KR20050083702A - 항원성이 감소한 중합체 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및용도 - Google Patents

항원성이 감소한 중합체 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및용도 Download PDF

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메리 알. 셔만
마크 쥐. 피. 세이퍼
엘. 데이비드 윌리암스
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Abstract

다양한 생체활성 성분, 특히 단백질의 수용성 중합체 (예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이의 유도체)와의 콘쥬게이트의 제조방법이 제공되는데, 여기에서 콘쥬게이트는 메톡실 또는 또다른 알콕실기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜)을 사용하여 제조된 유사한 콘쥬게이트와 비교하여 감소한 항원성 및 면역원성을 가진다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조되는 콘쥬게이트, 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 조성물, 이러한 콘쥬게이트 또는 조성물을 함유하는 키트 및 진단 및 치료 요법에 있어서 콘쥬게이트와 조성물의 사용방법을 제공한다.

Description

항원성이 감소한 중합체 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및 용도 {POLYMER CONJUGATES WITH DECREASED ANTIGENICITY, METHODS OF PREPARATION AND USES THEREOF}
본 발명은 단백질 생화학 분야이고 제약학 및 의학에 속한다. 특히, 본 발명은 수용성 중합체 (예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이의 유도체)와 생체활성 성분 간의 콘쥬게이트의 제조방법을 제공하는데, 여기에서 콘쥬게이트는 표준 중합체-생체활성 성분 콘쥬게이트와 비교하여 감소한 항원성 및 면역원성을 가진다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조된 콘쥬게이트, 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 조성물, 이러한 콘쥬게이트와 조성물을 포함하는 키트 및 각종 의학적 및 수의학적 증상을 예방하고, 진단하며 치료하는 데 있어서 콘쥬게이트 및 조성물의 사용방법을 제공한다.
두가지 핵심 요인이 치료제로서의 재조합 단백질의 발달을 방해해왔다 - 순환계에서의 일반적으로 짧은 반감기 및 잠재적인 항원성 및 면역원성. 본원 및 당분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "항원성"은 분자의 선재하는 항체에의 결합능을 지칭하고, 용어 "면역원성"은 그 반응이 항체의 형성을 수반하든("체액성 반응") 세포성 면역반응의 자극을 수반하든 어느 쪽이든지 생체내 면역반응의 도출능을 지칭한다. 재조합 치료용 단백질의 투여에 있어서, 최고 순환 활성을 달성하고 생체이용률 및 분해 문제를 최소화하기 위해서는 정맥내 (i.v.) 투여가 종종 바람직하다. 그러나, 정맥내 투여 후에 작은 단백질의 반감기는 보통 극히 짧다 (참조, 문헌 [Mordenti, J., et al., (1991) Pharm Res 8:1351-1359; Kuwabara, T., et al., (1995) Pharm Res 12:1466-1469]의 예). 건강한 신장은 일반적으로 약 36 Å 스토크스 반경 및 약 66,000 달톤 (66 kDa)의 분자량을 가지는 혈청 알부민의 값을 초과하는 유체역학적 반경의 혈류 단백질을 보유하고 있다. 그러나, 더 작은 단백질, 예컨대 과립구집락-자극 인자 ("G-CSF") 및 리보핵산분해효소는 사구체 여과에 의해 혈류로부터 신속히 제거된다 (문헌 [Brenner, B. M., et al. (1978) Am J Physiol 234:F455-F460; Venkatachalam, M. A., et al. (1978) Circ Res 43:337-347; Wilson, G., (1979) J Gen Physiol 74:495-509]). 그 결과, 순환계에서 작은 재조합 단백질의 치료학적으로 유용한 농도의 유지가 정맥내 투여 후에 문제화된다. 따라서, 고농도의 이러한 단백질과 더욱 빈번한 주사가 투여되어야 한다. 높은 투여량 비율은 치료 비용을 증가시키고, 환자 순응도의 가능성을 감소시키며 악영향, 예를 들면 면역반응의 위험성을 증가시킨다. 세포성 및 체액성 면역반응 모두 유효 투여량의 투여를 방해할 수 있거나 치료-제한 결과, 예컨대 아나필락시스를 유도할 수 있을 정도로 주사한 재조합 단백질의 순환 농도를 감소시킬 수 있다 (문헌 [Pui, C. -H., et al. (2001) J Clin Oncol 19:697-704]).
대안의 투여 경로, 예컨대 피하 (s.c.) 또는 근육내 (i.m.) 주사는 재조합 단백질의 순환계로의 더욱 점차적인 배출을 제공함으로써 이러한 문제점 중 일부를 극복할 수 있다. 그러나, 생체이용률은 꽤 낮아서, 이러한 약제의 유효한 순환 농도 달성을 어렵게 할 수 있다. 피하 또는 근육내 투여된 약제의 불량한 생체이용률과 관련있을 수 있는 추가의 문제점은 주사 부위에서 치료용 단백질의 분해 가능성 증가이다.
폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG") 유도체의 공유 부착에 의한 재조합 단백질의 변형이 전술한 단점을 해결하기 위한 수단으로서 광범위하게 조사되었다 (문헌 [Sherman, M. R., et al. (1997) in: Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, Harris, J. M., et al., eds., American Chemical Society, Washington, D. C., pp. 155-169; Roberts, M. J., et al. (2002) Adv Drug Deliv Res 54:459-476]에서 검토). PEG 유도체의 단백질에의 부착은 생체내에서 단백질을 안정화시키고, 이들의 생체이용률을 개선하며/개선하거나 이들의 면역원성을 감소시키는 것으로 보여진다. (PEG 유도체의 단백질 또는 기타 기질에의 공유 부착은 본원에서 "PEG화"로 지칭되고 당분야에 공지되어 있다.) 또한, PEG화는 단백질의 유체역학적 반경을 상당히 증가시킬 수 있다. 작은 단백질, 예컨대 시토킨 또는 폴리펩티드 호르몬이 (예를 들면, 약 18 kDa 이상의 분자량을 가지는) PEG의 단일 장스트랜드에 커플링되면, 생성되는 콘쥬게이트는 혈청 알부민보다 더 큰 유체역학적 반경을 가지고 신장 사구체를 통한 이의 제거가 현저히 지연된다. PEG화의 복합 효과 - 감소한 단백질 분해, 감소한 면역 인식 및 감소한 신장 제거 속도 - 는 PEG화된 단백질에 치료제로서의 실질적인 장점을 부여한다.
1970년대 이래로, 중합체의 공유 부착을 사용하여 각종 단백질의 제약용으로서의 안전성과 효능을 개선하기 위한 시도가 행해져왔다 (참조, 예를 들면 미국 특허 제4,179,337호). 일부 예로 중증 합병 면역결핍증의 치료에 사용하기 위한 PEG 또는 폴리(에틸렌 옥시드) (PEO)의 아데노신 데아민아제 (EC 3.5.4.4)에의 커플링이 포함된다 (문헌 [Davis, S., et al. (1981) Clin Exp Immunol 46:649-652; Hershfield, M. S., et al. (1987) N Engl J Med 316:589-596]). 다른 예로는 염증 증상의 치료를 위한 PEG의 과산화 디스뮤타아제(EC 1.15.1.1)에의 커플링 (Saifer, M. et al., 미국 특허 제5,006,333호 및 제5,080,891호) 및 혈액과 요로부터 과량의 요산의 제거를 위한 요산염 산화제 (EC 1.7.3.3)에의 커플링 (Inada, Y., 일본 특허 출원 55-099189; 문헌 [Kelly, S. J., et al. (2001) J Am Soc Nephrol 12:1001-1009]; Williams, L. D., et al., PCT 공보 WO 00/07629 A3 (미국 특허 제6,576,235호에 대응); Sherman, M. R., et al., PCT 공보 WO 01-59078 A2)이 포함된다.
PEO 및 PEG는 공유 결합된 에틸렌 옥시드 단위로 이루어지는 중합체이다. 이들 중합체는 하기 화학식을 가진다:
R1-(OCH2CH2)n-R2
여기에서, R2는 히드록실기 (또는 이의 반응성 유도체)일 수 있고 R1은 "PEG 디올"에서와 같이 수소, 모노메톡시PEG ("mPEG")에서와 같이 메틸기, 또는 예를 들면, 이소-프로폭시PEG 또는 t-부톡시PEG에서와 같이 또다른 저급 알킬기일 수 있다. PEG의 화학식에서 변수 n은 중합체 중 에틸렌 옥시드 단위 수를 나타내고 본원에서 그리고 당분야에서 "중합도"라고 지칭된다. PEG 및 PEO는 선형, 분지형 (문헌 [Fuke, I., et al. (1994) J Control Release 30:27-34]) 또는 스타형 (star-shaped) (문헌 [Merrill, E. W. (1993) J Biomater Sci Polym Ed 5:1-11])일 수 있다. PEG 및 PEO는 양친매성, 즉 물 및 특정 유기 용매에서 가용성이고 외피 바이러스와 동물 및 박테리아의 세포막을 비롯한 지질-함유 물질에 부착할 수 있다. 화학식: 을 가지는, 에틸렌 옥시드 (OCH2CH2)와 프로필렌 옥시드의 특정 랜덤 또는 블록 또는 교호 공중합체는 이들 공중합체가 특정 용도에서는 PEG의 적합한 대체물이라고 여겨지는 PEG의 성질과 충분히 유사한 성질을 가진다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 제4,609,546호 및 제5,283,317호). 용어 "폴리알킬렌 옥시드" 및 약어 "PAO"는 본원에서 이러한 공중합체 뿐만 아니라 PEG 또는 PEO 및 폴리(옥시에틸렌-옥시메틸렌) 공중합체를 지칭하는 데 사용된다 (미국 특허 제5,476,653호). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 및 약어 "PAG"는 일반적으로 본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기에 적합한 중합체, 특히 PEG, 보다 특히 단일 반응기를 함유하는 PEG ("단일관능성 활성화된 PEG")를 지칭하는 데 사용된다.
통상적으로, 하나 이상의 PAG, 예를 들면 약 5 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 지니는 하나 이상의 mPEG의 다수의 (예를 들면, 5 내지 10) 스트랜드는 1급 아미노기 (리신 잔기의 입실론 아미노기 및 N-말단 아미노산의 알파 아미노기)를 통해 표적 단백질과 커플링된다. 더욱 최근에는, 더 큰 분자량, 예를 들면 12 kDa, 20 kDa 또는 30 kDa의 mPEG의 단일 스트랜드를 함유하는 콘쥬게이트가 합성되었다. 콘쥬게이트의 혈장 반감기와 커플링된 PEG의 증가하는 분자량 및/또는 증가하는 스트랜드 수 사이의 직접적인 상관관계가 규명되었다 (문헌 [Clark, R., et al. (1996) J Biol Chem 271:21969-21977)]. 또다른 한편, PEG의 스트랜드 수가 증가할수록, 생체활성 성분 (특히 생체활성 성분이 단백질이라면)의 필수 영역에서 아미노기가 이의 생물학적 작용 (예를 들면, 효소에 의한 촉매작용 또는 시토킨에 의한 수용체 결합)을 손상시키면서 변형될 가능성도 증가한다. 다수의 아미노기를 함유하는 더 큰 단백질 및 저분자량의 기질을 지니는 효소의 경우에, 이는 생체내 PEG-함유 콘쥬게이트의 생물학적 활성의 순증가를 초래하기 때문에 길어진 작용 지속시간과 감소한 특정 활성 사이의 이 트레이드오프 (tradeoff)가 허용될 수 있다. 그러나, 더욱 작은 단백질, 예컨대 폴리펩티드 호르몬 및 시토킨 경우에는, 비교적 높은 치환 정도가 혈류내 연장된 반감기의 장점을 무효화할 정도까지 작용 활성을 감소시킬 것이다 (상기 문헌 [Clark, R., et al.]).
본 발명자 중 일부는 다양한 PEG화 전략을 개발하였고 이들을 다수의 단백질에 적용하여 생체내에서 호적한 약물동력학과 증가한 효능의 목적하는 조합을 달성하였다. 이들 단백질로는 과립구집락자극인자 ("GM-CSF") (상기 문헌 [Saifer, M. G. P., et al. (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, M. R., et al. (1997)]) 및 재조합 포유류 요산분해효소 (참조, PCT 공보 WO 00/07629 및 WO 01/59078; 상기 문헌 [Kelly, S. J., et al.]; 미국 특허 제6,576,235호)가 포함된다. 모델 시토킨으로서 GM-CSF를 사용하여, 본 발명자 중 일부는 고분자량 (약 36 kDa) mPEG의 하나 또는 두 스트랜드의 부착이 생체내에서 재조합 마우스 GM-CSF의 효능을 현저히 증대시키기에 충분함을 입증하였다 (상기 문헌 [Saifer, M. G. P., et al. (1997); Sherman, M. R., et al. (1997)]).
재조합 포유류 요산염 산화제 (요산분해효소)가 난치 통풍을 위한 잠재적인 치료법으로서 변형되고 조사된 연구 또한 수행되었다 (참조, PCT 공보 WO 00/07629 (대응 미국 특허 제6,576,235호) 및 WO 01-59078, 그의 명세는 참고로 본원에 포함된다). PEG-요산분해효소가 심한 요산-유도 신장병증을 보이는 요산분해효소-결핍 마우스 (uox -/-)를 치료하는 데 사용되면, 이는 잘 견뎌내고, 효과적이며 실질적으로 비-면역원성인 것으로 밝혀졌다. 현미경 자기공명 영상에 의해 입증된 바와 같이 치료한 마우스는 치료 기간 동안 (10주) 개선된 신장의 기능을 보이고 비치료 uox -/- 마우스보다 요산-관련 신장 손상을 실질적으로 덜 보였다 (상기 문헌 [Kelly, S. J., et al. (2001)].
PAG 스트랜드의 폴리펩티드 분자에의 공유 부착은 미국 특허 제4,179,337호 (Davis, F. F., et al.) 및 문헌 [Abuchowski, A., et al. (1981) in: Enzymes as Drugs, Holcenberg, J. S., et al., eds., John Wiley and Sons, New York, pp. 367-383]에 기술되어 있다. 이들 참조문헌은 mPEG로 변형된 효소 및 다른 단백질이 상응하는 비변형 단백질과 비교하여, 감소한 면역원성 및 항원성을 가지고 혈류중에서 더욱 길어진 반감기를 가진다는 것을 기술하고 있다. 화학적으로 변형된 콘쥬게이트의 유리한 성질은 각종 치료에 매우 유용하다.
PEG 또는 폴리알킬렌 옥시드의 단백질에의 공유 부착을 시행하기 위해, 중합체의 히드록실 말단기 중 하나 이상은 우선 반응성 작용기로 전환되어야 한다. 이 방법은 흔히 "활성화"라고 지칭되고 생성물은 "활성화된 PEG" 또는 "활성화된 폴리알킬렌 옥시드"라고 불린다. 일 말단에서는 비반응성이고 화학적으로 안정한 메틸 에테르 ("메톡실기")로 또다른 말단에서는 단백질 분자 상의 아미노기에 대해 반응성인 작용기로 캡핑된 모노메톡시PEG가 이러한 접근법을 위해 가장 통상적으로 사용된다. 활성화된 일 작용기로부터 원위에 있는 둘 이상의 메톡실기를 함유하는 이른바 "분지형" mPEG는 통상적으로 덜 사용된다. 그 예로는 리신의 카르복실기가 N-히드록시숙신이미드로의 에스테르화에 의해 가장 종종 활성화되는 디-mPEG-리신이 있다 (Harris, J. M., et al., 미국 특허 제5,932,462호).
활성화된 중합체는 부착 부위로 소요되는 친핵성 작용기를 가지는 치료제와 반응한다. 부착 부위로 통상 사용되는 일 친핵성 작용기는 리신 잔기의 입실론 아미노기이다. 유리 카르복실산 기, 적합하게는 활성화된 카르보닐기, 산화된 탄수화물 잔기 및 티올기 또한 부착 부위로 사용된다.
mPEG의 히드록실기는 염화시아누르로 활성화되고 생성된 화합물은 이어서 단백질과 커플링된다 (상기 문헌 [Abuchowski, A., et al. (1977) J Biol Chem 252:3582-3586; Abuchowski, A., et al. (1981)]). 그러나, 이 방법의 사용은 단점, 예컨대 염화시아누르의 독성 및 아민 외의 작용기를 가지는 단백질, 예컨대 용매-접근성이 있는 시스테인 또는 기능을 위해 필수적일 수 있는 티로신 잔기에 대해 비-특이적 반응성을 가진다.
이러한 단점 및 기타 단점을 극복하기 위해, 대안의 활성화된 PEG, 예컨대 mPEG의 숙신이미딜 숙신에이트 유도체 ("SS-PEG")가 소개되었다 (문헌 [Abuchowski, A., et al. (1984) Cancer Biochem Biophys 7:175-186]). 온후한 조건하에서, SS-PEG는 단백질과 신속히 (30 분내) 반응하여, 활성이지만 매우 변형된 콘쥬게이트를 생성한다.
미국 특허 제5,468,478호에서 세이퍼 (M. Saifer) 등은 폴리알킬렌 글리콜-모노-N-숙신이미딜 카르보네이트 및 이로부터 제조되는 콘쥬게이트를 기술하고 있다. 미국 특허 제5,612,460호에서 잘리프스키 (S. Zalipsky)는 폴리(에틸렌 글리콜)-N-숙신이미딜 카르보네이트의 제조방법을 기술하고 있다. 이 형태의 중합체 ("SC-PEG")는 단백질의 아미노기와, 또한 저분자량의 펩티드 및 유리 아미노기를 함유하는 기타 물질과 쉽게 반응하여 우레탄 결합을 형성한다.
단백질의 아미노기와 PEG 간의 우레탄 (또는 카르바메이트) 결합 또한 기타 PEG-카르보네이트 유도체로부터 제조되는 것으로 당분야에 공지되어 있다 (문헌 [Beauchamp, C., et al. (1983) Anal Biochem 131:25-33; Veronese, F. M., et al. (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152]). 그 중에서도 특히 아미드 결합, 에스테르 결합, 2차 아민 및 티오에스테르 결합을 통해 연결된 생체활성 성분의 PEG 콘쥬게이트의 합성을 위한 반응성 mPEG 중간체 및 이의 사용방법 또한 당분야에 공지되어 있다.
스즈끼 (T. Suzuki) 등 (문헌 [(1984) Biochim Biophys Acta 788:248-255])은 염화시아누르에 의해 활성화된 mPEG에 면역글로불린 G ("IgG")를 공유 커플링시켰다. 이들은 PEG-IgG 콘쥬케이트에 의한 비특이적 활성화 완료를 유도하는 생물학적 및 물리화학적 성질, 예컨대 항원-결합 작용 및 분자 구조, 크기별-배제 크로마토그래피 거동, 표면 활성, 계면 응집능 및 열 응집능을 연구하였다. PEG의 IgG에의 커플링은 IgG의 겉보기 스토크스 반경 및 표면 활성을 증가시키고 가열 및/또는 계면에의 노출에 대해 IgG를 안정화시키는 반면, IgG의 구조 변성은 관찰되지 않았다. 비특이적 응집능의 억제는 주로 PEG화된 IgG 분자간 회합의 입체 장해에 기인한다. 이러한 결과는 정맥내 제조물로서 mPEG-커플링된 IgG의 이용을 나타내고 또한 정맥내 사용을 위한 비변형 IgG를 안정화시키기 위한 첨가제로서 PEG의 용도를 제안한다.
샤프 (K. A. Sharp) 등 (문헌 [(1986) Anal Biochem 154:110-117])은 세포 표면 항원을 기초로 하여 수성 2-상 중합체 시스템에서 세포를 분리하기 위한 생체특이적 친화성 리간드의 제조 가능성을 조사하였다. 토끼 항-인간 적혈구 IgG를 PEG 대 단백질 상의 리신기의 다양한 몰비로 대략 0.2, 1.9 및 5 kDa의 분자량을 지니는 염화시아누르-활성화된 mPEG와 반응시켰다. 덱스트란 및 PEG를 함유하는 2-상 시스템에서 단백질의 분배 계수는 mPEG의 변형 정도 및 분자량의 증가에 따라 증가하였다. 동시에 인간 적혈구 접합능의 손실이 있었다.
미국 특허 제4,904,582호에서 튤리스 (R. H. Tullis)는 올리고뉴클레오티드가 폴리옥시알킬렌기일 수 있는 소수성 잔기에 연결 암 (arm)을 통해 접합되는 올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트를 기술하고 있다. 생성되는 콘쥬게이트는 막 수송에 더욱 효율적이어서, 막을 교차할 수 있고 전사 시스템을 효과적으로 조정할 수 있다고 한다. 이러한 방식으로, 조성물은 세포성 진행을 연구하고 병원체로부터 포유류 숙주를 보호하며 유전자 요법을 용이하게 하는 것 등을 위해 시험관내 및 생체내 사용될 수 있다.
그러나, 중합체의 과도한 콘쥬게이션 및/또는 생체활성과 관련있는 기가 발견되는 치료용 잔기의 활성 부위를 수반하는 콘쥬게이션은 종종 활성의 손실을 초래하여, 치료 효능의 손실을 초래한다. 이는 종종 생체활성과 무관한 부착 부위를 거의 지니지 않는 저분자량의 펩티드 경우이다. 예를 들면, 벤하르 (I. Benhar) 등 (문헌 [(1994) Bioconjug Chem 5:321-326])은 재조합 단일쇄 면역독소의 PEG화가 면역독소의 특이적 표적 면역반응성의 손실을 초래함을 관찰하였다. 면역독소 활성의 손실은 면역독소의 항원-결합 부위내 2 리신 잔기에 PEG의 부착 결과이다.
PAG 및 PAO (예를 들면, PEG, PEO 등)의 치료용 단백질에의 공유 부착이 그들의 면역반응성을 제거하기 위한 것이지만, PEG화된 단백질은 약하게 면역원성을 보유하고 있다. 이 면역원성은, 적어도 부분적으로는, PEG 및 PAO 중합체 자체가 다소 항원성이고 면역원성이라는 사실 때문인 것 같다. 예를 들면, PEG가 면역원성 담체 단백질에 커플링된 콘쥬게이트를 동물에 주사함으로써 토끼를 각종 PEG에 대해 면역화시켰다 (문헌 [Richter, A. W., et al. (1983) Int Arch Allergy Appl Immunol 70:124-131]). 또한, PEG의 폴리에테르 주쇄와 반응하는 단일클론 항체가, 마우스에 β-글루쿠론산분해효소의 mPEG 콘쥬게이트를 주사하고 항-PEG 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 선별함으로써 발생되었다 (문헌 [Cheng, T. -L., et al. (1999) Bioconjug Chem 10:520-528; Cheng, T. -L., et al. (2000) Bioconjug Chem 11:258-266; Tsai, N. -M., et al. (2001) Biotechniques 30:396-402; Roffler, S., et al.], 미국 특허 제6,596,849호 및 제6,617,118호; 그의 모든 명세는 참고로 본원에 포함된다). PEG의 폴리에테르 주쇄와 반응하는 또다른 단일클론 항체는 로버츠 (Roberts, M. J.) 등의 미국 특허 출원 제2003/001704 A1호에 최근에 기술되었다.
수많은 연구자가 선형 또는 분지형 "비-항원성" PEG 중합체 및 이의 유도체 또는 콘쥬게이트의 제조를 기술하였다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 제5,428,128호; 제5,621,039호; 제5,622,986호; 제5,643,575호; 제5,728,560호; 제5,730,990호; 제5,738,846호; 제5,811,076호; 제5,824,701호; 제5,840,900호; 제5,880,131호; 제5,900,402호; 제5,902,588호; 제5,919,455호; 제5,951,974호; 제5,965,119호; 제5,965,566호; 제5,969,040호; 제5,981,709호; 제6,011,042호; 제6,042,822호; 제6,113,906호; 제6,127,355호; 제6,132,713호; 제6,177,087호; 및 제6,180,095호; 또한 PCT 공보 WO 95/13090 및 공개된 미국 특허 출원 제2002/0052443호, 제2002/0061307호 및 제2002/0098192호). 선행 특허 및 특허 출원에서 대부분의 예는 하나 이상 스트랜드의 mPEG를 함유하는 중합체, 예를 들면 디-mPEG-리신을 이용하였다. 그러나, 지금까지 이러한 중합체 또는 콘쥬게이트에서 PEG를 비-항원성이도록 하는 기작을 기술한 문헌은 없었다.
따라서, 감소하였거나, 실질적으로 감소하였거나, 검출 불가능한 항원성을 지니는 PAO-함유 (예를 들면, PEG- 및/또는 PEO-함유) 콘쥬게이트, 특히 이러한 수용성 중합체와 치료용 단백질 간의 콘쥬게이트의 제조방법을 규명할 필요가 있다. 이러한 콘쥬게이트는 생체내에서 증가한 안정성 및 생체이용률의 중합체 성분에 의해 제공되는 이점은 가질 것이지만, 콘쥬게이트가 치료용 또는 진단용으로 도입된 동물에서 실질적인 면역반응을 도출하지는 않을 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 전술한 필요성을 해결하고, 수용성 중합체 (예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이의 유도체)와 생체활성 성분, 특히 치료용 생체활성 성분, 예컨대 단백질의 콘쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조된 중합체 및 콘쥬게이트를 제공하는데, 이 중합체 및 콘쥬게이트는 알콕실-함유 중합체 및 알콕시PEG, 예를 들면 mPEG로 제조된 동일한 생체활성 성분의 콘쥬게이트와 비교하여 감소한 항원성 및 면역원성을 가진다. 본 발명은 또한 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 조성물, 이러한 콘쥬게이트와 조성물을 함유하는 키트 및 다양한 치료용 및 진단용 양생법에서 콘쥬게이트와 조성물의 사용방법을 제공한다.
일면에서, 본 발명은 하나 이상의 선형 또는 분지형 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜과 공유 결합된 하나 이상의 생체활성 성분을 포함하는 콘쥬게이트를 제공하는데, 여기에서 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜은 어떤 말단에도 메톡실기, 또다른 알콕실기 또는 아릴옥실기를 포함하지 않는다. 이러한 특정 실시양태에서, 콘쥬게이트는 알콕시폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들면 mPEG 또는 mPEG를 함유하는 분지형 중합체, 예컨대 디-mPEG-리신을 사용하여 제조된 콘쥬게이트와 비교하여 감소하였거나 실질적으로 감소한 항원성을 가진다.
본 발명의 콘쥬게이트의 합성에 사용하기에 특히 적합한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체를 포함하지만, 이로 한정되지는 않으며; PEG가 특히 바람직하고, 단일관능성 활성화된 PEG (예를 들면, 히드록시PEG-모노알데히드, 히드록시PEG-모노비닐술폰, 히드록시PEG-모노카르복실산의 반응성 에스테르 및 히드록시PEG-모노페닐 카르보네이트 유도체를 포함하는, 단일 말단에서 활성화된 PEG)가 보다 특히 바람직하다. 반응성 중합체 유도체의 합성에 유용할 수 있는 다른 중간체는 다른 히드록시PEG-일산 및 히드록시PEG-모노아세탈을 포함한다.
이러한 특정 실시양태에서, 폴리알킬렌 글리콜은 약 1,000 달톤 내지 약 100 kDa, 바람직하게는 약 2 kDa 내지 약 60 kDa; 약 2 kDa 내지 약 30 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa; 약 10 kDa 내지 약 30 kDa; 약 10 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가지고; 두 분지 각각이 약 2 kDa 내지 약 30 kDa, 더욱 바람직하게는 18 kDa 내지 약 22 kDa의 분자량을 가진다. 본 발명의 이 일면에 따른 콘쥬게이트는 고분자량의 효소 단백질 서브유닛 마다 하나 이상의 스트랜드, 특정 실시양태에서 바람직하게는 약 1 내지 약 10 스트랜드, 약 1 내지 약 5 스트랜드, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 3 스트랜드, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 2 스트랜드; 다른 실시양태에서 바람직하게는 약 5 내지 약 100 스트랜드, 약 10 내지 약 50 스트랜드, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 20 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 이러한 특히 바람직한 실시양태에서, 콘쥬게이트에 사용되는 폴리알킬렌 글리콜은 약 18 kDa 내지 약 22 kDa 또는 약 27 kDa 내지 약 33 kDa의 분자량을 가지는, 1 또는 2 스트랜드의 단일관능성 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜) (예를 들면, 히드록시PEG-일산의 반응성 에스테르, 히드록시PEG-모노알데히드, 히드록시PEG-모노비닐술폰 또는 히드록시PEG-모노페닐 카르보네이트 유도체)을 포함한다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물에 사용하기에 적합한 생체활성 성분은 각종 펩티드, 단백질, 당단백질, 유기 화합물, 아민-함유 화합물, 카르복실-함유 화합물, 히드록실-함유 화합물 및 티올-함유 화합물을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 예를 들면, (a) 후속 제거될 수 있는 하나 이상의 비반응성 차단기, 예컨대 하나 이상의 트리페닐메틸기 ("트리틸기")를 포함하는 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜을 입수하거나 제조하고; (b) 폴리알킬렌 글리콜이 일 유도체화기 (예컨대, 일 카르복실기)로 차단기(들)이 결여된 말단에서 유도체화되도록 하는 조건하에서 이를 하나 이상의 유도체화 화합물과 반응시킴으로써 폴리알킬렌 글리콜의 유도체를 제조하며; (c) 유도체화기를 제거하지 않고 차단기(들)을 제거하여 하나 이상의 단계로 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜을 제조한 다음; (d) 생체활성 성분의 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜에의 공유 결합을 촉진하는 조건하에서 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜을 하나 이상의 생체활성 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체활성 화합물과 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜 간의 콘쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 방법에 의해 제조된 콘쥬게이트는, 유사한 크기와 구조를 가지고 생체활성 제제에 결합된 mPEG로 동일한 정도까지 유도체화된 콘쥬게이트와 비교하여, 감소하였거나, 실질적으로 감소하였거나 검출 불가능한 항원성 및 면역원성을 지닌다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조된 콘쥬게이트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 콘쥬게이트 및 제약용 또는 수의학용으로 허용가능한 하나 이상의 부형제 또는 담체를 포함하는 제약용 또는 수의학용 조성물을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물을 사용하여 동물 (예컨대, 인간을 비롯한 포유류)에게서 신체 장애를 예방하고, 진단하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 일 방법은 예를 들면, 신체 장애 (예컨대, 빈혈, 관절염, 암, 알츠하이머병, 효소 결핍, 심장혈관병, 고혈압, 감염병, 대사 장애, 신경계 질환, 호중성 백혈구 감소증, 고요산혈증 및 이의 징후 (예를 들면, 통풍), 유전자 결손 질환 또는 장애 등)를 앓거나 이러한 장애 소인을 갖는 동물에게 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트 또는 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 동물, 특히 포유류에, 가장 특히 인간에게, 경구로, 국소 또는 비경구로, 예를 들면 정맥내, 근육내 또는 피하로 투여할 수 있다.
부가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 감소한 항원성을 지니는 하나 이상의 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이는 하나 이상의 부가 성분 또는 시약, 예컨대 하나 이상의 완충염, 하나 이상의 탄수화물 부형제, 하나 이상의 담체 단백질, 하나 이상의 효소, 하나 이상의 세정제, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 중합체, 예컨대 PEG 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 감소한 항원성을 지니는 콘쥬게이트 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
부가의 실시양태에서, 본 발명은 단일관능성 활성화된 mPEG보다는, 메톡실 또는 기타 알콕실기가 결여된 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜을 사용하여 제조한 감소한 면역반응성의 PEG-리포솜을 제공한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 본 발명의 하기 도면 및 상세한 설명과 청구범위에 의해 당업자에게 자명할 것이다.
도 1은 경쟁적 효소면역측정법 ("ELISA") 분석으로부터의 결과를 도시한다. 이 분석에서, 한 단백질의 mPEG 콘쥬게이트를 96-웰 분석 플레이트에 결합시켰고, mPEG 또는 t-부톡시PEG의 용액에 의한 토끼 항체의 또다른 단백질의 mPEG 콘쥬게이트에의 결합 저해가 측정되었다.
도 2a는 하나 또는 두 개의 메톡실기를 함유하는 다양한 크기 및 구조의 PEG를 사용하여, 도 1에서 설명한 바와 같이 수행한 경쟁적 ELISA로부터의 결과를 도시한다. 항체 결합에 대한 결과는 각 표본 중 메톡실기 몰 농도의 함수로 도표되었다.
도 2b는 메톡실기의 몰 농도 대신 PEG 중량 농도 (마이크로그램/mL)의 함수로 도표된, 도 2a와 동일한 데이타를 도시한다.
도 3은 PEG 분자당 메톡실기 수에의 직접적인 항원성 의존도를 보여주는 포맷으로 도 1, 2a 및 2b로부터의 데이타 일부를 도시한다. 이들 표본은 10-kDa PEG를 포함하고, 이들 중 하나는 메톡실기가 없고 (t-부톡시PEG), 하나는 하나의 메톡실기를 함유하며 (mPEG) 하나는 두 개의 메톡실기를 함유한다 [디-(5-kDa)mPEG-리신].
도 4는 도 1에서 설명한 경쟁적 ELISA를 도해하는데, 여기에서 4.8-kDa mPEG를 선형 중합체의 말단에 메톡실기를 가지지 않는 본 발명의 세 개의 PEG ("파마PEG(PharmaPEG)"로 표지)와 비교하였다. 가로 축의 곡선 사이의 이동은 본 발명의 PEG 세 개 모두의 항원성이 항-mPEG 항체로 분석하였을 때, mPEG의 항원성보다 대략 100배 낮음을 나타낸다.
도 5a는 탄산탈수효소 ("CA II")의 이성질체 표본과 평균 3-4 스트랜드의 5-kDa mPEG에 커플링된 동일한 탄산탈수효소를 나트륨 도데실 술페이트의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ("SDS-PAGE")에 의해 분석한 연구 결과를 도시한다. 겔의 레인 1 및 2는 사이프로® (SYPRO®) 상표 루비 (Ruby) 착색제를 사용하여 단백질에 대해 염색함으로써 얻어지는 결과 및 302 nm 조도의 암실에서의 사진을 보여준다. 레인 3 및 4는 mPEG 콘쥬게이트와 비PEG화 효소 각각의 웨스턴 블롯 결과를 보여주는데, 여기에서 다중클론 토끼 항-mPEG 항체가 1차 항체로 사용되었다. 레인 5는 예비-염색된 단백질 표준의 위치를 보여준다.
도 5b는 코닥 (Kodak) 카메라와 디지털 영상 소프트웨어로 얻어진, 도 5에서 보여진 겔 및 웨스턴 블롯에서의 밴드 강도의 정량화를 보여준다. 가로 축은 염색면에 대한 이동 거리를 나타내고 세로 축은 단백질 염색 또는 항-mPEG 염색의 상대 강도를 나타낸다. 바닥 흔적은 겉보기 분자량이, 왼쪽부터 오른쪽으로 203.8, 110.9, 68.8, 51.5, 40.2, 28.9, 20.7 및 14.9 kDa인 예비-염색된 표준 단백질의 밴드를 보여준다. 바닥으로부터 두번째 흔적은 PEG화된 탄산탈수효소의 항-mPEG 항체 염색이다. 바닥으로부터 세번째 흔적은 탄산탈수효소의 단백질-염색된 밴드를 나타내고 최상단의 흔적은 탄산탈수효소의 mPEG 콘쥬게이트의 단백질-염색된 밴드를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 요산분해효소 서브유닛당 평균 약 두 스트랜드의 mPEG 또는 히드록시PEG ("파마PEG")를 함유하는 돼지 요산분해효소의 콘쥬게이트로 면역화된 3 마리의 토끼 군으로부터 혈청의 ELISA 분석 결과를 보여준다. 요산분해효소에 대한 항체는 돼지 요산분해효소로 코팅된 분석 플레이트를 사용하여 측정하였다. PEG에 대한 항체는 mPEG와 커플링된 무관한 단백질의 콘쥬게이트로 코팅된 플레이트를 사용하여 측정하였다. 도 6a는 불완전한 프로인트 (Freund's) 항원보강제 중의 PEG-요산분해효소를 4회 주사한 토끼의 두번째 채혈로부터의 데이타를 보여준다. 도 6b는 불완전한 프로인트 항원보강제 중의 PEG-요산분해효소를 5회 주사한 후에 동일한 토끼의 세번째 채혈로부터의 데이타를 보여준다.
달리 규명하지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상 이해되는 의미와 동일하다. 본원에 설명되어 있는 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실험 또는 검사에서 사용될 수 있고, 바람직한 방법 및 물질은 하기에 설명되어 있다.
정의
약 : 본원에서 수치를 언급할 때 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 값의 ±10 ％의 값을 의미한다 (예를 들면, "약 50 ℃"는 45 ℃ 이상 내지 55 ℃ 이하의 온도 범위를 포함하고; 마찬가지로, "약 100 mM"은 90 mM 이상 내지 110 mM 이하의 농도 범위를 포함한다).
생체활성 성분 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체활성 성분"은 세포, 조직, 장기 또는 유기체에서 생체내, 시험관내 또는 생체외 특정 생물학적 활성을 가지고, 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜에 결합하여 본 발명의 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 화합물, 분자, 잔기 또는 복합체를 지칭한다. 바람직한 생체활성 성분은 하기에 상세히 설명되어 있다.
결합된 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합된"은 공유, 예를 들면 화학적 커플링, 또는 비공유, 예를 들면 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 수소결합 등일 수 있는 결합 또는 부착을 지칭한다. 공유 결합은 예를 들면, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 티오에스테르, 티오에테르, 우레탄, 아미드, 펩티드, 이미드, 탄소-황 결합, 탄소-인 결합 등일 수 있다. 용어 "결합된"은 용어, 예컨대 "커플링된," "연결된" 및 "부착된"보다 넓은 범위이고 이들을 포함한다.
커플링된 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "커플링된"은 공유 결합 또는 강력한 비-공유 상호작용에 의한 부착, 통상적으로 및 바람직하게는 공유 결합에 의한 부착을 지칭한다. 생물학적으로 활성인 물질의 커플링을 위해 당업자에 의해 통상 사용되는 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
질환, 장애, 증상 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환" 또는 "장애"는 종양, 암, 알레르기, 마약중독, 자가면역, 중독 또는 최적의 정신 또는 신체 기능의 이상을 포함하는 인간 또는 동물의 임의의 악영향을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "증상"은 질환 및 장애를 포함하지만, 또한 생리적 상태도 지칭한다. 예를 들면, 생식력은 생리적 상태지만 질환 또는 장애는 아니다. 따라서 생식력을 감소시킴으로써 임신을 방지하기에 적합한 본 발명의 조성물은 장애 또는 질환의 치료가 아닌 증상 (생식력)의 치료로 설명될 것이다. 기타 증상은 당업자에 의해 이해된다.
유효량 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 실현하기 위해 필요하거나 충분한 특정 콘쥬게이트 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본 발명의 특정 콘쥬게이트 또는 조성물의 유효량은 이 선택된 결과를 달성하는 양일 것이고, 이러한 양은 당업자에 의해 관례대로 결정될 수 있다. 예를 들면, 면역계 이상을 치료하기 위한 유효량은 면역계의 활성화를 일으켜 항원에 노출시 항원-특이적 면역반응을 도출하는 데 필요한 양일 수 있다. 이 용어는 또한 "충분량"과 동의어이다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료할 질환 또는 증상, 투여할 특정 조성물, 대상체의 신체 사이즈 및/또는 질환 또는 증상의 심각성과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 특정 콘쥬게이트 또는 조성물의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있다.
면역반응 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역반응"은 체액성 면역반응 (즉, 항체의 형성) 및/또는 B- 및/또는 T-림프구 및/또는 항원-전달 세포의 활성화 또는 증식을 유도하는 세포성 면역반응을 지칭한다. 그러나, 일부 예에서 면역반응은 낮은 강도일 수 있고 본 발명에 따른 하나 이상의 물질을 사용할 때만 검출 가능하게 된다. "면역원성"은 살아있는 유기체의 면역계를 자극할 수 있어 면역계의 하나 이상의 기능을 증대시키거나 면역원성 제제에 대한 것이 되도록 하는 제제를 지칭한다.
하나 : 용어 "하나"가 본 명세서에 사용되면, 이들은 달리 언급하지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
폴리펩티드 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (또한 펩티드 결합으로 공지)에 의해 선형으로 결합된 단량체 (아미노산)로 이루어진 분자를 지칭한다. 이는 아미노산의 분자쇄를 나타내고 특정 길이의 생성물을 언급하지는 않는다. 따라서, 미특정 길이의 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변이, 예를 들면 당화, 아세틸화, 인산화 등의 생성물을 지칭하고자 한다. 폴리펩티드는 재조합체일 수 있거나 천연 생체 기원으로부터 유래될 수 있지만, 반드시 정해진 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학 합성을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
단백질 및 당단백질 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 일반적으로 약 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상 또는 2,000 이상의 아미노산 크기의 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질은 반드시 그럴 필요는 없지만, 일반적으로 정해진 3차원 구조를 가지고, 종종 정해진 3차원 구조를 지니지 않는 펩티드 및 폴리펩티드와는 대조적으로 폴딩 (folded)되었다고 지칭되지만, 오히려 다수의 상이한 구조를 채택할 수 있고, 비폴딩 (unfolded)이라고 지칭된다. 그러나, 펩티드 또한 정해진 3차원 구조를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "당단백질"은 아미노산, 예를 들면 세린 또는 아스파라긴의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 하나 이상의 당 잔기를 함유하는 단백질을 지칭한다.
정제된 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"이 분자에 관해 사용되면, 이의 천연 환경 또는 이것이 제조되었거나, 발견되었거나 합성된 환경에서 이와 회합한 분자에 비해 정제될 분자의 농도가 증가하였음을 의미한다. 천연의 회합한 분자는 단백질, 핵산, 지질 및 당을 포함하지만, 일반적으로 정제될 분자의 완전성을 유지하거나 정제를 촉진하기 위해 첨가된 물, 완충액 및 시약은 포함하지 않는다. 예를 들면, 조추출액 중의 특정 단백질이 컬럼 크로마토그래피 중에 수성 용매로 희석될때도, 단백질 분자는 천연의 회합한 핵산, 목적하지 않는 단백질 및 기타 생체 분자가 특정 단백질 분자로부터 분리된다면 이 크로마토그래피에 정제된 것으로 간주한다. 이 정의에 따라, 물질은 이의 오염물질에 대해 고려할 때 5 ％이상, 10 ％이상, 20 ％이상, 30 ％이상, 40 ％이상, 50 ％이상, 60 ％이상, 70 ％이상, 80 ％이상, 90 ％이상, 95 ％이상, 98 ％이상, 99 ％이상 또는 100 ％ 순수할 수 있다.
잔기 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "잔기"는 통상적으로 폴리펩티드 주쇄 또는 측쇄에서 하나 이상의 펩티드 결합에 관여한 결과 탈수된 특정 아미노산을 지칭한다.
치료 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료," "치료하다," "치료된," 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 치료 요법을 지칭한다. 예를 들어, 감염병 측면에서 사용하면, 용어는 병원체로의 감염에 대한 대상체의 내성을 증가시키거나, 달리 설명하면 대상체가 병원체로 감염되거나 감염에 기인한 병의 징후를 보일 가능성을 감소시키는 예방 요법을 지칭할 수 있고, 또한 대상체가 감염된 후에 감염에 대항하기 위한, 예를 들면 감염을 감소시키거나 제거하기 위한 또는 더욱 악화되는 것을 방지하기 위한 치료 요법을 지칭할 수 있다.
개요
다수의 선행 발명자들이 선형 또는 분지형 비-항원성 PEG 중합체 또는 이의 콘쥬게이트의 제조를 기술하였다 (참조, 예를 들면 미국 특허 제5,428,128호; 제5,621,039호; 제5,622,986호; 제5,643,575호; 제5,728,560호; 제5,730,990호; 제5,738,846호; 제5,811,076호; 제5,824,701호; 제5,840,900호; 제5,880,131호; 제5,900,402호; 제5,902,588호; 제5,919,455호; 제5,951,974호; 제5,965,119호; 제5,965,566호; 제5,969,040호; 제5,981,709호; 제6,011,042호; 제6,042,822호; 제6,113,906호; 제6,127,355호; 제6,132,713호; 제6,177,087호 및 제6,180,095호; 또한 PCT 공보 WO 95/13090 및 공개된 미국 특허 출원 제2002/0052443호, 제2002/0061307호 및 제2002/0098192호; 그의 모든 명세는 참고로 본원에 포함된다). 그러나, 이들 선행 기술에서 PEG 및 콘쥬게이트는 콘쥬게이트가 예방, 진단 또는 치료용으로 동물에 도입되었을 때 콘쥬게이트의 PEG 성분에 대한 항체 발달이라는 목적하지 않는 결과를 유도할 수 있는, 적어도 약한 면역원성을 보인다. 이러한 항체는 PEG-함유 생체활성 콘쥬게이트의 신속한 제거를 유도함으로써, 치료용 조성물의 생체이용률을 감소시키고 (상기 문헌 [Cheng, T. -L., et al. (1999)], 또한 면역-복합 매개되는 장애를 유도할 가능성도 있다. 게다가, 청구된 PEG 또는 이의 콘쥬게이트를 실질적으로 비-항원성 또는 비-면역원성이도록 하기 위한 기작의 특허기술은 지금까지 없었다.
본 발명은 당분야에서 이러한 한계점을 극복하였다. 일반적으로, 본 발명은 각종 신체 장애의 예방, 진단 및 치료에 유용한 안정한 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 감소한 항원성의 반응성 중합체 및 단백질, 특히 감소하였거나 실질적으로 감소한 항원성 또는 검출 불가능한 항원성을 가지는 치료용 단백질의 안정화된 중합체 콘쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 이러한 방법에 의해 제조되는 콘쥬게이트를 제공하고, 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물을 제공한다. 부가의 실시양태에서, 본 발명은 각종 신체 장애를 예방하고, 진단하며 치료하는 데 이러한 콘쥬게이트 및 조성물의 사용방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
감소한 항원성의 콘쥬게이트 제조
일면에서, 본 발명은 수용성 중합체의 하나 이상의 생체활성 화합물 또는 성분, 예컨대 하나 이상의 단백질 및 특히 하나 이상의 치료용 단백질에의 공유 부착에 의한, 감소한 항원성, 실질적으로 감소한 항원성 또는 검출 불가능한 항원성의 콘쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 이러한 콘쥬게이트에서, 선택된 중합체 자체는 단백질-중합체 콘쥬게이트를 제조하기 위해 통상 사용되는 표준 중합체와 비교하여, 감소한 항원성, 실질적으로 감소한 항원성 또는 검출 불가능한 항원성을 보일 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "감소한 항원성"은 중합체 (예를 들면, PAO 또는 PAG, 특히 PEG, 보다 특히 단일관능성 활성화된 PEG), 또는 이러한 중합체를 포함하거나 이러한 중합체를 사용하여 합성된 콘쥬게이트 또는 조성물을 지칭하는데, 여기에서 중합체의 더욱 항원성인 중합체 (예를 들면, mPEG)에 대해 형성된 항체와의 반응능은 임의의 양으로 감소하였다. 바람직하게는, 항원성은 더욱 항원성인 중합체와 비교하여 적어도 약 30 ％, 보다 바람직하게는 적어도 약 50 ％, 가장 바람직하게는 약 75 ％ 이상 감소하였다. 이어서, 연장에 의해 중합체 (또는 콘쥬게이트 또는 조성물)가 상응하는 항원성 중합체 (예를 들면, mPEG)의 항원성의 약 20 ％미만, 보다 바람직하게는 약 15 ％미만, 보다 더 바람직하게는 약 10 ％미만, 가장 바람직하게는 약 1 ％미만이면, 중합체 (또는 이러한 중합체를 포함하거나 이를 사용하여 합성된 콘쥬게이트 또는 조성물)는 "실질적으로 감소한 항원성"을 보이는 것으로 간주된다. 최종적으로, 중합체, 콘쥬게이트 또는 조성물이 공지된 방법 (예를 들면, ELISA 또는 항원성을 검출하기 위한 다른 방법, 예컨대 당분야에 공지되어 있고 본원 실시예에 설명된 방법)으로 분석하였을 때 검출 불가능한 항원성을 가지면, 중합체 (또는 이러한 중합체를 포함하거나 이를 사용하여 합성된 콘쥬게이트 또는 조성물)가 "검출 불가능한 항원성"을 가지는 것으로 간주된다.
중합체
본 발명의 콘쥬게이트의 제조에 사용하기에 특히 적합한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리(에틸렌)글리콜 및 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않고; PEG가 특히 바람직하며, 단일관능성 활성화된 히드록시PEG (예를 들면, 히드록시PEG-모노카르복실산의 반응성 에스테르, 히드록시PEG-모노알데히드, 히드록시PEG-모노아민, 히드록시PEG-모노히드라지드, 히드록시PEG-모노카르바제이트, 히드록시PEG-모노아이오도아세트아미드, 히드록시PEG-모노말레이미드, 히드록시PEG-모노오르토피리딜 디술피드, 히드록시PEG-모노옥심, 히드록시PEG-모노페닐 카르보네이트, 히드록시PEG-모노페닐 글리옥살, 히드록시PEG-모노티아졸리딘-2-티온, 히드록시PEG-모노티오에스테르, 히드록시PEG-모노티올, 히드록시PEG-모노트리아진 및 히드록시PEG-모노비닐술폰을 포함하는, 단일 말단에서 활성화된 히드록시PEG)가 보다 특히 바람직하다.
감소한 항원성, 실질적으로 감소한 항원성 또는 검출 불가능한 항원성을 가지는 본 발명 콘쥬게이트의 제조에 사용하기에 특히 바람직한 중합체는 메톡실기, 기타 알콕실기 또는 아릴옥실기를 함유하지 않는 단일관능성 활성화된 PEG이다. 본 발명 콘쥬게이트의 합성에서 단일관능성 활성화된 mPEG 대신 이러한 단일관능성 활성화된 PEG로의 치환은 생성되는 콘쥬게이트에 예상밖으로 감소한 항원성, 즉 동일한 생체활성 성분의 mPEG 콘쥬게이트에 대해 발달된 항체와의 상호작용 능력 감소를 부여한다. 생성되는 콘쥬게이트는 또한 감소한 면역원성, 즉 감소한 면역반응 도출능을 가진다.
본 발명의 일면에서, 단일관능성 활성화된 PEG는 에틸렌 옥시드의 중합을 위한 개시제로서 활성기의 적합한 역 차단된 유도체를 사용함으로써 합성될 수 있다 (문헌 [Akiyama, Y., et al. (2000) Bioconjug Chem, 11:947-950]). 아끼야마 (Akiyama) 등은 에틸렌 옥시드의 중합을 위한 개시제로서 칼륨 3,3-디에톡시프로판올리에이트를 사용함으로써 PEG의 모노히드록실, 모노아세탈 유도체의 합성을 위한 조건을 제공한다. 아끼야마 등은 이 중간체의 가장 바람직하게 감소한 항원성 또는 면역원성을 인지하지 않았기 때문에, 그들은 메탄술포닐 클로라이드의 첨가에 의해 중합을 종결시킴으로써 말단 히드록실기를 티올로 전환시켰고, 그리하여 본 발명의 PEG 유도체 대신 헤테로 이관능성 PEG를 제조하였다. 이 연구 그룹이 히드록실 종결된 단일관능성 활성화된 PEG의 용도를 인지하지 않았다는 추가의 증거로서, 그들은 모노히드록실, 단일관능성 활성화된 PEG로부터의 대체 헤테로 이관능성 PEG의 합성방법을 공개 및 특허 출원하였고 일부 경우에는 심지어 히드록시PEG를 메톡실기로 "말단-캡핑"하였다. 마찬가지로, 공개된 미국 특허 출원 제2002/0072573 A1호에서 벤틀리 (Bentley, M. D.) 등은 히드록실-종결된 단일관능성 활성화된 중합체의 면역학적 장점을 인지하지 못하였음을 반영하는 중합체 조성물 및 방법을 기술하였고 이러한 중합체의 말단 히드록실기의 메톡실기로의 전환의 바람직함을 교시하였다.
본 발명의 또다른 일면에서, 실시예 5에 나타나 있는 방법과는 달리, 양 말단에 히드록실기를 함유하는 선형 PEG ("PEG 디올")의 활성화 정도를 조절하여 이중-활성화된 PEG의 양을 허용가능한 낮은 수준으로, 예를 들어 5 ％ 미만, 바람직하게는 2 ％ 미만, 보다 바람직하게는 1 ％ 미만으로 제한함으로써 단일관능성 활성화 PEG를 합성할 수 있다. 특히 바람직한 일면에서, 단일관능성 활성화 PEG는 단일관능성 PEG로부터 합성할 수 있는데, 이로부터 유도체화기를 제거하지 않고 PEG의 유도체화 후에 비반응성 차단기를 제거할 수 있다. 유도체화 PEG의 일례로는 PEG-카르복실산이 있으며, 유도체화 후에 제거될 수 있는 비반응성 차단기의 예로는 아릴옥실기 (Bentley, M. D., et al., PCT 공보 WO 01/26692 A1), 트리틸기 (문헌 [Kocienski, P. J., (1994) Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp. 54-58]) 및 t-부톡실기가 있다. t-부톡시PEG-카르복실산은, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드로 활성화시킬 수 있다. 최종적으로, t-부톡실기를 무수 산첨가분해에 의해 제거하여, 중합체의 원위 말단에 메톡실기 대신에 히드록실기를 가지는 활성화 PEG 카르복실산 유도체를 제조할 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서는, t-부톡시PEG-카르복실산은 산첨가분해 후 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드로 활성화시킴으로써 히드록시PEG-카르복실산으로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서는, t-부톡시PEG를 할로아세탈과 접촉시키고, 생성물을 선택적 무수 산첨가분해에 의해 t-부톡실기를 제거하여 히드록시PEG-아세탈 또는 히드록시PEG-알데히드로 전환시킴으로써 t-부톡시PEG-아세탈을 합성한다. 아세탈은 환원성 알킬화에 의한 아민-함유 화합물로의 그의 커플링 제조시 알데히드 (또는 알데히드 수화물)로 전환시킬 수 있다 (Bentley, M. D., et al., 미국 특허 제5,990,237호). 또다른 실시양태에서는, 중합체의 반응성 말단으로부터 원위에 있는 아릴옥실 보호기를 촉매적 수소첨가분해에 의해 제거함으로써, 본 발명의 단일활성화 히드록시PAG를 제조할 수 있다. 이와 달리, 실시예 6에 설명되어 있는 바와 같이, 하나의 말단 히드록실기를 제외한 전체의 가역적 차단을 단일관능성 활성화 히드록시PAG의 합성에 이용할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트 제조에 사용되는 PAG 중합체는 선형 중합체일 수 있거나, 중합체 분자내의 하나 이상의 지점에서 분지화될 수 있다. 또한, 본 발명의 콘쥬게이트 형성에 사용되는 중합체는 단일 단량체 유형의 다수 단위가 함께 결합되어 중합체를 형성하는 단독중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있거나, 헤테로중합체 또는 공중합체 (둘 이상의 구조를 갖는 단량체 단위가 함께 결합되어 중합체를 형성한 것으로, 예를 들어 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체가 있음)일 수 있다. 이러한 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 교호 공중합체일 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 중합체는 비반응성 중합체 또는 반응성 중합체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "비반응성 중합체"는 단백질에 공유 부착되지 않을 중합체를 의미한다. 이러한 "비반응성 중합체"의 예로는, 일 말단에 히드록실기를 지니고 다른 말단에 메톡실기를 지니는 에틸렌 옥시드 단위로 이루어진 선형 중합체인 mPEG, 및 양 말단에 히드록실기를 지니는 에틸렌 옥시드 단위로 이루어진 선형 중합체인 PEG 디올이 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, "반응성 중합체"는 생체활성 성분 (예컨대, 단백질) 상의 용매-접근성이 있는 친핵성기, 예를 들어 티올기 또는 아미노기, 예를 들면 리신 잔기의 알파 아미노기 또는 입실론 아미노기 (이들로 한정되지는 않음)와 반응할 수 있는 중합체를 의미한다. "반응성 중합체"의 예로는, 히드록실 말단기가 친전자성기, 예컨대 ("SPA-PEG"에서와 같이) 숙신이미딜 프로피온산 또는 ("NPC-PEG"에서와 같이) p-니트로페닐 카르보네이트 또는 PEG-알데히드에서와 같이 알데히드로 전환되거나 치환된 PEG가 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 폴리알킬렌 옥시드 외에, 적합한 중합체로는 폴리비닐 알코올, 폴리(옥시에틸렌-옥시메틸렌) 공중합체, 폴리아미드 (예를 들면, Rose, K., PCT 공보 WO 00/12587), 폴리카르복실레이트, 폴리(비닐피롤리돈) (문헌 [von Specht, B.-U., et al. (1973) Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 354: 1659-1660]), 폴리 D-아미노산 및/또는 폴리 L-아미노산, 폴리아크릴로일-모르폴린 (문헌 [Rocca, M., et al. (1996) Int J Artif Organs 19: 730-734]) 및 덱스트란 (문헌 [Iakunitskaya, L. M., et al. (1980) Prikl Biokhim Mikrobiol 16: 232-237])이 포함될 수 있다. 표적 생체활성 성분 상의 다양한 부위와 어느 정도 선택적으로 반응하는 PEG, PEO 및 기타 PAO의 유도체는 당분야에 공지되어 있으며, 플루카 (Fluka) (미국 위스콘신주 밀와우키 소재); NOF 코포레이션 (NOF Corporation) (일본 도꾜 소재); 쉬어워터 코포레이션 (Shearwater Corporation) (미국 알라바마주 헌츠빌 소재); 넥타 테라퓨틱스 (Nektar Therapeutics)의 자회사 (미국 캘리포니아주 산 카를로스 소재); 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 선바이오 인크 (SunBio, Inc.) (한국 안양시 소재)와 같은 공급원으로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 활성화 형태의 중합체로는, 당분야에 공지되어 있는 임의의 히드록실 종결된 단일관능성 활성 형태의 중합체가 포함될 수 있다. 예를 들면, (활성화기의 질량을 제외한) 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 범위인 것들을 비롯한 다양한 크기의 선형 또는 분지형 PAO가 적합하다. 분자량의 적합한 범위로는, 약 2 kDa 내지 약 60 kDa; 약 2 kDa 내지 약 30 kDa; 약 5 kDa 내지 약 20 kDa; 약 10 kDa 내지 약 20 kDa; 및 약 18 kDa 내지 약 60 kDa, 약 20 kDa 내지 약 30 kDa의 범위가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 선형 PEG의 경우, 약 20 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량 범위는 에틸렌 옥시드 약 450 내지 약 680 단량체 단위의 범위의 중합도 (n)에 상응한다. 치료 단백질을 상기와 같은 비교적 높은 범위의 분자량 (즉, 20 kDa 내지 약 30 kDa 초과)을 가지는 중합체와 커플링하는 것의 이점은 mPEG의 면역원성이 인식되기 오래 전에 최초로 확인되었음을 주목하여야 한다 (Saifer, M., et al., PCT 공보 WO 88/01033, 1989년 2월 9일자로 공개, 그의 명세 전체가 참고로 본원에 포함된다).
임의로, 선형 중합체는 일 말단 또는 양 말단에 반응성 기를 가짐으로써 "반응성 중합체"를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서는, 그의 명세 전체가 본원에 참고로 인용되는 해리스 (Harris, J. M.) 등의 미국 특허 제5,672,662호에 기술되어 있는 바와 같이 PEG의 모노프로피온산 유도체의 숙신이미딜 에스테르 또는 다른 숙신이미드 활성화 PEG-카르복실산을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 세이퍼 등의 미국 특허 제5,006,333호; 제5,080,891호; 제5,283,317호 및 제5,468,478호에 기술되어 있는 바와 같이, PEG의 숙신이미딜 카르보네이트 유도체 ("SC-PEG"), 또는 켈리 (Kelly, S. J.) 등의 상기 문헌 (2001); 상기 PCT 공보 WO 00/07629 A2 및 대응 미국 특허 제6,576,235호, 및 상기 PCT 공보 WO 01/59078 A2에 기술되어 있는 바와 같이, PEG의 p-니트로페닐 카르보네이트 유도체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 다른 유형의 반응성 기를 사용하여 단백질의 중합체 콘쥬게이트를 합성할 수 있다. 이들 유도체로는, PEG의 알데히드 유도체 (Royer, G. P., 미국 특허 제4,002,531호; Harris, J. M., et al., 미국 특허 제5,252,714호), 및 PEG의 아민, 브로모페닐 카르보네이트, 카르보닐이미다졸, 클로로페닐 카르보네이트, 플루오로페닐 카르보네이트, 히드라지드, 카르바제이트, 아이오도아세트아미드, 말레이미드, 오르토피리딜 디술피드, 옥심, 페닐글리옥살, 티아졸리딘-2-티온, 티오에스테르, 티올, 트리아진 및 비닐술폰 유도체가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 중합체를 생체활성 성분과 커플링시켜 본 발명의 콘쥬게이트를 제조하는 반응 중에 PEG 등의 중합체에 의한 분자내 및 분자간 가교 형성을 최소화하는 것이 바람직하다. 이것은 일 말단에서만 활성화된 중합체 (본원에서 "단일관능성 활성화 PEG" 또는 "단일관능성 활성화 PAG"로 지칭)를 사용함으로써, 또는 이관능성 활성화 중합체 (선형 PEG의 경우에 "이중-활성화 PEG 디올"로 지칭)의 비율이 30 중량％ 미만, 보다 바람직하게는 10 중량％ 미만, 가장 바람직하게는 2 중량％ 미만인 중합체 제조에 의해 달성할 수 있다. 주로 단일관능성인 활성화 중합체를 사용함으로써, 각각의 단백질 분자내의 분자내 가교, 중합체의 한 스트랜드가 두 개의 단백질 분자와 연결되어 있는 "아령 (dumbbell)" 구조, 및 보다 큰 응집체 또는 겔 모두의 형성을 최소화할 수 있다. 아미노기와 반응하는 활성화 중합체를 사용하는 경우, 단백질 한 분자에 부착될 수 있는 중합체의 이론상 최대 스트랜드 수는 아미노기의 전체 수에 상응한다. 중합체 커플링의 임의 특정 조건 하에 단백질 표면 상에 접근가능한 아미노기의 실제 수는 이론상 최대치보다 작을 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는, 폴리에틸렌 글리콜의 스트랜드를 치료 효소 서브유닛 당 1 개 이상, 바람직하게는 약 1 개 내지 약 100 개, 약 1 개 내지 약 20 개, 및 수용체 결합 시토킨, 성장 인자, 단백질 호르몬 및 집락 자극 인자 서브유닛 당 약 1 개 내지 약 3 개, 보다 바람직하게는 약 1 개 내지 약 2 개 포함할 수 있다. 이러한 특히 바람직한 실시양태에서, 콘쥬게이트 제조에 사용되는 폴리알킬렌 글리콜은 1 개 또는 2 개의 폴리(에틸렌 글리콜) (특히, 카르복시PEG, 히드록시PEG, 디히드록시PEG 또는 PEG-아세탈) 스트랜드를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜은, 선형이라면, 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 바람직하게는 약 2 kDa 내지 약 60 kDa; 약 5 kDa 내지 약 20 kDa; 약 10 kDa 내지 약 20 kDa; 약 18 kDa 내지 약 60 kDa; 가장 바람직하게는 약 18 kDa 내지 약 22 kDa 또는 약 27 kDa 내지 약 33 kDa의 분자량을 가지고, 중합체가 동일 분자량의 두 분지를 가진다면, 총 분자량은 약 36 kDa 내지 약 44 kDa이다.
생체활성 성분
전술한 바와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트는 하나 이상의 생체활성 성분에 공유 부착된 하나 이상의 PAG 또는 PAO, 특히 하나 이상의 PEG 스트랜드를 포함한다. 하나 이상의 중합체 (또는 그의 스트랜드)가 공유 부착된 생체활성 성분은 본원에서 다양하게 및 동일하게 "콘쥬게이팅 생체활성 성분" 또는 "변형 생체활성 성분"으로 지칭한다. 이들 용어는 본원에서 "비콘쥬게이팅 생체활성 성분" "초기 생체활성 성분" 또는 "비변형 생체활성 성분" (이들 용어는 모두 하나 이상의 중합체가 공유 부착되지 않은 생체활성 성분을 지칭한다)과 구분하기 위한 것이다. 또다른 일면에서, 본 발명은 중합체와 혼합함으로써 생체활성 성분 용액을 안정화시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 그러나, "비콘쥬게이팅", "비변형" 또는 "초기" 생체활성 성분은 야생형 또는 천연 분자와 비교하여 다른 비-중합체 콘쥬게이션 또는 변형을 함유할 수 있으나, 이들 생체활성 성분은 중합체 부착에 대해서는 "비콘쥬게이팅", "비변형" 또는 "초기" 생체활성 성분이기 때문에 여전히 본 발명에 따른 "비콘쥬게이팅", "비변형" 또는 "초기" 생체활성 성분으로 간주된다는 것을 이해하여야 한다.
용어 생체활성 성분의 "안정화" (또는 "생체활성 성분의 안정화 방법" 또는 "안정화된 생체활성 성분")는, 생체활성 성분이 본 발명의 방법에 따라 안정화되었음을 (즉, 본 발명의 방법에 따라 중합체가 공유 부착되거나 혼합된 생체활성 성분) 의미한다. 이러한 안정화된 생체활성 성분은 안정화되지 않은 생체활성 성분 (즉, 중합체가 공유 부착되거나 혼합되지 않은 생체활성 성분)과 비교하여 특정 변화된 생화학적 및 생물리적 특성을 보일 것이다. 특히 단백질, 예컨대 효소에 있어서, 상기와 같은 변화된 생화학적 및 생물리적 파라미터로는, 감소된 자가용해, 및 특히 가혹한 환경 또는 실험 조건 하에서의 인큐베이션 동안 단백질의 효소 활성 유지가 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 변경된 생화학적 및 생물리적 파라미터로는, 예를 들어 생체내 순환계에서 연장된 반감기, 증가한 생체이용률 등이 포함될 수 있다.
생물학적 (즉, 생리적, 생화학적 또는 약학적) 활성을 가지는 임의의 성분 (통상적으로는 분자 또는 거대분자 복합체)를 본 발명의 초기 성분으로서 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 생체활성 성분으로는, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 치료 바이러스, 유기 화합물 등이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 생체활성 성분에는, 상기 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 치료 바이러스, 유기 화합물 등의 단편, 변이체 및 유도체, 특히 생물학적 (즉, 생리적, 생화학적 또는 약학적) 활성을 가지는 상기 단편, 변이체 및 유도체가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 생체활성 성분으로서 유용한 적합한 유기 화합물로는, 다우노루비신, 독소루비신, p-아미노아닐린 머스타드, 멜팔란, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C") 및 다른 항대사 화합물, 예를 들어 젬시타빈 등을 비롯한, 탁산, 안트라시클린 화합물 잔기를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이와 달리, 생체활성 성분은 심장혈관제, 항종양제, 항감염제, 항진균제, 예컨대 니스타틴 및 암포테리신 B, 항불안제, 위장제, 중추 신경계에 작용하는 제제, 진통제, 출산 제제, 피임제, 항염증제, 스테로이드제, 항요산혈제, 혈관확장제, 혈관수축제 등일 수 있다.
본 발명의 생체활성 성분으로서 유용한 적합한 펩티드, 폴리펩티드, 효소 및 기타 단백질, 당단백질 등에는, 중합체가 부착될 수 있는 하나 이상의 아미노기, 티올기 또는 다른 기를 가지는 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 효소 또는 다른 단백질이 포함된다. 이러한 성분은 생리적 또는 약리적 활성을 가지는 물질 뿐만 아니라, 유기 용매 중에서 반응을 촉매할 수 있는 물질을 포함한다. 해당 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질로는, 헤모글로빈, 혈청 단백질, 예컨대 혈액-응고 인자, 예를 들면 인자 VII, VIII 및 IX, 면역글로불린, 인슐린, 시토킨, 예컨대 인터루킨, 예를 들면 IL-1 내지 IL-18, 인터페론 (예를 들면, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 및 콘센서스 (concensus) IFN), GM-CSF, G-CSF를 비롯한 (이로 한정되지는 않는다) 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자, 트롬보포에틴, 거대핵세포 성장 및 발달 인자, 에리트로포에틴, 혈소판 유래 성장 인자, 포스포리파제 활성 단백질 ("PLAP"), 백혈병 억제 인자 ("LIF", 또한 당분야에 "스틸 인자" (Steel Factor)로 공지됨), 향신경 인자 및 줄기 세포 인자 및 그의 펩티드 유사체가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 생체활성 제제의 수용체-결합 길항제는 그 자체로 본 발명의 생체활성 성분으로서 사용하기에 적합하다. 생물학적으로 또는 치료학적으로 일반적인 기타 해당 단백질로는, 인슐린, 식물 단백질, 예컨대 렉틴 및 리신, 종양 괴사 인자 및 관련 단백질, 성장 인자, 예컨대 형질전환 성장 인자, 예를 들면 TGF-알파 또는 TGF-베타, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포에틴, 색소 호르몬, 시상하부 분비 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 융모 생식샘 자극호르몬, 난포-자극 호르몬, 갑상샘-자극 호르몬, 프로락틴, 조직 플라스미노겐 활성화제, 그의 수용체-결합 단백질 길항제 등이 포함된다. 이러한 다수의 단백질은 당화 및 비-당화 형태 모두로 존재한다. 비-당화 형태는 원핵생물에서의 재조합 기술을 사용하는 제조법에 의해 형성될 수 있다. 이러한 비-당화 생성물은 본 발명의 적합한 생체활성 성분인 펩티드 및 단백질에 포함되는 것이다.
해당 효소로는 탄수화물 특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소 및 리가제가 포함된다. 특정 효소로 한정되지는 않는, 해당 효소의 예로는 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데이민아제, 아데노신 데아민아제, 과산화 디스뮤타제, 엔도톡신아제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 요산분해효소, 아데노신 디포스파타제, 티로신아제 및 빌리루빈 산화효소가 포함된다. 해당 탄수화물-특이적 효소로는 글루코스 산화효소, 글루코시다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루쿠론산분해효소 등이 포함된다.
또한, 생체내에서 생체활성을 보이는 임의의 화합물이 본 발명의 콘쥬게이트 중의 생체활성 성분으로서 사용하기에 적합하다. 이러한 화합물로는, 아미노산 서열, 핵산 (DNA, RNA), 펩티드 핵산 ("PNA"), 항체 단편, 단일쇄 결합 단백질 (참조, 예를 들면, Ladner, R. C., et al., 미국 특허 제4,946,778호, 그의 명세는 본원에 참고로 포함된다), 가용성 수용체를 비롯한 결합 분자, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 촉매적 항체 및 항체 또는 그의 단편의 융합 생성물이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
단백질 또는 이의 단편은 당분야의 숙련자에게 공지된 기술, 예컨대 화학적 합성, 세포, 조직 또는 장기 배양, 동물 공급원으로부터의 추출을 사용하거나, 재조합 DNA 방법을 사용함으로써 제조 또는 분리할 수 있다. 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 단백질 등의 트랜스제닉 공급원도 고려된다. 이러한 물질은 트랜스제닉 동물, 예를 들면 단백질이 우유, 혈액 또는 조직에서 발현되는 마우스, 토끼, 돼지, 염소 및 암소로부터, 또는 트랜스제닉 조류의 알에서 얻을 수 있다. 트랜스제닉 곤충 및 진균 또는 바큘로바이러스 발현 시스템 또한 공급원으로서 고려할 수 있다. 게다가, 단백질의 돌연변이형도 본 발명의 범위내에 포함된다.
기타 해당 단백질은 알레르기성 단백질, 예컨대 호그위드 (ragweed), 항원 E, 꿀벌 독, 좀진드기 알레르기항원 등이다. 상기 기재는 본 발명에 적합한 단백질을 예시하는 것이다. 본원에서 구체적으로 언급하지는 않아도 본 발명에 따라 하나 이상의 중합체와 커플링하기에 적합한 하나 이상의 이용 가능한 아미노기 또는 티올기를 가지는 기타 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 단편 또한 본 발명의 범위내에 포함시키고자 하며 포함되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 바람직한 일면에서, 중합체 커플링할 수 있는 화합물은 치료가 요망되는 질환을 갖는 동물, 예를 들면 인간을 비롯한 포유류의 치료에 있어 의약용 또는 진단용으로 적합한 생물학적으로 활성인 화합물이다. 선행 목록은 변형될 수 있는 화합물에 대한 예시이며 한정하지는 않는다. 당업자라면 과도한 실험 없이 다른 화합물이 유사하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 구체적으로 언급하지는 않았지만 본 발명에 따라 하나 이상의 중합체와 커플링할 수 있는 하나 이상의 가능한 친핵성 기, 예컨대 아미노기 또는 티올기를 가지는 생물학적으로 활성인 물질 또한 본 발명의 범위내에 포함시키고자 하며 포함되는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 콘쥬게이트에 도입하기에 적합한 생체활성 성분은 콘쥬게이트에서 또는 콘쥬게이트로부터의 가수분해적 배출 직후에는 그 자체가 활성이 아니지만, 추가의 화학적 과정 또는 반응 수행 후 활성이 될 수 있는 물질 또는 화합물일 수 있다는 것이 주목된다. 예를 들면, 본 발명의 콘쥬게이트 형태로 혈류에 전달되는 항암제는 암 또는 종양 세포에 진입할 때까지 비활성으로 남아있고, 암 또는 종양 세포내에서 일어나는 화학적 과정, 예를 들면 상기 세포에 특이적이거나 상기 세포에서 특히 효과적인 효소 반응에 의해 활성화된다.
본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물에 생체활성 화합물로 사용하기에 적합한 기타 화합물로는, 히드록실-함유 화합물, 예컨대 캄프토테신 및 국소이성질화효소 I의 관련 억제제가 포함된다. 캄프토테신은 중국에서 자생하는 캄프토테카 아큐미나타 (Camptotheca accuminata) 나무 및 인도에서 자생하는 노타포다이테스 포에티다 (Nothapodytes foetida) 나무에서 제조되는 수 불용성 세포독성 알칼로이드이다. 캄프토테신과 관련 화합물 및 유사체는 또한 잠재적인 항암제 또는 항종양제로 공지되어 있으며 이들은 시험관내 및 생체내에서 활성을 나타내는 것으로 보여진다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 제4,943,579호, 제5,004,758호 및 Re 32,518, 그의 명세는 본원에 참고로 포함된다). 이러한 화합물 및 그의 유도체는 과도한 실험 없이 공지된 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 본원에 사용하기에 바람직한 캄프토테신 유도체로는, 활성화된 형태의 중합체, 예컨대 본 발명의 단일관능성 활성화 PEG와 직접 반응할 수 있는 20-OH 또는 또다른 히드록실기를 포함하는 유도체가 포함된다.
본 발명의 콘쥬게이트에 생체활성 성분으로 사용하기에 적합한 추가의 히드록실-함유 잔기로는 탁산 및 파클리탁셀 유도체가 포함된다. 본 발명의 목적상, 용어 "탁산"은 테르펜의 탁산류 중의 모든 화합물을 포함한다. 따라서, 탁솔 (파클리탁셀), 3'-치환된 t-부톡시카르보닐-아민 유도체 (탁소테레) 등 뿐만 아니라 표준 유기 기술을 사용하여 용이하게 합성되거나 시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)와 같은 시판 공급원으로부터 입수 가능한 기타 유사체도 본 발명의 범위 내에 있다. 이들 화합물 및 그의 유도체는 항암제로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 많은 연구에서 상기 제제가 각종 악성 암 및 기타 암에 대한 활성을 갖는 것으로 나타났다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 당분야에 공지되어 있으며 용이하게 입수 가능한 임의의 생체활성 성분이 본 발명에 따른, 감소한 항원성, 실질적으로 감소한 항원성 또는 검출 불가능한 항원성을 가지는 단일관능성 중합체와의 콘쥬게이션에 적합하다. 본 발명의 특정 일면에 따라, 이러한 초기 생체활성 성분을 사용하여 하나 이상의 PAG 또는 PAO가 생체활성 분자에 공유 결합되어 있는 콘쥬게이트를 제조한다. 중합체가 유리하게 부착될 수 있는 초기 생체활성 성분 분자 상의 부위로는, 잔기 각각 두 개의 아미노기를 가지는 펩티드 분자 상의 리신 잔기가 포함된다. 이들 아미노기 (알파 아미노기) 중 하나는 펩티드 결합 형성에 관여하여 (리신이 단백질의 아미노-말단 잔기인 경우 제외), 다른 아미노기 (입실론 아미노기)가 중합체 커플링이 가능하도록 남아있다. 중합체가 유리하게 부착될 수 있는 단백질 또는 펩티드 분자 상의 다른 부위로는, 그 중에서도 특히, 폴리펩티드의 아미노-말단 잔기의 알파 아미노기; 비닐 술폰, 말레이미드, 아이오도아세트아미드, 브로모아세트아미드 또는 오르토피리딜 디술피드와, 그 중에서도 특히 당분야에 공지된 기타 티올-반응성 기로 활성화된 중합체가 커플링될 수 있는, 단백질 또는 펩티드 상의 시스테인 잔기의 술프히드릴기 (Braxton, S. M., 미국 특허 제5,766,897호); 페닐글리옥살로 활성화된 중합체가 커플링될 수 있는, 단백질 또는 펩티드 상의 아르기닌 잔기의 구아니도기 (Sano, A., et al., 미국 특허 제5,093,531호); 중합체의 아미노 또는 히드라지드 유도체가 커플링될 수 있는, 단백질 또는 펩티드 상의 C-말단 잔기의 알파 카르복실기, 아스파테이트 잔기의 베타 카르복실기 및 글루타메이트 잔기의 감마 카르복실기 (문헌 [Sakane, T., et al. (1997) Pharm Res 14: 1085-1091])가 포함된다. 물론, 하나 이상의 폴리알킬렌 옥시드가 유리하게 부착될 수 있는 단백질 또는 펩티드 분자 상의 다른 적합한 부위는, 특히 펩티드의 일차원 및 삼차원 구조와 본원의 특허기술을 고려하면 당업자에게 용이하게 자명해질 것이다.
중합체가 표적 생체활성 성분 (예를 들면, 단백질)에 커플링되기 전에, 성분을 정제하여 오염물을 제거하는 것이 유리할 수 있으며; 그렇지 않으면, 무손상 성분의 변형 정도의 분석이 성분의 단편과 기타 오염물의 중합체 콘쥬게이트 형성에 의해 복잡해질 수 있다. 생체활성 성분의 정제는 콘쥬게이팅될 단백질이 천연 공급원으로부터 얻어졌는지 재조합 방법에 의해 제조되었는지에 상관 없이 유리할 수 있는데, 이는 제조물 중의 오염물이 상기 공급원 어느 쪽이든 예상될 수 있기 때문이다. 특정 생체활성 성분의 정제는 전기영동, 투석, 염 추출 (예컨대, 황산암모늄 침전), 크로마토그래피 (예컨대, 친화 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기별-배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC"), 고속 단백질 액체 크로마토그래피 ("FPLC") 등) 또는 이들의 조합을 비롯한 (이로 한정되지는 않는다), 당업자에게 익숙해질 공지된 방법에 의해 달성할 수 있다. 그러나, 조 제조물 중의 생체활성 성분 (특히, 단백질)도 본 발명의 방법에 따라 중합체와 유리하게 콘쥬게이팅될 수 있기 때문에, 특정 생체활성 성분의 정제가 본 발명의 중합체-생체활성 성분 콘쥬게이트 제조에 있어 필수적이지는 않음을 이해해야 한다.
중합체의 생체활성 성분에의 커플링
전술한 바와 같이, 바람직하게는 커플링기와의 반응에 의해 활성화되는 PAG는 본 발명의 실행에 이용되는 생체활성 성분 분자 상에 존재할 수 있는 여러 기중 어느 하나, 예를 들어 펩티드 결합에 관여하지 않는 카르복실기 또는 아미노기, 티올기 및 페놀계 히드록실기에 부착될 수 있다. 특정 펩티드 또는 단백질에 있어서, 활성화 PAG가 N-말단 알파 아미노기 및/또는 리신 잔기의 아미노기 및/또는 시스테인 잔기의 술프히드릴기에 커플링되는 것이 바람직하다.
조 생체활성 성분 또는 정제된 생체활성 성분 (예를 들면, 단백질)을 pH가 약 11 또는 알칼리도에 의한 단백질의 임의의 비활성화가 역전될 수 있는 최대값의 pH 내지 약 pH 5 또는 산도에 의한 단백질의 임의의 비활성화가 역전될 수 있는 최소값의 pH 범위에 있는 완충액 중에서 활성화 중합체와 인큐베이션할 수 있다 (참조, 문헌[Arakawa, T., et al. (1990) Biopolymers 29: 1065-1068]). 당분야에 공지된 바와 같이, 그리고 당업자가 용이하게 인지하는 바와 같이, 단백질에의 중합체 커플링에 낮은 pH를 사용하는 것이 특정 단백질 또는 결합 화학에 있어 바람직할 수 있다. 그러나, pH가 단백질의 용해도 및 안정성에 끼치는 영향 및 당분야에 공지된 방법에 따른 표적 단백질에의 중합체 부착 속도에 대한 (자발적이거나 단백질 자체에 의해 촉매되는) 활성화 중합체의 비활성화 속도에 따라, 특정 기타 단백질 및 특정 커플링 화학에 있어서는 높은 pH를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
PAG와 생체활성 성분 간의 반응은 통상적으로 용액 중에서, 바람직하게는 pH가 약 5 내지 약 11 범위인 수성 완충액 중에서 수행된다. PAG와 단백질 생체활성 성분 (예를 들면, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 또는 이의 단편)의 커플링에 특히 바람직한 pH 값은 약 7 내지 약 9, 가장 바람직하게는 약 7 내지 약 8이다. 다른 실시양태에서, 약 4.5 내지 약 6.5의 pH 값이 바람직하다. pH 값이 25 ℃에서 이러한 범위내에 있는 완충액의 예로는,
0.1 M 인산이수소칼륨 50 mL + 0.1 M NaOH 5.6 내지 46.1 mL의 100 mL 희석액,
0.025 M 붕산염 50 mL + 0.1 M HCl 2.0 내지 20.5 mL의 100 mL 희석액,
0.025 M 붕산염 50 mL + 0.1 M NaOH 0.9 내지 18.3 mL의 100 mL 희석액,
0.05 M 중탄산나트륨 50 mL + 0.1 M NaOH 5.0 내지 10.7 mL의 100 mL 희석액,
0.05 M 아세트산 50 mL + 0.1 M NaOH 5.0 내지 30 mL의 100 mL 희석액, 및
0.05 M 트리스 (Tris) HCl 50 mL + 0.1 M 트리스 염기 10 내지 50 mL의 100 mL 희석액이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
특히 바람직한 pH를 제공하기 위해 사용될 산 또는 염기의 양의 정확한 조정은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 완충액 사용이 요구되는 경우, 하기 완충액 중 하나를 이용할 수 있다:
히드록시에틸피페라진-에탄 술폰산 ("HEPES")
3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산 ("MOPS")
3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판 술폰산 ("MOPSO")
피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판 술폰산) ("POPSO")
PAG와 생체활성 성분 간의 반응은 통상적으로 비활성화 또는 변성이 일어나지 않을 조건하에서, 예를 들면 생체활성 성분이 실질적인 생체활성을 보유하는 온도에서 그리고 반응물의 적절한 혼합을 보장하는 이상의 교반에 가하지 않을 조건하에서 수행한다. PAG와 생체활성 단백질 간의 반응은 바람직하게는 약 4 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 수행될 것이다. 보다 바람직하게는, 반응은 약 4 ℃ 내지 8 ℃, 또는 실온, 즉 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃에서 수행될 것이다. PAG와 비-단백질 생체활성 제제, 예를 들면 펩티드 및 생체활성 유기 화학물질 간의 반응은 PAG와 커플링될 특정 생체활성 유기 화학물질의 안정성과 상용적인 고온 또는 저온에서 수행할 수 있다.
당업자는, 생체활성 성분의 양에 대한 PAG 이용량이 중합체와 생체활성 성분의 요망되는 커플링 정도에 좌우된다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, PAG가 용매-접근성이 있는 리신 잔기의 특정 부분과 반응할 것이 요망되는 경우 (생체활성 성분이 폴리펩티드인 경우), PAG의 몰 농도는 커플링될 리신의 몰 농도 이상으로 요구될 것이다. 명백하게, 생체활성 성분 분자 상의 용매-접근성이 있는 전체 부위보다 적은 부위가 유도체화되는 경우, 상응하게 적은 PAG가 요구될 것이다. 그러나, 일반적으로, PAG가 초과 몰 농도로 사용되는 경우, 본 발명자들은 2 내지 10 정도의 초과 몰 농도가 바람직할 수 있다고 판단하였다.
반응에 요구되는 시간은 수많은 요인, 예컨대 반응 온도, 반응물 농도 및 요망되는 유도체화 정도에 좌우될 것이다. 반응 과정은 통상적 수단, 예컨대 크기별-배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의한 주기적 표본 분석에 의해 모니터링할 수 있다. 반응은 반응성 기, 예를 들어 글리신을 가지는 저분자량 화합물의 첨가에 의해 과량의 아민-반응성 PAG를 제거하거나 크로마토그래피 분별증류에 의해 필요시 편리하게 종결될 수 있다. 실온에서는, 통상적으로 PAG가 대부분의 생체활성 성분의 결합기 (예를 들면, 폴리펩티드쇄의 리신기)와 반응하기 위해서 약 15분 내지 약 24시간의 반응 시간이 요구될 것이다. 저온에서는 보다 긴 반응 시간이 요구될 수 있다. 당업자는 콘쥬게이션에 요구되는 시간 뿐만 아니라, PAG의 양 및 종류가 이용될 생체활성 성분을 비활성화시키지 않을 정도, 즉 생체활성 성분의 생물학적 활성을 실질적으로 손실시키지 않을 정도여야 함을 이해할 것이다. "생체활성 성분의 생물학적 활성을 실질적으로 손실시키지 않음"은 PAG-콘쥬게이팅 생체활성 성분이, PAG로 콘쥬게이팅되지 않은 동일한 생체활성 성분이 시험관내 또는 생체내에서 나타내는 생체활성 (예를 들어, 효소 활성; 수용체 결합 능력; 항종양 활성 등) 수준의 약 10 ％ 이상, 바람직하게는 약 20 ％, 35 ％, 50 ％, 75 ％, 90 ％, 92 ％, 94 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 99 ％ 이상의 생체활성을 나타냄을 의미한다.
중합체-커플링된 생체활성 성분의 정제는 당업자가 통상 이용하는 수단, 예컨대 크기별-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 초미세여과, 투석 등에 의해 수행될 수 있다. 필요시, 반응 생성물 용액을 회전 증발기로 농축시킬 수 있고, 동결 건조에 의해 생성물을 건조 상태로 얻을 수 있다.
사용되는 특정 생체활성 성분 및 PAG와 반응하는 정도에 따라, 생성되는 부가생성물은 유용한 생물학적 활성 수준을 유지하면서, 미반응 생체활성 성분과 비교하여 감소한 항원성 및 면역원성, 연장된 순환 수명 및 증가한 안정성을 나타냄으로써, 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용할 것으로 기대된다.
생체활성 성분은, 전술한 바와 같은 단일관능성 활성화된 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 (특히, 하나 이상의 단일관능성 활성화된 분지형 디히드록시PEG, 예를 들어 디히드록시PEG-리신)와 친핵체 및 활성화 중합체의 요구되는 pH에 따라 완충액화될 수 있는 수성 반응 매질 중에서 반응할 수 있다. 대부분의 폴리펩티드의 용해도 및 안정성 유지를 위한 반응의 최적 pH는 일반적으로 약 6.5 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 7.4이다. 활성화 PAG, 예를 들어 NPC-PEG를 포유류 요산분해효소에 커플링하기 위한 최적 pH는 대략 pH 10인 반면, 특정 활성화 PAG를 단백질 또는 펩티드의 N-말단 알파 아미노기에 선택적으로 커플링하기 위한 최적 pH는 약 4 내지 약 7의 범위에 있다. 생체활성 성분의 안정성, 반응 효율 등을 유지하기 위해 필요한 최적 반응 조건은 당업자의 수준내에 있다. 바람직한 온도 범위는 약 4 ℃ 내지 약 40 ℃이다. 반응 온도는 친핵체가 변성 또는 분해될 수 있는 온도를 초과하지 않아야 한다. 친핵체가 과량의 활성화된 분지형 중합체와 반응하는 것이 바람직하다. 반응 후, 콘쥬게이트는, 예를 들어 투석여과, 컬럼 크로마토그래피 또는 이들의 조합 등에 의해 회수 및 정제될 수 있다.
분자 모델링의 사용은 중합체의 단백질에의 최적의 커플링을 위한 전략을 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, X-선 결정학 데이타를 사용하여 단백질의 용매-접근성이 있는 표면의 컴퓨터 처리된 영상을 생성할 수 있다 (문헌 [Sayle, R. A. et al. (1995) Trends Biochem Sci 20:374-376]). 이와 관련하여 핵자기 공명 측정 장치에 기준한 구조 분석도 유용할 수 있다. 특정한 활성 중합체와 반응할 수 있는 표면 상의 접근가능한 부위 및 여러 부위 중 중합체 스트랜드의 분포는 적절한 활성기, 중합체 대 단백질의 몰비 및 적절한 커플링 반응 조건 (예를 들면, pH, 온도, 반응물의 농도, 인큐베이션 지속 시간)을 선택함으로써 조정될 수 있다. 특정 상황에서, 효소의 활성 부위로부터 충분히 원위에 있는 잔기에 중합체를 부착하여 생체활성에 끼치는 임의의 악영향을 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 단백질분해 효소 K의 표면은 각종 화학 물질로 활성화된 중합체의 부착을 위한 잠재적인 다수의 부위를 함유한다. 그러나, 단백질분해 효소 K에서 가장 용매-접근성이 우수한 리신 잔기가 촉매 부위로부터 비교적 원위에 있는 효소 영역에 전적으로 위치한다는 본 발명자들 중 일부에 의한 기존의 발견은 이 특정 효소에 대해 특히 바람직한 아민-반응성 중합체를 사용하도록 한다 (참조, 공동 소유, 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제10/183,607호, 2002년 6월 28일자로 출원, 그의 명세 전체가 본원에 참고로 포함된다).
특정 실시양태에서 (예를 들면, 촉매 도메인이 활성 중합체가 반응할 수 있는 아미노기 (예컨대, 상기의 아미노기)를 함유하는 효소의 경우), 활성 부위가 활성 중합체와 접촉하지 않도록 차폐시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 효소는 활성 부위내 또는 활성 부위 근처에서 반응성 잔기의 활성 중합체의 접근을 입체적으로 장해할 정도로 충분히 큰 기질 유사체 또는 경쟁 억제제에 단단히, 그러나 가역적으로 결합할 수 있다 (참조, 예를 들면, 문헌 [Nahri, L. O., et al., (1991) J Protein Chem 10:385-389]). 이와 달리, 이러한 유사체 또는 억제제는 고상 매트릭스에 결합된 후 단백질을 흡착할 수 있다. 단백질은 생성되는 "친화 매트릭스"에 구속되지만, 활성 중합체와 반응할 수 있다. 이 전략은 이러한 커플링이 촉매 작용을 저해할 수 있는 부위에의 반응성 중합체의 커플링을 최소화할 수 있다. 선택적으로 변성된 단백질이 당업자에게 공지된 방법 (참조, 문헌 [Wilchek, M.. et al., (1984) Methods Enzymol 104:3-55])에 의해 친화 매트릭스로부터 후속 배출될 수 있다. 생성되는 콘쥬게이트는 중합체가 단백질의 생체활성을 저해하지 않는 부위에 우선적으로 부착되는 단백질 분자를 포함할 수 있다.
커플링 반응에 이어, 다양한 정도로 유도체화된 콘쥬게이트는 상기 셔먼 (Sherman, M. R.) 등 (1997)에 의해 기술된 바와 같이, 크기별-배제 크로마토그래피 및/또는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 서로 분리될 수 있다. 예를 들면, 슈퍼덱스® (Superdex®) 75 상표 HR 10/30 칼럼 또는 슈퍼덱스 200 상표 HR 10/30 칼럼 (아머샴 파마시아 바이오테크사 (Amersham Pharmacia Biotech; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)) 상의 크로마토그래피는 서로 상이한 정도로 PEG화된 단백질 분자의 분리 뿐만 아니라, 잔류 유리 PEG 및 커플링 반응의 주요 부산물로부터의 분리도 가능하게 한다 (참조, 상기 공동 소유, 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제10/183,607호).
조성물
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조되는, 항원성이 감소한 PEG화된 생체활성 성분의 안정화된 콘쥬게이트를 제공한다. 관련 일면에서, 본 발명은 또한 이러한 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 이 일면에 따른 조성물은 전술한 본 발명의 콘쥬게이트를 하나 이상 (예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 등) 포함할 것이다. 이러한 임의의 일면에서, 조성물은 하나 이상의 추가 성분, 예컨대 하나 이상의 완충염, 하나 이상의 무질서유발제 (chaotropic agent), 하나 이상의 세정제, 하나 이상의 단백질 (예를 들면, 하나 이상의 효소), 하나 이상의 중합체 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 이 일면의 조성물은 고상물 (예를 들면, 건조 분말) 또는 용액 (특히 본 발명의 콘쥬게이트를 하나 이상 포함하는 생리적으로 상용 가능한 완충염 용액의 형태)을 비롯한 임의의 형태일 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 특정 조성물은 특히 예방용, 진단용 또는 치료용으로 사용하기 위한 약학 조성물로서 제형된다. 이러한 조성물은 통상적으로 하나 이상의 본 발명의 콘쥬게이트 및, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 약학 조성물이 도입되었을 때, 이의 첨가로 인한 악영향 없이 인간 또는 기타 포유류를 비롯한 수용자 동물이 견딜 수 있는 비독성 고상물, 반고상물 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 형태의 제형 보조제를 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예컨대 경구, 직장, 비경구, 계내, 질, 복강내, 국소적 (분말, 연고, 점적약제 또는 경피 부착포로서), 경구 분무 또는 비내 분무로서 구강으로 또는 흡입에 의해 수용자에게 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 수조내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
비경구 용으로 본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션 뿐만 아니라, 사용하기 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성되는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 운반체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리(에틸렌 글리콜)), 카르복시메틸셀룰로오스 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일 (예컨대, 올리브유) 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트가 포함된다. 예를 들면, 코팅 재료, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입도의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
본 발명의 이러한 약학 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물의 작용은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함시킴으로써 확실히 예방할 수 있다. 또한, 삼투제, 예컨대 당, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아르산 알루미늄, 히드로겔 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사 가능한 약학 형태의 흡수를 연장할 수 있다.
일부 경우에, 약제의 효과를 연장하기 위해, 피하 주사 또는 근육내 주사의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 수성 체액 중 용해도가 불량한 결정질 또는 무정형 물질의 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 이어서, 약제의 흡수율은 그의 분해율에 좌우되며, 따라서 약물의 흡수율은 그의 물리적 형태에 좌우될 수 있다. 이와 달리, 비경구 투여 약제 형태의 흡수 지연은 오일 운반체 내에 약제를 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.
약제의 미소캡슐화 매트릭스를 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 내에 형성시켜 주사 축적 부위 형태를 제조한다. 약제 대 담체 중합체의 비율 및 이용되는 특정 담체 중합체의 특성에 따라, 약제의 배출 속도는 조절할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예로는 생체적합성 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 약제를 리포솜 또는 신체 조직과 상용성인 미소에멀션 내에 포착시켜 축적 부위 주사 제형물을 제조할 수 있다.
예를 들면, 세균-보전 필터를 통한 여과 또는 사용하기 전에 멸균수 또는 다른 주사 가능한 멸균 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고상 조성물 형태의 멸균제를 도입함으로써 주사 가능한 제형물을 멸균시킬 수 있다.
경구 투여용 고상 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고상 투여 형태에 있어서, 활성 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산 나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아 검, (c) 보습제, 예컨대 글리세롤, (d) 분해제, 예컨대 우무-우무, 탄산칼슘, 감자 전분 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨, (e) 용액 완염제, 예컨대 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡착제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 (i) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고상 폴리(에틸렌 글리콜), 라우릴 황산 나트륨 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수도 있다.
또한, 유사한 유형의 고상 조성물은 또한 이러한 부형제로서 락토오스 (유당)뿐만 아니라 고분자량 PEG 등을 사용하는 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 이용될 수 있다.
정제, 당제, 캡슐, 환제 및 과립인 고상 투여 형태는 코팅물 및 쉘 (shell), 예컨대 장 코팅물 또는 시간 조절 (chronomodulating) 코팅물 및 약학적 제형 업계에 널리 공지된 다른 코팅물로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 또한 위장관의 특정 부분에서, 임의로 지연된 방식으로 활성 성분(들)만, 또는 이(들)을 우선적으로 배출하는 조성물일 수도 있다. 사용 가능한 내재 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다. 활성 화합물은 또한, 적절하다면, 상기 부형제를 하나 이상 갖는 미세캡슐화 형태일 수 있다.
경구 투여용 액상 투여 형태는 약학적으로 허용가능한 에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물 이외에, 액상 투여 형태는 당분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 용해제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일류 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, PEG 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 보조제, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미료 및 향료를 포함할 수도 있다.
현탁액은, 활성 화합물 이외에, 현탁제, 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미소결정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 우무-우무, 트래거캔스 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
국소 투여는 폐 및 안구의 표면을 비롯한 표피 또는 점막에의 투여를 포함한다. 흡입용 조성물을 비롯한, 국소 투여용 조성물은 가압될 수도 그렇지 않을 수도 있는 건조 분말로서 제조될 수 있다. 가압되지 않은 분말 조성물에 있어서, 미분 형태의 활성 성분은 예를 들면, 직경 100 ㎛ 이하의 크기를 가지는 입자를 포함하는, 대형의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와의 혼합물로 사용될 수 있다. 적합한 불활성 담체는 당, 예컨대 락토오스 및 수크로오스를 포함한다. 바람직하게는, 활성 성분 입자의 95 중량％ 이상이 0.01 내지 10 ㎛ 범위의 유효 입도를 가진다.
이와 달리, 약학 조성물을 가압할 수 있으며, 압축 가스, 예컨대 질소 또는 액화 가스 분사제를 함유할 수 있다. 액화 분사 매질과 실제로 총 조성물은 활성 성분이 그 안에서 실질적인 정도로 용해되지 않도록 하는 것이 바람직할 것이다. 가압된 조성물은 또한 표면 활성제를 함유할 수도 있다. 표면 활성제는 액화 또는 고상 비이온형 표면 활성제이거나, 고상 음이온형 표면 활성제일 수 있다. 고상 음이온형 표면 활성제는 나트륨 염의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.
국소 투여의 추가 형태는 안구에 관한 것이다. 이 방식의 투여에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물은 약학적으로 허용가능한 안과용 운반체 내에 이송되어, 활성 화합물이 결막 또는 각막 및 안구의 내부 영역, 예를 들면 전방, 후방, 유리체, 안구방수, 유리체액, 각막, 홍채/속눈썹, 수정체, 맥락/망막 및 공막에 침투하기에 충분한 시간 동안 안구 표면과의 접촉이 유지되도록 한다. 약학적으로 허용가능한 안과용 운반체는, 예를 들면 연고, 식물성 오일 또는 캡슐화 물질일 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게는 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물을 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, PEG 또는 좌약용 왁스와 혼합함으로써 제조될 수 있는데, 이는 실온에서는 고상이나 체온에서는 액상이므로 직장 또는 질 공간 내에서 용융되어 약제를 배출한다.
본 치료 방법에 사용되는 약학 조성물은 또한 리포솜 형태로 투여될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 리포솜은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유도된다. 리포솜은 수성 매질에 분산되는 단일- 또는 다중-라멜라 수화 액상 결정에 의해 형성된다. 리포솜을 형성할 수 있는 비독성이며, 생리적으로 허용가능하며 물질 대사가 가능한 지질이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트 또는 조성물 이외에, 리포솜 형태의 본 발명의 약학 조성물도 하나 이상의 안정제, 보존제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린 (레시틴)이며, 천연 및 합성을 모두 포함한다. 리포솜의 형성 방법은 당분야에 공지되어 있다 (참조, 예를 들면, Zalipsky, S., et al., 미국 특허 제5,395,619호). PEG에 콘쥬게이팅된 인지질을 포함하는 리포솜, 가장 통상적으로 mPEG에 커플링된 포스파티딜 에탄올아민은 포유류의 혈액 순환 중 연장된 수명을 비롯한 유리한 성질을 가진다 (Fisher, D., 미국 특허 제6,132,763호). 더욱 유리하게는, 본 발명의 히드록시PEG는 이러한 PEG-리포솜의 형성에 있어서 mPEG를 대신할 수 있다. 가장 유리하게는, 본 발명의 단일관능성 활성 히드록시PEG가 PEG-리포솜 내에 도입될 PEG-디아실글리세롤의 합성에 있어서 활성화된 mPEG를 대신할 수 있다.
투약 계획
본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물은 세포에 시험관내, 생체외 또는 생체내 투여되어 활성 화합물(들)에 대한 세포성 반응을 증대시킬 수 있다. 당업자는 특정 활성 화합물, 콘쥬게이트 또는 조성물의 유효량이 실험적으로 결정될 수 있고, 순수한 형태가 존재한다면 약학적으로 허용가능한 제형에 순수한 형태로, 또는 전구약물 형태로 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 화합물, 콘쥬게이트 또는 조성물은 그것을 필요로 하는 동물 또는 인간 환자에게 수의학적 또는 약학 조성물로서 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여될 수 있다. 인간 환자에게 투여하는 경우, 주치의가 적절한 의학적 판단의 관점에서 본 발명의 화합물 및 조성물의 일일 총사용량, 주간 총사용량 또는 월간 총사용량을 결정할 것임이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자를 위한 치료학상 유효 투여량의 수준은 달성되어야 할 세포성 반응의 유형 및 그 정도; 이용되는 특정 화합물(들), 콘쥬게이트(들) 또는 조성물(들)의 특성 및/또는 작용; 환자의 연령, 체중 또는 체표면적, 일반적인 건강, 사회학적 성, 식이 및 활동 정도; 활성 화합물(들)의 투여 시간, 투여 경로 및 배출율; 치료 지속 기간; 특정 화합물(들), 콘쥬게이트(들) 또는 조성물(들)과 조합하여 또는 부합하여 사용되는 다른 약제; 및 약학 및 의학계의 숙련자에게 널리 공지된 유사 인자들을 비롯한 각종 인자에 좌우될 것이다. 예를 들면, 당업자는 본 발명의 특정 화합물, 콘쥬게이트 또는 조성물의 투여량을 목적하는 치료 효능을 달성하기 위해 요구되는 것 미만의 수준에서 시작해서 목적하는 효과를 달성할 때까지 그 투여량을 서서히 늘려나가는 것이 능숙하다.
투약 계획은 또한 환자마다 특정한 방식으로 조정되어, 당분야에 허용되며 일상적인 기술, 예컨대 크기별-배제, 이온-교환 또는 역상-HPLC에 의해 측정되는 혈액 중 특정 활성 화합물의 농도를 소정의 농도로 제공할 수 있다. 따라서, 대상체 투여량 요법을 조절하여, 의학, 약학 및/또는 약리학계의 숙련자에게는 일상적이고 친숙한 방법에 따라, HPLC에 의해 측정되는 바와 같이, 비교적 일정한 혈중 수준을 달성할 수 있다.
진단학적 용도 및 치료학적 용도
본 발명의 콘쥬게이트의 진단학적 용도는 본 발명의 중합체-콘쥬게이팅 항체를 투여함으로써 동물, 특히 인간의 체내에 항원성 병소, 예컨대 암의 위치를 알아내기 위한 것일 수 있는데, 여기에서 콘쥬게이트는 예를 들면, 후술될 바와 같이 광학, 방사선 분석, 형광 또는 공명 검출에 의해 검출될 수 있도록 단백질 또는 중합체 성분 중 어느 하나에 표지된다.
본 발명의 PAG-생체활성 화합물 콘쥬게이트 (바람직하게는 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 조성물로서 투여됨)는 훨씬 연장된 순환 반감기 및, 생체내 감소한 항원성 및 면역원성을 가질 것으로 기대된다. 이러한 성질들은 다수의 치료학적 화합물 (특히 본 발명 콘쥬게이트의 성분들로서 사용되는 것 등의 생체활성 화합물)을 치료용으로 동물, 특히 인간 또는 기타 포유류에 도입하는 경우 관찰되는, 이 화합물이 순환계로부터 신속히 제거되는 것을 완화시키거나 개선한다. 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물의 사용은 또한, 그렇지 않은 경우 대상체에게 면역반응을 도출할 수 있는, 특정 생체활성 화합물 또는 성분의 반복 투여에 대한 우려를 감소시키거나 제거한다. 우려하는 면역반응은 생체활성을 중화시키고/중화시키거나 생체활성 화합물이 순환계로부터 제거되는 속도를 증가시키는 것 (그에 의해, 진단학적 절차 또는 치료학적 절차의 효능이 감소함) 및 대상체에게 악영향을 끼치는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또다른 일면에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물은 진단학적 또는 치료학적 방법, 예를 들면 각종 신체 장애 소인을 갖거나 신체 장애를 앓고 있는 동물, 특히 인간 등의 포유류에게서 이러한 장애를 진단, 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법에 있어서, 치료 목적은 장애의 발달을 지연시키거나 예방하는 것, 및/또는 장애를 치료하거나 이의 완화를 유도하는 것, 및/또는 다른 치료 요법의 악영향을 감소시키거나 최소화하는 것이다. 따라서, 본 발명의 PAG-생체활성 성분 콘쥬게이트 및 조성물은 신체 장애, 예컨대 감염 또는 질환의 예방, 억제 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 신체 장애로부터의 "방어"란 용어는 "예방", "억제" 및 "치료"를 포함한다. "예방"이 질환 또는 신체 장애가 유도되기 전에 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물의 투여를 수반하는 데 반해, "억제"는 질환이 임상적으로 나타나기 전에 콘쥬게이트 또는 조성물의 투여를 수반하며; 따라서, 신체 장애의 "예방" 및 "억제"는 통상적으로 장애 소인을 갖거나 장애를 앓을 가능성은 있지만 아직 장애를 앓지는 않는 동물에게 행해진다. 그러나, 신체 장애의 "치료"는 질환이 나타난 후에 치료학적 콘쥬게이트 또는 조성물의 투여를 수반한다. 의학 및 수의학에 있어서, 신체 장애의 "예방"과 "억제"를 항상 구별할 수 있는 것은 아니라는 것이 이해될 것이다. 다수의 경우에, 궁극적인 유도성 결과 또는 결과들은 알려져 있지 않거나 잠재적일 수 있고, 환자도 의사도 유도성 결과가 충분히 발생한 후에야 인지할 수 있다. 따라서, "예방"이라는 용어를 "치료"와 구별하여 본원에 정의한 바와 같이 "예방" 및 "억제"를 모두 포함하여 사용하는 것이 통상적이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 "방어"라는 용어는 "예방"을 포함하고자 한다.
본 발명의 이 일면에 따른 방법은 임상의가 상기 치료학적 목적을 달성하도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 일 방법은, 예를 들면
(a) 신체 장애를 앓거나 이러한 장애 소인을 갖는 동물 (바람직하게는 인간 등의 포유류)을 확인하고;
(b) 동물에게 전술한 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 조성물, 특히 생체활성 성분의 하나 이상의 PAG 콘쥬게이트 (또는 이러한 콘쥬게이트를 포함하는 하나 이상의 약학 조성물) 유효량을 투여하여, 화합물 또는 조성물의 투여가 동물의 신체 장애의 발달을 예방, 지연 또는 진단하거나, 이를 치료하거나 그의 완화를 유도하도록 하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 신체 장애 "소인을 갖는" 동물은 다수의 명백한 신체 장애 증상을 보이지는 않지만, 유전적, 생리적 또는 그렇지 않으면 장애를 발달시킬 위험이 있는 동물로 정의한다. 본 방법에 있어서, 특정 신체 장애 소인을 갖거나, 장애 위험이 있거나, 장애를 앓고 있는 동물 (예컨대, 인간을 비롯한 포유류)의 확인은 예를 들면, 방사선학적 분석, 생화학적 분석 (예를 들면, 동물로부터 얻은 표본 중 특정 펩티드, 단백질, 전해질 등의 상대적인 수준 분석), 외과적 방법, 유전학적 선별, 가족력, 신체 촉진, 병리학적 또는 조직학적 시험 (예를 들면, 조직 또는 체액 표본 또는 도말표본의 현미경 평가, 면역학적 분석 등), 체액 (예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 요, 침, 정액 등) 검사, 영상 (예를 들면, 방사선, 형광, 광학, 공명 (예컨대, 핵자기 공명 (NMR) 또는 전자 스핀 공명 (ESR)을 사용함) 등을 비롯하여, 임상의에게는 잘 알려질, 업계에 표준적으로 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 하나 이상의 방법에 의해 그 동물을 확인한 후에야, 그 동물을 적극적으로 및/또는 순향적으로 치료하여 신체 장애를 예방, 억제, 지연 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트, 조성물 및 방법으로 예방, 진단 또는 치료할 수 있는 신체 장애는 콘쥬게이트의 생체활성 성분이 예방, 진단 또는 치료에 사용될 수 있는 임의의 신체 장애를 포함한다. 이러한 장애로는 각종 암 (예를 들면, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 고환암, 백혈병, 림프종, 폐암, 신경계 암, 피부암, 두부암 및 경부암, 골암, 결장암 및 기타 위장암, 췌장암, 방광암, 신장암 및 기타 암종, 육종, 샘종 및 골수종); 감염병 (예를 들면, 세균병, 진균병, 바이러스병 (간염 및 HIV/AIDS 포함), 기생충병 등); 유전적 장애 (예를 들면, 낭성 섬유증, 근위축성 측삭 경화증, 근육 퇴행 위축증, 고셔 (Gaucher)병, 폼페 (Pompe)병, 중증 복합 면역결핍증 등), 빈혈, 호중성 백혈구 감소증, 혈우병 및 기타 혈액 질환; 신경계 장애 (예를 들면, 다발성 경화증 및 알츠하이머병); 효소 장애 (예를 들면, 통풍, 요독증, 고콜레스테롤혈증 등); 병인이 불확실한 장애 (예를 들면, 심장혈관병, 고혈압 등); 및 당업자에게 용이하게 알려질, 의학적으로 중요한 기타 장애가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 질환의 진행 예방, 예컨대 전암성 환부에서 악성 환부로의 진행을 화학예방하는 데 사용될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 치료학적 방법은 경구, 직장, 비경구 (정맥내, 근육내, 복강내, 수조내, 피하 및 관절내 주사 및 주입에 의한 것을 포함), 계내, 질, 복강내, 국소적 (분말, 연고, 점적약제 또는 경피 부착포로서), 경구 분무 또는 비내 분무로서 구강으로 또는 흡입에 의한 투여를 비롯한 각종 투여 경로에 의해 필요로 하는 동물에게 투여할 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트, 또는 본 발명의 하나 이상의 약학 조성물을 사용한다. 본 발명에 의하면, 콘쥬게이트 또는 조성물 유효량은 특정한 장애를 앓고 있거나 장애 소인을 갖고 있는 세포 또는 동물에게 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내 투여되어, 동물의 장애를 예방, 지연, 진단 또는 치료할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "콘쥬게이트 (또는 조성물)의 유효량"은 콘쥬게이트가 그의 생체활성 성분의 생물학적 활성을 수행하여 본 발명의 콘쥬게이트가 투여된 동물의 신체 장애를 예방, 지연, 진단, 처치 또는 치료하도록 하는 양을 지칭한다. 당업자는 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물의 유효량이 약학 및 의학계의 숙련자에게 널리 공지된 표준적인 방법 (참조, 예를 들면, 문헌 [Beers, M. H., et al., eds. (1999) Merck Manual of Diagnosis & Therapy, 17th edition, Merck and Co., Rahway, NJ; Hardman, J. G., et al., eds. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th edition, McGraw-Hill Professional Publishing, Elmsford, NY; Speight, T. M., et al., eds. (1997) Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 4th edition, Blackwell Science, Inc., Boston; Katzung, B. G., (2000) Basic and Clinical Pharmacology, 8th edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT]; 여기에서 언급된 참조문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 따라 실험적으로 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
인간 환자에게 투여하는 경우, 주치의가 적절한 의학적 판단의 관점에서 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물의 일일 총투여량, 주간 총투여량 또는 월간 총투여량을 결정할 것임이 이해될 것이다. 예를 들면, 사용된 특정 생체활성 화합물에 따라 본 발명의 콘쥬게이트 또는 조성물을 적절한 투여량으로 투여함으로써 만족스러운 결과를 얻으며, 이 투여량은 당업자에게는 용이하게 알려지거나, 일상적인 실험만을 사용해서 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 이 일면에 따르면, 콘쥬게이트 또는 조성물은 한 번에 또는 나눠서, 예를 들면 하루, 한 주 또는 한 달에 2번으로 투여량을 나눠서 투여할 수 있다. 각종 투여 방식 (예를 들면, 비경구, 피하, 근육내, 안구내, 비강내 등)을 위한 적절한 투여량 요법도 일상적인 실험만을 사용하여 실험적으로 용이하게 결정될 수 있거나, 생체활성 성분의 특성에 따라 당업자에게는 용이하게 자명해질 것이다.
추가 응용에서, 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물은 진단 또는 치료 제제를 콘쥬게이트의 생체활성 성분에 대해 수용체를 표시하고, 콘쥬게이트의 생체활성 성분을 결합하거나, 도입하거나, 그렇지 않으면 이를 취할 수 있는 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 대해 특이적으로 표적화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 이 일면에 따른 방법은, 예를 들면 세포, 조직, 장기 또는 유기체와 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트를 접촉시키는 단계를 포함하는데, 이 콘쥬게이트는 임의의 기작 (예를 들면, 수용체-매개 세포 내 이입, 세포 흡수 작용, 포식 작용, 확산 등)에 의해 세포, 조직, 장기 또는 유기체가 콘쥬게이트를 취하도록, 하나 이상의 진단학적 또는 치료학적 제제 (바람직하게는 콘쥬게이트의 PAO 또는 PEG 성분과 공유 결합함)를 추가로 포함하여, 진단학적 또는 치료학적 제제를 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 이송하도록 한다. 본 발명의 이 일면에 따라 사용되는 진단학적 또는 치료학적 제제는 핵산, 유기 화합물, 단백질, 항체, 효소, 당단백질, 지질단백질, 원소, 지질, 당류, 동위 원소, 탄수화물, 영상제제, 검출 가능한 탐침, 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 1종 이상의 제제일 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들은 또한 본원에 기술된 대로 검출 가능하도록 표지될 수 있다. 본 발명의 이 일면에 사용되는 치료학적 제제는 표적 세포 (또는 조직, 장기 또는 유기체)에 대한 치료 효능을 가질 수 있으며, 이 효능은 결손 유전자 또는 단백질의 교정, 약제 작용, 중독 효과, 성장-자극 효과, 성장-방해 효과, 대사 효과, 이화 (異化) 효과, 동화 효과, 항바이러스 효과, 항진균 효과, 항균 효과, 호르몬 효과, 신경전달 효과, 세포 분화 자극 효과, 세포 분화 방해 효과, 신경 조절 효과, 항신생물성 효과, 항종양 효과, 인슐린 자극 또는 방해 효과, 골수 자극 효과, 다능성 간세포 자극 효과, 면역계 자극 효과, 및 본 발명의 이 일면에 따른 이송계를 통해 세포 (또는 조직, 장기 또는 유기체)에 이송되는 치료학적 제제에 의해 제공될 수 있는 공지된 다른 임의의 치료 효능으로부터 선택되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 생체활성 콘쥬게이트 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있는, 이러한 추가의 치료학적 제제는 항생제, 스테로이드, 세포 독성제, 혈관작용 약제, 항체 및 다른 치료학적 제제를 비롯한, 공지 및 신규 화합물과 조성물 중에서 선택될 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 이러한 제제의 비제한적인 예로는 항생제, 및 젠타마이신, 토브라마이신, 나프실린, 비경구 세팔로스포린 등의 세균 쇼크의 치료에 사용되는 다른 약제; 내독소에 의한 세포 손상을 완화하는 덱사메타손 등의 부신 코르티코스테로이드 및 그의 유사체; 알파 아드레날린 수용체 차단제 (예컨대, 페독시벤즈아민), 베타 아드레날린 수용체 작용제 (예컨대, 이소프로테레놀) 및 도파민 등의 혈관작용 약제를 포함한다.
본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물은 또한 질환을 진단하고, 치료 반응을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 임의의 방법에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트는 하나 이상의 검출 가능한 표지 (예컨대, 본원의 다른 곳에 기술된 것)를 포함할 수 있다. 이러한 특정 방법에 있어서, 이들 검출 가능하게 표지된, 본 발명의 콘쥬게이트는 콘쥬게이트의 생체활성 성분에 대한 수용체를 표시하거나, 그렇지 않은 경우 콘쥬게이트의 생체활성 성분을 취하는 세포, 조직, 장기 또는 유기체를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 일례에는, 세포, 조직, 장기 또는 유기체가 세포, 조직 또는 유기체에 의한 콘쥬게이트의 취득 (예를 들면, 세포-표면 수용체에 콘쥬게이트를 결합시키거나, 세포 내에 콘쥬게이트를 세포 흡수 작용 또는 확산시킴으로써)에 호적한 조건하에서 본 발명의 검출 가능하도록 표지된 하나 이상의 콘쥬게이트와 접촉된 후, 사용된 표지에 따라 특이적인 검출 수단 (예를 들면, 형광 표지된 콘쥬게이트에는 형광 검출; 자기적으로 표지된 콘쥬게이트에는 자기 공명 영상; 방사선 표지된 콘쥬게이트에는 방사선 영상; 등)을 사용하여 세포에 결합되거나 세포 내에 도입된 콘쥬게이트를 검출한다. 이러한 검출 가능하도록 표지된 콘쥬게이트의 다른 용도로는, 예를 들면 세포, 조직, 장기 또는 유기체, 또는 동물 (인간 포함)의 내부 구조를 본 발명의 하나 이상의 콘쥬게이트의 표지된 형태를 유효량으로 투여하고, 세포, 조직, 장기 또는 유기체 (또는 동물)와 회합된 검출 가능한 방사선을 측정함으로써 영상화하는 것을 포함할 수 있다. 각종 표지의 검출 방법 및 진단학적 및 치료학적 영상화에서의 이들의 용도는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
또 다른 일면에서, 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물을 특이적인 수용체를 발현하는 세포의 표면 상에 콘쥬게이트의 생체활성 성분에 대한 상기 수용체의 농도 또는 활성을 조정하기 위한 방법에 사용할 수 있다. 상기 수용체의 활성을 "조정"한다는 것은 콘쥬게이트가 수용체에 결합할 때 그 수용체를 통해 매개되는 생리학적 활성 (예를 들어, 세포내 신호전달 캐스케이드)을 활성시키거나 또는 억제시킨다는 것을 의미한다. 본 발명의 콘쥬게이트의 조절 활성에 대한 임의의 특정 기계적 설명에 의해 결부하려는 의도 없이, 상기 콘쥬게이트는 콘쥬게이트의 생체활성 성분을 통해 수용체에 결합함으로써, 이에 따라 천연 아고니스트 (예를 들어 비콘쥬게이팅 생체활성 성분)의 결합을 차단하고, 천연 아고니스트에 의해 수용체 활성을 억제시키나 수용체 그 자체의 생리학적 활성의 실질적인 활성은 유도시키지 않음으로써 세포성 수용체의 생리학적 활성을 길항시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 방법은 하나 이상의 단계, 예를 들어 콘쥬게이트 (즉, 콘쥬게이트의 생체활성 성분 일부)가 세포 표면 상에서 생체활성 성분에 대해 수용체와 결합하나 실질적으로는 상기 수용체를 활성화시키지 않는 조건 하에 1종 이상의 본 발명의 콘쥬게이트와 세포를 접촉시키는 단계 (이는 시험관내 또는 생체내에서 수행할 수 있음)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 당업자가 용이하게 인지할 수 있는 바와 같이 다양한 진단 및 치료적 적용에 유용할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 콘쥬게이트 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 통상적으로 1종 이상의 용기, 예컨대 바이알, 튜브, 앰플, 병 등을 밀봉 하에 수용하는 박스, 카톤, 튜브 등과 같은 캐리어를 포함하는데, 여기에서 제1 용기는 하나 이상의 본 발명의 콘쥬게이트 및/또는 조성물을 함유한다. 본 발명의 일면에 포함되는 키트는 본 발명의 콘쥬게이트 및 조성물의 하나 이상의 특정 적용을 수행하는데 필요한 하나 이상의 추가 성분 (예를 들어, 시약 및 화합물), 예컨대 특정 질환 또는 신체적 장애의 진단, 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 성분 (예를 들어, 하나 이상의 추가 치료용 화합물 또는 조성물, 하나 이상의 진단 시약, 하나 이상의 담체 또는 부형제 등), 하나 이상의 본 발명의 추가 콘쥬게이트 또는 조성물 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명 또는 그의 어떠한 실시양태의 범위에 벗어남 없이, 본원에 기술되어 있는 방법 및 적용에 다른 적합한 변형 및 개조가 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 이제 본 발명을 상세하게 설명하는데 있어, 단지 설명하려는 목적으로 포함되며, 본 발명을 한정하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참고로 하여 보다 명확하게 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1: 모노메톡시PEG에 대한 항체의 제조 및 시험
토끼를 PEG가 면역원성 담체 단백질에 커플링된 콘쥬게이트로 상기 동물을 면역화시킴으로써 각종 PEG에 대해 면역화시킬 수 있다는 것이 사전에 보고된 바 있다 (문헌 [Richter, A.W., et al. (1983) Int Arch Allergy Appl Immunol 70:124-131]). PEG의 폴리에테르 주쇄와 반응하는 단일클론 항체는 마우스에 β-글루쿠론산분해효소의 mPEG 콘쥬게이트를 주입하고, PEG에 대한 항체를 제조하는 하이브리도마 클론을 선별함으로써 발생시켰다 (상기 문헌 [Cheng, T-L., et al. (1999)]; 상기 문헌 [Cheng, T L., et al. (2000)]; 상기 문헌 [Tsai, N.-M., et al. (2001)]; Roffler, S., et al., 공개 미국 특허 출원 제2001/0028881 A1호 및 미국 특허 제6,596,849호 및 제6,617,118호, 그의 명세 모두는 전체가 본원에 참고로 포함된다). PEG의 폴리에테르 주쇄와 반응하는 또다른 단일클론 항체가 로버츠 등의 미국 특허 출원 제2003/001704 A1호에 최근에 기술되었다.
PEG-단백질 콘쥬게이트 중에서 PEG를 검출하기 위한 감수성 방법을 개발하기 위해, PEG에 대한 다중클론 항체를 하기 기술하는 바와 같이 제조하였다. 당분야에 기술된 치료용 단백질의 거의 모든 PEG 콘쥬게이트가 mPEG로 합성되었기 때문에, 본 발명자들은 mPEG를 함유하는 콘쥬게이트의 면역반응에서 메톡실기의 역할을 조사하였다. 10-kDa mPEG의 p-니트로페닐 카르보네이트 유도체는 쉬어워터 코포레이션, 넥타 테라퓨틱스의 자회사에 의해 관례대로 합성된다. 생리학적 pH에서 단백질을 용해시키는 데 필요한 최소 수의 스트랜드를 가지는 상기 10-kDa mPEG (대략 35-kDa 요산분해효소 서브유닛 당 두 스트랜드의 PEG 또는 mPEG)를 함유하는 재조합 포유류 요산분해효소의 우레탄-결합된 mPEG 콘쥬게이트를 제조하였다. 상기 양의 PEG는 요산분해효소의 비이상적으로 높은 면역원성을 억제하는 데 충분하지 않았다 (참조, Sherman, M.R., et al., PCT 공보 WO 01/59078 A2 및 상기 문헌 [Kelly, S. J., et al. (2001)], 그의 명세는 전체가 본원에 참고로 포함된다). 이 PEG-요산분해효소 제조물을 프로인트 항원보강제 중에 3 마리의 토끼에 반복하여 주사하고, 토끼를 요산분해효소, PEG-요산분해효소 콘쥬게이트 및 PEG에 대한 다중클론 항체를 함유하는 항혈청을 준비하기 위해 방혈시켰다.
각각의 토끼에 완전 프로인트 항원보강제 중에서 PEG-요산분해효소 제조물을 1회 주사하고, 불완전 프로인트 항원보강제 중에서 1 내지 4주의 간격으로 5회 주사하였다. 혈액을 각각 최종 3회 주사 후 대략 2주에 샘플링하였다. 혈청을 각각의 9개의 혈액 표본으로부터 제조하고, 소량의 혈청을 요산분해효소와 구조적으로 무관한 단백질의 mPEG 콘쥬게이트로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하는 효소면역측정법("ELISA")에 의해 PEG에 대한 항체에 대해 검사하였다.
각각의 검사 혈액은 ELISA 분석에서 PEG와 반응하는 항혈청을 생성하였다. 3 마리의 토끼 각각을 경쟁적 ELISA에 의해 측정하자, 양적으로 유사한 역학 및 mPEG의 메톡실 말단기에 대해 유사한 특이성으로 PEG로의 면역화에 반응하였다. 초기에는 도트 블롯 분석을 수행하여 토끼 혈청중 항-PEG 항체의 감수성을 측정하였다. 다양한 크기 및 구조의 PEG 용액 및 토끼를 면역화시키는데 사용되는 PEG-요산분해효소 용액을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 블롯팅 막 (인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재; 카탈로그 번호 LS2002) 상에 점찍었다. 2％ (w/v) 탈지 건조 우유 분말의 용액으로 상기 막을 차단시킨 후에, 막을 전술한 바와 같이 제조된 PEG-요산분해효소에 대한 토끼 항혈청의 희석액과 함께 인큐베이팅하였다. 이어서, 염소에서 제조되었고, 알칼리성 포스파타제 (칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재; 카탈로그 번호401371)와 커플링된 항-토끼 IgG 항체 의 희석액을 2차 항체로서 적용하였다. 블롯 상에서의 알칼리성 포스파타제 활성을 전술한 바와 같이 (문헌 [Blake, M.S., et al. (1984) Anal Biochem 136:175-190], 이의 명세는 전체가 본원에 참고로 포함된다), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 및 니트로블루 테트라졸륨 (시그마, 카탈로그 번호 B-1911)의 조합물을 사용하여 검출하였다. 토끼 항-PEG 항체는 시험된 PEG 용액 및 mPEG-단백질 콘쥬게이트를 높은 감수성 및 특이성으로 검출하였다.
실시예 2: mPEG의 항원성에 있어서의 메톡실기의 역할 입증
예기치 않게, 본 발명자들은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 항-PEG 항체가 항원의 mPEG 성분의 메톡실 말단기에 대해 유력하게 관련된다는 것을 알아내었다. 도 1은 요산분해효소와 구조적으로 무관한 단백질의 mPEG 콘쥬게이트로 코팅된 96-웰 플레이트에서의 경쟁적 ELISA 측정법으로부터의 결과를 도시한다. 2％ 염소 혈청으로 플레이트를 차단한 다음, 4.8-kDa mPEG (폴리머 라보라토리즈(Polymer Laboratories), 카탈로그 번호 6570-5010), 10-kDa mPEG (유니온 카바이드(Union Carbide), 카탈로그 번호 MPEG-10,000) 또는 10-kDa t-부톡시PEG (폴리머 라보라토리즈, 카탈로그 번호 29999997)의 증가되는 농도의 용액을 첨가하고, mPEG-요산분해효소 콘쥬게이트에 대해 형성된 토끼 항혈청의 1:1,000 희석액과 함께 인큐베이팅하였다. 용액을 제거한 후, 플레이트 상에서 mPEG-단백질 콘쥬게이트에 결합한 항-PEG 항체의 양을 퍼옥시다제-콘쥬게이팅된 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG, 칼바이오켐®; 카탈로그 번호 401393)를 사용한 다음, 퍼옥시다제 기질인, o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (시그마; 카탈로그 번호 P-9781)를 첨가하는 분광법으로 측정하였다. 각각의 표본에 대해, 경쟁자 부재하에 관찰되는 초기 반응 속도 (1분 당 밀리-흡광 단위)를 100％로 정하였다. mPEG의 2개의 용액의 중첩 곡선은 PEG 주쇄의 길이가 그의 항원성의 유력한 결정인자가 아님을 암시한다. t-부톡시PEG에 대한 곡선은 오른쪽으로 대략 2 로그 단위 이동하며, 이는 t-부톡시PEG가 mPEG보다 약 100 배 낮은 mPEG-단백질 콘쥬게이트에 대해 발생된 항체에 대한 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 그러나, 본 발명자들 중 일부에 의한 사전에 비공개된 실험에서, t-부톡시PEG는 면역원성 단백질과 콘쥬게이팅되는 경우 충분한 면역원성을 보인다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 도 1이 t-부톡시PEG가 mPEG에 대해 발생된 항체와 교차-반응성이 매우 적다는 것을 설명하고 있으나, PEG화된 치료 단백질의 생성에서 mPEG 대신에 t-부톡시PEG를 사용하는 것은 PEG 성분의 면역원성의 문제를 해결하지는 못할 것이다.
도 1에서 도식한 결과는 mPEG 상의 메톡실기가 중합체 분자 상에서 유력한 항원기라는 것을 암시한다. 상기 추론을 확인하기 위해, 실시예 1에서 설명한 바와 같이 생성된 항체를 하나 또는 두 개의 메톡실기를 함유하는 다양한 크기 및 구조의 PEG를 사용하여 도 1에 대해 기술된 바와 같이 수행되는 경쟁적 ELISA로 분석하였다. 도 2a는 각각의 표본에서 메톡실기의 몰 농도의 함수로서 도표된 항체 결합에 대한 결과를 나타낸다. 결합의 50％ 억제 ("IC50")를 일으키는 경쟁자의 농도를 5-매개변수 S자 곡선에 대한 방정식 및 프로그램 시그마플롯® (SigmaPlot®, SPSS Science, 미국 일리노이주 시카고 소재)을 사용하여 계산하였다.
도 2a에서 보여지는 바와 같이, mPEG-NPC (PEG-Shop) 및 리신과 20-kDa NPC-PEG (쉬어워터, 카탈로그 번호 M-NPC-20,000)를 커플링시켜 합성하는 "모노-20-kDa mPEG-리신"을 가수분해하여 제조하는 하나의 메톡실기를 가지는 선형 PEG ("10-kDa mPEG"); 두 개의 메톡실기를 가지는 선형 PEG ("비스-(2-kDa) mPEG" (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 81314)) 및 두 개의 메톡실기를 함유하는 거대한 "분지형" PEG ("디-(20-kDa) mPEG-리신" (쉬어워터, 카탈로그 번호 PEG2-NHS-40K))는 모두 몰을 기초로 하여 유사한 항원이다. 반면에, 두 개의 메톡실기를 가지는 보다 작은 "분지형" PEG ("디-(5-kDa) mPEG-리신" (쉬어워터, 카탈로그 번호 2Z3X0L01))에 대한 곡선은 다른 표본에 대한 결과의 평균의 왼쪽으로 0.5 내지 0.6 로그 단위 이동하였으며, 이는 이러한 형태의 "분지형" mPEG가 이 실험에서 시험되는 다른 표본에 비해 3 내지 4 배 항원성이라는 것을 나타낸다. 도 2b는 메톡실기의 몰 농도 대신에 mPEG의 중량 농도 (마이크로그램/mL)의 함수로서 도 2a로부터의 데이타를 나타내며, 이는 메톡실기가 항-mPEG 항체와 mPEG의 상호작용에 중요하다는 결론을 지지한다.
도 3은 PEG의 분자 당 메톡실기의 수에 대한 항원성의 직접적인 의존성을 입증하는 형식으로 도 1, 2a 및 2b로부터의 데이타의 하위세트를 나타낸다. 이들 표본은 메톡실기를 갖지 않는 10-kDa PEG ("10-kDa t-부톡시PEG"), 하나의 메톡실기를 가지는 10-kDa PEG ("10-kDa mPEG") 또는 두 개의 메톡실기를 가지는 10-kDa PEG ("디-(5-kDa) mPEG-리신")를 나타낸다. 결과는 상기 중합체의 항원성 및 이에 따라 상기 중합체로 생성된 본 발명의 콘쥬게이트의 항원성이 PEG 중합체 분자 상에 함유된 메톡실기의 수에 직접적으로 의존한다는 것을 나타낸다. 메톡실기의 수가 많을수록, mPEG-단백질 콘쥬게이트에 대해 생성되는 항체에 대한 중합체의 친화도가 높아진다.
종합하면, 이들 결과는 mPEG 콘쥬게이트에 대한 토끼 항체 결합의 완전 저해가 PEG, 및 특히 mPEG의 용액과 경쟁시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, 무관한 단백질의 mPEG 콘쥬게이트에 토끼 항-PEG 항체가 결합하는 것을 차단하는 mPEG 용액의 능력이 이들의 메톡실기 함량과 상호연관된다. 중량부 농도를 기초로 하여, 도 2b에 보여지는 바와 같이 저분자량의 mPEG가 더 고분자량의 mPEG보다 더욱 효력있는 경쟁자였다. 이 결론은 메톡실기의 질량 대 중합체의 전체 질량 비가 중합체의 몰 중량이 증가함에 따라 감소한다는 사실과 일치한다. 시험된 PEG 중, (몰을 기초로 하여) 가장 효력있는 항원은 때때로 우산형 또는 "U-PEG" (Martinez, A., et al., 미국 특허 제5,643,575호) 또는 "Y-PEG" (Greenwald, R.B., et al. 공개 미국 특허 출원 제2002/0052443 A1호)로서 언급되는 두 개의 메톡실기를 함유하는 "분지형" PEG이었다.
실시예 3 : 메톡실 기가 없는 PEG와의 항-PEG 항체 시험
용어 "파마PEG"는 본원에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 말단이거나 또는 말단으로부터 원위에 있는 말단 또는 말단들에 항원성 기가 없는 선형 또는 분지형 PEG를 지칭하는 데 사용된다. 상기 실시예로부터 중합체의 항원성, 및 이에 따른 생체활성 제제의 중합체 콘쥬게이트의 항원성이 중합체 내에서 메톡실기의 함량의 함수라는 것을 추론할 수 있다. 상기 추론을 더욱 시험하기 위해, 선형 중합체의 말단에 메톡실기가 없거나 다른 알콕실기를 갖는 mPEG ("4.8-kDa mPEG") 및 12-kDa, 20-kDa 및 35-kDa 파마PEG가 항-mPEG 항체에 의해 결합하는 능력을 비교하는 도 1에서 기재한 바와 같은 경쟁적 ELISA 분석을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 도식된 mPEG 곡선에 대한 세 개의 파마PEG 곡선의 이동은 항-mPEG 항체로 측정한 경우, 파마PEG의 항원성이 mPEG의 항원성 보다 대략 100 배 더 낮다는 것을 나타낸다. 따라서, 메톡실기가 없는 중합체 (예를 들면, 파마PEG)는 제약, 예를 들어 mPEG의 생체콘쥬게이션에 전통적으로 사용되는 중합체와 비교하였을 때, 항원성이 감소하였거나 실질적으로 감소하였다.
상기에서 언급한 바와 같이, 중량에 기초하여, mPEG의 경쟁 잠재력은 이들의 분자량에 반비례한다. 그러나, 메톡실기가 없는 PEG는 이들의 분자량과 독립적으로 mPEG의 경쟁 잠재력의 약 1％만을 가진다. 이러한 결과는 메톡실기가 없는 일관능적으로 반응성인 중합체가 mPEG, 특히 "분지형" mPEG, 예컨대 디-mPEG-리신을 사용하여 제조되는 콘쥬게이트와 비교하여 항원성이 감소하였거나, 실질적으로 감소하였거나 또는 항원성이 없는 생체활성 제제의 중합체 콘쥬게이트를 제조하는데 사용하기에 특히 매우 적합하다는 결론을 지지한다.
실시예 4: 항-mPEG 항체로의 웨스턴 블롯에 의한 PEG화된 단백질 콘쥬게이트의 검출
탄산탈수효소 (EC 4.2.1.1; "CA II")의 모노메톡시PEG 콘쥬게이트를 나트륨 도데실 술페이트의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ("SDS-PAGE") 후에 PEG화된 단백질 콘쥬게이트를 검출하는 항-mPEG 항체의 능력을 시험하기 위한 모델로서 사용하였다. 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 상에서 전기블롯팅하고, 블롯을 토끼 항-mPEG 항체 (1:200으로 희석)와 함께 인큐베이팅시킨 후, 알칼리성 포스파타제에 콘쥬게이팅된 2차 항체 (염소 항-토끼 IgG)와 함께 인큐베이팅시키고, 착색된 침전물을 형성하는 기질에 노출시켰다. 전기영동 겔로부터 막으로 옮겨진 단백질 또는 중합체-단백질 콘쥬게이트의 이 면역 검출방법을 통상적으로 "웨스턴 블롯"으로 지칭한다 (문헌 [Tsang, V. C. W., et al., (1984) Anal Biochem 143:304-307)]. 검출 절차 및 시약은 실시예 1에서의 도트 블롯에 대해 기술한 바와 동일하다. 결과는 도 5a에 나타내었다. 레인 1 및 2는 사이프로® 상표 루비 착색제 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 미국 오레건주 유진 소재, 카탈로그 번호 S-12000)을 사용하여 단백질에 대해 염색하고, 302 nm 조도의 암실에서 오렌지/레드 가시광선 필터 (몰레큘라 프로브즈, 카탈로그 번호 S-6655)를 사용하여 코닥 디지털 카메라로 촬영한 겔을 보여준다. 레인 3 및 4는 동일한 샘플의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 항-mPEG 항체가 모든 PEG화된 종의 위치에서 보여지지만 (레인 3), 비변형 탄산탈수효소의 위치에서는 나타나지 않았다 (레인 4).
도 5b는 코닥 1D 영상 분석 소프트웨어 (Imaging Analysis software) (코닥, 미국 뉴욕주 로체스터 소재)로 얻어지는, 도 5a에 나타나 있는 겔 및 웨스턴 블롯에서 밴드 강도의 정량화를 보여준다. 가로 축은 염색면에 대한 이동 거리를 나타내고, 세로 축은 단백질 염색 또는 항-mPEG 염색의 상대 강도를 나타낸다. 바닥 흔적은 1 내지 8로 넘버링된 피크가 각각 204, 111, 68.8, 51.5, 40.2, 28.9, 20.7 및 14.9 kDa인 겉보기 분자량을 가지는 단백질로 확인되는 시블루 플러스2TM (SeeBlue Plus2TM) 상표 예비-염색된 표준 단백질 (인비트로겐 코포레이션; 카탈로그 번호 LC5625)의 밴드를 보여준다. 바닥에서부터 두번째 흔적은 PEG화된 탄산탈수효소의 항-mPEG 항체 염색이다. 바닥에서부터 세번째 흔적은 탄산탈수효소의 단백질-염색된 밴드를 나타내고, 최상단의 흔적은 탄산탈수효소의 단백질-염색된 mPEG 콘쥬게이트를 나타낸다. 도 5b에서의 상기 피크 번호는 상기 피크에서 콘쥬게이트(들) 중 탄산탈수효소와 커플링된 mPEG 스트랜드의 수를 나타낸다. PEG0은 PEG가 커플링된 탄산탈수효소의 위치가 없다는 것을 나타낸다.
종합하면, 이들 결과는 항-mPEG 항체가 mPEG의 반응성 형태로 제조된 PEG화된 단백질과 용이하게 복합체를 형성할 수 있고, 이에 따라 이들의 감수성이며 선택성인 검출을 가능하게 할 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 콘쥬게이트를 진단, 예방 또는 치료의 목적으로 동물에게 도입하는 경우, 항-mPEG 항체의 유도는 혈류로부터 제제의 제거율의 가속에 기여할 수 있으며, 따라서 이들 콘쥬게이트의 효율을 제한하고, 잠재적으로는 면역 복합체의 형성에 의해 매개되는 악영향을 유도하는 것에 기여할 수 있다.
실시예 5 : 파마PEG-모노니트로페닐 카르보네이트의 합성
PEG 디올로부터 일관능성으로 활성화된 파마PEG를 제조하기 위한 조건은 합성 중 일부 단계에서 PEG의 말단기 중 하나가 상이한 수의 상기 말단기를 함유하는 PEG의 분리를 가능하게 하는 특성을 가져야만 한다는 것이다. 이러한 기는 역상 크로마토그래피 ("RP 크로마토그래피")에 의해 분리될 수 있도록 PEG 또는 활성화된 PEG보다 더욱 소수성이어야 한다. 이와 달리, 이러한 기는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있도록 전하를 띠어야 한다. 이러한 기는 결합하지 않은 PEG가 용해될 수 있는 액체로부터 상분리될 수 있도록 고체상의 일부이어야 한다. 활성화 기가 분리의 기준으로서 사용될 수 있는 경우, 실시예 5에 기술되어 있는 NPC-PEG의 경우에서와 같이, 이어서 활성화 기의 부착만이 합성 반응에 필요하다. 제거 가능한 차단기, 예를 들면 t-부틸 또는 트리페닐메틸 ("트리틸") 기가 분리의 기준을 제공하는 경우, 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이 차단기는 활성화되었거나 활성화될 수 있는 기의 부착 전 또는 후에 첨가할 수 있다. 이론적으로, 바람직한 수의 차단기를 함유하는 PEG를 분리하는데 사용되는 정제 단계는 차단기가 부착된 이후에 언제든지 수행할 수 있다. 실제로, 중합체 주쇄와 차단기 사이 및 중합체 주쇄와 활성화된 (또는 활성화될 수 있는) 기 사이에서의 결합의 상대적인 불안정성이 상기 단계의 최적 순서를 지시할 수 있다.
디히드록시PEG로부터의 일관능성으로 활성화된 NPC-PEG의 합성을 Ph는 페닐기를 나타내고, n은 중합체 내에서의 에틸렌 옥시드 단위 수(10-kDa PEG 경우에는 약 227)를 나타내는 하기 도표에 요약하였다.
여러 공급원으로부터의 PEG 디올 모두를 10 kDa의 분자량을 가지는 것으로 표지하고, 순도 및 균질성에 대해 시험하였다. 이들 중 약 10 kDa의 분자량을 가지는 PEG를 90 ％ 이상 함유하는 것은 없었다. 따라서, 10-kDa PEG 디올 (플루카 케미칼 코포레이션(Fluka Chemical Corp.), 미국 위스콘신주 밀와우키 소재, 카탈로그 번호 81280)을 앰버크롬(Amberchrom) MD-P CG-300SD 컬럼 (7.5 mm x 15 cm, 토소하스(TosoHaas), 미국 펜실베니아주 몽고메리빌 소재) 상의 역상 크로마토그래피에 의해 저분자량의 오염체로부터 분획하였다. PEG를 5％ (v/v)의 수중 아세토니트릴 용액으로서 컬럼 상에 로딩하고, 5％ 내지 35％의 수중 아세토니트릴의 선형 구배로 용리하였다. 분획을 150 mM NaCl을 함유하는 20 mM 나트륨 아세테이트 중에서 pH 4.6인 슈퍼덱스® 200 상표 HR10/30 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크사) 상의 크기별-배제 크로마토그래피로 분석하였다. PEG로 인해 98％ 초과의 굴절 지수 ("RI") 신호가 약 10-kDa PEG에 상응하는 피크에 존재하는 앰버크롬 컬럼으로부터의 분획을 풀링하고 냉동건조시켰다.
정제되고 건조된 PEG 디올 (530 mg)을 p-니트로페닐 클로로포르메이트 (알드리치, 카탈로그 번호 16,021-0) 61.4 mg과 합하고, 스크류-캡핑된 13 x 100 mm 유리 튜브에서 아세토니트릴 4 mL 중에 용해시켜 약 12.5 mM PEG 디올 및 75 mM p-니트로페닐 클로로포르메이트의 최종 농도를 수득하였다. 피리딘 (0.25 g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 36℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 반응물을 빙냉된 0.1 M 염산 33 mL과 함께 혼합물을 교반시켜 급냉시켰다. 이 용액을 여과하여 p-니트로페놀의 소량의 침천물을 제거하고, 냉장하면서 하루 동안 물 1 L를 4번 교체하여 투석하였다. 투석시킨 용액에 아세토니트릴을 첨가하여 농도가 5％ (v/v)가 되도록 하였다. 정제된 10-kDa PEG 디올 약 265 mg을 함유하는 단계 1에서 생성된 혼합물의 반을 앰버크롬 컬럼 상에 로딩하고, 결합한 PEG 종을 5％ 내지 65％의 수중 아세토니트릴 구배로 용리시켰다. 분획을 굴절 지수 및 280 nm에서의 흡수성 모두를 모니터링하는 상기 크기별-배제 크로마토그래피로 분석하였다. 280 nm에서 흡수성이 없는 디히드록시PEG를 먼저 용리한 다음, 단일 p-니트로페닐기로 유도된 PEG ("모노-NPC PEG")를, 이어서 굴절 지수에 대한 280 nm에서의 흡수성의 비율이 모노-NPC-PEG의 2배인 디-NPC PEG를 용리하였다. 모노-NPC PEG 용리 범위의 중간에서의 두 분획을 합하여 약 42％의 수율에 상응하는 모노-NPC PEG 약 110 mg을 수득하였다. 단계 2의 생성물을 저장을 위해 건조기 및/또는 냉동기에서 건조시키거나 아민-함유된 생체활성 화합물 또는 분지형 PEG, 예를 들면, 알콕실기를 함유하지 않은 디PEG-리신의 제조를 위한 두 개 이상의 아미노기를 함유하는 링커와 커플링하는데 직접 사용될 수 있다.
실시예 6 : PEG 디올로부터의 파마PEG-모노알데히드의 합성
파마PEG의 모노프로피온알데히드 유도체의 합성을 KOtBu가 칼륨 t-부톡시드를 나타내고, DEP가 3,3-디에톡시프로필기를 나타내는 하기 도표에 요약하였다.
바람직하게는, 단계 1에서 출발 물질로서 사용되는 디히드록시PEG는 그의 명목상 분자량의 10％ 내에 존재하는 분자량을 가질 것이며, 1.05 미만의 다분산도를 가질 것이다. 다분산도는 중량-평균 분자량("Mw") 대 수-평균 분자량("Mn")의 비율로 정의한다. 이들 매개변수 Mw 및 Mn 모두는 표준으로 정밀하게 공지된 분자량의 PEG 및 EZ크롬 엘리트 클라이언트/서버 소프트웨어, 버젼 2.8.3 (EZChrom Elite Client/Server Software, Version 2.8.3) (사이언티픽 소프트웨어 인크.(Scientific Software, Inc.), 미국 캘리포니아주 플리산톤 소재)과 같은 겔 투과성 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하는 크기별-배제 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 이와 달리, PEG의 다분산도를 소프트웨어, 예컨대 보이저 소프트웨어(Voyager Software) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터시 소재)를 사용하는 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 비행시간 ("MALDI-TOF") 질량 분광법 (문헌 [Marie, A., et al., (2000) Anal Chem 72: 5106-5114])으로 측정할 수 있다. 공유결합적으로 연결된 PEG를 함유하는 제약 생성물의 제조를 위해, PEG 출발 물질은 MALDI-TOF 질량 분광법으로 측정한 경우, 바람직하게는 다분산도가 1.02 미만, 더욱 바람직하게는 1.01 미만일 것이다. 출발 물질은 알드리치 케미칼 코.(Aldrich Chemical Co.), 플루카 케미칼즈 (스위스 부쉐 소재), 쉬어워터 코포레이션 또는 시그마 케미칼 컴파니와, 그 중에서도 특히 당업자에게 공지된 그밖의 공급원들로부터 입수할 수 있다. 만약 출발 물질이 충분히 동질성이 아닌 경우, 실시예 5에 기재된 방법의 개조에 의해 이를 분획시킬 수 있다.
PEG 디올의 모노프로피온알데히드 및 디프로피온알데히드 디에틸 아세탈 유도체의 혼합물을 Harris, J.M. 등에 의해 문헌 [(1984) J Polym Sci 22:341-352]에서 아세트알데히드 디에틸 아세탈에 대해 기재된 바와 같은 3-클로로-프로피온알데히드 디에틸 아세탈 (알드리치 카탈로그 번호 C6,900-4)을 사용하여 합성할 수 있다 (단계 1 참고). 유사한 방법이 또한 Bentley, M.D. 등에 의해 문헌[(1998) J Pharm Sci 87:1446-1449]에 기술되었고, 이후에 Bentley, M.D. 등에 의해 특허를 받았다 (미국 특허 제5,990,237호).
피리딘 중에 용해된 충분항 양의 트리페닐메틸 클로라이드 (클로로트리페닐메탄 또는 트리틸 클로라이드, Ph3CCl, 예를 들어 알드리치 카탈로그 번호 T8,380-1)를 단계 1에서 제조한 혼합물에 첨가함으로써, 상기 반응 조건하에 Ph3CCl은 프로피온알데히드 디에틸 아세탈 (Kocienski, P.J., 상기 문헌)과 커플링되지 않은 PEG 출발 물질의 모든 히드록실기와 반응될 것이다. 단계 2를 완료하기 위해, 혼합물을 PEG에 대해 불량한 용매 (예를 들면, 에테르)를 첨가하거나 용매를 증발시키거나, 또는 당분야에 공지된 그밖의 방법으로 침전시킨 후 회수한다.
단계 2로부터 회수한 혼합물을 5％ (v/v)의 아세토니트릴의 첨가 전 또는 후에 물에 용해시키고, 용액을 당분야에 공지된 원리로부터 PEG의 트리틸 유도체와 결합할 것으로 예상되는 역상 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼은 실리카 또는 중합체성 기질의 알킬 또는 아릴 유도체를 함유하거나 또는 실시예 5에서와 같이 스티렌-기재 중합체 (예를 들어, 앰버크롬 MD-P CG-300)일 수 있다. PEG 디올 및 트리틸 유도체를 실시예 5에서와 같이 유기 용매의 증가하는 구배로 역상 형식으로 용리하거나 또는 적어도 목적하는 종의 일부가 용리될 때까지 컬럼에 계속 로딩함으로써 샘플을 치환하는 형식 (Agner, E., et al., PCT 공보 WO 00/23798 A1)으로 또는 치환 형식 (Cramer, S.M., 미국 특허 제6,239,262호) 또는 이들 형식의 조합으로 용리할 수 있다. 일반적으로는 어떠한 트리틸기도 없는 PEG 유도체가 처음으로 용리될 것이고, 모노트리틸 유도체가 두번째로 용리되며, 디트리틸 PEG가 세번째로 용리될 것이다. 목적하는 생성물의 최적 수율은 이들 세가지 종의 비율이 1:2:1일 때 얻어진다. 목적하는 모노트리틸 PEG 생성물의 수율 및/또는 순도를 개선하기 위해, 컬럼 유출물의 일부를 크로마토그래피 분야에 잘 공지된 반복 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 단계 3을 완료하기 위해, 적어도 모노트리틸 유도체의 일부를 함유하는 용리물의 일부를 당분야에 공지된 방법으로 분리하고, 농축시키고, 건조하였다.
다소 산성인 조건하 저온에서 PEG의 원위 말단에서 트리틸 연결부의 대부분을 보호하면서 아세탈을 알데히드로 전환시킬 수 있다. 본 실시예의 일부 적용에서, 트리틸 기를 제거하기 전에 모노트리틸 PEG 모노알데히드를 표적 잔기와 반응시키는 것이 유리할 수 있다. 상기 실시양태는 본 발명에 의해 예상되며, 본 발명에 포함된다.
실시예 7: 메톡시PEG와 비교하여 히드록시PEG로 제조된 콘쥬게이트의 감소한 면역원성 입증
실시예 1에서와 같이 요산분해효소의 mPEG 콘쥬게이트로의 면역화에 대해 기술한 바와 같이 진행하면서, 3 마리의 토끼 군을 요산분해효소 서브유닛 당 평균 약 2 스트랜드의 10-kDa PEG를 함유하는 각각의 돼지 요산분해효소의 동일한 제제의 mPEG 콘쥬게이트 또는 히드록시PEG 콘쥬게이트로 면역화시켰다. 콘쥬게이트의 각각의 제조물에 부착된 중합체 스트랜드의 평균 수를 크기별-배제 HPLC 분석 및 공동 소유의 공동-계류중인 미국 특허 출원 10/183,607 (2002년 6월 28일자로 출원, 그의 명세는 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 방법을 사용하여, 겔이 실시예 4에서와 같은 단백질 및 PEG 모두에 대해 염색된 SDS-PAGE로 확인하였다. 각각의 토끼에 완전 프로인트 항원보강제 중에서 PEG-요산분해효소 제조물을 1회 주사하고, 불완전 프로인트 항원보강제 중에서 1 내지 4주의 간격으로 5회 주입하였다. 불완전 프로인트 항원보강제 중에서 4회 및 5회 주입한 후 2주에 혈액을 채취하고, 혈청을 제조하였다. 실시예 2에서와 같이, ELISA 분석에 의해 시험되는 이들 토끼로부터의 혈청을 연속 4-배 희석 하자, 히드록시PEG로 제조된 콘쥬게이트에 의해 유도된 항-PEG 항체의 농도가 mPEG로 제조된 콘쥬게이트에 의해 유도된 항-PEG 항체 농도의 5％ 미만인 것으로 밝혀졌다 (도 6a 및 6b 참고). 반면에, 두 가지 형태의 PEG로 제조된 콘쥬게이트에 의한 항-요산분해효소 항체의 유도는 두 마리의 토끼 군에서 유사하였다. 이들 토끼로부터 사전면역화된 혈청의 어떠한 것도 검출가능한 항-PEG 항체를 함유하고 있지 않았다.
논의 및 결론
메톡실기로 종결된 PEG (mPEG) 및 히드록실기로 종결된 PEG (비스-히드록시PEG 또는 PEG 디올)가 생체콘쥬게이션에 사용하는 데 있어서 등가라는 것 또는 보다 빈번히 mPEG 및 다른 저급 알콕실 PEG가 PEG 디올보다 우수하다는 것이 당분야에 보고된 바 있다. 게다가, 이중-활성화된 디올은 낮은 면역원성 및 항원성을 지니는 길게-작용하는 가용성 생체콘쥬게이트를 제조하는데 부적합할 수 있는 가교제로서 작용할 수 있다. 놀랍게도, 본 연구의 결과는 mPEG가 충분히 항원성이며, mPEG의 메톡실기에 대해 형성된 항체가 mPEG를 사용하여 제조한 PEG화된 단백질 콘쥬게이트에 결합한다는 것을 나타낸다. 따라서, 예기치 않게 사전 보고와는 반대로, mPEG는 히드록시PEG와 동등하지 않으며, mPEG는 증가한 생체이용률, 혈액 순환에서의 안정성 및 최소의 면역원성을 갖게 하는 생체활성 성분 (예컨대, 단백질)의 중합체 콘쥬게이트를 제조하는데 바람직하지 않다.
본 결과를 기초로, 단백질 콘쥬게이트의 합성에서 메톡실기 또는 또다른 알콕실기를 함유하지 않는 일관능성으로 활성화된 PEG를 사용하는 것이 콘쥬게이트의 면역반응성을 감소시킨다는 것이 명백하다. 생성되는 콘쥬게이트는 항원성, 즉 동일한 단백질의 mPEG 콘쥬게이트에 대해 발생된 항체와 상호작용하는 능력이 감소되고, 면역원성, 즉 PEG 성분에 대해 면역 반응을 일으키는 능력이 감소된 것이 입증되었다. 추론해 볼 때, 두 개 이상의 메톡실기를 함유하는 분지형 PEG로 제조한 콘쥬게이트가 알콕실기가 없는 분지형 PEG로부터 제조된 콘쥬게이트보다 면역원성이 큰 것으로 예상된다.
결론적으로, 본 발명의 발견을 기초하여 볼 때, PEG-리포좀의 합성에 일관능성으로 활성화된 mPEG보다 메톡실기 또는 또다른 알콕실기를 함유하지 않는 일관능성으로 활성화된 PEG를 사용하는 것이 생성된 PEG-리포좀 상에 혈중 보충물의 활성을 유발하는 경향을 감소시키고 급성 호흡 곤란 또는 아나필락시스 및 거짓 알레르기 반응을 유도하는 경향을 감소시키는 등의 면역반응성을 감소시킨다고 예상된다.
본 발명은 그의 특정 실시양태에 관련하여 기재되었다. 본 발명의 방법은 다른 유형의 단백질, 다른 생체활성 제제 및 다른 콘쥬게이션 시약에 유사하게 적용될 수 있다. 따라서 본 발명의 범위는 상기한 실시양태에 한정되는 것이 아니라 청구하는 범위 및/또는 그의 등가 범위에 의해서만 한정된다. 당업자는 다른 실시양태가 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 실시될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 발명의 일부로 고려된다.
본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 본 발명과 관계된 당업자의 기술 수준을 나타내며, 이들은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 또는 개별적으로 참고문헌으로 포함된 것으로 명시한 경우, 그의 본문이 참고문헌으로 포함된다.

Claims (100)

  1. 폴리알킬렌 글리콜이 어떤 말단에도 알콕실기를 포함하지 않고 폴리알킬렌 글리콜의 단일 부위에서 단일 생체활성 성분에 부착된, 하나 이상의 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜에 공유 부착된 하나 이상의 생체활성 성분을 포함하는 콘쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 콘쥬게이트가 생체활성 성분(들)의 동일한 부위 또는 부위들에서 하나 이상의 말단 알콕실기를 함유하는 동일한 크기 및 선형 또는 분지형 구조의 동일한 수의 폴리알킬렌 글리콜에 결합된 동일한 생체활성 성분(들)을 포함하는 콘쥬게이트와 비교하여 항원성이 감소하였거나 실질적으로 감소한 콘쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, 선형 또는 분지형 폴리알킬렌 글리콜이 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")인 콘쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜의 생체활성 성분(들)에의 부착이 선형 디히드록시PEG ("PEG 디올"), 히드록시PEG-모노아세탈 및 히드록시PEG-일산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜의 반응성 유도체를 사용하여 수행되는 콘쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜의 생체활성 성분(들)에의 부착이 모노알데히드, 일산의 모노에스테르, 모노아민, 모노티올, 모노디술피드, 모노브로모페닐 카르보네이트, 모노클로로페닐 카르보네이트, 모노플루오로페닐 카르보네이트, 모노니트로페닐 카르보네이트, 모노카르보닐이미다졸, 모노히드라지드, 모노카르바제이트, 모노아이오도아세트아미드, 모노말레이미드, 모노오르토피리딜 디술피드, 모노옥심, 모노페닐 글리옥살, 모노티아졸리딘-2-티온, 모노티오에스테르, 모노트리아진 및 모노비닐술폰으로 이루어진 군 중에서 선택되는 히드록시PEG의 반응성 유도체를 사용하여 수행되는 콘쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 1,000 달톤 (1 kDa) 내지 약 100,000 달톤 (100 kDa)의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  8. 제7항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 2 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 각각 약 2 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량의 2 분지를 가지는 콘쥬게이트.
  10. 제9항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 각각 약 5 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량의 2 분지를 가지는 콘쥬게이트.
  11. 제8항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 10 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  12. 제11항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 12 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  13. 제8항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 18 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  14. 제13항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 18 kDa 내지 약 22 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 20 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  16. 제13항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 27 kDa 내지 약 33 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  17. 제1항에 있어서, 약 1 내지 약 100 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  18. 제17항에 있어서, 약 1 내지 약 5 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  19. 제18항에 있어서, 약 1 내지 약 2 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  20. 제17항에 있어서, 약 5 내지 약 100 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  21. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 모노히드록시PEG-산 및 디히드록시PEG-산, 예컨대 디히드록시PEG-리신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  22. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이, 선형이라면, 생체활성 성분(들)과 부착되지 않은 말단 ("원위 말단")에 히드록실기를 가지거나, 분지형라면, 모든 원위 말단에 히드록실기를 가지는 콘쥬게이트.
  23. 제5항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 선형 디히드록시PEG의 반응성 유도체인 콘쥬게이트.
  24. 제5항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 히드록시PEG-모노카르복실산의 반응성 유도체인 콘쥬게이트.
  25. 제1항에 있어서, 생체활성 성분이 펩티드, 단백질, 당단백질, 유기 화합물, 아민-함유 화합물, 카르복실-함유 화합물, 히드록실-함유 화합물 및 티올-함유 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  26. 제25항에 있어서, 생체활성 성분이 펩티드, 단백질 및 당단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  27. 제26항에 있어서, 펩티드 또는 단백질 또는 당단백질이 효소, 혈청 단백질, 혈청 당단백질, 혈구 단백질, 색소 단백질, 헤모글로빈, 바이러스 단백질, 펩티드 호르몬, 단백질 호르몬, 당단백질 호르몬, 시상하부 분비 인자, 시토킨, 성장 인자로 이루어진 군 및 상기 군 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  28. 제27항에 있어서, 혈청 단백질이 알부민, 면역글로불린, 혈액 응고 인자로 이루어진 군 및 상기 혈청 단백질 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  29. 제27항에 있어서, 펩티드 호르몬 또는 단백질 호르몬 또는 당단백질 호르몬이 항이뇨 호르몬, 융모생식샘자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 난포-자극 호르몬, 인슐린, 프로락틴, 소마토메딘, 성장 호르몬, 갑상샘-자극 호르몬, 태반 락토겐으로 이루어진 군 및 상기 호르몬 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  30. 제27항에 있어서, 성장 인자가 집락-자극 인자, 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 간세포 성장 인자, 향신경 인자, 섬모 향신경 인자, 뇌-유래 향신경 인자, 아교세포-유래 향신경 인자 또는 뼈 형태발생 펩티드로 이루어진 군 및 상기 성장 인자 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  31. 제27항에 있어서, 시토킨이 적혈구생성소, 림포카인, 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 백혈병 억제 인자 및 혈소판형성인자로 이루어진 군 및 상기 시토킨 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  32. 제27항에 있어서, 효소가 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소 및 리가제로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  33. 제32항에 있어서, 산화환원효소가 요산분해효소인 콘쥬게이트.
  34. 제32항에 있어서, 단백질분해 효소가 플라스미노젠 활성제인 콘쥬게이트.
  35. 제26항에 있어서, 펩티드, 단백질 또는 당단백질이 알레르기항원인 콘쥬게이트.
  36. 제1항에 있어서, 생체활성 화합물이 탁산 또는 이의 유도체인 콘쥬게이트.
  37. 제1항에 있어서, 생체활성 화합물이 항생제 또는 이의 유도체인 콘쥬게이트.
  38. 제1항의 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. 제1항의 컨쥬게이트 또는 제38항의 조성물 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 신체 장애를 예방하거나, 진단하거나 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 동물이 포유류인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 신체 장애가 암, 관절염, 감염병, 유전적 장애, 신경계 장애, 대사 장애, 효소 장애, 심장혈관병 및 고혈압으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 암이 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 고환암, 폐암, 백혈병, 림프종, 결장암, 위장암, 췌장암, 방광암, 신장암, 골암, 신경계 암, 두부암 및 경부암, 피부암 및 기타 암종, 육종, 샘종 및 골수종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 감염병이 세균병, 진균병, 바이러스병 및 기생충병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 바이러스병이 HIV/AIDS 및 간염을 포함하는 군 중에서 선택되는 방법.
  46. 제42항에 있어서, 유전적 장애가 근위축성 측삭 경화증, 낭성 섬유증, 고셔병, 혈우병 및 기타 유전 혈액 질환, 폼페병 및 중증 복합 면역결핍증 ("SCID")으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  47. 제42항에 있어서, 신경계 장애가 알츠하이머병 및 다발성 경화증을 포함하는 군 중에서 선택되는 방법.
  48. 제39항에 있어서, 투여가 비경구 투여인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 비경구 투여가 정맥내 투여인 방법.
  50. 제39항에 있어서, 투여가 경구 투여인 방법.
  51. 제39항에 있어서, 투여가 국소 투여인 방법.
  52. 제39항에 있어서, 투여가 흡입에 의한 투여인 방법.
  53. 제39항에 있어서, 투여가 직장 투여인 방법.
  54. (a) 안정적으로 결합된 알콕실기인 어떤 말단 기도 함유하지 않는 폴리알킬렌 글리콜을 수득하고;
    (b) 임의로, 단계 (a)의 폴리알킬렌 글리콜의 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜로의 전환 전에, 하나 이상의 제거 가능한 차단기, 예컨대 t-부톡실기(들), 아릴옥실기(들) 또는 트리페닐메틸기(들)("트리틸기(들)")의 첨가에 의해 말단기 중 하나를 제외한 전체를 보호하며;
    (c) 폴리알킬렌 글리콜이 제거가능한 차단기 또는 차단기들을 함유하지 않는 말단에서 단일 유도체화기로 유도체화되도록 하는 조건하에서 폴리알킬렌 글리콜을 유도체화 화합물 또는 화합물들과 반응시킴으로써 폴리알킬렌 글리콜의 단일관능성 활성화된 유도체를 제조하며;
    (d) 차단기가 말단기(들)을 보호하기 위해 상기 단계 (b)에 설명되어 있는 바와 같이 첨가되었다면, 상기의 단계 (c)에 설명되어 있는 바와 같이 부착된 활성기를 제거하지 않고, 하나 이상의 단계에서 차단기를 제거하여, 원위 말단 또는 말단들이 히드록실기인 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜을 제조한 다음;
    (e) 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜이 생체활성 성분에 공유 결합하기에 호적한 조건하에서, 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜을 하나 이상의 생체활성 성분과 접촉시키거나,
    (f) 이와 달리, 단계 (d)를 수행하기 전에 단계 (e)를 수행하는 단계를 포함하는, 생체활성 화합물과 일 말단에서만 활성화된 폴리알킬렌 글리콜 ("일활성화된 폴리알킬렌 글리콜") 간의 콘쥬게이트의 제조방법.
  55. 제54항에 있어서, 유도체화기가 알데히드 및 카르복실기로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 차단기가 트리틸기, 아릴옥실기 및 t-부톡실기로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  57. (a) PEG-알데히드 상의 모든 히드록실기를 트리틸 유도체로 전환시키고;
    (b) 역상 크로마토그래피에 의해 PEG-디알데히드 및 임의의 디트리틸PEG로부터 모노트리틸PEG-모노알데히드를 분리한 다음;
    (c) 산성 매질 중에서 트리틸기의 가수분해 제거에 의해 모노트리틸PEG-모노알데히드를 모노히드록시PEG-모노알데히드로 전환시키는 단계를 포함하는, 상응하는 PEG-디알데히드로부터 선형 모노히드록시PEG-모노알데히드를 분리하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 알데히드 또는 디알데히드가 아세탈 유도체 형태인 방법.
  59. 제54항의 방법에 의해 제조되는 콘쥬게이트.
  60. 제59항에 있어서, 생체활성 성분의 동일한 부위 또는 부위들에서 폴리알킬렌 클리콜이 선형이라면, 원위 말단에 알콕실기를 함유하거나, 폴리알킬렌 글리콜이 분지형이라면, 원위 말단에 둘 이상의 알콕실기를 함유하는 동일한 크기 및 선형 또는 분지형 구조의 동일한 분자 수의 폴리알킬렌 글리콜에 결합된 동일한 생체활성 성분을 포함하는 콘쥬게이트와 비교하여 항원성이 감소하였거나 실질적으로 감소한 콘쥬게이트.
  61. 제59항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  62. 제59항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 성분이 선형 폴리(에틸렌 글리콜) 및 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  63. 제59항에 있어서, 각 폴리알킬렌 글리콜이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  64. 제63항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 2 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  65. 제64항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 각각 약 2 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량의 2 분지를 가지는 콘쥬게이트.
  66. 제65항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 각각 약 5 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량의 2 분지를 가지는 콘쥬게이트.
  67. 제64항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 10 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  68. 제67항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 12 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  69. 제64항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 18 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  70. 제69항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 18 kDa 내지 약 22 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  71. 제70항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 20 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  72. 제69항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜이 약 27 kDa 내지 약 33 kDa의 분자량을 가지는 콘쥬게이트.
  73. 제59항에 있어서, 1 내지 약 100 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  74. 제73항에 있어서, 약 1 내지 약 5 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  75. 제74항에 있어서, 약 1 또는 약 2 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  76. 제73항에 있어서, 약 5 내지 약 100 스트랜드의 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 콘쥬게이트.
  77. 제59항에 있어서, 콘쥬게이트의 합성에 사용되는 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜이 히드록시PEG-모노알데히드 및 히드록시PEG-일산의 반응성 에스테르로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  78. 제59항에 있어서, 콘쥬게이트의 합성에 사용되는 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜이, 선형이라면, 원위 말단에 히드록실기를 가지거나, 분지형이라면, 모든 원위 말단에 히드록실기를 가지는 콘쥬게이트.
  79. 제59항에 있어서, 합성에 사용되는 단일관능성 활성화된 폴리알킬렌 글리콜이 선형 디히드록시PEG로부터 유래되는 콘쥬게이트.
  80. 제59항에 있어서, 생체활성 성분이 펩티드, 단백질, 당단백질, 유기 화합물, 아민-함유 화합물, 카르복실-함유 화합물, 히드록실-함유 화합물 및 티올-함유 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  81. 제80항에 있어서, 생체활성 성분이 펩티드, 단백질 및 당단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  82. 제81항에 있어서, 펩티드 또는 단백질 또는 당단백질이 효소, 혈청 단백질, 혈청 당단백질, 혈구 단백질, 색소 단백질, 헤모글로빈, 바이러스 단백질, 펩티드 호르몬, 단백질 호르몬, 당단백질 호르몬, 시상하부 분비 인자, 시토킨, 성장 인자로 이루어진 군 및 상기 군 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  83. 제82항에 있어서, 혈청 단백질이 알부민, 면역글로불린, 혈액-응고 인자로 이루어진 군 및 상기 혈청 단백질 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  84. 제82항에 있어서, 펩티드 호르몬 또는 단백질 호르몬 또는 당단백질 호르몬이 항이뇨 호르몬, 융모생식샘자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 난포-자극 호르몬, 인슐린, 프로락틴, 소마토메딘, 성장 호르몬, 갑상샘-자극 호르몬, 태반 락토겐으로 이루어진 군 및 상기 호르몬 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  85. 제82항에 있어서, 성장 인자가 집락-자극 인자, 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 간세포 성장 인자, 향신경 인자, 섬모 향신경 인자, 뇌-유래 향신경 인자, 아교세포-유래 향신경 인자 또는 뼈 형태발생 펩티드로 이루어진 군 및 상기 성장 인자 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  86. 제82항에 있어서, 시토킨이 적혈구생성소, 림포카인, 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 백혈병 억제 인자 및 혈소판형성인자로 이루어진 군 및, 상기 시토킨 중 어느 하나를 모방하거나 어느 하나의 길항제로서 기능하는 펩티드, 단백질 및 당단백질 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  87. 제82항에 있어서, 효소가 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소 및 리가제로 이루어진 군 중에서 선택되는 콘쥬게이트.
  88. 제87항에 있어서, 산화환원효소가 요산분해효소인 콘쥬게이트.
  89. 제87항에 있어서, 단백질분해 효소가 플라스미노젠 활성제인 콘쥬게이트.
  90. 제81항에 있어서, 펩티드, 단백질 또는 당단백질이 알레르기항원인 콘쥬게이트.
  91. 제59항에 있어서, 생체활성 화합물이 탁산 또는 이의 유도체인 콘쥬게이트.
  92. 제59항에 있어서, 생체활성 화합물이 항생제 또는 이의 유도체인 콘쥬게이트.
  93. 제59항의 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  94. 제1항의 콘쥬게이트를 포함하는 키트.
  95. 제38항의 약학 조성물을 포함하는 키트.
  96. 제59항의 콘쥬게이트를 포함하는 키트.
  97. PEG 성분이 어떤 말단에도 알콕실기를 포함하지 않고 PEG 각 분자가 지질 분자 및 상기 PEG 분자의 단일 부위에서 단일 지질 분자에 부착되는 PEG-리포솜 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 부착 부위가 포스파티딜 에탄올아민의 아미노기인 조성물.
  99. 제97항에 있어서, 부착 부위가 디아실글리세롤의 히드록실기인 조성물.
  100. 제97항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 부위에서 지질에 또는 하나 이상의 지질 분자에 부착된 하나 이상의 알콕시PEG 또는 PEG를 포함하는 PEG-리포솜 조성물과 비교하여 면역반응성이 감소하였거나 실질적으로 감소한 조성물.
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Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20010003580A1 (en) 1998-01-14 2001-06-14 Poh K. Hui Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
DK1531791T3 (da) 2002-06-07 2010-11-01 Dyax Corp Forebyggelse og begrænsning af iskæmi
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
WO2004060299A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
CA2519092C (en) 2003-03-14 2014-08-05 Neose Technologies, Inc. Branched water-soluble polymers and their conjugates
PL1615945T3 (pl) 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
MXPA05012313A (es) 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP1663281B1 (en) * 2003-08-29 2013-12-25 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
KR101439880B1 (ko) 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
NZ556436A (en) 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7858080B2 (en) * 2005-05-20 2010-12-28 Agency For Science, Technology And Research Aldehyde conjugated flavonoid preparations
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US7816484B2 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for making polyethylene glycol carbonates
WO2007102562A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Keio University 新規抗血栓薬
EP2018437A2 (en) * 2006-05-02 2009-01-28 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
ES2516694T3 (es) 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
BRPI0809670A8 (pt) 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA2696208A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
CN103497246B (zh) 2008-02-27 2016-08-10 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
WO2010080833A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2597954T3 (es) 2009-07-27 2017-01-24 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de la coagulación sanguínea
KR101912335B1 (ko) 2009-07-27 2018-10-26 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
NZ623810A (en) 2009-07-27 2015-10-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
RS57870B1 (sr) 2010-01-06 2018-12-31 Dyax Corp Proteini koji vezuju kalikrein plazme
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
CA3065178C (en) 2010-12-13 2022-02-01 Quiapeg Pharmaceuticals Ab Functionalized polymers
BR112013015898A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-26 Baxter International Inc. derivado de ácido graxo solúvel em água, e, métodos para preparar um derivado de ácido graxo e uma proteína terapêutica conjugada.
KR102107695B1 (ko) 2011-01-06 2020-05-07 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
JP5949037B2 (ja) 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
EP3628332A1 (en) 2012-06-12 2020-04-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Conjugates of biologically active molecules to functionalized polymers
RU2677796C9 (ru) * 2013-03-05 2019-03-15 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом
BR112016022318A2 (pt) 2014-03-27 2017-10-31 Dyax Corp método, composição farmacêutica para uso no tratamento de doenças de retina e uso de um anticorpo
JP2017516869A (ja) * 2014-06-04 2017-06-22 ジム バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド 皮膚の質を改善するための組成物及び方法
EA201791437A1 (ru) 2014-12-31 2017-12-29 Лантеус Медикал Имэджинг, Инк. Композиции микросфер c инкапсулированным в липиде газом и соответствующие способы
BR112018011622A2 (pt) 2015-12-11 2018-11-27 Dyax Corp método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae
TWI832081B (zh) 2016-05-04 2024-02-11 美商藍瑟斯醫學影像公司 用於形成充氣微球體及成像個體之方法、震盪裝置及電腦可讀軟體
US9789210B1 (en) 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
EP3592393B1 (en) 2017-03-10 2021-12-01 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
JP2021535920A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 キアペグ ファーマシューティカルズ アクチエボラグ 放出可能なｇｌｐ−１コンジュゲート
CN110376369B (zh) * 2019-07-30 2022-02-15 重庆派金生物科技有限公司 一种抗聚乙二醇抗体的抗原区免疫原性分析方法
EP4052726A4 (en) * 2019-10-29 2023-12-20 National University Corporation Kumamoto University CD4 MIMETIC COMPOUND WITH ANTI-HIV ACTIVITY
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
CN114392237B (zh) * 2021-12-28 2024-02-02 上海允英生物医药科技有限公司 一种冻干病毒制剂及其制备方法

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2433883C2 (de) * 1973-07-20 1986-03-27 Research Corp., New York, N.Y. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
US4399282A (en) * 1979-07-10 1983-08-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Camptothecin derivatives
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4434228A (en) * 1982-04-20 1984-02-28 Genex Corporation Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
IE64284B1 (en) 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
US4943579A (en) * 1987-10-06 1990-07-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Water soluble prodrugs of camptothecin
US5004758A (en) * 1987-12-01 1991-04-02 Smithkline Beecham Corporation Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells
JP2958019B2 (ja) * 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5364612A (en) * 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6326353B1 (en) * 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
WO1994027498A1 (en) * 1993-05-20 1994-12-08 The Regents Of The University Of California Macromolecular contrast media for mr imaging
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
WO1995000162A1 (en) * 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5824701A (en) * 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
US5622986A (en) * 1993-10-20 1997-04-22 Enzon, Inc. 2'-and/or 7-substituted taxanes
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5728560A (en) * 1996-06-14 1998-03-17 Enzon, Inc. Method of treating CD4+ T cell lymphopenia in immuno-compromised patients
US5804183A (en) * 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
EP1017794A1 (en) * 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
EP0981548A4 (en) * 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6239262B1 (en) * 1998-01-07 2001-05-29 Rensselaer Polytechnic Institute Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems
US5880225A (en) * 1998-02-18 1999-03-09 Arco Chemical Technology, L.P. Process for making polyetherester resins having high aromatic diester
JP5183836B2 (ja) 1998-08-06 2013-04-17 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
EP2158923B1 (en) 1998-08-06 2013-02-27 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CN1330675A (zh) 1998-08-28 2002-01-09 格莱风科学公司 精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物
AU762616B2 (en) * 1998-10-16 2003-07-03 Biogen Ma Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses
GB9822963D0 (en) 1998-10-20 1998-12-16 Agner Erik Improvements in or relating to chromatography
US6596849B1 (en) * 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
MXPA02003540A (es) 1999-10-08 2003-09-12 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de poli(etilenglicol) heterobifuncionales y los metodos para su preparacion.
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
WO2002080207A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Arizona State University Micro-machined radio frequency switches and method of operating the same
DK1421175T3 (da) * 2001-06-28 2009-03-23 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabiliserede proteinaser
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
EP1498420B1 (en) * 2002-03-29 2017-02-01 Nof Corporation Phospholipid derivative
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

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Publication number Publication date
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BRPI0314831B8 (pt) 2021-05-25
CA2500389C (en) 2015-03-10
CA2836959C (en) 2017-06-06
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CA2500389A1 (en) 2004-04-15
AU2003275176A1 (en) 2004-04-23
JP2006510601A (ja) 2006-03-30

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