尤其是包含該結合體之藥學組成物。在額外的具體實施例 中，本發明提供使用該結合體及組成物預防、診斷以及治 療各種身體病症的方法。本發明亦提供包含一種或多種本 發明之結合體及/或組成物之套組。 φ 製備降低的抗原性之結合體 在特色之一中，本發明提供製備降低抗原性、實質上 降低抗原性、或無可偵測抗原性之結合體的方法，其係經 由共價鍵聯結水溶性聚合物至一種或多種生物活性化合物 ’ 或成份，例如一種或多種蛋白質且尤其是一種或多種治療 性蛋白質。在結合體中，選擇的聚合物本身即具有降低的 抗原性'實質上降低的抗原性或無可偵測的抗原性（相較 泰 於典型製備蛋白質-聚合物結合體之標準聚合物）。本文 術語之"降低的抗原性"意指聚合物（例如PAO或PAG， 尤其是PEG，以及最明確的說是單官能活化的PEG)，或 使用該聚合物所包含或合成之結合體或組成物，與形成的 對抗更具抗原性的聚合物（例如mPEG )抗體的反應能力 已作任何量之降低。較佳者，抗原性降低至少約30%，更 佳者降低至少約50%，最佳者降低大於約75% (相較於抗 原性的聚合物）。此外若聚合物（或結合體或組成物）比 -25- 1362942 對應的抗原性的聚合物（例如mPEG)有大約或少於20% ，更佳者大約或少於15%，再更佳者大約或少於10%，最 佳者大約或少於1 %的抗原性時，則此聚合物（或該聚合 物所包含或合成之結合體或組成物）具有"實質上降低的 抗原性"。最後，若用技藝上已知的方法（例如酵素聯結 免疫抗體檢測法或其它偵測抗原性之方法，例如已知的技 藝以及描述於本文之實施例）測定發現聚合物、結合體或 φ 組成物無可偵測的抗原性，則此聚合物（或該聚合物所包 含或合成之結合體或組成物）具有"無可偵測的抗原性"。 聚合物 尤其適用於製備本發明結合體之聚烷二醇類包括（但 非限於）：聚（乙二醇），以及環氧乙烷以及環氧丙烷共 聚物；尤較佳的是PEGs，以及更明確的說較佳的是單官 能活化的羥基PEGs (例如，在單一的末端活化的羥基 馨PEGS’包括羥基PEG-單羧酸反應性酯類、羥基PEG單醛 類、羥基PEG-單胺類、羥基PEG -單醯肼、羥基PEG -單 肼基甲酸酯、羥基PEG-單碘乙醯胺、羥基PEG-單馬來醯 亞胺、順丁烯二醯亞胺、羥基PEG-鄰吡啶基二硫化物、 羥基PEG-單肟、羥基PEG-單苯基碳酸鹽、羥基PEG單苯 基乙二醛、羥基PEG-單噻唑烷-2-甘肽、羥基PEG·單硫酯 類、羥基PEG-單硫醇、羥基peg-單三嗪以及羥基PEG-單乙烯基颯）。 應用於製備本發明結合體帶有降低的抗原性、實質上 -26- 1362942 降低的抗原性、或無可偵測的抗原性的尤佳聚合物，是不 含有甲氧基' 其它烷氧基團或芳氧基團之單官能活化的 PEGs »以該單官能活化的PEGs取代單官能活化的mPEG in來合成本發明結合體可賦予產生的結合體未料到地低抗 原性，即減低以相同生物活性成份之mPEG結合體所發 展之抗體交互反應能力。產生的結合體亦可減低免疫產生 性，即減低喚起免疫反應之能力。 本發明特色之一中，可使用適當可逆阻塞衍生物之活 化基團作爲聚合環氧乙烷之起動劑合成單官能活化的 PEGs ( Akiyama > Y. > et a 1. ( 2 0 0 0 ) Bioconj ug Chem， 11:947-950) 。Akiyama et al.供應使吊 3,3-二乙氧基丙醇 酸鉀作爲起動劑聚合環氧乙烷合成單羥基、單乙縮醛衍生 的PEG的條件。由於Akiyama et al.沒有認知中間物最須 要降低抗原性或免疫產生性，所以經由添加甲磺醯基氯化 物以終止此轉換末端羥基至硫醇之聚合反應，從而產生雜 雙功能PEG而非本發明之PEG衍生物。進一步的證據顯 示此團隊並未確認羥基末端單官能活化PEG之用途，他 們所發表以及申請專利的方法是從單羥基、單官能活化的 PEGs合成製備雜雙功能PEGs以及在一些案例中甚至用 甲氧基"末端帽化"羥基PEGs »同樣地，Bentley，M.D.， et al.在發表的美國專利申請案第2002/0072573 A1號中揭 示的聚合物組成物以及方法，反射出沒有確認到羥基·端 化之單官能活化的聚合物在免疫學上的優點並教示轉換該 聚合物成末端羥基至甲氧基的可取之處。 -27- 1362942 本發明另一特色中，控制兩端內含羥基之鏈狀PEGs ("PEG二元醇"）的活化程度以限制雙活化的PEG之量 . 至可接受的低程度，例如<5 %、較佳者<2%或更佳者< 1 % i ，可合成單功能活化的PEGs，此替代方法展示於實施例 5»在尤佳的特色中，僅從單功能的PEGs中移除未反應 阻斷基團再進行PEG之衍生化反應，而未去除此衍生基 團可合成官能活化的PEGs。衍生的PEG之實施例是PEG-φ羧酸以及可移除接著進行衍生化反應之無反應性阻斷基團 的實施例是芳氧基團（Bentley，M.D.，et al.，PCT publication W00 1 /26692 Al)、三苯甲基團（Kocienski， P. J. ' ( 1 9 9 4 ) Protecting Groups，Georg Thieme Verlag ，Stuttgart，pp.54-58)、以及第三丁氧基團。第三丁氧 基PEG-羧酸可加以活化，例如便用N-羥基琥珀醯亞胺。 最後，第三丁氧基團可用無水的酸解移除產生活化的PEG 羧酸衍生物，該聚合物在末端具有羥基而非甲氧基。更佳 鲁的具體實施例中，第三丁氧基PEG-羧酸可在N-羥基琥珀 醯亞胺活化羧基之前經酸解轉換成羥基PEG-羧酸。本發 明另一具體實施例中，經接觸第三丁氧基PEG與鹵素乙 縮醛可合成第三丁氧基PEG-乙縮醛以及選擇性的無水的 酸解去除第三丁氧基團可將產物轉換成羥基PEG-乙縮醛 或羥基PEG-醛。乙縮醛可轉換成醛（或醛水合物）然後 經垸化偶合至內含胺之化合物（Bentley，M.D.，et al.， U_S. Patent No. 5,990,2 37 )。另一具體實施例中，可經 催化氫解移除聚合物反應端遠端的芳氧基保護基，從而產 -28- 1362942 生本發明單活化的羥基PAG。此外，可逆的阻斷—個以外 所有的末端羥基，如描述於實施例6，可合成單功能活化 的羥基PAGs。 用於製備本發明結合體之PAG聚合物可爲鏈型聚合 物’或可爲在聚合物分子內一個或多個位點分支的分支狀 聚合物。此外，用以形成本發明結合體之聚合物可爲均聚 物’其中單一的單體類型之多重單位可共同聯結以形成聚 合物’例如聚（乙二醇）或彼可爲雜聚物或共聚物（其中 兩種或多種構造之單體單位可共同聯結以形成聚合物，例 如環氧乙烷以及環氧丙烷之共聚物）。該共聚物可爲雜亂 共聚物、嵌段共聚物或交替共聚物。 依據本發明使用之聚合物可爲無反應性聚合物或反應 性聚合物。本文之"無反應性聚合物"是不會以共價鍵附上 蛋白質之聚合物。該π無反應性聚合物”之實施例包括（但 非限於）；mPEG ’其爲一個末端具有羥基且另—個末端 具有甲氧基之環氧乙烷單位之鏈型聚合物，以及PEG二 醇，其爲兩端具有羥基之環氧乙烷單位鏈型聚合物。本文 之n反應性聚合物"是在生物活性成份（例如蛋白質）上可 與溶劑-易接近的親核的基團，例如硫醇基或胺基反應之 聚合物’包括（但非限於這）：α胺基或離氨酸殘基之ε 胺基。”反應性聚合物”之實施例包括（但非限於）：PEGs ’其中經基末端基團已經轉換或經親電子基團取代，經親 電子基團爲例如：琥珀醯亞胺基丙酸（如"SPA-PEG")或 對硝基苯碳酸鹽（如"NPC-PEG")、或醛（如PEG-醛） 1362942 .» . 1 « * . 1 。除了聚環氧烷類之外，適當的聚合物可包含聚乙烯醇、 聚（氧基乙烯-氧基亞甲基）共聚物、聚醯胺（例如Rose ，K.，PCT公告W0 0 0/12587)、聚羧酸酯、聚（乙烯基 妣略院_)(乂〇113?6(；1^，8.-1；.，6131.( 1973)11〇?口6-Seyler's Z Physiol Chen 3 5 4:1 659 1 660 )、聚 D_ 胺基酸及 / 或聚L -胺基酸、聚丙燃醯基嗎福琳（Rocca，M.，et al. (1 996 ) Int J Artif Organs 1 9:730-734 )以及聚葡萄糖（ 鲁 Iakunitskaya，L.M. ， et al. ( 1 9 8 0 ) Prikl Biokhim
Mikrobiol 1 6:23223 7 )。技藝上已知的與目標生物活性成 份上各種位點或多或少具有反應選擇性之PEG、PEOs以 及其它 PAOs衍生物，可購自供應商，例如 Fluka ( Milwaukee > WI ) ； N OF Corporation ( Tokyo，Japan)；
Shearwater Corporation ( Huntsville ， AL ) ， Nektar
Therapeutics ( San Carlos，CA )之子公司；Sigma Chemical Company ( St. Louis，MO)或 SunBio，Inc.( 鲁 Anyang City，South Korea )。 適用於本發明方法以及組成物之活化形式的聚合物包 含技藝上已知的任何羥基終止的、單功能活性形式的聚合 物。適當者爲例如各種大小之鏈狀的和分支狀PAOs，包 括分子量（活化基團之質量除外）介於約IkDa至約 lOOkDa。分子量適當的範圍包含（但非限於）：約2kDa 至約 60kDa ；約 2kDa 至約 30kDa ；約 5kDa 至約 20kDa ； 約 10kDa至約 20kDa ;以及約 18kDa至約 60kDa，約 20kDa或約30kDa。在鏈狀的PEGs中，分子量範圍約 -30- 1362942 20kDa至約30kDa’相當於聚合度（n)介於約450至約 680之環氧乙烷單體單位。應注意的是遠在確認mPEG之 免疫產生性之前已先觀察到偶合治療性蛋白質至相對高範 圍分子量（即>20-30kDa)聚合物之優點（Saifer，μ·，et al.’ PCT 公告 WO 89/01033，發表於 1989 年二月 9 日， 全文在此倂入參考文獻）。 可視需要，鏈型聚合物在一端或兩端可具有反應性基 團，從而產生"反應性聚合物"》在某些本發明具體實施例 中，其可令人滿意的使用單丙酸衍生的PEG的琥珀醯亞 胺基酯，揭示於 Harris，J.M.，et al.，美國專利第 5,672,662號，全文在此倂入參考衮獻，或其它琥珀醯亞 胺活化的PEG-羧酸。在某些其它具體實施例中，其可令 人滿意的使用PEG之琥珀醯亞胺基碳酸鹽衍生物（"SC-PEG")，描述於 Saifer，M.，et al.，美國專利第 5,006,333 ; 5,080,891 ; 5,283,317 以及 5,468,478 號，或 PEG衍生的對硝基苯碳酸鹽，揭示於Kelly，S.J.，et al. (200 1 ) supra ； PCT 公告 WO 00/07629 A2 > supra 以及 對應的美國專利第 6,5 76,23 5號，以及 PCT公告 WO 0 1 /59078 A2 supra。此外，其它類型之反應性基團可用以 合成聚合物蛋白質之結合體。此類衍生物包括（但非限於 ):PEGs之酵衍生物（Royer，G.P.，美國專利第 4,002,531 號；Harris，J.M.，et al·，美國專利第 5，252,714號）、PEGs之胺、溴苯基碳酸鹽、羰基咪唑、 氯苯基碳酸鹽、氟苯基碳酸鹽、醯肼、肼基甲酸酯、碘乙 -31 - 1362942 醯胺、馬來醯亞胺、鄰吡啶基二硫化物、肟、苯 、噻唑烷-2-甘肽、硫酯、硫醇、三嗪以及乙烯 . 物。 . 在本發明某些具體實施例中，聚合物偶合至 成份產生本發明結合體之反應期間可令人滿意的 子內以及分子間聚合物（例如經由PEG )形成之 用僅在一個端點活化的聚合物（本文稱爲"單官 φ PEGs"或"單官能活化的PAGs")或雙官能基活化 (本文之"雙-活化的PEG二元醇"的鏈狀PEGs ) 少於3 0%、或更佳者少於1 0%或最佳者少於2% ( 聚合物製劑，可完成上述之目的。使用主要是單 的聚合物可極小化所有下列；在個別地蛋白質分 子內交聯的形成（"啞鈴"構造），其中一股聚合 種蛋白質分子、以及較大的聚集物或凝膠。當使 反應的活化聚合物時，理論上可聯結在一個蛋白 ®聚合物股極大値相當於胺基之總數。在任何聚合 特定條件下可接近蛋白質之表面的實際胺基的數 理論上的最大値。 本發明結合體可包含一股或多股聚烷二醇股 約1至約100股，每治療酵素的次單體約1至乾 以及約1至約3股，以及更佳者每受體-結合細 、生長因子、蛋白質荷爾蒙以及菌落刺激因素的 1至約2股。尤較佳的該具體實施例中，用於製 之聚烷二醇包含一或二股聚（乙二醇）（尤其是:
基乙二醛 基碾衍生 生物活性 極小化分 交聯。使 能活化的 的聚合物 之百分比 :vv/w )之 功能活化 子內之分 物連接二 用與胺基 質分子的 物偶合的 目可小於 ，較佳者 丨20股， 胞激動素 次單體約 備結合體 竣基PEG •32- 1362942 、羥基PEG、二羥基PEG或PEG·乙縮醛）。某些具體實 施例中，鏈狀或分支狀聚烷二醇具有之分子量約IkDa至 約 lOOkDa，較佳者約2kDa至約 60kDa;約 5kDa至約 20kDa ；約 lOkDa 至約 20kDa ；約 18kDa 至約 60kDa ；以 及最佳者約18kDa至約22kDa或約27kDa至約33kDa( 若爲鏈狀），以及總共約36kDa至約44kDa (若此聚合物 有二個相等質量之分支）。 生物活性成份 如上述，本發明結合體包含一個或多個PAGs或 PAOs’尤其是一股或多股PEG，以共價鍵聯結在一個或 多個生物活性成份。一個或多個以共價鍵與生物活性成份 聯結之聚合物（或其股），在本文中名稱雖有變化，但等 同於”共軛結合的生物活性成份”或"經修飾之生物活性成 份"。此類術語可與”未共軛結合的生物活性成份"、"起始 生物活性成份"或"未經修飾之生物活性成份”區別，所有 術語均意指沒有和一個或多個聚合物共價鍵聯結的生物活 性成份。在另一特色中’本發明提供經由攙和聚合物穩定 生物活性成份溶液之方法以及組成物。然而據瞭解，"未 共軛結合的"、"未經修飾之"或"起始"生物活性成份可含 有其它非聚合物共軛體或修飾體（當相較於野生型或天然 的分子），由於這"未共軛結合的"、"未經修飾之"或„起 始"生物活性成份可聯結上聚合物，所以仍可考慮爲依據 本發明之"未共軛結合的"、"未經修飾之"或，，起始"生物活 -33- 1362942 性成份β 本文術語之"穩定"生物活性成份（或"穩定"或"穩定 . 生物活性成份”方法）表示生物活性成份已依據本發明方 . 法加以穩定（即生物活性成份已依據本發明方法共價鍵聯 結或混合於聚合物）。當相較於未經穩定化的生物活性成 份（即未經共價鍵聯結或混合於聚合物的生物活性成份） ，該穩定生物活性之成份將展示某些改變的生化以及生物 •物理特性。包括在該改變的生化以及生物物理之參數中， 尤其是蛋白質例如酵素可減低自溶現象以及尤其是在某些 嚴厲的環境或實驗條件下於反應期間保存蛋白質之活性。 在本發明某些具體實施例中，改變的生化以及生物物理的 參數可包括，例如：增加在生物體內循環中的半生期，增 加生物效性等。 任何成分（典型地分子或巨分子複合體）其具有生物 的（即生理的、生化的或醫藥學的）活性，可適當地作爲 #本發明之起始成分。該生物活性成份包括（但非限於）： 蛋白質、多胜肽、肽類、治療性的病毒、有機化合物等。 生物活性成份亦包含蛋白質、多胜肽、肽類、治療性的病 毒、有機化合物及其類似者之片段、變異體以及衍生物， 尤其是具有生物的（即生理的、生化的或醫藥學的）活性 之片段、變異體及其衍生物。 本發明中作爲生物活性成份的適當有機化合物包括（ 而未限制）例如：紫杉烷、蒽土黴素部份，化合物包括： 柔紅霉素、阿霉素、Ρ-胺基苯胺芥末、苯丙氨酸氮芥、阿 -34- 1362942 糖胞苷（"Ara-C")以及其它抗-代謝的化合物，例如吉西 他濱等。此外’此生物活性成份可爲心血管藥劑、抗-腫 瘤劑、抗-傳染劑、抗真菌劑’例如：制黴菌素以及兩性 黴素B、抗-焦慮藥劑、胃腸的藥劑、中樞神經系統活性 劑、止痛藥、能育性藥劑、避孕劑、消炎的藥劑、類固醇 的藥劑、抗血尿酸劑、血管舒張藥劑、血管緊縮劑等。 用於本發明生物活性成份的適當肽類、多胜肽、酵素 以及其它蛋白質、糖蛋白及其類似者包含具有至少一個胺 基、硫醇基或其它基團其可聯結聚合物的任何肽、多肽、 酵素或其它蛋白質等。該成份包含具有生理的或藥理活性 ，以及能在有機溶劑中催化反應的材料。狀類、多胜肽以 及重要的蛋白質包括（但非限於）：血紅素、血清蛋白質 ，例如凝血因子，例如：因子VII、VIII、以及IX、免疫 球蛋白、胰島素、細胞激動素，例如介白素，例如：IL -1 至IL-18、干擾素（例如：干擾素-α、干擾素-β'干擾素_ γ以及共有序列之干擾素）、菌落刺激因素包括（而未限 制）：GM-CSF、G-CSF、巨噬細胞菌落刺激因素、促血 小板生成素、巨核細胞生長以及發生因子、紅細胞生成素 、源自血小板之生長因子、磷脂酶-活化蛋白質（"PPL ΑΡ" )、白血病抑制性因子（"LT-F"亦爲技藝上已知的"青灰 因子"）、神經營養因子以及幹細胞激動素以及其模仿肽。 生物活性劑之受體-結合拮抗劑亦適用於作爲本發明之生物 活性成份。其它普通的生物性或治療性蛋白質包含：胰島 素：植物蛋白質，例如外原凝集素以及蓖麻毒蛋白、腫瘤 -35- 1362942 壞死因子以及相關的蛋白質、生長因子例如轉形生長因子 ，例如：TGF-α或TGF-β、成纖維細胞生長因子、表皮生 . 長因子、肝細胞生長因子、荷爾蒙、生長調節素、紅細胞 生成素、色素的荷爾蒙、下室丘的釋放因子、抗利尿素、 催乳素、絨毛（膜）性促素、濾泡刺激荷爾蒙、甲促素、 催乳素 '組織血纖維蛋白溶酶原活化蛋白、其受體-結合 蛋白質拮抗劑等。許多該蛋白質存在有糖基化的以及非糖 擊基化的形式。非糖基化的形式是在原核生物中使用重組技 藝產生之原核細胞。在肽類以及蛋白質之中該非糖基化的 產物是本發明適當的生物活性成份。 重要的酵素包含碳水化合物專一性酵素、蛋白質分解 酵素、氧化還原酶、轉移酶、水解酶、溶解酶、異構酶、 及連接酶。未限制特定的酵素，重要酵素的實施例包含： 門冬醯胺酶、精胺酸酶、精氨酸去亞胺酶、腺苷脫胺酶、 超氧化物岐化酶酶、內毒素酶、過氧化氫酶、胰凝乳蛋白 #酶、脂酶、尿酸分解酶、腺嘌呤核苷二磷酸酯酶、酪胺酸 酶以及膽紅素氧化酶。重要的碳水化合物-專一性酵素包 含：葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷 脂酶、葡萄糖醛酸苷酶等。 亦適用於作爲本發明結合體中之生物活性成份是在在 生物體內展現生物活性之化合物。該化合物包括（而未限 制）：胺基酸序列、核酸（DNA、RNA )、肽核酸（ "PNAs")、抗體片段、單鏈結合蛋白質（參閱例如： Ladner ’ R.C·，et al.，美國專利第 4,946,778 號，全文在 -36- 1362942 此倂入參考文獻）、結合分子包括：可溶解的受體、多株 的抗體、單株抗體、催化的抗體以及融合抗體或其片段之 產物。 蛋白質或其部份可使用一般熟悉此技藝的專業人士習 知的技藝製備或分離，例如化學合成、細胞、組織或器官 培養、萃取自動物、或重組DNA方法。胺基酸序列、多 胜肽以及蛋白質及其類似者亦可考慮導入外來基因的來源 。該材料可得自基因轉殖動物，例如：小鼠、兔子、豬、 山羊以及牛，其中該蛋白質係表現於牛奶、血或組織、或 導入外來基因鳥類的卵。亦可考慮導入外來基因的昆蟲以 及真菌的或桿狀病毒表現系統作爲來源。此外，蛋白質之 突變種亦是在本發明範圍之內。 其它重要的蛋白質是過敏原蛋白質，例如：豚草、抗 原E、蜂蜜蜂毒、蟎變應原等。前述的說明是說明用於本 發明之蛋白質。據了解其它肽類、多胜肽或蛋白質、或其 片段，在本文中沒有特別地提及但有提供一個或多個胺基 或硫醇基適於偶合至一個或多個依據本發明之聚合物，預 期亦在本發明範圍之內。 本發明較佳的特色中，能與聚合物偶合之化合物是生 物活性化合物，其係適用於作爲藥物或臨床檢驗用途以治 療動物，例如：哺乳動物（包括人類），所要求治療的症 狀。前述的表單是爲了說明而不是限制可經修飾之化合物 。那些平常的技能將可認出同樣地經修飾之其它化合物而 不必透過實驗。據了解那些不^特別地提及但具—個或多 -37- 1362942 個可提供的親核的基團，例如胺基或硫醇，其係易接近的 可偶合至一個或多個依據本發明聚合物的生物活性材料， . 亦預期是在本發明範圍之內。 _ 應注意到適用於倂入本發明結合體之生物活性成份在 結合體中或立刻水解性從結合體釋放出來之後可爲本身不 具活性的物質或化合物，但經進一步的化學加工或反應之 後可變得具有活性。例如，以本發明結合體的形式運送至 φ血流之抗癌藥物，可保持去活性的直到進入癌症或腫瘤細 胞，在在癌症或腫瘤細胞之內可經化學方法活化，例如經 細胞中獨一無二的或特別有效的酶催化反應。 本發明結合體及組成物中其它適用的生物活性化合物 包含內含羥基之化合物，例如喜樹鹼以及相關的拓樸異構 酶I抑制劑。喜樹鹼是不溶於水的細胞毒生物鹼製作自喜 樹（原產於中國）以及清脆枝樹（原產於印度）。喜樹鹼 以及相關的化合物以及類似物亦是習知的可能的抗癌症或 抗腫瘤藥劑以及在體外以及在活體內已顯示此類活性（參 閱例如：美國專利第 4,943,579、5,004,758以及 Re 32,5 18號，全文在此倂入參考文獻）。該化合物以及其衍 生物可使用習知的合成技藝無須過度的實驗而加以製造。 本文使用的較佳喜樹鹼衍生物包含20-OH或能和活化形 式的聚合物（例如本發明單官能活化的PEGs )直接反應 的另一羥基。 額外的內含羥基部份適用於作爲結合體之生物活性成 份包含紫杉烷以及太平洋紫杉醇衍生物。本發明目的中本 -38- 1362942 文術語之"紫杉烷"包括松稀油家族內所有的紫杉烷化合物 。因此，紫杉醇（太平洋紫杉醇）、3·-經取代的第三丁 氧基羰基-胺衍生物（泰索帝）及其類似者、與其它那個 使用標準有機的技藝合成或是可購自商品來源例如Sigma (St. Louis，MO)之類似物）是在發明範圍之內。此類 化合物及其衍生物已發現爲有效的抗-癌症藥劑。許多的 硏究指出此藥劑有對抗各種惡性腫瘤以及其它癌症之活性 —般熟悉技藝的專業人士將認知，依據本發明用適於 和單功能高分子聯結具有降低的抗原性、實質上降低的抗 原性或不可偵測的抗原性之任何習知的以及在此技藝中立 即可提供的生物活性成份。依據某些本發明特色，此類起 始生物活性成份係用於產生結合體，其中一種或多種 PAGs或PAOs可共價鍵地聯結至此類生物活性的分子。 在起始生物活性成份分子上聚合物可有利聯結的位點包含 :肽分子上之離氨酸殘基，該殘基各有二個胺基。一個胺 · 基（α胺基）參與狀鍵之形成（除了離氨酸爲蛋白質胺基 端殘基之外），留下的另一胺基（ε胺基）可提供作爲聚 合物偶合。蛋白質或肽分子上可爲聚合物有利地聯結的其 它位點包括（尤其是指）：多肽胺基端殘基之α胺基；蛋 白質或肽上半胱胺酸殘基之硫氫基（Braxton，S.M.，U.S.
Patent No. 5,766,897 )，其可聯結在乙烯基碾、馬來醯亞 胺、碘乙醯胺、溴乙醯胺或鄰吡啶基二硫化物活化的聚合 物，此外技藝上已知硫醇-反應性基團可偶合至蛋白質或 -39- 1362942 肽精氨酸殘基之胍基團（Sano，A.，et al.，美國專利第 5,093,531號），其可偶合至苯基乙二醛活化的聚合物； . 蛋白質或肽上之C-端殘基之α羧基團、天門冬胺酸酯殘 基上之Ρ羧基團以及麩胺酸殘基上之γ羧基團（Sakarie， T.，et al. ( 1 997 ) Pharm Res 14:1 085-1091 )，其可偶合 至聚合物之胺基或醯肼衍生物。其它蛋白質或肽分子上一 種或多種聚環氧烷類可有利聯結的適當位點對一般熟悉此 φ技藝的專業人士是立即而明顯的，尤其是顧及肽以及本揭 示蛋白質之一級以及三級結構。 在將聚合物偶合於目標生物活性成份（例如蛋白質） 之前，可有利的先純化成分去除污染物；否則，完整的成 分修飾程度分析會因爲聚合物結合在成分以及其它污染物 片段而複雜化。不論共軛結合的蛋白質是否得自天然的來 源或製作自重組方法，由於任一來源之製備中均預期污染 物之存在，所以純化生物活性成份是有利的。純化給定的 暴生物活性成份可用通常熟悉技藝的專業人士已知的任何技 藝方法完成，包括（但非限於）：電泳、透析、鹽萃取（ 例如硫酸銨沈澱）、色譜法（例如親和層析法、離子交換 層析法、大小排除層析、高效能液相色譜法（"HPLC") 、快速蛋白質液相層析（"FPLC")及其類似者）或其組 合。然而據瞭解，純化給定的生物活性成份對於製備聚本 發明合物-生物活性成份結合體不是必要，由於粗製備中 的生物活性成份（尤其是蛋白質）亦可有利地依據本發明 方法共轭結合至聚合物。 -40- 1362942 聚合物偶合至生物活性成份 本發明使用之PAGs (如上指出），較佳者是與偶合 基團反應活化，可聯結於生物活性成份分子上肽鍵、硫醇 基以及酚羥基以外任何數目之基團，例如：羧基團或胺基 。在某些肽類或蛋白質中，較佳之活化的PAGs可偶合至 N-端α胺基及/或離氨酸殘基之胺基及/或半胱胺酸殘基之 硫氫基。 天然的或純化的生物活性成份（例如蛋白質）可和活 化的聚合物在酸鹼度介於約11 (或任何去活化蛋白質可 被逆轉之最高酸鹼度之鹼性下）至約酸鹼度5(或任何去 活化蛋白質可被逆轉之最低酸鹼度之酸性下）之緩衝液中 反應（參閱 Arakawa，Τ.，et al. ( 1 990 ) Biopolymers 29:1 065- 1 068 )。技藝上已知的，一般熟知技藝之專業人 士可立即認知在某些蛋白質或聯結化學中要使用低酸鹼度 將聚合物偶合至蛋白質。然而，某些其它蛋白質以及某些 偶合化學中使用較高的酸鹼度則較有利，此係取決於蛋白 質在溶解度以及穩定性上之酸鹼度效應和活化的聚合物在 去活化上之速率（是否是自發的或蛋白質本身催化的）相 對於依據技藝上已知的方法聯結聚合物至目標蛋白質之速 率〇 PAG以及這生物活性成份間之反應通常在溶液中進行 ，較佳者爲酸鹼度介於約5至約11之水溶性緩衝溶液。 偶合PAG至蛋白質的生物活性成份（例如多肽、肽、蛋 1362942 白質、或其片段）尤佳的酸鹼度値從約7至約9，最佳者 從約7至約8。其它具體實施例中，以酸鹼度値約4.5至 . 約6.5爲較佳β在25 °C下提供此類範圍酸鹼度値緩衝溶液 . 之實施例包括（但非限於）： 5〇毫升0·1莫耳濃度二氫磷酸鉀+ 5.6至46.1毫升 〇·1莫耳濃度NaOΗ，稀釋至100毫升 50毫升0.02 5莫耳濃度硼酸鹽+ 2.0至20.5毫升0.1 Φ莫耳濃度HC1，稀釋至100毫升 50毫升〇_〇25莫耳濃度硼酸鹽+0.9至18.3毫升0.1 莫耳濃度NaOH，稀釋至100毫升 50毫升0.05莫耳濃度碳酸氫鈉+ 5.0至10.7毫升0.1 莫耳濃度NaOH，稀釋至100毫升 50毫升0.05莫耳濃度醋酸+5.0至30毫升0.1莫耳濃 度NaOH’稀釋至100毫升 50毫升0.05莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷HC1 +10至 參50毫升0.1莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷鹼，稀釋至100毫 升 酸或鹼精確的調整量以用於提供特定的所要求的酸鹼 度’將可由熟悉此技藝的專業人士立即決定。 於特定實例中若要使用生物學緩衝液時，可使用下列 之一： 羥基乙基哌嗪·乙烷磺酸（"HEPES") 3 - ( N -嗎福啉基）丙烷磺酸（"μ Ο P S ") .3- ( Ν-嗎福啉基）-2-羥基丙烷磺酸（"MOPSO") -42- 1362942 哌嗪-N，N'-雙（2-羥基）丙烷磺酸）（"POPSO") PAG以及這生物活性成份通常是在不會導致去活化或 變性，例如生物活性成份仍保留實質上生物活性之溫度以 及適當的攪拌反應物之攪拌條件下進行反應。PAG以及生 物活性的蛋白質間之反應較佳者進行之溫度約4 °C至約40 °C。更佳者，反應進行介於約以及81之間或在室溫 下，即約20 °C至約25 °C。PAG以及非蛋白質生物活性劑 ，例如：肽類以及生物活性的有機的化學藥品間之反應可 在偶合至PAG之特定的生物活性的有機的化學品穩定性 相容之較高的或較低的溫度下進行。 熟悉此技藝的專業人士將容易的理解PAG相對於生 物活性成份之用量視聚合物偶合至生物活性成份所要求的 程度而定。例如，當要將PAG和溶劑-易接近的離氨酸殘 基的特定部分（當生物活性成份是多肽時）反應時，PAG 之莫耳濃度至少要等於須要偶合的離氨酸之莫耳濃度。明 顯地’若衍生的生物活性成份分子其溶劑-易接近的位點 較少’則須要對應至較少的PAG。然而一般而言，PAGs 之莫耳濃度是過量的，本案發明人測定較佳的莫耳濃度過 量爲2至1〇倍量級。 反應須要的時間取決於許多因子，例如反應溫度、反 應物濃度、以及衍生化反應所要求的程度。反應進展可用 習見的方法監測，例如用大小排阻層析或膠體電泳週期性 的分析樣品。終止反應係可添加具有反應性基團的低分子 量化合物’例如甘胺酸，以清除過量的胺反應性PAG或 1362942 以層析分離。在室溫下，反應時間約15分鐘至約24小時 ，此爲典型地PAG和大多數生物活性成份結合基團（例 . 如離氨酸基團之多胜鍵）反應所須要的時間。較低的溫度 .下須要較長的反應時間。熟練的專業人仕將瞭解共軛時間 、與PAG之用量以及類型，不必須是例如使生物活性成 份失活，即不必須是導致實質上流失生物活性成份之生物 活性。”不造成實質上流失生物活性成份之生物學活性"意 鲁指PAG-共軛結合的生物活性成份顯示至少約生物活性（ 例如：活性；受體結合能力；抗-腫瘤的活性；等）之 1 0 %，較佳者至少約 2 0 %、3 5 %、5 0 %、7 5 %、9 0 %、9 2 % 、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，其可用沒 有軛結合PAG的相同生物活性成份在體外或在活體內之 水準說明。 純化聚合物-偶合的生物活性成份可使用熟悉此技藝 的專業人士常用之方法，例如：大小排除色譜法、離子交 •換層析法、超濾法、透析等。反應產物溶液可視需要用旋 轉蒸發器濃縮以及產物可用冷凍乾燥法得到乾燥狀態。 取決於使用之特定的生物活性成份以及和PAG反應 之程度，產生的預期適用於診斷或治療之加合物，會展現 (當相較於這未反應的生物活性成份）減低之抗原性和免 疫產生性、增加的循環半生期、以及增加穩定性，而仍維 持適用的生物活性水準。 生物活性成份可與以上討論之單官能活化的分支狀聚 (乙二醇）聚合物（尤其是一個或多個單官能活化的、分 -44- 1362942 支狀二羥基PEGs，例如：二羥基PEG-離氨酸）在緩衝的 (取決於親核劑以及活化的聚合物需求之酸鹼度）反應水 溶液中性反應。反應最佳的酸鹼度一般而言介於約6.5以 及約8.5之間，較佳者約7.4以維持大多數多胜肽之溶解 度以及穩定性。偶合活化的PAG，例如：NPC-PEG至哺 乳動物的尿酸分解酶最佳的酸鹼度大約爲酸鹼度10，而 選擇性偶合某些活化的PAGs至蛋白質或肽之N-端α胺基 最佳的酸鹼度介於約4至約7。必需保持生物活性成份穩 · 定性、反應效率等最佳的反應條件是一般熟悉此技藝的專 業人士所熟知之水準。較佳的溫度範圍介於約4°C至約40 °C。反應溫度必須不超過此溫度否則親核劑會變性或分解 。較佳者親核劑之和過量的活化的支化聚合物反應。反應 後回收及純化結合物，例如用透析過濾；管柱層析法、其 組合等方法。
使用分子模式可協助最佳化聚合物偶合至蛋白質之策 略。例如，可用X-光晶體學資料產生蛋白質溶劑可及表 H 面的計算化之影像（Sayle，R_A·，et al. ( 1995) Trends Biochein Sci 20:3 74-3 76 )。基於核磁共振的構造分析亦 可用於測定。可與特定活化的聚合物反應的表面上易接近 位點的部分、以及聚合物股各種不同的位點之分佈，可選 擇適當的活化基團，聚合物對蛋白質之莫耳比和適當的偶 合反應條件（例如：酸鹼度、溫度、反應物濃度、反應持 續期間）加以調控。在某些情況下，聚合物可在酵素活性 部位夠遠的地方有利的附上殘基，極小化生物活性任何負 -45- 1362942 面之效應。例如，蛋白酶K之表面含有許多可能聯結聚 合物的位點，其可用各式化學試劑活化。然而，某些本案 . 發明人在以前的發現大多數蛋白酶 Κ溶劑-易接近的離氨 . 酸殘基位於酵素催化部位遠方使得使用胺-反應性聚合物 對此特定的酵素會產生尤其是令人滿意的結果（參閱申請 中的美國專利申請案編號1 0/1 83,607，申請日期2002年 6月28日，全文在此倂入參考文獻）。 • 在某些具體實施例中（例如當酵素的催化結構區含有 可和活化的聚合物反應之胺基（例如說明如上）時），其 可爲令人滿意的接觸活化的聚合物以遮位活性部位，在該 案例中酵素可緊密但可逆結合至大到足以在空間上阻礙 活化的聚合物接近活性部位之內或附近反應性殘基的反應 受質類似物或競爭性抑制劑（參閱例如：Nahri，L.O.，et al. ( 1991) JProtein Chem 10:385-389)。此外，該類似 物或抑制劑可結合於可吸附蛋白質之固態基質。當結合至 β產生的”親和性基質"，此蛋白質可和活化的聚合物反應。 此策略可極小化反應性聚合物偶合至可能抑制催化作用之 位點。其後選擇性修飾之蛋白質可用熟悉此技藝的專業人 士習知的方法自親和性基質釋出（參閱 Wilchek，M.，et al. ( 1 984 ) Methods Enzyniol 1 04:3-5 5 )。產生的結合體 可包含聚合物優先聯結在不妨礙蛋白質生物活性位點之蛋 白質分子。 偶合反應後，衍生至各種程度之結合體可使用大小排 除及/或離子交換層析法分離，描述於Sherman，M.R.，et -46 - 1362942 al. ( 1997 ) supra。例如，Superdex®75 商標 HR 10/30 管 柱或 Superdex®200 商標 HR 10/30 管柱（Amersham Phannacia Biotech’ Piscataway，NJ)色譜法可分離不同 聚乙二醇化程度的蛋白質分子，且可從偶合反應之副產品 中分離出自由PEG殘留物（參閱申請中的美國專利申請 案編號 1 0/1 83,607，supra)。 組成物 本發明提供本發明方法製作的減低抗原性之聚乙二醇 化的生物活性成份的穩定結合體。相關的特色中，本發明 亦提供包含一個或多個該結合體之組成物。依據本發明將 特色之組成物包含一個或多個（例如：一、二、三、四、 五、十等）本發明上述的結合體。在某些特色中組成物可 包含一個或多個額外的成份，例如一個或多個緩衝鹽類、 一個或多個離液劑、一個或多個兩性介面活性劑、一個或 多個蛋白質（例如，一個或多個酵素）、一個或多個聚合 物等。本發明特色之組成物可爲任何形式，包括固態（例 如乾燥粉劑）或溶液（尤其是包含一個或多個本發明結合 體之生理上相容的緩衝鹽溶液的形式）。 藥學組成物 某些本發明組成物尤其可調製成應用於預防性的、臨 床檢驗或治療的用途的藥學組成物。該組成物典型地包含 一種或多種本發明結合體以及一種或多種醫藥學上可接受 -47- 1362942 的載體或賦形劑。本文術語之"醫藥學上可接受的載體或 賦形劑"，意指無毒的固體、半固態或液體塡料、稀釋劑 . 、任何類型的包膠材料或調配輔助劑，其係爲加入藥學組 . 成物後引入接受體動物，包括人類或其它哺乳動物’其可 耐受，而無負面效應的材料。 本發明藥學組成物可經由任何適當的投用模式，例如 :口服地、直腸地、非經腸地、全身內的、陰道內的、腹 鲁腔內的、局部（粉末、油膏、點滴或經皮貼片）、口頰的 、口服的或鼻噴液或吸入法投用至接受體。本文術語之" 不經腸道的"意指投用模式，包含靜脈內的、肌肉內的、 腹腔內的、囊泡內的、皮下和關節內的注射以及輸注。 本發明提供的不經腸道的注射藥學組成物可包含醫藥 學上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或 乳狀液，以及使用之前重新調製成無菌的注射溶液或分散 液的無菌粉末。適當的水溶液以及非水溶液的載體、稀釋 參劑、溶劑或載劑之實施例，包含：水、乙醇、多元醇（例 如甘油、丙二醇、聚（乙二醇）、及其類似者）、羧基甲 基纖維素以及其適當的混合物、植物油（例如橄欖油）、 以及可注射的有機酯類例如乙基油酸酯。使用塗敷劑例如 卵磷脂，當分散時可維持須要之粒度以及使用表面活性劑 可維持適當的流動性。 本發明藥學組成物亦可含有佐劑，例如防腐劑、溼化 劑、乳化劑以及分散劑。預防微生物之作用可各種抗菌性 以及抗真菌的藥劑確保其達成，例如：對氧苯甲酸、苯甲 -48- 1362942 醇、氯丁醇、酚、山梨酸等。亦可令人滿意的包含滲透劑 ，例如糖、氯化鈉等。長期吸收的可注射的醫藥學形式可 內含延遲吸收之藥劑，例如：單硬脂酸鋁、水凝膠以及明 膠。 在一些案例中，爲了延伸藥效，須要延緩從皮下或肌 內注射之吸收。此可使用具有不良溶解度之結晶或非結晶 液體懸浮液之水溶液完成。然後藥物吸收速率可依其溶解 的速率而定，即取決於其物理的形式。此外，非經腸地投 用藥物形式其延緩的吸收可經藥物溶解或懸浮於油載劑加 以完成。 製造可注射的點滴形式是採用生物可降解性高分子例 如聚丙內酯聚糖內酯形成藥物微封包的基質。取決於藥物 與載體聚合物之比例，和使用的特定載體聚合物本質，可 控制藥物釋出速率。其它生物可降解性高分子之實施例包 含生物相容的聚（正酯類）以及聚（酐）。可注射點滴的 調配物亦可用誘捕藥物之脂質體或用能和體組織相容之微 乳狀液製備。 可注射的調配物在使用之前可加以滅菌，例如經由過 濾細菌的濾器，或以無菌的固態組成物的形式倂入可溶解 或分散於滅菌水或其它無菌的注射液之消毒劑。 口服投用之固體劑量形式包含膠囊、藥片、藥九、粉 末以及顆粒。在固體劑量形式中活性化合物可混合至少一 個醫藥學上可接受的賦形劑或載體，例如：檸檬酸鈉或磷 酸二鈣及/或a )塡充劑或增量劑，例如：澱粉、乳糖、蔗 -49- 1362942 糖、葡萄糖、甘露糖醇、以及矽酸；b)結合劑，例如·· 羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗 -糖、及阿拉伯膠；c )保濕劑，例如甘油；d )崩解的藥劑 . :例如：瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、藻酸 、某些矽酸鹽、及碳酸鈉：e)溶解遲滯劑例如石蠟；f) 吸收加速劑，例如：四級銨化合物；g )溼化劑，例如： 十六烷基醇以及甘油單硬脂酸鹽；h)吸附劑，例如：高 鲁嶺土以及膨潤土、黏土；以及i)潤滑劑，例如：滑石粉 、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態聚（乙二醇）、硫酸月桂酯 鈉、及以上之混合物。膠囊、藥片以及藥九劑型中亦可包 含緩衝劑。 相似類型的固體組成物亦可使用乳糖與高分子量 PEGs等作爲賦形劑以作爲軟-以及硬明膠膠囊之塡充劑。 •藥片、糖衣藥九、膠囊、藥九以及顆粒之固體劑量形 式可用塗料以及外殼，例如腸內的或慢性調控塗料以及其 ®它醫藥學的調製技藝熟知的塗料製備。彼可視需要含有不 透明化藥劑以及亦可爲僅在（或優先在）胃腸道某些部份 以延發的方式釋放出有效成份之組成物。可使用之包埋組 成物的實施例包含聚合的物質以及蠟。活性化合物亦可爲 微封包的形式，若適當可含有一個或多個上述的賦形劑。 口服投用的液體劑量形式包含醫藥學上可接受的乳狀 液、溶液、懸浮液、糖漿以及酏劑。除了活性化合物之外 ，液體劑量形式可含有此技藝中常用的惰性稀釋劑，例如 :水或其它溶劑、溶解劑以及乳化劑，例如：乙醇、異丙 50 - 1362942 醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇 、1，3-伸丁基（乙）二醇、二甲基甲醯胺、油類（特定言 之’棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄欖油、麻油、以及芝 麻油）、甘油、四氫糠醇、PEGs以及山梨糖醇酐脂肪酸 酯、及以上之混合物》 除了惰性稀釋劑之外，口服的組成物亦可包含佐劑， 例如：溼化劑、乳化劑以及懸浮劑、增甜劑、矯味劑以及 香味劑。 除了活性化合物之外，懸浮液可含有懸浮劑，例如： 乙氧化異十八烷基醇、聚氧乙烯山梨糖醇以及山梨糖醇酐 酯類、微晶粒纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂 、以及特拉加康斯膠樹、及以上之混合物。 塗覆投用包括投用至皮膚或粘膜，包括肺及眼睛表面 。塗覆投用組成物，包括吸入劑，可製備成可加壓的或非 加壓的乾燥粉劑。非加壓的粉劑組成物，細分形式的有效 成分中可攙和較大的顆粒大小例如直徑多至100微米之醫 藥學上可接受的惰性載體使用。適當的惰性載體包含糖， 例如：乳糖和蔗糖。至少95 %以重量計之有效成份顆粒， 其有效的粒度介於0.01至10微米。 此外，可加壓的藥學組成物可含有壓縮氣體，例如氮 或液態氣體推進劑。較佳者總組成物不會以任何實質上之 程度溶入液化的推進劑。加壓的組成物亦可含有表面活性 劑。表面活性劑可爲液體或固體非離子性表面活性劑或可 爲固體陰離子性的表面活性劑。宜使用固體陰離子性的表 1362942 面活性劑的鈉鹽形式。 進一步的塗覆投用形式是投用至眼睛。此投用模式中 ，結合體或本發明組成物可用醫藥學上可接受的眼睛載體 . 運送，活性化合物可接觸眼的表面一段充分的時間以使化 合物穿透結膜或角膜的以及眼睛內部的區域，例如：前室 、後室、玻璃體、水樣液、玻璃體、角膜、虹膜/睫毛、 晶體、脈絡膜/視網膜以及鞏膜。醫藥學上可接受的眼的 馨載體可爲例如：油膏、植物油或包膠材料。 直腸的或陰道投用的組成物較佳者是栓劑，其製備係 攪拌本發明之結合體或組成物與適當的非刺激性賦形劑或 載體，例如：可可油、PEG或栓劑蠟，其在室溫下爲固態 但在體溫下爲液體，因此可在直腸或陰道的空腔熔化並釋 放出藥物。 用於本治療方法的藥學組成物亦可以脂質體的形式投 用。技藝上已知一般而言脂質體是源自磷脂或其它脂肪物 β質。脂質體是由單·或層的水合液態晶體所形成是分散於 水溶性介質。任何無毒的、生理上可接受的以及可代謝的 脂肪均可用於形成脂質體。除了一種或多種本發明結合體 或組成物之外，脂質體形式之藥學組成物亦可含有一種或 多種穩定劑、防腐劑、賦形劑等。較佳的脂質是磷脂以磷 脂醯基膽鹼（卵磷脂），兩者均有天然的以及合成的來源 。形成脂質體的方法是已知技藝（參閱例如：Zalipsky， S_ ’ et al·，U.S. Patent No. 5,395·619)。聯結至 PEG 之 包含磷脂的脂質體’最常見的是磷脂醯乙醇胺偶合至 -52- 1362942 mPEG ’其有利的性質包括在哺乳動物之血液循環中具有 延長的生命期（Fisher，D.，U.S. Patent No_ 6,132,763)。 更有利地是本發明之羥基PEGs可取代mPEG形成PEG-脂 質體。最有利地是本發明之單官能活化的涇基PEGs可取代 活化的mPEGs合成PEG-二醯甘油，其可倂入peg-脂質體
給藥療程 H 本發明結合體或組成物可在體外、體外或在活體內投 用至細胞以增強細胞對活性化合物的反應。一般熟悉技藝 的專業人士將認知給定的活性化合物、結合體或組成物之 有效量可經試驗測定以及可使用純化形式（若該形式存在 )、或醫藥學上可接受的調配物或前藥物形式。本發明化 合物、結合體或組成物可以獸醫或藥學組成物結合一種或 多種醫藥學上可接受的賦形劑投用至須要的動物或人類。 據瞭解當投用至人類患者時，本發明化合物以及組成物每 鲁 曰、每週或每月總用量可由醫師在醫學判斷的範圍之內確 定。任何特定病人的治療上有效劑量將取決於各種因子， 包括達成之細胞反應的型態以及程度；使用之專一性化合 物、結合物或組成物之特性及/或活性；年齡、體重或表 面積、健康狀況、性別、膳食以及患者之活動程度；投用 時間、投用路線、及活性化合物之排泄速率；治療持續期 間：結合或同時和此專一性化合物、結合物或組成物使用 之其它藥品；以及熟知的此醫藥學的以及醫學技藝的專業 -53- 1362942 人士熟知的類似因子。例如，在開始時投用一個技藝範圍 之內給定的本發明化合物、結合體或組成物比須要達成所 . 要求的治療效果還低之起始劑量，然後緩慢地增加劑量直 . 到達成所要求的效應爲止。 給藥療程亦可爲患者專一性的方式提供血液中預定濃 度的給定活性化合物，其可用可接受的以及在此技藝中常 規地技藝，例如大小排除、離子-交換或逆相HPLC測定 φ 。因此，病人給藥療程可依據熟悉醫學、醫藥學的及/或 藥理技藝的專業人士熟知的常規方法調至達成相對固定的 血液含量（由HPLC測定）^ 臨床檢驗和治療的用途 本發明結物在臨床檢驗之用途上可定位動物（尤其是 人類）體內抗原性的部分（例如癌症），其係投用本發明 聚合物-共軛結合的抗體，其中在結合物之蛋白質或聚合 •物成分加以標記使其可被加以檢測，例如經討論於下之光 學、放射性、螢光或共振檢測的方法。 本發明PAG-生物活性化合物結合體（較佳者係投用 包含該結合體組成物）預期具有非常長的循環半生期以及 在生物體內降低的抗原性和免疫產生性。此類性質可緩和 或改善在許多治療的化合物（尤其是生物活性化合物，例 如本發明結合體之用作成份）中當以治療爲目的時引入動 物（尤其是人類或其它哺乳動物）所觀察到的在循環中快 速清除的現象。使用本發明結合體及組成物亦可降低或消 -54- 1362942 除重覆對患者投用特定的生物活性化合物或成分所激起的 免疫反應。相關的免疫反應包含中和生物活性及/或增加 生物活性化合物從循環中清除之速率（從而降低臨床檢驗 或治療過程之療效）以及在患者上導至之負面效應。 因此，在本發明另一特色中，本發明結合體及組成物 可用於臨床檢驗或治療的方法，例如診斷、治療或預防具 有病症之傾向或患有病症動物（尤其是哺乳動物例如人類 )之各種身體的病症。該方法中，治療的目的是延遲或防 φ 止這病症之發展，及/或校正或誘發緩和之病症，及/或 減少或極小化其它治療的給藥療程之副作用。因此，本發 明之PAG-生物活性成份結合體及組成物可用於保護、抑 制或治療身體的病症，例如感染或疾病。本文術語之"保 護''身體的病症，包含"預防”、"抑制”以及"治療”。"預防” 包含在誘發疾病或身體的病症之前投用本發明結合體或組 成物，而"抑制"包含在疾病出現臨床的外觀之前投用結合 體或組成物，因此”預防"以及”抑制"身體的病症典型地是 · 針對有病症之傾向或易感病症，但尙未發病的動物。然而 "治療”身體的病症，包含在疾病出現後投用治療的結合體 或組成物。據瞭解在人類以及獸醫醫學上不可能分辨"預 防"以及"抑制"身體的病症。在許多案例中，最後的誘發 的事件或事件是未知的或潛伏的，病人及醫師在誘發的事 件出現才會注意到。因此，一般的"預防"與"治療"不同， 包含本文中"預防"以及"抑制"之定義。因此依據本發明方 法本文術語之"保護"包含"預防"。 -55- 1362942 依據本發明此特色之方法，其可包含一個或更多的步 驟以允許臨床醫生達成上述的治療目標。本發明方法之一 . 可包含例如： (a) 確認動物（較佳¥哺乳動物，例如人類） 患有或有身體病症之傾向；以及 (b ) 對動物投用有效量之一種或多種在此描述 之本發明化合物或組成物，尤其是一種或多種PAG結合 Φ之生物活性成份（或一種或多種包含該結合體之藥學組成 物），因此投用化合物或組成物可防止、遲延或診斷動物 身體病症的發展、或校正或只誘發緩和之動物身體病症。 本文之"有身體病症之傾向"有的動物其定義是該動物 不展示病症許多公開的身體症狀，但在基因上、生理上 則處於發展此病症之危險中。本發明方法中辨別動物（例 如哺乳動物，包括人類）有身體病症之傾向，處於身體病 症之危險中，或患有給定的身體病症可依據一般熟練的臨 ®床醫生熟知的標準技藝完成，包括例如：放射性的測定、 生化學檢定（例如測定動物樣本中特定的肽類、蛋白質、 電解質等相對的含量）、外科的方法、遺傳篩選、家族病 史、身體的觸診、病理的或組織學的測試（例如微觀的組 織或體液樣品或塗片評估、免疫的測定等）、體液測試（ 例如：血液、血清、血漿、腦脊髓液、尿、唾液、精液及 其類似者.）、影像（例如放射性、螢光、光學、共振（例 如使用核磁共振（NMR)或電子自旋共振（ESR))等。 一旦已用一種或多種該方法確認動物，此動物可進行侵略 -56- 1362942 性的及/或前有效的治療以預防、抑制、耽誤’延遲或校 正身體的病症。 本發明結合體、組成物以及方法可預防、診斷或治療 的身體病症包含結合物之生物活性成份可預防、診斷或治 療之任何身體的病症。該病症包括（但非限於）：各種癌 症（例如：乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌 '睪九癌、 白血病、淋巴瘤、肺癌、神經癌症、皮膚癌、頭部以及頸 部癌症、骨癌、大腸和其它胃腸的癌症、胰腺癌、膀胱癌 、腎.癌以及其它癌症、肉瘤、腺腫瘤以及骨髓癌）：傳染 性疾病（例如：細菌的疾病、黴菌疾病、病毒疾病（包括 肝炎以及人類免疫不全病毒/愛滋病）、寄生蟲病、及其 類似者）：遺傳疾病（例如：囊性纖維化、側索硬化性肌 肉萎縮症、肌肉萎縮症、高雪氏病、糖原貯積病、嚴重倂 發之免疫不全病症及其類似者）、貧血、中性血細胞減少 症、血友病以及其它血病症；神經錯亂（例如：多發 性硬化以及老年痴呆症的疾病）：酵素的病症（例如：痛 風、尿毒症、高膽固醇血症、及其類似者）：未確定病原 學之病症（例如：心血管疾病、高血壓、及其類似者）； 以及其它熟悉技藝的專業人士熟知的重要醫學病症。本發 明組成物以及方法亦可用於這預防疾病進展，例如化學預 防前惡性的傷害至惡性的傷害之進展。 如此使甩一種或多種本發明結合體，或一種或多種本 發明藥學組成物之本發明治療的方法可用各種路徑投用至 動物，包括：口服地、直腸地、非經腸地（包括靜脈內地 -57- 1362942 、肌肉內的、腹腔內的、囊泡內的' 皮下的以及關節內的 注射以及輸注）、全身的、陰道的、腹腔內的、局部的（ 經 粉 末、 油 膏、 點 滴或 經皮的貼 片） 、□ 頰 的，口服 的或 鼻 噴 液或 吸 入法 ο 本發 明中有效 量之 結合 體 或組成物 可在 體 外 、體 外 或在 活 體內 投用至細 胞或 患有 或 有特定病 症傾 向 之 動物 9 從而 預 防、 延緩、診 斷或 治療 動 物之病症 。本 文 之 "有效量之結合物 (或組成物）" 意指 結 合物帶有 之生 物 活 性成 份 量， 在 本發 明結合物 投用 至動 物 後可預防 、延 緩 診斷 、 治療 或 校正 身體的病 症。 一般 熟 悉技藝的 專業 人 士 將認 知 本發 明 結合 體或組成 物之 有效 量 可依據醫 藥學 的 以 及醫 學 技藝 的 標準 方法測定 :參 閱例如 ：Beers > M.H > e t al · eds. ( 1999 )Merck Man mal of Diagnosi s & Th erapy ， 1 7th edition ，Merck and Co. Rahway ， NJ; Hard man > J.G. et ; a 1. ， eds. (200 1 ) Goodman and
Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics， 10th edition ， McGraw-Hill Professional Publishing ， Elmsford，NY; Speight，T.M.，et al.，eds. ( 1 997 )
Avery's Drug Tre at me nt: P r i nc i p 1 e s and Practice of
Clinical Pharmacology and Therapeutics，4th edition， Blackwell Science，Inc.，Boston; Katzung，B. G. ( 2000 )Basic and Clinical Pharmacology ， 8 th edition ，
Appleton and Lange，Norwalk，CT ; 全文在此倂入參考文 獻。 據瞭解當投用至人類患者時，本發明結合物以及組成 -58- 1362942 物每日、每週或每月總用量可由醫師在醫學判斷的範圍之 內確定。例如，投用適當劑量的本發明結合體或組成物以 得到令人滿意的結果是取決於使用之專一性生物活性化合 物，該劑量是熟悉技藝的專業人士所熟知或可用常規地實 驗立即測定。依據本發明特色，結合體或組成物可一次投 用，或以分劑量分開用，例如：每天兩次或每兩次、每月 兩次。取決於這生物活性成份之特性，各種模式（例如不 經腸道的、皮下的、肌肉內的、眼睛內的、鼻腔內的等） 適當的給藥療程亦可使用常規地實驗立即測定，或對熟悉 技藝的專業人士而言是立即而明顯的。 在其它用途上，本發明結合體及組成物可使臨床檢驗 或治療劑特別地標定表現受體之細胞、組織、器官或生物 體’以結合、倂入或攝入組合物之生物活性成份。依據本 發明特色之方法可包含，例如將細胞、組織、器官或生物 體接觸一種或多種本發明結合體，該結合體可額外地包含 一種或多種臨床檢驗或治療劑（較佳者共價鍵地聯結至結 合物之PAO或PEG成分），該結合可被細胞、組織、器 官或生物體以任何機制（例如：受體調節的胞飮作用、胞 飲作用、吞噬作用、擴散等）攝入，從而運送臨床檢驗或 治療劑至細胞、組織、器官或生物體。用於依據本發明特 色之臨床檢驗或治療劑可爲（但非限制於）至少一個藥劑， 其係選自核酸、有機化合物、蛋白質、抗體、酵素、糖蛋白 、脂蛋白、化學元素、脂質、糖、同位素、碳水化合物、 影像藥劑、可偵測的探針、或任何其組合，亦可馬在此描 -59- 1362942 述之可偵測地標記。本發明特色使用之治療劑可對標的細 胞（或組織、器官或生物體）具有治療效果，該效應其係 選自（但非限於）：矯正缺陷的基因或蛋白質、藥物作用 、毒性作用、生長-刺激效應、生長·抑制效應、代謝的效 應、影響異化作用的效應、同化作用的效應、抗病毒的效 應、抗黴菌效應、抗菌性效應、荷爾蒙的效應、神經荷爾 蒙的效應、細胞分化刺激效應、細胞分化抑制性效應、神 ϋ經調控效應、抗腫瘤的效應、抗腫瘤效應、胰島素刺激或 抑制效應、骨髓刺激效應、多潛能型幹細胞刺激效應、免 疫系統刺激效應、以及任何其它經由依據本發明特色之傳 送系統提供之治療劑運送至細胞（或組織、器官或生物體 )的已知治療效果。 該額外的治療劑，可進一步的包含本發明生物活性的 結合體或組成物，其係選自（但非限於）習知的以及新的 化合物以及組成物，包括：抗生素、類固醇、細胞毒的藥 β劑、血管生物活性藥物、抗體以及其它治療劑。此藥劑非 限制的實施例包含抗生素以及其它用於治療細菌性休克的 藥品，例如：慶大黴素、妥布黴素、萘夫西林、不經腸道 的頭芽孢菌素等：腎上腺皮質類固醇以及其類似物，例如 :地塞米松，其可減輕內毒素引起的細胞的受傷：血管生 物活性藥物，例如：α腎上腺素能受體封阻劑（例如酚苄 Μ) 'Ρ腎上腺素能受體促效劑（例如異丙腎上腺素）、 及多巴胺。 本發明結合體及組成物亦可用以診斷疾病以及監視治 -60- 1362942 療的反應。在某些方法中本發明結合體可包含一種或多種 可偵測的標記（例如描述於本文別處者）。在特定的方法 中，本發明可偵測地標記的結合體可用以偵測表現受體以 攝入結合體生物活性成份之細胞、組織、器官或生物體。 該方法的實施.例之一中，將細胞、組織、器官或生物體和 一種或多種本發明可偵測地標記的結合體在細胞、組織或 生物體可攝入結合體（例如經胞飲作用結合此結合體至細 胞-表面受體或經擴散結合到細胞）之條件下接觸，然後 使用對此標記具有專一性之檢測方法（例如：用螢光檢測 螢光標記的結合體；核磁共振造影檢測標記的結合體；放 射性造影檢測放射性標記之結合體等）偵測結合體結合或 倂入細胞。可偵測地標記的結合體之其它用途包括例如： 對動物（包括人類）細胞、組織、器官或生物體、或內在 的構造進行造影，其係投用一種或多種有效量之本發明結 合體的標記形式以及測量和細胞、組織、器官或生物體（ 或動物）聯結之可偵測的放射量。偵測各種類型之標記的 方法以及其臨床檢驗和治療的造影用途是熟悉技藝的專業 人士熟知的，以及描述本文別處。 在另一特色中，本發明結合體及組成物可用於調控表 ί見_受體細胞表面之活性成份結合物專一性受體之濃度或 '活性的方法。"調控"給定受體的活性意指組合物在結合至 受體後可經由受體的調節活化或抑制生理的活性（例如細 Μ Θ fi肩、系列）。本文不打算結合任何特定的機制解釋本 胃日月^合體是何的調控活性，經由生物活性成份之結合物 1362942 ’該結合體結合至受體可阻斷天然的促效劑（例如未共軛 結合的生物活性成份）之結合以及預防天然的促效劑活化 受體，而不會誘發實質上活化受體生理本身的活性，因而 . 拮抗細胞受體生理的活性。依據本發明此特色之方法可包 含一個或多個步驟，例如接觸細胞（可在體外或在活體內 完成）和一個或多個本發明結合體，其條件爲該結合體（ 即結合物之生物活性成份部分）結合至細胞表面生物活性 ϋ成份之受體但不實質上活化此受體。該方法將可用於熟悉 技藝的專業人士熟知的各種診斷的、以及治療的用途。 套組 本發明亦提供包含本發明結合體及/或組成物之套組 。該套組一般包含載體，例如盒子、紙板、管子等，在關 閉區間具有一個或多個容器，例如：管形瓶、管、安瓿、 瓶子及其類似者，其中第一個容器含有一種或多種本發明 β結合體及/或組成物。本發明此特色之套組可進—步的包 含必須進行本發明結合體及組成物之一種或或多種用途的 —種或多種額外的成份（例如試劑以及化合物），例如用 於這診斷、治療或預防特定的疾病或身體的病症的一種或 多種成份（例如一種或多種額外的治療的化合物或組成物 、一種或多種診斷試劑、一種或多種載體或賦形劑、及其 類似者）、一種或多種本發明額外的結合體或組成物等。 本方法其它適當的修飾以及適應以及在此描述之用途 對熟悉此技藝之專業人士而言是非常明顯的，且應屬於本 -62- 1362942 發明或其任何具體實施例之範圍以內。目前將對本發明作 詳細地描述，參考下列實施例後對本發明將更瞭解，該實 施例是僅用以說明而不是對本發明加以限制。 實施例 實施例1 :抗單甲氧基PEG抗體之製備及測試 之前已報導兔子可用各種不同的PEGs進行免疫，其 係將動物用PEG偶合至免疫產生性的運載蛋白之結合體 進行免疫（Richter，A.W.，et al. ( 1 983 ) Int Arch
Allergy Appl.Iimnunol 70:1 24-1 3 1 )。製作和 PEG 聚醚主 鏈反應之單株抗體是對小鼠注射結合至β-葡萄糖醛酸苷 酶的mPEG以及選擇產生PEG抗體的雜交瘤細胞株（ Cheng，T-L.，et al. ( 1 999 ) ，supra.; Cheng > T L. > et al. ( 2000 ) supra; Tsai，N.-M.，et al, ( 200 1 ) ，supra·;
Roffler，S·，et al.，發表的美國專利申請案編號 200 1/0028 8 8 1 Al 以及美國專利第 6,596,849 以及 6,617，118號；全文在此倂入參考文獻。最近已揭示另一和 PEG聚醚主鏈反應之單株抗體，參見Roberts，M.J.，et al.，in U.S. Patent Application No. 2003/00 1 704 Al。 爲了發展偵測PEG蛋白質結合體中之PEG的敏感方 法，如下列所述製備抗PEG的多株抗體。由於幾乎所有 描述於技藝之治療蛋白質的PEG結合體均已和mPEG聯 結合成，本案發明人硏究內含mP EG結合體之甲氧基在免 疫反應性中所拌演的角色。對硝基苯碳酸酯衍生的10-kDa -63- 1362942 mPEG 可訂製的合成自 Shearwater Corporation ( Huntsville > AL )，其爲 Nektar Therapeut ics ( S an Carlos . ，CA)之子公司》製備聯結胺基甲酸酯的mPEG之重組 . 哺乳動物尿酸分解酶結合體，其係內含在生理的酸鹼度下 須要溶解此蛋白質最小量股之10-kDa mPEG at (大約每 35-kDa尿酸分解酶次單體含二股fPEG或mPEG) 。PEG 的含量是不足以抑制尿酸分解酶之高免疫產生性（參閱 • Sherman，M.R.，e t al.，PCT publication WO 01/59078 A2，and Kelly，S.J.，et al. ( 2001) supra，全文在此併 入參考文獻）。將此PEG·尿酸分解酶製劑之Freund's佐 劑重複地注射到三隻兔子並將兔子放血以製備內含抗尿酸 分解酶、PEG-尿酸分解酶結合體以及PEG的多株抗體之 抗血清" 將各兔子注射PEG-尿酸分解酶之完全的Freund's劑 製劑一次，以及在一至四週的區間注射PEG-尿酸分解酶 •之不完全的Freund’s佐劑製劑共五次。在大約最後三次注 射之後二週進行血液採樣。從九個血液樣本製備血清以及 用小量體積血清測試對抗PEG之抗體，其係用酵素-聯結 的-免疫吸附分析（”酵素聯結免疫抗體檢測法"），使用 塗覆與尿酸分解酶結構上不相關的蛋白質之mPEG結合體 之96孔微量滴定盤進行。 用酵素聯結免疫抗體檢測法測驗各放血產生之抗血清 和PEG之反應。用三隻與PEG及mPEG甲氧基末端之免 疫反應在定性的動力學以及相似的專一性均相似的兔子， -64- 1362942 進行競爭性酵素聯結免疫抗體檢測法測定。最初，進行斑 點印刷分析測定兔子血清中抗-PEG抗體之敏感性。將用 於免疫兔子之各種不同大小以及構造之PEG溶液以及 PEG-尿酸分解酶溶液點到聚亞乙烯基二氟化物印膜上（ Invitrogen，Carlsbad > CA; ca .alog # LS2002 )。膜用 2% ( w/v )脫脂奶粉溶液阻斷之後，將膜與說明如上製備 之稀釋之兔子抗PEG-尿酸分解酶抗血清反應。然後以稀 釋之偶合鹼性磷酯酶的山羊抗-兔子免疫球蛋白G抗體作 爲一次抗體進 ί了反應（Calbiochem，San Diego，CA; catalog # 40 1 3 7 1 )。使用5-溴-4·氯-3-吲哚基磷酸鹽以及 硝基藍四氮哗鑰鹽組合（Sigma，catalog # Β-1911)偵測 印膜上鹼桂磷酯酶活性，描述如前（Blake，M.S.，et al. ( 1984) Anal Biochem 136:175-190，全文在此倂入參考 文獻）。在高敏感性和專一性下，測試兔子抗-PEG抗體 偵測PEG溶液以及mPEG-蛋白質結合體。 實施例2:顯示甲氧基在mPEG的抗原性上所拌演的 角色 未料到地，本案發明人發現描述於實施例I製備的 抗-PEG抗體可直接主要的對抗抗原之mPEG成分的甲氧 基末端基團。圖1描述用塗覆和尿酸分解酶結構上不相關 的蛋白質之mPEG結合體的96孔微量滴定盤進行競爭性 酵素聯結免疫抗體檢測法之結果。滴定盤用2 %山羊血清 阻斷之後》加入增加濃度之4.8-kDa mPEG (Polymer -65- 1362942
Laboratories，catalog # 6570-5010 ) 、10-kDa mPEG (
Union Carbide » catalog # MPEG-10,000)或 10-kDa 第三 丁氧基 PEG ( Polymer Laboratories，catalog # 29999997 )溶液，並和1:1,000稀釋之兔子抗mPEG-尿酸分解酶 結合物之抗血清反應。之後去除溶液，滴定盤上抗-PEG 抗體結合至mPEG-蛋白質結合體之程度係以分光光度法測 量，其係使用過氧化酶-共軛結合的二次抗體（山羊抗-兔 子免疫球蛋白 G，Calbiochem®，San Diego，CA; catalog # 40 1 3 93 )，接著添加入過氧化酶受質，鄰苯二胺二氯化 氫（Sigma，St. Louis，MO; catalog # P-9781)。各樣本 中，在缺少競爭者下觀察到之起始反應速率（毫吸光度單 位/分鐘）稱爲100%。二種mPEG溶液之重疊曲線顯示 PEG主鏈長度不是抗原性主要的決定因子。第三丁氧基 PEG之曲線向右位移大約2個對數單位，顯示第三丁氧基 PEG與mPEG-蛋白質結合物產生抗體之親和力比 mPEG ®約低100-倍。然而某些本案發明人以前的未發表之實驗 則是發現當第三丁氧基PEG聯結至免疫產生性的蛋白質 有顯著的免疫產生性。因此，雖然圖1顯示第三丁氧基 PEG和抗mPEG抗體只有非常小的交互作用，但使用第三 丁氧基PEG取代mPEG在產生聚乙二醇化的治療性蛋白 質上將不是解決PEG成分之免疫產生性問題的法。 圖1描述之結果顯示PEG上之甲氧基是聚合物分子 上主要的抗原性的基團。爲了證實這個推理，可使用描述 於實施例I產生抗體進行競爭性酵素聯結免疫抗體檢測法 -66- 1362942 分析’其使用內含一或二個甲氧基之各種不同大小以及構 造的PEG進行’如描述於圖1。圖2a顯示抗體結合的結 果’其係與各樣本中甲氧基之莫耳濃度函數作圖。造成 50%結合抑制之競爭者濃度（"1(：50")是使用5_參數8形 曲線公式以及這 SigmaPlot®， （SPSS Science，Chicago ，IL)程式計算。 如展示於圖2a，下列 PEGs在莫耳濃度之基準上均 有同樣地抗原性：具有一個甲氧基之鏈狀的PEG ("10-kDa mPEG") ’ 其製備係水解 mPEG-NPC ( PEG-Shop)以 及"單-20-kDamPEG-離氨酸，，，偶合離氨酸至20-kDa NPC-PEG ( Shearwater > catalog # M-NPC-20,000 )力口以合 成；具有二個甲氧基之鏈狀的 PEG ("雙·（ 2-kDa ) mPEG" ( S igma-Aldrich > catalog # 81314))、以及內含 二個甲氧基之大的"分支狀"PEG ("二-(20-kDa) mPEG 離氨酸"（Shearwater，catalog # PEG2-NHS-40K))。相 反的，具有二個甲氧基之較小的"分支狀"PEG ("二-(5-kDa) mPEG 離氣酸"（Shearwater，catalog # 2Z3X0L01 ))其曲線是向其他樣品平均値的左方位移0 · 5至0 · 6個 對數單位，顯示"分支狀"mPEG形式的抗原性是實驗中其 他樣品測試之三至四倍。圖2b顯示圖2a之數據是mPEG 重量濃度（微克/毫升）而非甲氧基莫耳濃度之函數，支 援此結論的証據是甲氧基對mPEG和抗-mPEG抗體之交 互作用至爲關鍵。 圖3顯示某些圖1、2a以及2b之數據，其版式顯示 1362942 抗原性與每個PEG分子甲氧基之數目之直接的依存性》 此類樣品代表沒有甲氧基（"ΙΟ-kDa第三丁氧基PEG") . 、一個甲氧基（"10-kDa mPEG")或二個甲氧基之10-kDa . PEG ("二（5-kDa) mPEG-離氨酸"）。結果指出給定的聚 合物，用此聚合物製作之本發明結合物之抗原性，直接的 和PEG聚合物分子內之甲氧基數目相依存的。甲氧基之 數目越大，聚合物與抗mPEG蛋白質組合物抗體之親和性 參越高。 總之，此類結果指出完全的抑制兔子抗體結合至 mPEG結合體可經由PEG (而尤佳者爲mPEG)溶液之競 爭完成。此外，mPEG溶液阻斷兔子抗-PEG抗體結合至不 相關的蛋白質與mPEG結合體之能力與其甲氧基含量相關 。基於重量濃度，較低分子量的mPEGs比較高分子量的 mPEGs更有競爭力，如展示於圖2b。這個結論和聚合物 分子量增加則甲氧基質量與聚合物總質量比例減低事實上 ® —致。在測試的PEGs中，最有效的抗原（以莫耳濃度爲 準）是內含二個甲氧基之"分支狀"PEGs “，有時稱爲傘形 或"U-PEGs" ( Martinez，A. ，et al.，美國專利第 5,643,5 75 號）或"Y-PEGs" ( Greenwald，R.B.，et al.，發 表的美國專利申請案編號2002/ 0052443 Al)。 實施例3 :抗PEG抗體對缺少甲氧基PEGs之測試 本文術語之"PharmaPEG"意指在末端缺少末端遠端活 化的或可活化的抗原性基團的鏈狀或分支狀PEGs。從以 -68- 1362942 前的實施例可推論該聚合物之抗原性，因此生物活性劑之 聚合物結合體是聚合物甲氧基含量之函數。爲了進一步的 測驗這個推理，進行競爭性酵素聯結免疫抗體檢測法分析 ，描述如圖 1，比較 mPEG("4.8-kDa mPEG")以及 12-kDa、20-kDa以及35-kDa PhannaPEG (鏈型聚合物端不 帶有甲氧基或其它烷氧基團）與抗-mPEG抗體結合的能力 。結果示於圖4。三個PharmaPEG曲線相對於mPEG曲線 之位移描述於圖4，顯示當用抗-mPEG抗體測定時， PharmaPEG之抗原性低於mPEG大約100倍。因此，缺少 甲氧基之聚合物（例如PharmaPEG)相較於統傳上作爲藥 物之生物結合的聚合物（例如mPEG)降低或實質上是降 低抗原性。 如上述’以重量爲準，mPEGs之競爭性與其分子量 成反比。然而，缺少甲氧基PEGs之競爭性效能大約僅有 mPEGs的1%，與其分子量不相關。此類結果可支持以下 之結論’缺少甲氧基之單功能地反應性聚合物尤其是適用 於製備生物活性劑聚合物結合體，相較於使用mPEGs， 尤其是"分支狀"mPEGs例如：二-mPEG-離氨酸製作之結 合體其可降低、實質上降低、或無抗原性。 實施例4:用西方轉漬法和抗_mP EG抗體偵測聚乙二 醇化的蛋白質結合體 使用碳酸酐酶（EC 4.2.1.1; "CA II，1)單甲氧基PEG 結合體作爲模式’以十二基硫酸鈉（"SDS-PAGE")存在 1362942 之聚丙烯醯胺凝膠電泳，測試抗-mP EG抗體偵測聚乙二醇 化的蛋白質結合體之能力。將凝膠以電泳墨點至聚亞乙烯 基二氟化物膜上，將墨點和兔子抗-mPEG抗體（1 : 200 .稀釋）反應，接著和聯結至鹼性磷酯酶之二次抗體（山羊 抗-兔子免疫球蛋白G)反應以及曝露至反應受質以形成 有色彩的沉澱物。此免疫偵測從電泳凝膠轉移至膜上的蛋 白質或聚合物·蛋白質結合體之方法通常稱爲"西方轉漬法 • " ( Tsang，V.C.W.，et al.，（ 1984) Anal Biochem 1 43:3 04-3 07 )。檢測步驟及試劑如同描述於實施例1之 墨點印跡法。此結果展示於圖5a。行1以及2顯示使用 SYPRO® 商品 Ruby Stain ( Molecular Probes，Eugene > OR’ catalog # S- 1 2000 )染色蛋白質的凝膠，以及使用橙 色的 / 紅色可見光爐器（Μ ο 1 e c u 1 a r P r 〇 b e s，c a t a 1 〇 g # S-6655 )在黑箱中302毫微米照明下用柯達照數位攝影機拍 照。行3以及4顯示相同樣品西方轉漬法的結果。抗-® mPEG抗體可偵測到所有的聚乙二醇化的結合物（行3 ) 但無法偵測到未修飾之碳酸酐酶（行4)。 圖5b顯示凝膠中環帶強度之定量分析以及展示於圖 5a之西方轉漬法係得自柯達1D影像分析軟體（Kodak， Rochester ’ NY )。水平軸代表相對於染料頭位移之距離 以及垂直軸代表蛋白質染劑或抗-mP EG染色的相對強度。 底部蹤跡顯示SeeBlue Plus2TM預先染色的標準蛋白質之 條帶(Invitrogen Corporation > Carlsbad，CA; catalog # LC 5 62 5 )，其中吸收峰編號1至8分別爲具有下列表觀 -70- 1362942 分子量（kDa) : 204 ' 111、68.8、51.5、40.2、28.9、 20.7以及l4.9之蛋白質。從底部算起的第二個蹤跡是抗_ mPEG抗體染色之聚乙二醇化的碳酸酐酶。從底部算起的 第三個蹤跡是代表碳酸酐酶蛋白質染色的環帶，以及頂部 的蹤跡是代表碳酸酐酶mPEG結合體的蛋白質染色的條帶 。圖5b中吸收峰以上之數目指出在該吸收峰中結合物內 mPEG股偶合至碳酸酐酶之數目。PEG0意指碳酸酐酶位 置上無PEG的偶合。 總之此類結果指出抗-mPEG抗體能立即和反應性形式 mPEG製備的聚乙二醇化的蛋白質形成絡合物，以及從而 允許彼進行其敏感性以及選擇的檢測。當該結合體引入動 物進行診斷的、預防性的或治療的目的時，誘發抗-mPEG 抗體將可加速藥劑從血流清除的速率，從而限制結合體之 功效以及可能地導致形成的免疫複合體調節的負面效應。 實施例5 :合成PharmaPEG-單硝基苯基碳酸酯 在合成的一些步驟中需要從PEG二醇製備單官能活 化的PharmaPEG，是因爲PEG的一個末端必須具有允許 分離內含不同末端基團數目之PEG的性質。該基團可能 比PEG或活化的PEG更具厭水性，可用逆相色譜法（”RP 色譜法"）分離。此外，該基團可帶有電價，可用離子交 換層析法分離。該基團可爲固相之一部份，可自溶解未結 合的PEG之液體中進行相分離》若以活化基團作爲分離 之基礎’如實施例5描述之NPC-PEG，則合成反應僅須 1362942 要聯結活化基團。若可移動的阻斷基團，例如第三丁基或 三苯甲基團提供分離之基礎，可在聯結活化的或可活化的 . 基團之前或之後加入阻斷基團，如描述於實施例6»理論 . 上，用以分離內含所要求的阻斷基團數目之PEG的純化 步驟，可在阻斷基團聯結之後任何時間進行。實際上，介 於聚合物主鏈以及阻斷基團之間以及介於聚合物主鏈以及 這活化（或可活化的）基團之間鍵結的相對不穩定性可主 馨導反應步驟最佳的序列。 從二羥基PEG合成單官能活化的NPC-PEG總結於下 列圖表，其中Ph表示苯基團以及η意指聚合物環氧乙烷 單位之數目，ΙΟ-kDa之PEG約227。 H0(CH2CH20)"H("PEG 二醇"） ~~! 對硝基苯氯甲 1 酸酯（02NPh0C0Cl) +之吡啶/乙腈 • H0(CH2CH20)nH + 02NPhOCOO(CH2CH20)nOCOPhN02 +
02NPhOCO0(CH2CH2O)nH ΤΙ RP色層分析的純
~~1 化單-NPC-PEG 02NPh0C00(CH2CH20)nH Ph_aPEG-單硝基苯基碳酸鹽
對來自許多供給商之PEG二元醇，標記的分子量均 爲lOkDa，測試其純度及均一性。沒有一種分子量約 lOkDa 之 PEG 超過 90%» 因此，用 Amberchrom MD-P -72- 1362942 CG300SD 管柱（7 5 毫米 x 1 5 公分，To s ο H aas， Montgomeryville，PA )以逆相色譜法自較低分子量的污 染物中份化 10-kDa PEG 二醇（Fluka Chemical Corp.， Milwaukee，WI，catalog #81280) e PEG 係以 5% (v/v) 乙腈之水溶液裝入管柱以及用5%至35%直線梯度的乙腈 水溶液溶析。分層用大小排阻層析之Superdex ®品牌之 HR10/30 管柱（Amersharn Phannacia Biotech，Piscataway ，NJ)以內含丨5〇毫莫耳濃度NaCl，酸鹼度4.6之20毫 莫耳濃度乙酸鈉分析。在Amberchrom管柱之分層中，集 中及冷凍乾燥吸收峰之折射率（"RI")信號大於98%對 應的至約ΙΟ-kDaPEG之PEG。 將純化的乾燥PEG二醇（530毫克）與61.4毫克對 硝基苯氯甲酸酯（Aldrich，Milwaukee，WI，catalog # 16,021-0)合倂以及在13 x 100毫米之螺帽玻璃管中溶於 4毫升之乙腈，最終濃度約12.5毫莫耳濃度PEG二醇以 及約75毫莫耳濃度對硝基苯氯甲酸酯。加入吡啶（0.25 克）以及在36 °C下將反應混合物反應過夜。攪拌混合物 與33毫升冰冷的0.1 Μ鹽酸以終止反應。過濾溶液去除 Ρ-硝基酚之微量沈澱以及在冷水中透析一天（換四次1升 的水）。在透析的溶液中加入乙腈，使濃度爲5% (ν/ν) »將一半步驟1製作之混合物（24毫升），內含約265 毫克純化的10-kDa PEG二醇，裝入Amberchrom管柱以 及結合的PEG用5 %至65%乙腈梯度之水溶液溶析。以先 前大小排阻層析之方法，監測折射率和280毫微米之吸光 1362942 度分析各分層。二羥基PEG，在280亳微米下缺少吸光度 ，先行溶析出，接著溶析出單一的對硝基苯基團之PEG 衍生物（"單-NPC PEG")，接著溶析出二-NPC PEG，其 . 280亳微米下之吸光度與折射率之比例是單_NPcpEG之兩 倍。合倂單-NPC PEG溶析範圍中心的二個分層以生成約 110毫克之單-NPC PEG，對應至產率約42%。步驟 2之 產物可乾燥後儲藏於乾燥器及/或冰箱或直接的用於偶合 擊內含生物活性化合物之胺或內含兩個或多個胺基之連結子 以製備分支狀PEG,例如不含烷氧基團之二PEG-離氨酸。 實施例6:從 PEG二醇合成PharmaPEG-單醛 合成PharmaPEG之單丙醛衍生物總結下列圖表，其 中KOtBu意指第三-丁氧化鉀，以及DEP意指3,3-二乙氧 基丙基團。
-74- 1362942 ho(ch2ch2o)"h("peg 二醇”） ~~I + C1CH2CH2CH(0CH2CH3)2 1 +KotBu之甲苯 τ
DEP0(CH2CH20)nH + DEP0(CH2CH20)nDEP + HO(CH2CH20)nH ~~1 三苯甲基氯化物（Ph3CCl) 2 之使乾燥吡啶 γ
DEP0(CH2CH20)nCPh3 + DEP0(CH2CH20)„DEP +
Ph3CO (CH2CH2 0) n CPh3 1Ί RP色層分析的純化單 ~~1 I 三苯甲基PEG-單乙縮醛 • DEP0(CH2CH20)nCPh3 ~7~| +HC) γ HO (CH2CH20)n CH2CH2CH O PharmaPEG-單丙醛
較佳者，作爲步驟I起始材料之二羥基PEG，其分 子量在標稱的分子量的10%之內，具有之聚分散度<1.05 。聚分散度之定義是重量平均分子量（"MW")與數量平 均分子量（"Μη")之比例。此二參數（Mw以及Μη )可 使用已知準確分子量的PEG作標準以及凝膠滲透層析軟 體例如 EZChrom Elite Client/Server Software，Version 2.8.3 ( Scientific Software，Inc.，Pleasanton，CA)以大 小排阻層析測定。此外，PEG之聚分散度可用基質輔助雷 射脫附/電離飛行時間式（"MALDI-TOF")質譜分析（ -75- 1362942
Marie > A. * et al. > ( 2 000 ) Anal Chern 72:5106-51 14 ) ，使用軟體例如 Voyager Software (Applied Biosystems ，Foster City，CA)測定。爲了製備內含共價鍵聯結PEG . 的藥品，當用MALDI-TOF質譜分析時較佳之PEG起始材 料的聚分散度<1.02，更佳者<1.01。起始材料可得自熟悉 此技藝的專業人士習知的 Aldrich Chemical Co.、Fluka Chemicals ( Buchs ， Switzerland ) 、 Shearwater ^ Corporation或Sigma Chemical Co·。若起始材料不夠均勻 ，其可用描述於實施例5之方法份化。 可使用3-氯丙醛二乙基乙縮醛（Aldrich catalog #C6,900-4 )合成PEG二醇之單丙醛以及二丙醛二乙基乙 縮醛衍生物之混合物，如描述於製備乙醛二乙基乙縮醛之 Harris，J.M. » et al.， ( ( 1 9 8 4 ) JPolynm Sci 22:341352 )(參閱步驟1)。相似的方法亦描述於Bentley，M.D. ，et al.， ( ( 1 998 ) JPharm Sci 8 7:1446- 1449 )以及後續 ®頒給 Bentley，M.D.，et al.之專利（美國專利第 5,990,237 號）。 將充分量的三苯基氯甲烷（氯三苯代甲烷/或三苯甲 基氯，Ph3CCl，例如 Aldrich catalog，# T8,380-l)溶於 吡啶，加入在步驟1中製作之混合物，在這反應條件下， Ph3CCl將會與PEG起始材料中所有未偶合至丙醛二乙基 乙縮醒（Kocienski，P.J·’ supra)之經基反應。在混合物 中添加入對PEG溶解力差的溶劑（例如醚）沉澱之後回 收混合物或經蒸發溶劑或用技藝上已知的其它方法完成步 -76- 1362942 驟2 〇 將步驟2回收之混合物在添加5% ( v/v)乙腈之前或 之後溶於水，以及將此溶液裝入從技藝原理上預期能結合 PEG三苯甲基衍生物之逆相管柱。此管柱可含有矽土或聚 合的基底之烷基或芳基衍生物，或其可爲以苯乙烯爲基底 的聚合物（例如Amberchrom MD-P CG-300 )，如實施例 5。在逆相模式中可以增加有機溶劑梯度溶析出PEG二醇 以及三苯甲基衍生物，如實施例5,或在樣本置換模式中 可連續裝入管柱直到溶析出至少一部分的所要求的產物（ Agner，E.，et al·，PCT 公告 WO 0 0/2 3798 A1)或可用置 換模式（Cramer，S.M.，美國專利第6，2 3 9,2 62號）、或 此類模式之組合。一般而言，缺少任何三苯甲基團的PEG 衍生物會最先被溶析出來，單三苯甲基衍生物將是第二被 溶析出來以及二三苯甲基PEG將是第三被溶析出來。當 此三種化合物之比例是1 : 2 : 1時可得到所要求的產物最 佳的產量。爲了改良所要求的單三苯甲基PEG產物之產 率及/或純度，可令人滿意的將部分之管柱流出物再次進 行色譜法，此爲色層分析中熟知的技藝。將，含有至少一 部分單三苯甲基衍生物之溶析物部分用技藝上已知的分離 、濃縮以及乾燥完成步驟3。 在溫和地酸性條件以及低溫下，乙縮醛可轉換成醛， 而保存PEG遠端大部份的三苯甲基聯結。在本實施例之 一些用途中，可在去除三苯甲基團之前有利的將單三苯甲 基PEG單醛與目標部分反應。該具體實施例想當然以及 1362942 包括於本發明中。 實施例7:相較於甲氧基PEG，羥基PEG製備的結合 體可減低免疫產生性 進行尿酸分解酶mPEG結合體之免疫反應如描述於實 施例1，將三隻兔子用相同樣製備自豬尿酸分解酶之 mPEG結合體或經基PEG結合體免疫，每個尿酸分解酶次 鲁單體各內含平均約二股之10-kDa PEG。聚合物聯結在各 製備結合體之平均股數可用大小排除HPLC分析以及 SDS-PAGE証實，其中凝膠內之蛋白質以及PEG是使用描 述於共同擁有的申請中的美國專利申請案編號1 0/183,607 ’申請日期2 002年6月28日（全文在此倂入參考文獻） 的方法染色（如實施例4)。將各兔子注射一種PEG·尿 酸分解酶之完全的Freund's佐劑製劑一次，以及在一至四 週的區間注射PEG-尿酸分解酶之不完全的Freund's佐劑 鲁製劑共五次。第四以及第五次注射不完全的Freund's佐劑 二週之後放血並製備血清。當從此類兔子連續的稀釋血清 4-次後用酵素聯結免疫抗體檢測法測試（如實施例2 )， 發現羥基PEG製備的結合體誘發的抗-PEG抗體之濃度少 於mPEG製備的結合體誘發的抗-PEG抗體之5% (參閱圖 6a及6b) »相反的，在二群兔子中這二種類型PEG製備 的結合體誘導之抗-尿酸分解酶抗體則是相似。此類兔子 之前免疫血清則不含可偵測的抗-PEG抗體。 -78- 1362942 討論以及結論 在此技藝中已報導應用於生物共軛結合作用上甲氧基 端化的PEG ( mPEG)以及羥基端化的PEG (雙-羥基PEG 或PEG二醇）是等値的，或可說mPEGs以及其它較低的 烷氧基PEGs比PEG二元醇優越。此外，雙-活化的二元 醇作爲交聯劑時，其可令討人厭的產生低免疫產生性以及 抗原性之可溶解的、長效的生物結合體。出人意外地，本 硏究之結果指出mPEGs有顯著的抗原性，而且可誘發抗 體對抗使用mPEG製備的mPEG結合至聚乙二醇化蛋白質 的結合體之甲氧基。因此，未料到地以及和以前的報告相 反，mPEG不等値於羥基PEG以及在製備增加生物效性、 血液循環穩定性以及最小的免疫產生性之生物活性成份（ 例如蛋白質）聚合物結合體時mPEG不是較佳的化合物。 基於本結果，使用含有甲氧基或另一烷氧基團之單功 能活化的PEG合成蛋白質結合體可產生減低免疫活性之 結合體。已說明產生的結合體有減低的抗原性，即減低與 對抗相同蛋白質之mPEG結合體抗體交互反應之能力，以 及減低免疫產生性，即減低喚起免疫反應對抗PEG成分 之能力。因此內含兩個或多個甲氧基的分支PEG製備的 結合體比爲缺少烷氧基團分支狀PEG製備的結合體有免 疫產生性。 最後，基於本發現使用含甲氧基或另一烷氧基團之單官能 活化的PEG (而不是單官能活化的mPEG )合成PEG-脂質體可 預期產生的PEG-脂質體有減低之免疫反應性，包括減低血液 1362942 中啓動活化補體之傾向，以及減低誘發急性的呼吸痛苦或 過敏性反應的以及假過敏反應之傾向。 本發明已參照某些具體實施例加以描述。本發明方法 .可同樣地用於其它類型之蛋白質、其它生物活性劑以及其 它結合試劑。因此本發明範圍並非限制於這些描述之具體 實施例，但僅受限制於申請專利範圍及/或其相當之範圍 。一般熟悉此技藝的專業人士可立即認知可實行之其它具 鲁體實施例，而不脫離本發明之範圍。所有該變異均爲本發 明之一部份。 本說明書針對熟悉本發明所屬技藝的專業人士層級提 及之所有出版、專利以及專利申請案均，全文在此倂入參 考文獻，特別地以及單獨的指出之個別地出版、專利或專 利申請案，全文在此并入參考文獻。 【圖式簡單說明】 圖1顯示競爭性酵素連結免疫吸附法（"ELISA")分 析之結果。此分析中，將一個蛋白質之mPEG結合體結合 至96孔分析板，以及這經由mPEG或第三丁氧基PEG溶 液測量兔子抗體結合另一蛋白質mPEG結合體之抑制作用 〇 圖2a顯示使用各種大小以及構造（內含一或二個甲 氧基）之PEGs，競爭性酵素聯結免疫抗體檢測法之結果 ，其進行之方法如描述於圖1。抗體結合的結果是與各樣 本甲氧基莫耳濃度函數作圖。 -80- 1362942 圖2b顯示如圖2a般相同之數據，其係用PEG之重 量濃度（微克/毫升）取代甲氧基之莫耳濃度函數作圖》 圖3顯示某些圖1，2a以及2b之數據，其版式顯示 抗原性與每個PEG分子甲氧基之數目之直接的依存性。. 此類樣品包含l〇-kDa PEGs，其中一個缺少甲氧基（第三 丁氧基PEG)，一個含有甲氧基（mPEG )以及一個含有 二個甲氧基[二-(5-kDa) mPEG-離氨酸]。 圖4闡明競爭（性）酵素聯結免疫抗體檢測法，如描 φ 述於圖1，其中係比較4.8-kDa mPEG與本發明在鏈型聚 合物端點無甲氧基之三PEGS (標記成"PharmaPEG”）。曲 線在水平軸上之位移顯示所有本發明三種PEGs的抗原性 大約比mPEG低100倍（當用抗-mPEG抗體測定）。 圖5a顯示經由聚丙烯醯胺凝膠電泳於十二基硫酸鈉 存在下（"SDS-PAGE")分析碳酸酐酶同分異構體（"CA Π")以及相同的碳酸酐酶偶合至平均3-4股的5-kDa mPEG樣品之硏究結果。凝膠的行1以及2顯示蛋白質使 鲁 用SYPRO®商標紅寶石染劑染色且在302亳微米照明之暗 房攝影得到之結果。行3以及4顯示mPEG結合體與未聚 乙二醇化的酵素分別經西方轉漬法分析所得到之結果，其 中使用的一級抗體是多株的兔子抗-mPEG抗體。行5顯示 預先染色的標準蛋白質所在之位置。 圖5b顯示凝膠中環帶強度之定量分析以及展示於圖 5a之西方轉漬法係得自柯達照像機以及數位的影像軟體 。水平軸代表相對於染料頭位移之距離以及垂直軸代表蛋 -81 - 1362942 白質染劑或抗-mPEG染色的相對強度。底部蹤跡顯示預先 染色的標準蛋白質的條帶，其視分子量從左至右是203.8 、110.9、68.8、51.5、40.2、28.9' 20.7 以及 14.9kDa。 從底部算起的第二個蹤跡是抗- mPEG抗體染色之聚乙二醇 化的碳酸酐酶。從底部算起的第三個蹤跡是代表碳酸酐酶 蛋白質染色的環帶，以及頂部的蹤跡是代表碳酸酐酶 mPEG結合體的蛋白質染色的條帶。 圖6a以及6b顯示以內含平均約二股mPEG或羥基 PEG ( "PharmaPEG" ) /尿酸分解酶次單體之豬尿酸分解酶 結合體進行免疫的三隻兔子之血清的酵素聯結免疫抗體檢 測法分析之結果。對抗尿酸分解酶抗體之測定係使用塗覆 豬尿酸分解酶之試驗板進行分析。對抗PEG抗體之測定 係使用塗覆不相關的蛋白質偶合至mPEG結合體之平板。 圖6a顯示得到四次不完全的Freund’s佐劑之PEG-尿酸分 解酶注射的兔子第二次放血的數據。圖6b顯示得到五次 不完全的Freund’s佐劑之PEG-尿酸分解酶注射的兔子第 三次放血的數據。 -82-

Claims (1)

1362942 拾、申請專利範圍 1·—種組成物，包括純度爲95 %或更高之結合體， 該純結合體含有以共價鍵聯結到至少一個鏈狀或分支狀聚 烷二醇的生物活性成分， 其中該（等）鏈狀或分支狀聚烷二醇係在該（等）鏈 狀或分支狀聚烷二醇的單一位點聯結到該生物活性成分， 其中在該純結合體中聚烷二醇的所有遠端上均有羥基 ，且 · 其中該純結合體相較於以下所述之第二結合體而言呈 現降低的抗原性：該第二結合體含有相同生物活性成分在 該生物活性成分的同一位點或該等相同位點連結相同數量 之具有相同大小及相同鏈狀或分支狀結構的聚烷二醇，其 中在該第二結合體中聚烷二醇的遠端上有烷氧基或芳氧基 〇 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該鏈狀或 分支狀聚烷二醇係選自：聚（乙二醇）及環氧乙烷與環氧 肇 丙烷之共聚物。 3. 如申請專利範圍第2項之組成物，其中該鏈狀或 分支狀聚烷二醇是聚（乙二醇）（"PEG”）。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中聯結該聚 烷二醇至該生物活性成份係使用至少一種聚烷二醇之反應 性衍生物進行’其係選自：鏈狀的二羥基PEGs ( "peg二 元醇”）、羥基PEG-單乙縮醛及羥基PEG-單酸。 5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中聯結該聚 -83- 1362942 . -' 烷二醇至該生物活性成份係使用羥基PEG之反應性衍生 物進行，其係選自：單醛、單酸的單酯'、單胺、單硫醇、 . 單二硫化物 '單溴苯基碳酸鹽、單氯苯基碳酸鹽、單氟苯 基碳酸鹽、單硝基苯基碳酸鹽、單羰基咪唑、單醯肼、單 肼基甲酸酯、單碘乙醯胺、單馬來醯亞胺、單鄰吡啶基二 硫化物、單肟、單苯基乙二醛、單噻唑烷-2·甘肽、單硫 酯、單三嗪以及單乙烯基颯。 φ 6-如申請專利範圍第1項之組成物，其中該聚烷二 醇之分子量約1，000道耳吞（lkD a)至約100,000道耳吞 (1 OOkDa)。 7.如申請專利範圍第6項之組成物，其中該聚烷二 醇之分子量約2kDa至約60kDa» 8·如申請專利範圍第7項之組成物，其中該聚烷二 醇具有二個分支，各分支之分子量約2kDa至約30kDa。 9. 如申請專利範圍第8項之組成物，其中該聚烷二 籲醇具有二個分支，各分支之分子量約5kDa至約20kDa。 10. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該聚烷二 醇之分子量約l〇kDa至約20kDa。 11. 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該聚院 二醇具有之分子量約12kDa。 12. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該聚院二 醇之分子量約18kDa至約60kDa。 13. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該聚院 二醇之分子量約18kDa至約22kDa。 -84- 1362942 14. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該聚烷 二醇具有之分子量約20kDa» 15. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該聚烷 二醇之分子量約27kDa至約33kDa。 16_如申請專利範圍第1項之組成物，其中該結合體 包含約1至約100股之該聚烷二醇。 17.如申請專利範圍第16項之組成物，其中該結合 體包含約1至約5股之該聚烷二醇。 φ 18·如申請專利範圍第17項之組成物，其中該結合 體包含約1至約2股之該聚烷二醇。 19. 如申請專利範圍第16項之組成物’其中該結合 體包含約5至約100股之該聚烷二醇。 20. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該聚烷二 醇係選自：單羥基PEG·酸以及二羥基PEG-酸。 2 1 ·如申請專利範圍第20項之組成物，其中該聚烷 二醇爲二羥基PEG-離胺酸。 # 22 .如申請專利範圍第1項之組成物，其中該聚烷二 醇若爲鏈狀則不聯結生物活性成份之末端（"遠端"）具有 羥基，若爲分支狀則每個遠端都有羥基。 23. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該聚烷二 醇是該鏈狀二羥基PEG的反應性衍生物。 24. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該聚烷二 醇是該羥基PEG-單羧酸的反應性衍生物。 25. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該生物活 -85- 1362942 性成份係選自：肽、蛋白質' 糖蛋白、有機化合物、內含 胺之化合物、內含羧基之化合物、內含羥基之化合物和內 -含硫醇之化合物。 - 26.如申請專利範圍第25項之組成物，其中該生物 活性成份係選自：肽、蛋白質和糖蛋白。 27. 如申請專利範圍第26項之組成物，其中該肽或 蛋白質或糖蛋白係選自：酵素、血清蛋白質、血清糖蛋白 •、血細胞蛋白質、色素的蛋白質、血紅素、病毒的蛋白質 、肽荷爾蒙、蛋白質荷爾蒙、糖蛋白荷爾蒙、下視丘的釋 放因子、細胞激動素、生長因子以及摹仿或作用爲前述任 何物質之拮抗劑的肽類、蛋白質、和糖蛋白。 28. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該血清 蛋白質係選自：白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子以及摹仿 或作用爲前述任何血清蛋白質之拮抗劑的肽類、蛋白質、 和糖蛋白。 ^ 29·如申請專利範圍第27項之組成物，其中該肽激 素或蛋白質激素或糖蛋白激素係選自：抗利尿素、絨毛性 促素、促黃體生成激素、濾泡刺激荷爾蒙、胰島素、促乳 素、生長調節素、生長激素、甲狀腺刺激荷爾蒙、胎盤激 乳素以及摹仿或作用爲前述任何荷爾蒙之拮抗劑的肽類、 蛋白質、和糖蛋白。 3 〇 ·如申請專利範圍第2 7項之組成物，其中該生長 因子係選自：菌落刺激因子、表皮生長因子、成纖維細胞 生長因子、胰島素樣生長因子、轉形生長因子、血小板衍 -86- 1362942 生型生長因子、神經生長因子、肝細胞生長因子、神經營 養因子、睫狀神經營養因子、源自腦之神經營養因子、源 自神經膠質的神經營養因子或骨形態發生的肽以及摹仿或 . 作用爲前述任何生長因子之拮抗劑的肽類、蛋白質和糖蛋 _ 白。 31. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該細胞 激動素係選自：紅細胞生成素、淋巴素、介白素、干擾素 '腫瘤壞死因子、白血病抑制性因子以及促血小板生成素 鲁 、以及摹仿或作用爲前述任何細胞激動素之拮抗劑的肽類 、蛋白質和糖蛋白。 32. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該酵素 係選自：碳水化合物-專一性酵素、蛋白水解酶、氧化還 原酶、轉移酶、水解酶、溶解酶、異構酶以及連接酶。 3 3 ·如申請專利範圍第3 2項之組成物，其中該氧化 還原酶是尿酸酶。 3 4 ·如申請專利範圍第3 2項之組成物，其中該蛋白 鲁 水解酶是纖溶酶原啓動子。 35.如申請專利範圍第26項之組成物，其中該狀、 蛋白質或糖蛋白是變應原。 3 6.如申請專利範圍第1項之組成物’其中該生物活 性化合物是紫杉烷或其衍生物。 37·如申請專利範圍第1項之組成物’其中該生物活 性化合物是抗生素或其衍生物。 38.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該結合體 -87- 1362942 爲98%或更高之純度。 39.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該結合體 . 爲99%或更高之純度。 . 40. —種具有降低之免疫產生性與抗原性的藥學組成 物，其包含如申請專利範圍第1項之組成物及醫藥學上可 接受的賦形劑或載體。 41. 一種如申請專利範圍第1項之組成物或如申請專 鲁利範圍第40項之組成物的用途，係用於製備預防、診斷 、或治療動物身體病症用的醫藥。 42. 如申請專利範圍第41項之用途，其中該動物是 哺乳動物。 43·如申請專利範圍第42項之用途，其中該哺乳動 物是人類。 44. 如申請專利範圍第41項之用途，其中該身體的 病症係選自：癌症、關節炎、傳染病、遺傳疾病、神經性 鲁疾病、代謝失調、酵素病症、心血管疾病以及高血壓。 45. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該癌症係 選自：乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、睪九癌、肺癌 、白血病、淋巴瘤、結腸癌、胃腸的癌症、胰腺癌、膀胱 癌、腎癌、骨癌、神經癌症、頭部以及頸癌症、皮膚癌以 及其它癌症、肉瘤、腺腫瘤以及骨髓癌^ 46. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該傳染病 係選自：細菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病以及寄生 疾病。 -88- 1362942 47.如申請專利範圍第46項之用途，其中該病毒的 疾病係選自：包括人類免疫不全病毒/愛滋病以及肝炎。 48·如申請專利範圍第44項之用途，其中該遺傳疾 病係選自：側索硬化性肌肉萎縮症、囊性纖維化、高雪氏 病、血友病以及其它遺傳性血液病症、糖原貯積病以及重 症聯合免疫缺陷（"SCID")。 49.如申請專利範圍第項44之用途，其中該神經性 疾病係選自：阿玆海默病以及多發性硬化。 φ 5 0. —種由生物活性化合物和僅在一個末端活化的聚 烷二醇（"單活化的聚烷二醇"）產生結合體之方法，該方 法包含： (a ) 得到不含有任何穩定聯結的末端烷氧基團 之聚烷二醇； (b) 可視需要，在將步驟（a)之聚烷二醇轉化 成單官能活化的聚烷二醇之前，先添加一種或多種可移除 的阻斷基團，例如第三丁氧基團、芳氧基團或三苯甲基團 · ("三苯甲基團"），以保護除了其中之一之外的所有末端 基團； (c) 在可用單一衍生基團將該聚烷二醇不含該 (等）可移除阻斷基團之末端進行衍生反應之條件下，使 該聚烷二醇和衍生化合物反應而產生該聚烷二醇的單官能 活化衍生物； (d ) 若加入阻斷基團保護該（等）末端基團， 如上述步驟（b)，則用一或多個步驟去除阻斷基團，而 -89- 1362942 不去除如以上步驟（C)所述聯結的活化基團，而產生單 官能活化的聚烷二醇，其中遠端是羥基：以及 (e) 在利於使該單官能活化的聚烷二醇與該生 物活性成份共價鍵結條件下，使單官能活化的聚烷二醇與 至少一個生物活性成份接觸，或 (f) 或者，在進行步驟（d)之前先進行步驟（e )° 51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該衍生基 團係選自醛以及羧基團。 52. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該阻斷基 團係選自：三苯甲基團、芳氧基團以及第三丁氧基團。 53_ —種使鏈狀單羥基PEG單醛與對應PEG-二醛分 開之方法，該方法包含： (Ο 將PEG-醛上所有羥基轉換成三苯甲基衍生 物； (b) 用逆相層析法使單三苯甲基 PEG-單醛與 PEG二醛及任何二（三苯甲基）PEG二者分開，以及 (c) 在酸性介質中水解去除三苯甲基團，而將 單三苯甲基PEG-單醛轉換成單羥基PEG-單醛。 54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該醛或該 等一酸是乙縮酵衍生物的形式。 55. —種以如申請專利範圍第50項之方法製造之結 合體。 56. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中該結合 -90- 1362942 體相較於一種包含有相同生物活性成份在生物活性成份之 一個或數個相同位點聯結相同分子數、相同大小的鏈狀或 分支狀構造聚烷二醇之結合體，且若聚烷二醇是鏈狀則遠 端含有烷氧基團，或若聚烷二醇是分支狀則在遠端含有兩 個或多個烷氧基團的結合體，其抗原性降低或實質上降低 〇 57. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中該聚烷 二醇係選自：聚（乙二醇）以及環氧乙烷以及環氧丙烷之 共聚物。 58. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中該聚烷 二醇成分係選自：鏈狀聚（乙二醇）以及分支狀聚（乙二 醇）。 59. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中各該聚 烷二醇之分子量約lkDa至約i〇〇kDa。 60. 如申請專利範圍第59項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約2kDa至約60kDa» 61. 如申請專利範圍第60項之結合體，其中該聚烷 二醇具有二個分支，各分支之分子量約2kDa至約30kDa 〇 62. 如申請專利範圍第6i項之結合體，其中該聚烷 二醇具有二個分支’各分支之分子量約5kDa至約20kDa 〇 63. 如申請專利範圍第60項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約l〇kDa至約20kDa。 1362942 64.如申請專利範圍第63項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約12kDa。 . 65·如申請專利範圍第60項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約18kDa至約60kDa» 66. 如申請專利範圍第65項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約18kDa至約22kDa。 67. 如申請專利範圍第66項之結合體，其中該聚烷 _二醇之分子量約20kDa。 68_如申請專利範圍第65項之結合體，其中該聚烷 二醇之分子量約27kDa至約33kDa。 69_如申請專利範圍第55項之結合體，其中該結合 體包含約1至約1〇〇股之該聚烷二醇。 70. 如申請專利範圍第69項之結合體，其中該結合 體包含約1至約5股之該聚烷二醇。 71. 如申請專利範圍第70項之結合體，其中該結合 #體包含約1至約2股之該聚烷二醇。 72. 如申請專利範圍第69項之結合體，其中該結合 體包含約5至約100股之該聚烷二醇。 73. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中用於合 成結合體之單官能活化的聚烷二醇係選自：羥基PEG-單 醛以及羥基PEG-單酸的反應性酯類。 74. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中用於合 成結合體之單官能活化的聚烷二醇若是鏈狀則在遠端具有 羥基，或若是分支狀則在每個遠端均具有羥基。 -92- 1362942 75. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中用於其 合成之單官能活化的聚烷二醇是衍生自鏈狀的二羥基PEG 〇 76. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中該生物 活性成份係選自：肽、蛋白質、糖蛋白、有機化合物、內 含胺之化合物、內含羧基之化合物、內含羥基之化合物和 內含硫醇之化合物。 77. 如申請專利範圍第76項之結合體，其中該生物 活性成份係選自：肽、蛋白質和糖蛋白。 78. 如申請專利範圍第77項之結合體，其中該肽或 蛋白質或糖蛋白係選自：酵素、血清蛋白質、血清糖蛋白 、血細胞蛋白質、色素的蛋白質、血紅素、病毒的蛋白質 、肽荷爾蒙、蛋白質荷爾蒙、糖蛋白荷爾蒙、下視丘的釋 放因子、細胞激動素、生長因子以及肽類以及摹仿或作用 爲前述任何物質之拮抗劑的肽、蛋白質和糖蛋白。 79. 如申請專利範圍第78項之結合體，其中該血清 蛋白質係選自：白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子以及摹仿 或作用爲前述任何血清蛋白質之拮抗劑的肽、蛋白質和糖 蛋白。 80. 如申請專利範圍第78項之結合體，其中該肽激 素，或蛋白質激素或糖蛋白激素係選自：抗利尿素、絨毛性 促素、促黃體生成激素、濾泡刺激荷爾蒙、胰島素、促乳 素、生長調節素、生長激素、甲狀腺刺激荷爾蒙、胎盤激 乳素以及摹仿或作用爲前述任何荷爾蒙之拮抗劑的肽類、 -93- 1362942 蛋白質和糖蛋白。 81. 如申請專利範圍第78項之結合體，其中該生長 •因子係選自：菌落刺激因子、表皮生長因子、成纖維細胞 生長因子、胰島素樣生長因子、轉形生長因子、血小板衍 生型生長因子、神經生長因子、肝細胞生長因子 '神經 營養因子、睫狀神經營養因子、源自腦之神經營養因子、 源自神經膠質的神經營養因子或骨形態發生的肽以及摹仿 Φ或作用爲前述任何生長因子之拮抗劑的肽類、蛋白質和糖 蛋白。 82. 如申請專利範圍第78項之結合體，其中該細胞 激動素係選自：紅細胞生成素、淋巴素、介白素、干擾素 、腫瘤壞死因子、白血病抑制性因子以及促血小板生成素 '以及摹仿或作用爲前述任何細胞激動素之拮抗劑的肽類 、蛋白質和糖蛋白。 8 3.如申請專利範圍第78項之結合體，其中該酵素 ®係選自：碳水化合物-專一性酵素、蛋白水解酶、氧化還 原酶、轉移酶、水解酶、溶解酶、異構酶以及連接酶。 84.如申請專利範圍第83項之結合體，其中該氧化 還原酶是尿酸酶。 85·如申請專利範圍第83項之結合體，其中該蛋白 水解酶是纖溶酶原啓動子。 86. 如申請專利範圍第77項之結合體，其中該肽、 蛋白質或糖蛋白是變應原。 87. 如申請專利範圍第55項之結合體，其中該生物 -94- 1362942
活性化合物是紫杉烷或其衍生物。 88.如申請專利範圍第55項之結合體，其中該生物 活性化合物是抗生素或其衍生物。 89·—種具有降低之免疫產生性與抗原性的藥學組成 物’其包含如申請專利範圍第55項之結合體及醫藥學上 可接受的賦形劑或載體。 90. —種套組，其包含如申請專利範圍第1項之組成 物。 91_ —種套組，其包含如申請專利範圍第40項之藥 學組成物。 92·—種套組，其包含如申請專利範圍第55項之結 合體。 93· —種PEG-脂質體組成物，其中PEG成分在每個 遠端包含羥基且各PEG分子係以單一位點在脂質分子的 單一位點上聯結單一脂質分子。 94. 如申請專利範圍第93項之組成物，其中該聯結 位點是磷脂醯乙醇胺之胺基。 95. 如申請專利範圍第93項之組成物，其中該聯結 位點是二醯甘油之羥基。 96. 如申請專利範圍第93項之組成物，其中相較於 一種包含至少一個烷氧基PEG之PEG脂質體組成物或一 種在多於一個位點上聯結脂質之PEG或聯結多於一個脂 質分子之PEG脂質體組成物，該組成物之免疫反應性降 低或實質上降低。 -95- 1362942 97. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該細胞 激動素係選自由粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子（GM-CSF )及其片段、變異體（variant )、與衍生物所組成之 . 群組》 98. 如申請專利範圍第78項之結合體，其中該細胞 激動素係選自由粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子（GM-CSF)及其片段、變異體（variant)、與衍生物所組成之 •群組。 99. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中該生長 因子爲菌落一刺激因子。 100·如申請專利範圍第99項之組成物，其中該菌落 -刺激因子爲粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子（GM-CSF );其片段、變異體（variant)、或衍生物；或摹仿GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白。 101. 如申請專利範圍第1〇〇項之組成物，其中該 ♦ GM-CSF、其片段、變異體（variant )、或衍生物，或摹 仿GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白是以共價鍵聯結至一 個鏈狀或分支狀的聚烷二醇分子，此聚烷二醇分子的任何 末端不含烷氧基團且此分子聯結至該GM-CSF單一分子》 102. 如申請專利範圍第100項之組成物，其中該 GM-CSF、其片段、變異體（variant)、或衍生物，或摹 仿GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白是以共價鍵聯結至二 個鏈狀或分支狀的聚烷二醇分子，此等聚烷二醇分子的任 何末端不含烷氧基團且此等分子聯結至該GM-CSF單一分 -96- 1362942 子。 103.如申請專利範圍第78項之結合體，其中該生長 因子爲菌落-刺激因子。 1〇4·如申請專利範圍第103項之結合體，其中該菌 落-刺激因子爲粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子（GM-CSF);其片段、變異體（variant)、或衍生物；或摹仿 GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白。 105.如申請專利範圍第1〇4項之結合體，其中該 GM-CSF、其片段、變異體（variant)、或衍生物，或摹 仿GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白是以共價鍵聯結至— 個鏈狀或分支狀的聚烷二醇分子，此聚烷二醇分子的任何 末端不含烷氧基團且此分子聯結至該GM-CSF單一分子。 10 6.如申請專利範圍第1〇4項之結合體，其中該 GM-CSF、其片段、變異體（variant)、或衍生物，或摹 仿GM-CSF之肽、蛋白質、或糖蛋白是以共價鍵聯結至二 個鏈狀或分支狀的聚烷二醇分子，此等聚烷二醇分子的任 何末端不含烷氧基團且此等分子聯結至該GM-CSF單一分 子。 107.—種用於製造申請專利範圍第1項之組成物的方法 ’其中該生物活性成份是以共價鍵聯結到至少一個鏈狀或分 支狀聚烷二醇’該聚烷二醇已藉包含以下步驟之方法轉化爲 單官能性活化之聚烷二醇： (a) 取得在每個末端具有羥基的聚烷二醇； (b) 在將（a)之聚烷二醇轉化爲單官能性活化之聚 -97- 1362942 烷二醇之前，藉由添加一或多個可去除的阻'斷基團把該聚 烷二醇中一個以外的所有羥基加以保護； . (C)藉以下方式製得該聚烷二醇之單官能性活化之衍 . 生物：（i)令該聚烷二醇與衍生化合物在使該聚烷二醇之 不含該可去除之阻斷基團的羥基處被單一衍生基團所衍生 化的條件下反應，並將該衍生的聚烷二醇上的該衍生基團 加以活化；或（H)令該聚烷二醇與活性衍生化合物在使 II該聚烷二醇之不含該可去除之阻斷基團的羥基處被單一活 性衍生基團所衍生化的條件下反應； (d) 將該單官能性活化之衍生物純化； (e) 在不去除（c)中所聯結的活性衍生基團之下去除 該阻斷基團，以製得所含遠端爲羥基的單官能性活化之聚 烷二醇；及 (Ό令該單官能性活化之聚烷二醇與該生物活性成份 在利於該單官能性活化之聚烷二醇共價結合該生物活性成 ®份的條件下接觸。 -98-
TW092127073A 2002-09-30 2003-09-30 Compositions comprising conjugates with decreased antigenicity and the pharmaceutical compositions, uses and production thereof;method of producing conjugates and the conjugates produced therefrom;method for separating linear monohydroxypeg-monoaldehyde TWI362942B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41442402P 2002-09-30 2002-09-30
US10/317,092 US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2002-12-12 Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200416035A TW200416035A (en) 2004-09-01
TWI362942B true TWI362942B (en) 2012-05-01

Family

ID=32033300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW092127073A TWI362942B (en) 2002-09-30 2003-09-30 Compositions comprising conjugates with decreased antigenicity and the pharmaceutical compositions, uses and production thereof;method of producing conjugates and the conjugates produced therefrom;method for separating linear monohydroxypeg-monoaldehyde

Country Status (26)

Country Link
US (1) US20040062748A1 (zh)
EP (2) EP2535347A1 (zh)
JP (2) JP5366352B2 (zh)
KR (1) KR101022577B1 (zh)
CN (2) CN1997661B (zh)
AU (1) AU2003275176B8 (zh)
BR (1) BRPI0314831B8 (zh)
CA (2) CA2500389C (zh)
CR (1) CR7776A (zh)
DK (1) DK1572728T3 (zh)
EA (1) EA009122B1 (zh)
EC (1) ECSP055717A (zh)
ES (1) ES2504165T3 (zh)
GE (1) GEP20074016B (zh)
HK (1) HK1083190A1 (zh)
HR (1) HRP20050353B1 (zh)
IL (1) IL167723A (zh)
IS (1) IS2944B (zh)
MA (1) MA27521A1 (zh)
MX (1) MXPA05003394A (zh)
NO (1) NO20052089L (zh)
NZ (1) NZ539133A (zh)
PT (1) PT1572728E (zh)
RS (1) RS20050263A (zh)
TW (1) TWI362942B (zh)
WO (1) WO2004030617A2 (zh)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20010003580A1 (en) 1998-01-14 2001-06-14 Poh K. Hui Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
DK1531791T3 (da) 2002-06-07 2010-11-01 Dyax Corp Forebyggelse og begrænsning af iskæmi
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
WO2004060299A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
CA2519092C (en) 2003-03-14 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. Branched water-soluble polymers and their conjugates
PL1615945T3 (pl) 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
MXPA05012313A (es) 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP1663281B1 (en) * 2003-08-29 2013-12-25 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
KR101439880B1 (ko) 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
NZ556436A (en) 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7858080B2 (en) * 2005-05-20 2010-12-28 Agency For Science, Technology And Research Aldehyde conjugated flavonoid preparations
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US7816484B2 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for making polyethylene glycol carbonates
WO2007102562A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Keio University 新規抗血栓薬
EP2018437A2 (en) * 2006-05-02 2009-01-28 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
ES2516694T3 (es) 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
BRPI0809670A8 (pt) 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA2696208A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
CN103497246B (zh) 2008-02-27 2016-08-10 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2010080833A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2597954T3 (es) 2009-07-27 2017-01-24 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de la coagulación sanguínea
KR101912335B1 (ko) 2009-07-27 2018-10-26 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
NZ623810A (en) 2009-07-27 2015-10-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
RS57870B1 (sr) 2010-01-06 2018-12-31 Dyax Corp Proteini koji vezuju kalikrein plazme
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
CA3065178C (en) 2010-12-13 2022-02-01 Quiapeg Pharmaceuticals Ab Functionalized polymers
BR112013015898A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-26 Baxter International Inc. derivado de ácido graxo solúvel em água, e, métodos para preparar um derivado de ácido graxo e uma proteína terapêutica conjugada.
KR102107695B1 (ko) 2011-01-06 2020-05-07 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
JP5949037B2 (ja) 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
EP3628332A1 (en) 2012-06-12 2020-04-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Conjugates of biologically active molecules to functionalized polymers
RU2677796C9 (ru) * 2013-03-05 2019-03-15 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом
BR112016022318A2 (pt) 2014-03-27 2017-10-31 Dyax Corp método, composição farmacêutica para uso no tratamento de doenças de retina e uso de um anticorpo
JP2017516869A (ja) * 2014-06-04 2017-06-22 ジム バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド 皮膚の質を改善するための組成物及び方法
EA201791437A1 (ru) 2014-12-31 2017-12-29 Лантеус Медикал Имэджинг, Инк. Композиции микросфер c инкапсулированным в липиде газом и соответствующие способы
BR112018011622A2 (pt) 2015-12-11 2018-11-27 Dyax Corp método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae
TWI832081B (zh) 2016-05-04 2024-02-11 美商藍瑟斯醫學影像公司 用於形成充氣微球體及成像個體之方法、震盪裝置及電腦可讀軟體
US9789210B1 (en) 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
EP3592393B1 (en) 2017-03-10 2021-12-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
JP2021535920A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 キアペグ ファーマシューティカルズ アクチエボラグ 放出可能なｇｌｐ−１コンジュゲート
CN110376369B (zh) * 2019-07-30 2022-02-15 重庆派金生物科技有限公司 一种抗聚乙二醇抗体的抗原区免疫原性分析方法
EP4052726A4 (en) * 2019-10-29 2023-12-20 National University Corporation Kumamoto University CD4 MIMETIC COMPOUND WITH ANTI-HIV ACTIVITY
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
CN114392237B (zh) * 2021-12-28 2024-02-02 上海允英生物医药科技有限公司 一种冻干病毒制剂及其制备方法

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2433883C2 (de) * 1973-07-20 1986-03-27 Research Corp., New York, N.Y. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
US4399282A (en) * 1979-07-10 1983-08-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Camptothecin derivatives
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4434228A (en) * 1982-04-20 1984-02-28 Genex Corporation Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
IE64284B1 (en) 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
US4943579A (en) * 1987-10-06 1990-07-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Water soluble prodrugs of camptothecin
US5004758A (en) * 1987-12-01 1991-04-02 Smithkline Beecham Corporation Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells
JP2958019B2 (ja) * 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5364612A (en) * 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6326353B1 (en) * 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
WO1994027498A1 (en) * 1993-05-20 1994-12-08 The Regents Of The University Of California Macromolecular contrast media for mr imaging
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
WO1995000162A1 (en) * 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5824701A (en) * 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
US5622986A (en) * 1993-10-20 1997-04-22 Enzon, Inc. 2'-and/or 7-substituted taxanes
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5728560A (en) * 1996-06-14 1998-03-17 Enzon, Inc. Method of treating CD4+ T cell lymphopenia in immuno-compromised patients
US5804183A (en) * 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
EP1017794A1 (en) * 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
EP0981548A4 (en) * 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6239262B1 (en) * 1998-01-07 2001-05-29 Rensselaer Polytechnic Institute Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems
US5880225A (en) * 1998-02-18 1999-03-09 Arco Chemical Technology, L.P. Process for making polyetherester resins having high aromatic diester
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
EP2158923B1 (en) 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CN1330675A (zh) 1998-08-28 2002-01-09 格莱风科学公司 精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物
AU762616B2 (en) * 1998-10-16 2003-07-03 Biogen Ma Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses
GB9822963D0 (en) 1998-10-20 1998-12-16 Agner Erik Improvements in or relating to chromatography
US6596849B1 (en) * 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
MXPA02003540A (es) 1999-10-08 2003-09-12 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de poli(etilenglicol) heterobifuncionales y los metodos para su preparacion.
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
WO2002080207A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Arizona State University Micro-machined radio frequency switches and method of operating the same
DK1421175T3 (da) * 2001-06-28 2009-03-23 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabiliserede proteinaser
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
EP1498420B1 (en) * 2002-03-29 2017-02-01 Nof Corporation Phospholipid derivative
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP055717A (es) 2005-08-11
KR101022577B1 (ko) 2011-03-16
TW200416035A (en) 2004-09-01
MXPA05003394A (es) 2005-10-05
IS2944B (is) 2016-04-15
MA27521A1 (fr) 2005-09-01
CN1997661A (zh) 2007-07-11
CA2836959A1 (en) 2004-04-15
NO20052089L (no) 2005-04-28
IL167723A (en) 2013-01-31
AU2003275176B8 (en) 2009-01-08
JP5366352B2 (ja) 2013-12-11
EP2535347A1 (en) 2012-12-19
HRP20050353A2 (en) 2006-06-30
BRPI0314831B1 (pt) 2021-01-19
PT1572728E (pt) 2014-09-19
AU2003275176B2 (en) 2008-12-18
EP1572728A4 (en) 2010-03-10
GEP20074016B (en) 2007-01-10
DK1572728T3 (da) 2014-09-22
RS20050263A (en) 2007-08-03
HRP20050353B1 (hr) 2013-07-31
WO2004030617A2 (en) 2004-04-15
CR7776A (es) 2007-10-07
WO2004030617A3 (en) 2005-07-21
HK1083190A1 (zh) 2006-06-30
EP1572728B1 (en) 2014-06-25
EA200500519A1 (ru) 2005-12-29
IS7778A (is) 2005-03-30
JP5603823B2 (ja) 2014-10-08
CN1997661B (zh) 2013-12-04
KR20050083702A (ko) 2005-08-26
ES2504165T3 (es) 2014-10-08
US20040062748A1 (en) 2004-04-01
JP2011157379A (ja) 2011-08-18
EA009122B1 (ru) 2007-10-26
EP1572728A2 (en) 2005-09-14
BRPI0314831B8 (pt) 2021-05-25
CA2500389C (en) 2015-03-10
CA2836959C (en) 2017-06-06
NZ539133A (en) 2008-03-28
BR0314831A (pt) 2005-08-16
CA2500389A1 (en) 2004-04-15
AU2003275176A1 (en) 2004-04-23
JP2006510601A (ja) 2006-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI362942B (en) Compositions comprising conjugates with decreased antigenicity and the pharmaceutical compositions, uses and production thereof;method of producing conjugates and the conjugates produced therefrom;method for separating linear monohydroxypeg-monoaldehyde
US8129330B2 (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
JP2006510601A5 (zh)
US6638906B1 (en) Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
JP2002508400A (ja) アミノ及びヒドロキシル含有生物活性剤のポリマープロドラッグ
AU2005224078B2 (en) Methods for increasing protein polyethylene glycol (PEG) conjugation
JP2022058911A (ja) 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
KR20120073196A (ko) 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
JP2006521372A (ja) 生物学的活性物質と生体適合性高分子の１：１接合体、この製造方法とこれを含む薬学組成物
JP4237703B2 (ja) インスリン様成長因子結合タンパク質−４及びポリ（エチレングリコール）の接合体
ZA200502707B (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
KR20040086521A (ko) 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees