DK175739B1 - Saponinadjuvans - Google Patents

Description

DK 175739 B1

Den foreliggende opfindelse angår immunadjuvanser, fremgangsmåder til fremstilling | deraf og anvendelsen deraf som immunadjuvanser og vacciner.

1 US-A-4.335.113 (Combier et al) henvises til en triterpen-saponin hidrørende fra cau-5 lophyllogenin.

JP-A-54-132218 og JP-A-61-7286 er blevet nævnt som modhold mod denne ansøgning, og det samme er T. Nagasawa et al, Chem. Pharm. Bull. 28(7): 2059-2064 (1980). Sidstnævnte skrift henviser til hovedkomponenterne af ginseng-saponiner.

10 J. Zhou et al, Chem. Pharm. Bull. 29(): 2844-2850 (1981) henviser til isoleringen af dammeran-saponiner fra rødder af Panax nologinseng.

Kartnig et al, Plante. Med. 23(3): 269-271 (1973) vedrører isoleringen af tre saponin-15 fraktioner, der alle var hydrolyseprodukter, fra barken af Quillaja saponaria.

A. A. McColm et al, Parasite Immunology 4: 337-347 (1982) henviser til beskyttende immunitet, der tilsyneladende bibringes ved injektion af en vaccine indeholder saponin.

20 R. Bomford Int. Archs. Allergy. Appl Immun. 57: 127-131 (1982) henviser til anvendelsen af saponin som en adjuvans for antigener.

Quillaja-saponiner er en blanding af triterpenglycosider, der ekstraheres fra barken af træet Quillaja saponaria. Råsaponiner er blevet meget anvendt som adjuvanser i vacci-25 ner mod mund- og klovsyge, og til at forstærke den beskyttende immunitet, der bibrin- i ges af eksperimentelle vacciner mod protozoparasitter, såsom Trypanosoma cruzi plas-modium, og også den humorale reaktion over for røde blodlegemer fra far (SRBC).

(Bomford, Int. Arch. Allerg. appl. Immun. 67:127 (1982)).

30 Saponiner er naturligt forekommende produkter, som er blevet karakteriseret ved hjælp af en række fælles egenskaber. Evnen til at frembringe skum i vandig opløsning navn- I DK 175739 B1 I 2 gav gruppen. Yderligere karakteristika er den hæmolytiske aktivitet, toksiciteten over

I for fisk, kompleksdannelsen med cholesterol og i nogle tilfælde antibiotisk aktivitet. I

I Kofler, Die Saponine (Springer Berlag), Berlin, 1927; Tschesche et al., Chemine und I

Biologic der Saponine, Fortscher. Chem. Org. Naturst. XXX:461 (1972). I

I 5

I De fælles saponinegenskaber reflekteres ikke i en fælles kemisk sammensætning. Selv I

om alle saponiner er glycosider, kan aglyconen høre til steroiderne, triterpenoideme el- I

ler stereodalcaloideme. Antallet af sukker og sukkerkæder forbundet til de glycosidiske I

bindinger kan variere meget. Saponiner er blevet fremstillet kommercielt og har mange I

I 10 anvendelser. De kommercielt tilgængelige Quillaja-saponiner er råblandinger, som på I

grund af deres forskellighed ikke er hensigtsmæssige til brug inden for veterinær prak- I

I sis eller i farmaceutiske midler til mennesker. På grund af deres forskellighed og hete- I

rogenitet skal hver portion undersøges ved dyreforsøg for at bestemme adjuvansaktivi- I

tet og -toksicitet. Urenhederne i de kommercielt tilgængelige produkter kan give ugun- | I

15 stige reaktioner. Derudover kan indholdet af det aktive stof i en given saponinportion I

variere, hvorved reproducerbarheden fra portion til portion formindskes. , I

Et tidligt forsøg på at oprense Quillaja-saponinadjuvanser blev gjort af Dalsgaard, Ar- I

chiv fuer die gesamte Virus-forschung 44:243 (1974). Dalsgaard oprensede delvis et I

20 vandigt ekstrakt af saponinadjuvansmaterialet fra Quillaja saponaria Molina. Dals- I

gaards præparat, som er kommercielt tilgængeligt fra Superfos under navnet "Quil-A" I

er blevet isoleret fra barken af det sydamerikanske træ Quillaja saponaria Molina og er I

kemisk karakteriseret som en carbohydratdel i glycosidisk binding til triterpenoidquil- I

lainsyre. Selv om Dalsgaards saponin ”Quil A" repræsenterer en klar forbedring sam- I

25 menlignet med de tidligere tilgængelige kommercielle saponiner, har den imidlertid og- I

så en betragtelig heterogenitet. I

Higuchi et al., Phytochemistry 26:229 (januar 1987) behandlede en Quillaja-råsaponin- I

blanding ved alkalisk hydrolyse i 6% NH4HC03 i 50% methanol og frembragte to ho- I

30 veddesacylsaponiner benævnt DS-1 og DS-2. DS-1 blev vist at indeholde glucuronsyre, I

galactose, xylose, fucose, rhamnose, apiose og Quillajic-syre, hvorimod DS-2 inde- I

i DK 175739 B1 , 3 holdt disse samme komponenter samt en yderligere glucose. Biprodukter fra denne de-acylering gav flere bestanddele omfattende 3,5-dihydroxy-6-methyloctansyre, 3,5-dihy-droxy-6-methyloctansyre, 5-O-a-L-arabinofuranosid og 5-O-or-L-rhamnopyranosyl-(1-*· 2)-or-L-arabinofuranosid (Higuchi et al., Phytochemistry 26:2357 (august, 1987), 5

Tokimitsu et al., 28,h Symposium on the Chemistry of Natural Products, Symposium Papers 224-230, Sendai 1986, beskriver på side 229 strukturen af en saponin, betegnet deri som QS-III og betegnet heri som QA-17 med formlen: 10 «φ oj co« ** “ <y ___ X / ft jt / \ uft /— A ® /~o./ r\. / cmo i/ \j « *T o

15 “ v vr<7 W

-¾ §!"

Kort beskrivelse af tegningerne.

Fig. 1 viser reffaktionsindeksprofilen af dialyseret methanolopløseliggjort Quillaja-25 barkekstrakt på omvendt fase HPLC.

Fig. 2 viser, at den ovenfor nævnte prøves refraktionsindekstoppe svarer til carbohy-drattoppe.

30 Fig. 3 viser sammenligningen mellem Superfos "Quil-A" og dialyseret methanolopløse-ligt barkekstrakt ved HPLC.

i

I DK 175739 B1 I

I 4 I

I Fig. 4 viser oprensning af QA-7, QA-17, QA-18, QA-19 og QA-21 fra "Quil-A", en rå- I

I saponinblanding, ved hjælp af silicachromatografi (4A) og efterfølgende chromatografi I

I med omvendt fase (4B, 4C, 4D). I

I 5 Fig. 5 viser renheden af QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 ved tyndtlagschromatografi I

I med omvendt fase (5A) og normal fase (5B). - I

Fig. 6A viser UV-spektrummet af QA-7. Fig. 6B viser UV-spektrummet af QA-17. Fig. I

6C viser UV-spektrummet af QA-18. Fig. 6D viser UV-spektrummet af QA-21. I

I 10 I

I Fig. 7A viser Ή-kememagnetisk resonans ("NMR") af QA-7. Fig. 7B viser Ή NMR af I

I QA-18. Fig. 7C viser Ή NMR af QA-21. I

Fig. 8A viser massespektroskopi-hurtigt atombombardamentspektrummet ("MS-FAB") I

I 15 af QA-7. Fig. 8B viser MS-FAB-spektrummet af QA-17. Fig. 8C viser MS-FAB-spek- I

I trummet af QA-21. I

Fig. 9 viser elueringsprofilen af rene QA-18-miceller og rene QA-21-miceller ved gel- I

filtrering på "Biogel" P-200 i PBS-isomer ækvilibreret med den kritiske micellekoncen- I

20 tration af den samme saponin og en sammenligning med standardproteiners elue- I

ringsposition. I

I Fig. 10 viser hæmolysen af røde blodlegemer fra får af QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, I

I QA-21 og Superfos "Quil-A". I

I 25 I

Fig. 11 viser de typiske endepunktstitere for immunisering med BSA-antigen i nærvæ- I

relse af HPLC-oprensede fraktioner af barkekstrakt. Absorbans på grund af anti- I

gen-specifik antistofbinding blev optegnet som en funktion af logaritmen af serafor- I

H tyndingen. I

I 30 I

5 DK 175739 B1

Fig. 12 viser sammenligningen af adjuvansvirkningeme af QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 ved forskellige antigenkoncentrationer og med "Freunds Complete adjuvant" ved immunisering med antigenet BSA.

5 Fig. 13 viser adjuvansvirkningeme af HPLC-oprensede adjuvanser, som anvendes sammen med Al(OH)3, et andet adjuvans, ved immunisering sammen med antigenet gp70R-delta.

Fig. 14 opsummerer virkningerne af HPLC-oprensede Quillajasaponiner alene og i 10 kombination med hinanden og sammen med et andet adjuvans ved immunisering med det antigenalkylerede gp70R-delta.

Fig. 15 viser en sammenligning af adjuvansvirkningeme af QA-18, QA-18H, QA-21 og QA-21H ved immunisering med antigenet BSA.

15

Der eksisterer et behov for en i alt væsentligt ren saponin, som kan anvendes som et adjuvans i relativt lave mængder med lav toksicitet og små bivirkninger. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således i alt væsentlige rene saponinadjuvanser, fremgangsmåde til oprensningen deraf og en fremgangsmåde til anvendelse af de i alt væ-20 sentlige rene saponiner som immunadjuvanser. Opfindelsen omfatter endvidere im-munreaktionprovokerende midler omfattende saponinadjuvanseme i kombination med en antigenkomponent.

Opfindelsen angår i alt væsentligt rene saponiner til anvendelse som immunadjuvanser 25 som defineret i de uafhængige krav 1,4 og 5 samt i alt væsentligt rene saponiner per se som defineret i de uafhængige krav 2, 3 og 6 til 8 og deres anvendelse i farmaceutiske sammensætninger og til forøgelse af immunreaktion.

30

I DK 175739 B1 I

I 6 I

I Adjuvanssaponiner er blevet identificeret og oprenset ud fra en vandig ekstrakt af bar- I

I

I ken fra det sydamerikanske træ Quillaja saponaria Molina. Der kunne adskilles i det I

I mindste 22 toppe med saponinaktivitet. De dominerende oprensede Quillaja-saponiner I

I er blevet identificeret som QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21. Disse saponiner er blevet I

I 5 oprenset ved hjælp af høj tryks væskechromatografi (HPLC) og lavttykssilicachromato- I

I grafi. Disse fire saponiner har adjuvansvirkning hos mus. QA-7, QA-17, QA-18 og I

I j QA-21, som er oprenset fra Superfos "Quil A", et Quillaja-råsaponinpræparat, er min- I

I dre toksiske hos mus end "Quil A". QA-17 og QA-18 er mindre toksiske hos katte end I

"Quil-A" (QA-7, QA-21 blev ikke undersøgt). Endvidere er der blevet identificeret en I

I 10 toksisk komponent af Superfos "Quil-A" som QA-19. Denne komponent er toksisk hos I

I mus i lavere doser end ”Quil-A” eller QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21. Den forøgede I

I toksicitet af QA-19 sammenlignet med QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 er uventet, idet I

I denne komponent er en saponin, har en lignende carbohydratsammensætning, udviser I

I adjuvansaktivitet hos mus i doser lavere end den toksiske dosis og udviser lignende I

I 15 kromatografisk adfærd. Alle de ovenfor nævnte saponiner kan isoleres fra vandige eks- I

I trakter af Quillaja saponaria Molina-bark. De i alt væsentlige rene saponiner ifølge den I

I foreliggende opfindelse er egnede som immunadjuvanser og fremmer immunreaktioner I

hos individer i en meget lavere koncentration end de tidligere tilgængelige heterogene I

I saponinpræparater uden de toksiske virkninger, som er forbundet med råsaponinpræpa- I

I 20 rater. Saponinkomponenter, som specifikt påtænkes ifølge opfindelsen, er QA-7, QA- I

I 17 og QA-21 til anvendelse som immunadjuvanser, og QA-7 og QA-21 per se. men ik- I

I ke QA-18 eller QA-19. I

I Saponineme ifølge den foreliggende opfindelse kan opnås fra træet Quillaja saponaria I

I 25 Molina. I

I Udtrykket "saponin" som anvendt heri omfatter glycosidisk triteipenoidforbindelser, I

I som fremstiller skum i vandig opløsning, har hæmolytisk aktivitet i de fleste tilfælde og I

har immunadjuvansaktivitet. Opfindelsen omfatter saponinen per se såvel som naturli- I

30 ge og farmaceutisk acceptable salte og farmaceutisk acceptable derivater. Udtrykket I

"saponin" omfatter også biologisk aktive fragmenter deraf. I

DK 175739 B1 i 7 i |

Opfindelsen angår også midler, såsom immunologiske midler, hvilke midler omfatter en eller flere i alt væsentligt rene saponinfraktioner og fremgangsmåder under anvendelse af disse midler som immunadjuvanser.

5

Udtrykket "immunadjuvans" som anvendt heri refererer til forbindelser som når administreret til et individ eller undersøgt in vitro forøger immunreaktionen over for et antigen i individet eller forsøgssystemet, hvortil antigenet er administreret. Nogle antigener er svagt immunogene, når de administreres alene eller er toksiske over for individet ved 10 koncentrationer, som fremkalder immunreaktioner hos nævnte individ. Et immunadjuvans kan fremme individets immunreaktion over for antigenet ved at gøre antigenet stærkere immunogent. Adjuvansvirkningen kan også sænke den nødvendige dosis af nævnte antigen til opnåelse af en immunreaktion i individet.

15 Saponiners adjuvansaktivitet kan bestemmes ved hjælp af en hvilken som helst af en række fremgangsmåder, som er kendte for fagmanden inden for området. Forøgelsen i antistoftiter over for specifikt antigen efter administration af et adjuvans kan anvendes som et kriterie for adjuvansaktivitet (Dalsgaard, K. (1978) Acta Veterinia Scandinavia 69, 1-40, Scott, M.T., Gross-Samson, M. og Bomford, R. (1985) Int. Archs. Allergy 20 Appl. Immun. 77, 409-412). Kort beskrevet omfatter et sådant forsøg, at man injicerer CD-I-mus intradermalt med et antigen (f.eks. dvs. bovint serumalbumin, BSA) blandet med forskellige mængder af det mulige adjuvans. Sera blev indsamlet fra mus to uger senere og undersøgt ved hjælp af ELISA for antistof mod BSA. En sammenligning af adjuvansvirkningeme af det dialyserede methanolopløselige barkekstrakt og "Quil A" 25 viste, at antistoftitere var to størrelsesordener større, når antigenet BSA blev indgivet i nærværelse af saponinpræparateme end når BSA blev indgivet i PBS alene. Barkekstrakten havde god adjuvansaktivitet, når indgivet i en adjuvansdosis på 12 pg carbohy-drat (analyseret ved hjælp af anthron) eller mere. Adjuvansreaktionen for "Quil-A" var lavere end for barkekstrakten, men var tydelig ved doser i intervallet fra 9-23 pg carbo-30 hydrat. Carbohydratvægt (bestemt ved hjælp af analyse med anthron under anvendelse af glucose som en standard) er ca. 30% af tørvægten af disse råadjuvansekstrakter.

I DK 175739 B1 I 8 I Udtrykket "i alt væsentlig ren" betyder i alt væsentligt fri for forbindelser, som normalt

I er forbundet med saponinen i dens naturlige tilstand, og udviser konstant og reprodu- I

cerbar kromatografisk reaktion, elueringsprofiler og biologisk aktivitet. Udtrykket "i alt

I væsentlig ren" er ikke ment at udelukke kunstige eller syntetiske blandinger af saponi- I

I 5 nen med andre forbindelser. I

I Fortrinsvis oprenses den i alt væsentlige rene saponin til en eller flere af de følgende I

I standarder: I

10 1) forekommer som kun et hovedcarbohydratfarvningsbånd på silicagel TLC (EM Sci- I

ence HPTLC Si60) i opløsningsmiddelsystem af 40 mM eddikesyre i chloroform/me- I

I ! thanol/vand (60/45/10, vol/vol/vol), I

I 2) forekommer som kun et hovedcarbohydratfarvningsbånd på TLC med omvendt fase I

15 (EM Science silicagel RP-8) i et opløsningsmiddelsystem af methanol/vand (70/30 I

I vol/vol), I

3) forekommer som kun en hovedtop ved HPLC med omvendt fase på Vydac C4 (5 pm I

partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 mm ID x 25 cm L) i 40 mM eddikesyre i methanol/- I

I 20 vand (58/42, vol/vol). I

I den foretrukne udførelsesform oprenses saponinadjuvanseme ifølge den foreliggende I

opfindelse fra Quillaja saponaria Molina-bark. Vandige ekstrakter af Quillaja saponaria I

I Molinabarken blev dialyseret mod vand. Den dialyserede ekstrakt blev lyofiliseret til I

25 tørhed, ekstraheret med methanol, og den methanol-opløselige ekstrakt blev yderligere I

fraktioneret ved silicagelchromatografi og ved højtryksvæskechromatografi med om- I

vendt fase (RP-HPLC). De individuelle saponiner blev adskilt ved HPLC med omvendt I

fase som beskrevet i eksempel 1. Der kunne adskilles i det mindste 22 toppe (benævnt I

QA-1 til QA-22). Hver top svarer til en carbohydrattop som vist i fig. 2 og gav kun et I

H 30 enkelt bånd ved tyndtlagschromatografi med omvendt fase. De individuelle komponen- I

ter blev identificeret ved retentionstid på en Vydac C4 HPLC-søjle som følger: I

9 DK 175739 B1

Top Retentionstid (minutter) QA-1 opløsningsmiddelfront QA-2 4,6 QA-3 5,6 5 QA-4 6,4 QA-5 7,2 QA-6 9,2 QA-7 9,6 1 QA-8 10,6 10 QA-9 13,0 QA-10 17,2 QA-11 19,0 QA-12 21,2 QA-13 22,6 15 QA-14 24,0 QA-15 25,6 j QA-16 28,6 QA-17 35,2 QA-18 38,2 20 QA-19 43,6 QA-20 47,6 QA-21 51,6 QA-22 61,0 25 Immunadjuvansaktivitet blev undersøgt ved at måle de oprensede saponiners evne til at fremme immunreaktionen hos mus over for exogent administrerede antigener. De oprensede saponiner ifølge den foreliggende opfindelse udviste adjuvansvirkninger ved lavere doser end råekstrakteme. Især viste de dominerende saponiner i barkekstrakt (QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21) adjuvansaktivitet ved doser på 4,5 pg carbohydrat 30 eller mindre (analyseret ved hjælp af anthron). De oprensede saponiner blev yderligere I DK 175739 B1 I 10 karakteriseret ved carbobydratindhold, TLC med omvendt fase og normal fase, UV, in- ffarød, NMR-spektre og hurtig atombombardement-massespektroskopi.

Den omtrentlige ekstinktionskoefficient som bestemt for 1% (vægt/vol) opløsninger i I 5 methanol ved 205 nm for flere af de mere foretrukne oprensede saponiner er som føl- I ger: I 1 % E205 fnml ! I QA-7 34 I 10 QA-17 27 I QA-18 27 QA-21 28

Carbohydratindholdet blev anvendt til at kvantitetsbestemme saponineme i nogle til-

15 fælde. Carbohydratanalysen var anthronmetoden beskrevet af Scott og Melvin (Anal. I

Chem. 25:1656 (1953)) under anvendelse af glucose som en standard som beskrevet i

eksempel 1. Denne analyse blev anvendt til at bestemme en størrelsesgrad af anthron- I

reaktion (udtrykt i glucoseækvivalenter) per mg oprenset saponin (tørvægt), således at I

H tørvægt af et bestemt præparat kunne estimeres ved hjælp af anvendelse af anthronana- I

20 lyse. Det må bemærkes, at forskelle i reaktivitet med anthron af forskellige saponiner I

kan skyldes carbohydratsammensætning snarere end mængde, da forskellige monosac- I

charider reagerer forskelligt i denne analyse. I

Det i alt væsentligt rene QA-7-saponin er karakteriseret som havende immunadjuvan- I

25 saktivitet, indeholdende ca. 35% carbohydrat (som analyseret ved anthron) per tørvægt, I

H med et UV-absorptionsmaksimum på 205-210 nm, en retentionstid på ca. 9-10 minutter I

H på RP-HPLC på en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 mm ID I

x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, vol/vol) I

ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, eluerende med 52-53% methanol fra en I

30 Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 10 mM ID x 25 cm L i et op- I

løsningsmiddel af 40 mM eddikesyre med gradienteluering fra 50 til 80% methanol, . I

11 DK 175739 B1 med en kritisk micellekoncentration på ca. 0,06% i vand og 0,07% i phosphatpufret saltopløsning, ikke forårsagende nogen påviselig hæmolyse af røde blodlegemer fra får i koncentrationer på 200 pg/ml eller mindre og indeholdende monosaccharidresteme terminal rhamnose, terminal xylose, terminal glucose, terminal galactose, 3-xylose, 5 3,4-rhamnose, 2,3-fucose og 2,3-glucuronsyre og apiose (binding ikke bestemt).

Den i alt væsentligt rene QA-17-saponin er karakteriseret som havende adjuvansaktivi-tet, indeholdende ca. 29% carbohydrat (som analyseret ved anthron) per tørvægt, med et UV-absorptionsmaksimum på 205-210 nm, en retentionstid på ca. 35 minutter på 10 RP-HPLC på en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol-vand (58/42 vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, eluerende med 63-64% methanol fra en Vydac C4-søjle med 5 μτη partikelstørrelse, 330 Å pore, 10 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre med gradienteluering fra 50 til 80% methanol, 15 med en kritisk micellekoncentration på 0,06% (vægt/vol) i vand og 0,03% (vægt/vol) i phosphatpufret saltopløsning, forårsagende hæmolyse af røde blodlegemer fra får ved 25 pg/ml eller højere og indeholdende monosaccharidresteme, terminal rhamnose, terminal xylose, 2-fucose, 3-xylose, 3,4-rhamnose, 2,3-glucuronsyre, terminal glucose, 2-arabinose, terminal galactose og apiose (binding ikke bestemt).

20

Den i alt væsentligt rene QA-18-saponin er karakteriseret som havende immunadjuvan-saktivitet, indeholdende ca. 25-26% carbohydrat (som analyseret ved anthron) per tørvægt, med et UV-absorptionsmaksimum på 205-210 nm, en retentionstid på ca. 38 minutter på RP-HPLC på en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 25 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42 vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, eluerende med 64-65% methanol fra en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 10 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre med gradienteluering fra 50 til 80% methanol, med en kritisk micellekoncentration på 0,04% (vægt/vol) i vand og 0,02% 30 (vægt/vol) i phosphatpufret saltopløsning forårsagende hæmolyse af røde blodlegemer fra får ved koncentrationer på 25 pg/ml eller højere og indeholdende monosaccharider- I--

I DK 175739 B1 I

I 12 I

ne terminal rhamnose, terminal arabinose, terminal apiose, terminal xylose, terminal I

glucose, terminal galactose, 2-fucose, 3-xylose, 3,4-rhamnose og 2,3-glucuronsyre. I

Den i alt væsentligt rene QA-21 saponin er karakteriseret som havende immunadju- I

I 5 vansaktivitet, indeholdende ca. 22% carbohydrat (som analyseret ved anthron) per tør- I

vægt, med et UV-absorptionsmaksimum på 205-210 nm, en retentionstid på ca. 51 mi- - I

I nutter på RP-HPLC på en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 I

I mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, I

I vol/vol) ved en strømningshastighed på l ml/minut, eluerende med 69 til 70% metha- I

10 nol fra en Vydac C4-søjle med 5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 10 mm ID x 25 cm I

I L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre med gradienteluering fra 50 til 80% I

I methanol, med en kritisk micellekoncentration på ca. 0,03% (vægt/vol) i vand og I

I 0,02% (vægt/vol) i phosphatpufret saltopløsning, forårsagende hæmolyse af røde blod- I

I legemer fra far ved koncentrationer på 25 pg/ml eller højere og indeholdende mono- I

15 saccharideme terminal rhamnose, terminal arabinose, terminal apiose, terminal xylose, I

I 4-rhamnose, terminal glucose, terminal galactose, 2-fucose, 3-xylose, 3,4-rhamnose og I

I 2,3-glucuronsyre. I

I Udtrykket "individ" betyder et hvilket som helst dyr, som kan fremkalde en immunre- I

20 aktion omfattende mennesker. I

De oprensede saponiner har adjuvansvirkninger, når de indgives indenfor et stort inter- I

I val af dosiser og et stort interval af forhold til antigenet, som indgives. I en udførelses- I

I form indgives saponinen i et forhold mellem adjuvans og antigen (vægt/ vægt) på 3,0 I

25 eller mindre, fortrinsvis 1,0 eller mindre. I

I De oprensede saponiner kan indgives enten enkeltvis eller blandet med andre i alt væ- I

sentligt rene adjuvanser til opnåelse af forøgelsen af immunreaktionen over for et anti- I

gen. Blandt de adjuvansblandinger, som er effektive ifølge den foreliggende opfindelse, I

I 30 er fraktioner QA-7 og QA-17. I

i DK 175739 B1 i3 ;

Oprensede saponiner kan også indgives sammen med ikke-saponinadjuvanser. Sådanne ikke-saponinadjuvanser, som er egnede sammen med den foreliggende opfindelse er olieadjuvanser (f.eks. Freunds fuldstændige og ufuldstændige) liposomer, mineralsalte (f.eks. A1K(S04)2, AlNa(S04)2; A1NH4(S04), silica, alun, A1(0H)3, Ca3(P04)2, kaolin 5 og carbon), polynukleotider (f.eks. poly IC- og poly-AU-syrer) og visse naturligt forekommende stoffer (f.eks. voks D ffa Mycobacterium tuberculosis såvel som stoffer fundet i Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis og medlemmer af slægten Brucella).

10 De oprensede saponiner ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til at fremme immunreaktionen over for et hvilket som helst antigen. Typiske antigener, som er egnede til de immunreaktionsprovokerende midler ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter antigener hidrørende fra en hvilken som helst af de følgende: virusser, såsom influenza, hundegalskab, mæslinger, hepatitis B, mund- og klovsyge eller HTLV-III, 15 bakterier såsom anthrax, diphtheria eller tuberkulosis eller protozoer, såsom Babeosis j bovis eller Plasmodium.

Et særligt eksempel er anvendelsen af de oprensede saponiner ifølge den foreliggende opfindelse til at fremme immunreaktionen over for gp70-holdigt rekombinant protein.

20 Et gp70-holdigt rekombinant protein er et antigen, som indeholder polypeptiddelen af FeLV-gp70-kappeprotein. Dette rekombinante antigen er betegnet "gp70R", "rec-gp70" eller "Rgp70". Et andet antigenpræparat, som indeholder polypeptiddelen af FeLV-gp70 sammen med de 40 amino-terminale aminosyrer (benævnt ',Rgp70-delta") eller med hele aminosyresekvensen (benævnt "Rgp90") af pl5e-kappeproteinet af 25 FeLV-undergruppe A fremstilles under anvendelse af DNA-rekombineringsteknikker.

Disse rekombinante gp70-holdige polypeptider gp70R, gp70R-delta og gp90R refereres herefter samlet til som gp70-holdigt protein. Benævnelsen gp70-holdigt protein er ment at omfatte polypeptider med den samme aminosyresekvens som det naturligt forekommende gp70holdige protein og analoger deraf. Udtrykket "analoger" er ment at omfatte 30 proteiner eller polypeptider, som adskiller sig fra gp70, gp70-delta eller gp90 ved addi- I DK 175739 B1 I 14 I tion, deletion eller substitution af en eller flere aminosyrer forudsat, at dette polypeptid I udviser i alt væsentligt den samme biologiske aktivitet som gp70-protein.

I Administrationen af forbindelserne, som er egnede ved fremgangsmåden ifølge opfin- 5 delsen kan være parenteral, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intranasal eller en hvilken som helst anden egnet metode. Den administrerede dosis kan være afhængig af I alder, vægt, type af samtidig behandling, om nogen, og naturen af det administrerede I antigen. Den effektive forbindelse, som er egnet ved fremgangsmåden ifølge den fore- I liggende opfindelse kan anvendes i sådanne former som kapsler, flydende opløsninger, I i 10 suspensioner eller eliksirer til oral administration eller sterile flydende former, såsom

H

i opløsninger eller suspensioner. Der anvendes fortrinsvis en hvilken som helst inert bæ-

H

rer, såsom saltopløsning eller phosphat-puffet saltopløsning, eller en hvilken som helst I

sådan bærer, hvori forbindelserne, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge den fore- I

i liggende opfindelse har egnede opløselighedsegenskaber til brug ved fremgangsmåden I

15 ifølge den foreliggende opfindelse. I

Efter at opfindelsen nu er blevet beskrevet generelt kan der opnås en mere fuldstændig I

forståelse ved henvisning til de følgende eksempler, som ikke skal opfattes som væren- I

de begrænset med mindre andet tydeligt er anført. I

I 20

Eksempel 1 I

I INDLEDENDE FREMSTILLING AF QUILLAJA SAPONARIA

MOLINA-BARKEKSTRAKT I

25 Quillaja saponaria Molina-bark blev omrørt med et overskud af vand (10% vægt/vol) I

for at ekstrahere saponineme. Det vandige ekstrakt blev derefter filtreret og opbevaret i I

0,1% NaN3. 150 ml af denne ekstrakt blev centrifugeret ved 20.000 x g i 30 minutter I

for at fjerne restbarkffagmenter. Supematanten, som var lysebrun, blev lyofiliseret og I

genopløst i 16 ml vand, og pH-værdien blev indstillet til mindre end 4 ved tilsætningen I

30 af 160 μΐ 1 N eddikesyre. Denne opløsning blev anbragt i dialyserørsystem med en I

12.000 molvægt afskæring og dialyseret mod 1 1 vand. Vandet blev skiftet efter 8 ti- I

I DK 175739 B1 mers dialyse, og dialysen fik lov til at fortsætte natten over. Dialysatprøver blev fjernet efter den første og anden dialysecyklus. Den dialyserede ekstrakt blev lyofiliseret og ekstraheret med 40 ml methanol ved 60°C i 15 minutter efterfulgt af centrifugering ved 1000 x g i 10 minutter for at sedimentere det uopløste materiale. Dette materiale blev 5 underkastet to yderligere ekstraktioner med methanol. Methanol ekstrakterne blev bragt sammen, inddampet på en rotationsfordamper til tørhed, genopløst i 5,5 ml methanol og filtreret gennem en 0,2 μ nylon 66 mesh til fjernelse af resterende uopløst materiale. Fraktionerne blev analyseret ved tyndtlagskromatografi med omvendt fase (RP-TLC) på C8-plader (E.M. Science RP-TLC, C8) i et opløsningsmiddelsystem af 70% metha-10 nol/30% vand eller ved tyndt]agschromatografi med normal fase på silicagel 60 TLC- plader i et opløsningsmiddelsystem af n-butanol, ethanol, vand og ammoniak (30/60/29/21, vol/vol/vol/vol). Carbohydratbåndene blev synliggjort med Bial-reagens, som påviste alle hovedbånd, som er påviselige ved svovlsyreforkulning med en forøget følsomhed sammenlignet med svovlsyreforkulningsmetoden. Bial-reagenscarbohydrat-15 pletning eller -farvning blev rutinemæssigt anvendt som et påvisningsreagens på TLC-plader. Alle hovedbånd blev glycosyleret.

Dialyse fjernede et hovedcarbohydrat-holdigt bånd (RF = 0,82 på EM Science RP TLC, C8 i methanol/vand (70/30, vol/vol)), såvel som nogle mindre bestanddele. Endvidere 20 fjernede dialyse bestanddele med stærke absorptionsmaksima ved 280 og 310 nm. Ca.

80% af carbohydratet (analyseret ved anthron) blev fjernet ved dialyse, men ca. 95% af den hæmolytiske aktivitet blev bevaret under dialyse.

De fleste saponinadjuvanser er kendt for at have detergentegenskaber, såsom hæmolyse 25 af røde blodlegemer, således at bibeholdelsen af hæmolytisk aktivitet er en grov indikation af bibeholdelsen af adjuvanssaponiner. Flere bånd blev bibeholdt ved dialyse, hvilket indikerer deres detergentnatur. Methanol opløseliggjorde alle tilstedeværende TLC-bånd i den dialyserede ekstrakt bortset fra et TLC-bånd (RF = 0 på både omvendt fase og silica TLC-plader). Det methanoluopløselige materiale var rødligt brunt. Mate-30 rialet, som var methanolopløseligt, fremkom hvidt efter lyofilisering.

I DK 175739 B1 I 16 I Carbohydratkoncentration blev bestemt ved hjælp af metoden beskrevet af Scott og I Melvin (Scott, T.A. og Melvin, E.H. Anal. Chem. 25, 1656 (1953)). Kort beskrevet I blev en vandig prøve, som skulle undersøges, eller glucose som en standardcarbohydra- I topløsning (450 μΐ), blandet med 900 μΐ 0,2% anthron (vægt/vol) i svovlsyre og inku- I 5 beret i 16 minutter ved 90-100°C. Absorbansen blev aflæst ved 625 nm. Glucose blev I anvendt som en standard.

I Prøvernes hæmolytiske aktivitet blev bestemt på følgende måde: Kort beskrevet blev I prøver fortyndet i en rundbundet mikrotiterplade med 1:2 fortyndinger i phosphatpufret 10 saltopløsning i på hinanden følgende rækker (100 μΐ/brønd). 10 μΐ normalt kaninblod i I Alseversopløsning (Hazelton) blev sat til hver brønd og blandet. Plader blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af centrifugering af pladerne i en Sorvall RT6000 I for at sedimentere ikke-hæmolyserede celler. Fravær af hæmolyse blev bestemt ved til- I stedeværelsen af en pellet af ikke-hæmolyserede celler i bunden af brønden.

I ' I Eksempel 2

SAMMENLIGNING AF DIALYSERET, METHANOL-OPLØSELIG

I BARKEKSTRAKT OG SUPERFOS "QUIL-A" VED TLC OG HPLC

I ' 20 Superfos "Quil-A" og dialyserede methanol-opløselige komponenter fra barkekstrakt, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1, blev sammenlignet ved TLC med om- vendt fase som beskrevet i eksempel 1. Alle tilstedeværende bånd i barkekstrakten efter dialyse og opløseliggørelse med methanol var til stede i "Quil-A". Endvidere indeholdt "Quil-A" et bånd med rf=0 på TLC-plader med omvendt fase. Denne komponent blev ) H 25 fjernet ved methanol-opløseliggørelse som ovenfor beskrevet. Ligheden i sammensæt- ning af dialyseret, methanol-opløselig barkekstrakt og "Quil-A" blev bekræftet ved HPLC. De individuelle komponenter af barkekstrakt kunne adskilles ved HPLC med H omvendt fase på Vypac C4 (5 pm partikelstørrelse, 330 Å pore, 4,6 mm ID x 25 cm L) H i 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, vol/vol). Refraktionsindekset for de enkel- H 30 te fraktioner blev bestemt. Fig. 1 repræsenterer refraktionsindeksprofilen af toppene 17 DK 175739 B1 (mærket QA-1 til QA-22 i rækkefølge med stigende retentionstider) fra RP-HPLC. Den relative andel af hver top i barkekstrakt og Superfos "Quil-A" er vist i tabel 1 nedenfor.

Tabel l:Relativ andel af HPLC-fraktioner af råsaponinekstrakt 5 og Superfos "Quil-A” (refraktionsindeks) % af samlede (toppe 2-21)

Dialyseret, methanol- Superfos HPLC-ffaktion opløselig barkekstrakt ’Ouil-A" 10 QA-2 3,1 1,2 QA-3 4,8 2,4 QAr4,5 10,1 7,1 QA-6,7 17,5 12,7 QA-8 6,8 10,5 15 QA-9 1,0 2,1 QA-10 2,7 1,3 QA-11 6,8 6,2 QA-12 3,5 5,6 QA-13,14,15 4,8 7,7 20 QA-16 2,8 1,4 QA-17 11,4 9,9 QA-18 13,51 21,8 QA-19 2,2 4,5 QA-20 3,2 2,2 25 QA-21 5,6 3,7

De individuelle toppe svarer til enkelte tyndtlagschromatografibånd på TLC-plader med omvendt fase. Et andet repræsentativt eksperiment, som er vist på fig. 2, viser at reffaktionsindekstoppene også svarer til carbohydrattoppe, hvilket bekræfter at alle ho-30 vedbarkekstraktkomponenter er glycosider (HPLC-fraktioner analyseret for carbohy-drat ved anthronanalysen).

I DK 175739 B1 I

I 18 I

I Dialyseret, methanol-opløselig barkekstrakt og "Quil-A" blev sammenlignet direkte i I

I dette HPLC-system. De individuelle komponenter blev identificeret ved retentionstid. I

Alle tilstedeværende toppe i dialyseret, methanol-opløselig barkekstrakt var også til I

I ! stede i "Quil-A” i lignende andele med den undtagelse af en højere andel af komponent I

I 5 QA-8 og en lavere andel af QA-17 i Superfos "Quil-A" sammenlignet med barkeks- I

trakt. Fig. 3 viser en sammenligning af dialyseret methanol-opløselig barkekstrakt og · I

I Superfos "Quil-A" under anvendelse af en semipræparativ Vydac C4 (10 mm ID x 25 I

I cm L, 330 Å porestørrelse, 5 μτη partikelstørrelse). Prøven fyldes i 50% methanol i 40 I

I mM eddikesyre og en methanolgradient i 40 mM eddikesyre (vist i fig. 3) anvendes til I

10 at eluere prøverne. Absorbansen blev overvåget ved 214 nm. I

I Forskellige Quillaja-barkprøver blev ekstraheret og analyseret ved HPLC. Der var no- I

I gen forskellighed i de relative andele af toppene, men de samme toppe var altid til ste- I

de. Det vides ikke for tiden, hvorvidt variationen i andele er på grund af variation i eks- I

15 traktionsproceseffektiviteten eller i bark fra forskellige kilder. I

I På grund af den lette tilgængelighed af "Quil-A" og den lignende sammensætning med I

I barkekstrakt blev "Quil-A" anvendt til at fremstille mg mængder af materiale. Adju- I

I vansaktivitet hos mus under anvendelse af BSA som antigen viste sig at være forbundet I

I 20 med toppe 4, 7,11, 12, 15, 16, 17, 18, 19 og 20 (tabel 2) i doser på 3,0 pg carbohydrat I

I (bestemt ved hjælp af anthronanalysen). Absorbansen på grund af antigenspecifik anti- I

stofbinding (2 uger efter immunisering bestemt ved ELISA) ved en serafortynding på I

1:10 gav et semi-kvantitativt estimat af adju vansaktivitet (i intervallet fra 0,07 hos mus I

H immuniseret ved fravær af adjuvans til 1,24 hos mus immuniseret ved tilstedeværelse I

B 25 af QA-20). I

^B ! I

B 30 I

DK 175739 B1 ! ' 19 i

Tabel 2: Adjuvansaktivitet hos mus HPLC- Adjuvansdosis Absorbans* fraktion i ue carbohvdraf) (410 nmt 5 QA-2 3,0 0,34 QA-3 3,0 0,27 QA-4 3,0 0,60 QA-7 3,0 0,49 QA-10 3,0 0,13 10 QA-11 3,0 0,46 QA-12 3,0 0,76 QA-13,14 3,0 0,20 QA-15 3,0 1,17 QA-16 3,0 0,66 15 QA-17 3,0 1,13 QA-18 3,0 0,75 QA-19 3,0 0,93 QA-20 3,0 1,24 0,07 20 ----- * Absorbans på grund af antigen-specifik antistofbinding ved serafortynding på 1:10.

På grund af at toppene QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 dominerede i barkekstrakt, 25 blev disse fire komponenter oprenset i større målestok som beskrevet i eksemplerne 3 og 4 nedenfor. QA-18 tilvejebringes til sammenligningsformål.

30 I ! DK 175739 B1 I 20

Eksempel 3 I

I ' OPRENSNING VED SDLICACHROMATOGRAFI

I 1 g "Quil-A" blev suspenderet i 75 ml methanol og opvarmet ved 60°C i 15 minutter og I

5 filtreret. Det uopløste materiale blev ekstraheret endnu en gang med 50 ml methanol I

I ved 60°C og filtreret. Filtraterne blev inddampet til tørhed på rotationsfordamperen. En I

I Lichropep Silica Si60-søjle (E.M. Science, 25 mm ID x 310 mm L, 40-63 μτη partikel- I

størrelse) blev ækvilibreret i forvejen i 40 mM eddikesyre i chloroform/methanol/vand I

I (62/32/6, vol/vol/vol). I

I 10

Det tørrede "Quil-A", en råblanding af saponiner, blev opløst i 5 ml søjleopløsnings- I

middel og elueret gennem silicatet isokratisk i dette opløsningsmiddelsystem ved en I

strømningshastighed på 1 ml/minut. Carbohydratanalyse, tyndtlagschromatografi og I

I HPLC blev anvendt til at overvåge fraktionerne for QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21. I

I 15 Fraktioner 19-30 var beriget med hensyn til QA-21 og blev bragt sammen for yderlige- I

re oprensning af QA-21. Fraktioner 31-60 var beriget med hensyn til QA-8 og QA-18 I

og blev bragt sammen til yderligere oprensning af disse bestanddele. Fraktioner 85-104 I

var beriget med QA-7 og QA-17 og blev bragt sammen for yderligere oprensning af I

disse bestanddele. Disse sammenbragte puljer blev flashfordampet før yderligere op- I

H 20 rensning. I

Eksempel 4 I

I YDERLIGERE OPRENSNING VED HPLC MED OMVENDT FASE I

25 Silicafraktioner blev yderligere oprenset ved semipræparativ HPLC med omvendt fase I

I på Vydac C4 (10 mm Π) x 25 cm L), fig. 4. Silicafraktioner (10-20 mg) blev opløst i I

det passende opløsningsmiddel og fyldt på Vydac C4. En methanolgradient blev an- I

vendt til at eluere fraktionerne. Strømningshastigheden var 3 ml per minut. Fraktioner- I

ne blev overvåget ved hjælp af absorbans ved 214 nm. Fig. 4B viser oprensningen af I

30 QA-21 fra silicafraktioner 19-30 under anvendelse af isokratisk adskillelse i 40 mM I

eddikesyre i 58% methanol/42% vand. Fraktioner, som eluerede med en retentionstid I

Ι· DK 175739 B1

på mellem 65-72 minutter blev identificeret som QA-21 ved TLC med omvendt fase og bragt sammen for yderligere karakterisering. Fig. 4C viser oprensningen af QA-18 ffa silicaffaktioner 31-60 under anvendelse af en methanolgradient i 40 mM eddikesyre (50-56% methanol/0-10 minutter, 56-69% methanol/10-79 minutter). Fraktioner, som 5 eluerede med en retentionstid på mellem 46-48 minutter blev identificeret som QA-18 i ved TLC med omvendt fase og bragt sammen for yderligere karakterisering. Fig. 4D

I viser oprensningen af QA-7 og QA-17 fra silicaffaktioner 85-104 under anvendelse af i den samme gradient, som er anvendt i fig. 4C. Fraktioner, som eluerede med en retentionstid på mellem 21-23 minutter blev identificeret som QA-7 ved TLC med omvendt 10 fase og bragt sammen for yderligere karakterisering. Fraktioner, som eluerede med en retentionstid på mellem 44-46 minutter blev identificeret som QA-17 ved TLC med omvendt fase og blev bragt sammen for yderligere karakterisering.

Eksempel 5

15 RENHED OG KARAKTERISERING AF ADJUVANSER, SOM VAR OPRENSET

VED SILIC AKROM ATOG RAFI OG KROMATOGRAFI MED OMVENDT

FASE

20 Renhed

Fig. 5a repræsenterer en TLC med omvendt fase (E.M. Science RP-TLC, C8 (opløs- I

ningsmiddel = 70% methanol, visualiseringsspray = Bial's reagens)). 5 pg hver af I

QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21, som var oprenset som beskrevet i eksempel 3 og 4, I

25 blev chromatograferet. Adjuvanseme fremkom hver som enkelte bånd i dette TLC-sy- I

stem. I

Fig. 5b viser fraktioner QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 og "Quil-A" på EM Si60 I

HPTLC-plade (opløsningsmiddel = 40 mM eddikesyre i chloroform/methanol/H20

30 (60/45/10, vol/vol/vol), visualiseringsspray = Bial's reagens). 2 pg hver af QA-7, H

QA-17, QA-18 og QA-21, som var oprenset som beskrevet i eksemplerne 3 og 4, og 20 H

I DK 175739 B1 I 22 pg "Quil-A", et råsapon i nekstrakt, blev chromatograferet. Det HPLC-oprensede mate- I riale fremkom hovedsageligt som et enkelt bånd.

I Spektroskop! I UV-spektrene af QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 i methanol er vist henholdsvis på fi- I gureme 6A-D. Dalsgaard's (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavica Supp.

I 69:1-40 (1978)) adjuvansfraktion havde en absorbanstop ved 280 nm. De HPLC-op- j I rensede fraktioner ifølge den foreliggende opfindelse har imidlertid ikke en top ved 280 10 nm, men har en hovedtop i regionen mellem 200-220 nm med en skulder centreret ved I 260 nm.

Fourier Transformation-Infrarød resonans-spektre ("FT-IR") havde små forskelle mel- lem adjuvanseme, hvilket antyder, at de alle har de samme funktionelle grupper. Selv 15 om stmkturidentifikationen ikke kan foretages ud fra IR, er de spektrale data i overens- stemmelse med tilstedeværelsen af en carboxylgruppe, som det var foreslået af Dals- gaard (Dalsgaard, K., supra).

Ή-NMR ved 250 MHz af de oprensede saponiner i CD3OD viser den komplekse natur H 20 af de oprensede saponiner QA-7 (fig. 7A), QA-18 (fig. 7B) og QA-21 (fig. 7C). Signa- lerne i området mellem 4,1 og 5,4 ppm viser tydeligt tilstedeværelsen af flere signaler ' fra de anomere protoner i monosaccharideme, hvilket indikerer et stort antal monosac- charidrester. Saponinemes NMR-spektre er imidlertid for komplekse til at muliggøre MS-FAB af de oprensede saponiner QA-7, QA-17 og QA-21 (figurerne henholdsvis 8A, 8B og 8C) viste omtrentlige pseudo-molekylionmasser på henholdsvis 1870, 2310 H og 1988. MS-FAB blev ikke bestemt på QA-18 på grund af problemer med at opløse- liggøre denne bestanddel. Disse molekylvægte er i overensstemmelse med de, der for- 30 ventes for en triterpen, som er forbundet til 8 til 10 monosaccharidrester og var i det

samme interval som monomermolekylvægte bestemt ved størrelsesudeluknings-HPLC

23 DK 175739 B1 af oprensede saponiner i methanol (Zorbax PSM 60 Si-søjle, 25 cm x 6,2 mm, 1 ml/minut strømningshastighed, molekylvægtstandarder = 18-jS-glycrrhetinsyre og gine-nosid Rbl), som gav omtrentlige molekylvægte på 2600, 2400, 1800 og 2400 for henholdsvis QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21. Forskellen mellem FAB-MS og størrelsesu-5 deluknings-HPLC skyldes højst sandsynlig variation i form mellem saponineme og molekyl vægtstandardeme.

Carboh vdratsammensætnin g 10 Tabel 3 nedenfor viser carbohydratsammensætning og bindingsanalyse af oprensede saponiner QA-7, QA-17, QA-18, QA-21 og QA-19. Carbohydratet i saponineme blev omdannet til alditolacetater ved opvarmning af 0,2 mg saponin i 0,3 ml 2 N trifluored-dikesyre indeholdende 0,1 mg/ml inositol ved 120°C i 2 timer. Syren blev ijemet under en luftstrøm og resterende syre fjernet ved tilsætning af isopropanol (2 x 0,25 ml) efter-15 fulgt afblæsning til tørhed med luft. Den opnåede tørre rest blev opløst i 1M ammoniumhydroxid (0,25 ml) indeholdende 10 ng/ml natriumbordeuterid og holdt i en time ved stuetemperatur. Iseddikesyre (0,1 ml) blev tilsat, og opløsningen blev blæst til tørhed. Resterende borat blev fjernet ved codestillation med 10% eddikesyre i methanol (3 x 0,25 ml) og til sidst med methanol (2 x 0,25 ml). Den tørre rest i eddikesyreanhydrid 20 (0,1 ml) og pyridin (0,1 ml) blev opvarmet i 20 minutter ved 120°C. Toluen (9,02 ml) blev sat til den afkølede blanding, og opløsningsmidlerne blev fjernet under en luftstrøm. Denne fremgangsmåde med tilsætning af toluen og fjernelse af pyridin og eddikesyreanhydrid blev gentaget to gange. Den opnåede rest blev optaget i dichlormethan (0,5 ml) og ekstraheret med vand (0,5 ml). Den organiske fase blev overført til et rent 25 rør og tørret. Før GLC-analyse (gas-væske-chromatografi) blev resten opløst i acetone (0,1 ml). Alditolacetater blev analyseret på en SP2330 kapillar GLC-søjle (30 m x 0,25 mm) ved 235°C med flammeioniseringspåvisning. Carbohydratet i saponineme blev omdannet til trimethylsilerede methylglycosider ved opvarmning af 0,1 mg af prøven i methanolisk HC1 (0,3 ml) indeholdende 50 pg/ml inositol i 16 timer ved 80°C. Prøven 30 blev blæst til tørhed og resterende syre fjernet ved tilsætningen af t-butylalkohol (2 x 0,25 ml) efterfulgt af tørring med en luftstrøm. Den tørre rest blev opløst i en opløsning I . DK 175739 B1 I 24 I (0,2 ml) indeholdende pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan (5:1:0,5 I vol/vol, "Tri-Sil") og opvarmet i 20 minutter ved 80°C. Silyleringsreagenset blev ind- 1 I dampet ved stuetemperatur og resten opløst i hexan (1 ml). Efter fjernelse af den uoplø- I selige rest ved filtrering under anvendelse af glasuldsprop blev filtratet overført til et I 5 rent rør og inddampet. Resten blev opløst i hexan (0,2 ml) før analyse med GLC. De trimethylsilerede methylglycosider blev analyseret på en GLC-søjle af smeltet silica I DB1 (25 m x 0,25 mm) i 3 minutter ved 160°C efterfulgt af en 2°/minut forøgelse til I 200°C og derefter en 10°/minut forøgelse til 260°C med flammeioniseringspåvisning.

Η 10 Glycosidbindingsanalyse blev udført ved hjælp af den følgende metode: Der blev til

I prøven (= 1 mg), som var opløst i tørt dimethylsulfoxid (0,2 ml) sat 0,2 ml I

I kaliumdimethylsulfinylanion (2 M), og blandingen blev omrørt i 12 timer under argon. I

I Reaktionsblandingen blev afkølet i is, og methyljodid (0,2 ml) blev tilsat dråbevis. Den I

opnåede blanding blev lydbehandlet og omrørt ved stuetemperatur i en time. Det I

I 15 methylerede materiale blev isoleret under anvendelse af Sep-Pak C18-kassetter (eng: I

B cartridges), som var konditioneret med ethanol (20 ml), acetonitril (8 ml) og vand (10 I

B ml). Vand (1 ml) blev sat til methyleringsreaktionsblandingen, og det overskydende I

I methyljodid blev fjernet ved at lede nitrogen gennem opløsningen. Den klare opløsning I

I blev ført til kassetten, som var vasket med vand (8 ml) og 20% acetonitril (5 ml). Det I

B 20 methylerede materiale blev elueret fra kassetten med 100% acetonitril (4 ml) og etha- I

B nol (4 ml). Opløsningsmidlerne blev fjernet ved hjælp af en luftstrøm. Det tørrede I

B methylerede materiale blev behandlet med 0,3 ml "superdeuterid"-opløsning ved stue- I

B temperatur i 1 time for at reducere uronsyreresteme til de tilsvarende hexoser. Efter at I

B have ødelagt det overskydende reagens med iseddikesyre (0,1 ml) blev reaktionsbi an- I

B 25 dingen blæst til tørhed med 10% eddikesyre/methanol og blæst til tørhed to gange til. I

B Det opnåede reducerede methylerede materiale i methanol blev ført gennem en søjle af I

B Dowex - 50 W(H+), og det, der løb ud, blev tørret. Det reducerede methylerede mate- I

B riale blev omdannet til methyleret alditoler, som beskrevet i del 1 ovenfor og analyseret I

B ved hjælp af GLC (SP2330 smeltet silicasøjle (30 m x 0,25 mm), 3 minutter ved 170°C I

I 30 efterfulgt af 4°/minut til 240°C) og GLC-MS (SP2330 smeltet silicasøjle (30 m x 0,25 I

I mm), 2 minutter ved 80°C efterfulgt af 30°/minut til 170°C efterfulgt af 4°/minut til I

240°C efterfulgt af ophold ved 240°C i 10 minutter, massespektrumsanalyse på Hew- I

I DK 175739 B1 fulgt af ophold ved 240°C i 10 minutter, massespektrumsanalyse på Hewlett-Packard MSD).

På trods af ligheden i carbohydratsammensætningen adskiller fine forskelle de indivi-5 duelle saponiner, især fraværet af arabinose i QA-7 og formindsket glucose i QA-21 sammenlignet med de andre saponiner.

i

DK 175739 B1 I

26 I

9 I

o I

cn I

σΐ ° I

m co I

-oi-'iCMi-t-rot— i- '·- ' c <M U>

m . E I

® I

c i—i t- to tn r-· o cj ,· c

cg (Λ|ο c-iocm ao m to i— w M

i s: '-«·-**'· °* < H-| .-i O O *-« 0002 ·

ry C C

^ Od) ·

<J> CO O CO _ Ό TJ

e-t Cl «Η W » * ·— ' — ’ <1 oo σ> p- ·-< oo σ> · o ·- ·<

<] TH ,-1 00 rH 2 fsi -K -M

t! ** +* I

S ® ® I

C TD W

•r- I Cl ** CO c c C CClt-'^h-KrOl— l- 't- 33

o -r- -H Γ0 cj -p -p I

Cl ω "Dl Jr ^

to < o o I

w <n **- ^

1,-H OT CO «t t- rH CM

ni i (Λ|<Δ 00 OT O r-ι O (O t- J* -a< S ' 4)tø dj cr (-11-1 o o cm τ-ι^-ιο * tø 0> T3

c a> I

φ *- J2 I

L. t- (O r-l OT £_ [_ CM t~ O

Q_ - - - OD-' <u O I

O tf|CM(Dr-iOTQ.Q-OTP" i- ><

<1 ο n n <t cn tø cm cm tj - I

U_ C O)

η « t I

ω i ol «» co 4> Φ I

tø CC|t-'.,CM|-|-eO»-l- * ri +J I

>. -r- -r- O S* I

r· ω tjI g p I

(O C U I

C CO OT (O «3 tD (O O CM · ·“

(1) nj tH φ 1*·ΙΟΗ οοοώΗ c > I

oil yj| - <utø I

i— cnc silo oot-i o i-* o 2 ·σο I

ω c o i-l 3 ^

O CO i-M CO τ-H CM - c- 9 1— I

I— C ·. ·.„* « * h~ ^ 41 O) I

.f~ CM ΙΛ O t- CO <7> ·ΙΛ — £

O <tj (O Q) CO CO ¢0 Z CM “O O

< τ*< H ^ ^ L* I

cn pr? I

o* i σΐ „ £ c _ I

c c c ^ oo t- E u

•I- <- -I-I \— - CM <N H-OO 1— H- ~ fr- 0) W

CCOOlCO 2l£e I

L> . > c

Ol [— -r- d) T—1

tø T-H 00 O 00 i-1 OJ r ^ ,1^ I

Cl ϋ5|σι t-OOO 00 O LO I— (TJO I

as <r £1' i—

£C> i—I 1—i OOi-« O ^ O Z O O E I

c L Ό Φ I

« - c c I

tø CO Oirtoo 3 c I

ii »- « s- ja tu

m ^ O-IOH Ollfi OLOtl" I

< <1 CO t~-U5C0 tOCOZOJ ~Ό O Φ 1

-r-j «Ϊ1-· <-*·-+* -p I

5, w φ w I

o c o ot c a> I

o i cn ·< > > σ o

t_ c d u « o oo ci-OJ3 ro I

(0 ·!- ·»" >—' t~ 00 h- (— ' O CT L- 'T I

O 00 Ό 00 <M OJ Q.·- - o O

15 >, 4-> 4->

tø ^ tø -r- I

Λ I p- P~ t- lO ^ 00 * +> Q) 4·1 Ό I

I cn io Φ O O) P- O "β I— Dltot-tøf- < ε * 'Ο.* ' ' ' · s e«— o» cn

O1!— r-<0tø0 0t-*02'v>t-„ I

σ> α» w ·— e I

Ό a Ό o > o I

OM CM · trt — DUtø tø I

^ 'O' - * i— ** i— ^ o I

ro I <-i (00.00 HH · cm */ #i— o<l> I

et cn co tø σ> oooozoiiro»— σ>>·+* I

< r-l I

<d tø r— σι a> > I

ro o ·— to -t-1 ϋ

o. ro > c c tø Ό I

> i- r -c a: οι 3 I

ro o» tø o +> ε -l* i

φ tø tø C +>0)t-IIO) I

cn o o ω o tu -i-ea> Φσ> i

o 4) c 0) +J tø L. <U Ό ·Γ· V t i C I

C tø -1- OT O O 3 tø 1— t-1'Ο^-ι- I

E o jo o ro o o o < h i- η h oc I

touto·— r-33—

£ 3 I_ > «0 ·— ·— CL I

t-M-rox σι σ> σι to tojou όο> I

27 DK 175739 B1

Karakterisering af saponiner som detergenter

Den kritiske micellekoncentration af adjuvanser QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 blev bestemt ved hjælp af fremgangsmåden af DeVendittis et al. (DeVendittis, E., Palumbo, 5 G., Pariato, G. og Bocchini, V. (1981) Anal. Biochem. 115, 278-286) på følgende må de: Emissionsspektret af l-anilinonaphthalen-8-sulfonsyre (ANS) i vand blev bestemt ved tørvægtskoncentrationer af adjuvans i intervallet fra 0,01 til 0,10% (vægt/vol) for at dække intervallet under og over den kritiske micellekoncentration. Over den kritiske micellekoncentration stiger fluorescensudbyttet af ANS og bølgelængden for maksi-10 mumemission falder på grund af udskillelse af fluorescensfarvestoffet ind i micelleme.

Lignende kritiske micellekoncentrationer blev fundet for QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 i vand (henholdsvis 0,06%, 0,06%, 0,04% og 0,03%) med lidt lavere koncentrationer bestemt i phosphatpufret saltopløsning (henholdsvis 0,07%, 0,03%, 0,02% og 0,02%).

15

Fig. 9 viser gelfiltreringschromatografen for miceller, som er dannet af oprenset QA-18 og QA-21 (på Bio-Gel P-200 (6,6 mm ID x 90 cm højde)), i forvejen ækvilibreret i en koncentration af oprenset saponin ækvivalent med den kritiske micellekoncentration for den saponin i phosphatpufret saltopløsning for at forhindre monomermicellelige-20 vægten fra at reducere den tilsyneladende radius af micelleme). QA-18- og QA-21-mi-celler elueres med en størrelse som svarer til den af proteinet bovinserumalbumin.

Den hæmolytiske aktivitet af adjuvanseme blev bestemt ved hjælp af den følgende metode: Fortyndinger af adjuvanser QA-7, QA-8, QA-17, QA-18, QA-21 og Superfos 25 "Quil-A" blev foretaget på en rundbundet mikrotiterplade (75 μΐ per brønd). Røde blodlegemer fra får (SRBC), som var vasket tre gange med PBS, blev fortyndet til 4% med PBS. SRBC (25 μΐ) blev sat til hver brønd og blandet med adjuvans. Efter inkubering ved stuetemperatur i 30 minutter blev pladerne roteret ved 1000 o/m 5 minutter i en Sorvall RT6000, H-1000 rotor, for at sedimentere ikke-hæmolyserede celler. 50 μΐ af 30 supematanten fra hver brønd blev overført til den samme brønd i en fladbundet mikrotiterplade og fortyndet til 200 μΐ med HzO. Absorbans blev bestemt ved 570 nm med en I DK 175739 B1 I '28 I Dynatech-mikrotiterpladelæser (fig. 9). Hæmolyse forøgede absorbansen ved 570 nm j I på grund af frigivelse af hæmoglobin fra de lyserede celler. Signifikante forskelle i hæmolyse blev iagttaget mellem adjuvanser. QA-17, QA-18, QA-21 og Superfos I "Quil-A" forårsagede delvis hæmolyse ved koncentrationer så lave som 25 pg/ml, I 5 hvorimod der blev iagttaget delvis hæmolyse med QA-8 ved 150 pg/ml. Der blev ikke I iagttaget nogen hæmolyse med QA-7 ved de undersøgte koncentrationer (200 pg/ml og I mindre).

I Eksempel 6 (Sammenligning) I 10 ISOLERING AF TOKSISK QA-19 I Den toksiske komponent QA-19 chromatograferes sammen med QA-18 på silica og er I beriget i silicafraktioner 31-60. Disse fraktioner blev bragt sammen og flashinddampet

I før yderligere oprensning. Fig. 4C viser adskillelsen af QA-19 fra QA-18 ved HPLC

I 15 med omvendt fase på Vydac C4 (10 mm ID x 25 cm L) under anvendelse af en metha- nolgradient. Fraktioner, som eluerede med en retentionstid på mellem 50-52 minutter, H blev identificeret som QA-19 ved TLC med omvendt fase og analytisk HPLC og bragt

sammen for yderligere karakterisering. QA-19 kunne yderligere adskilles i to toppe ved I

genoprensning i en lavere methanolgradient, idet toppen med kortere retentionstid be- 20 tegnes QA-19a, og toppen med længere retentionstid betegnes med QA-19b. Carbo-

hydratanalyse af top QA-19a, som er mere toksisk hos mus end QA-19b viser en car- I

bohydratsammensætning, som ligner sammensætningen af de andre saponiner (tabel 3). I

Eksempel 7 (Sammenligning) I

I 25 ISOLERING AF ALKALISK HYDROLYSEPRODUKT

Behandling af QA-18 ved kort alkalisk hydrolyse gav et carbohydratholdigt alkalisk I

hovedhydrolyseprodukt (betegnet QA-18 H). Oprenset QA-18 H blev fremstillet ud fra I

QA-18 og isoleret på den følgende måde: I

30 DK 175739 B1 29

En ml QA-18 (5 mg/ml) blev inkuberet med 25 μΐ 1 N NaOH i 15 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 100 μΐ 1 N eddikesyre. Under anvendelse af disse hydrolysebetingelser blev QA-18 fuldstændig omdannet til et ho-vedhydrolyseprodukt (QA-18 H), som eluerede i en top med retentionstid på 8,0 minut-5 ter sammenlignet med 66,8 minutter for ikke-hydrolyseret QA-18, hvilket viser den forøgede hydrofilicitet af QA-18 H. (Chromatografi på Vydac C4 (4,6 mm ID x 25 cm L) i 0,1% tri fluoreddikesyre i 55/45 methanol/vand (vol/ vol) og elueret i en gradient til 64/36 methanol/vand (vol/ vol) i løbet af 180 minutter, strømningshastighed på 1 ml/-minut), Toppen indeholdende ren QA-18 H (retentionstid 8,0 minutter) blev bragt sam-10 men for yderligere karakterisering. Hydrolyseproduktet af QA-21 betegnet QA-21 H, blev fremstillet og oprenset på den samme måde. QA-21 H havde en retentionstid på 9,3 minutter sammenlignet med 80,4 minutter for ikke-hydrolyseret QA-21. Disse hydrolyseprodukter blev vist ved retentionstid på HPLC og ved tyndtlagschromatografi med omvendt fase at være identiske med hovedhydrolyseprodukteme, som blev frem-15 stillet under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Higuchi et al., Phytochemistry 26: 229 (1987) under anvendelse af mild alkalisk hydrolyse i NH4HCO3 (tabel 4). Endvidere blev disse produkter, QA-18 H og QA-21 H, vist at være hovednedbryd-ningsprodukteme fra hydrolyse af "Quil-A", en råsaponinblanding indeholdende QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 såvel som andre saponiner, hvilket viser, at hydrolysepro-20 dukteme QA-21 H og QA-18 H er de samme hydrolyseprodukter, som blev isoleret af Higuchi et al, supra, til strukturkarakterisering. QA-18 H og QA-21 H blev bevaret for yderligere karakterisering af adjuvansaktivitet.

TABEL 4 25 Alkaliske hvdrolvsehovedprodukters retentionstid QA-17 H 8,0® QA-18 H 8,0® 8,2b 30 QA-21 H 9,3® 9,5b I DK 175739 B1 j I 30

I Hydrolyseret - "Quil-A" 8,2a, 9,3* I

I “Cambridge BioScience-hydrolysebetingelser: 5 mg/ml saponin, pH-værdi 13, reakti- I

I onstid = 15 minutter ved stuetemperatur. I

I I

I bHiguchi et al. hydrolysebetingelser: 5 mg/ml saponin, 6% NH4HCO3, methanol/H20 I

I (1 /1, vol/vol) reaktionstid = 60 minutter ved 100°C. I

I HPLC-betingelser: Vydac C4,5 pm partikelstørrelse, 300 Å I

I 10 porestørrelse, 0,46 x 25 cm I

I Opløsningsmiddel A = 0,1% trifluoreddike- I

syre i vand I

I Opløsningsmiddel B - 0,1% trifluoreddike- I

i 5 syre i methanol I

I Gradient = 55 - 64% B/180 minutter I

I Strømningshastighed -1 ml/min I

I 20 Eksempel 8 I

UNDERSØGELSE AF ADJUVANSVIRKNING UNDER ANVENDELSE I

I AF BSA SOM ANTIGEN I

I Kort beskrevet bedømmes adjuvansvirkning ved forøgelse i an ti gen-specifikke antistof- I

25 titre, som skyldes tilsætningen af mulig adjuvans i immuniseringsformuleringen. For- I

øgede titere er et resultat af forøgede antistofkoncentrationer og/eller forøget antigen/- I

antistof-affinitet. Saponiners adjuvansvirkninger er tidligere blevet målt ved forøgelse i I

titer af neutraliserende antistoffer over for mund- og klovsygevacciner i marsvin (Dals- I

gaard K., Archiv. fur die gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974)), forøgelse i titer I

30 af præcipiterende antistoffer over for BSA (som målt ved radial immunodiffusion) i I

marsvin, som var vaccineret med BSA/saponin-blandinger (Dalsgaard K., Acta Veteri- I

DK 175739 B1 31 naria Scandinavica 69, 1-40 (1978)), såvel som ved forøgelsen i titer af antistof over for "keyhole limpet hemocyanin” (KLH) (målt ved hjælp af ELISA) hos mus, som var immuniseret med KLH/saponin (Scott, M.T., Gross-Samson, M. og Bomford, R., Int.

' Archs. Allergy Appl. Immun. 77:409-412 (1985)).

5

Bedømmelse af adjuvansvirkning ved denne undersøgelse blev bestemt ved forøgelse i antistof over for BSA efter immunisering med BSA/saponin sammenlignet med immunisering med BSA ved fravær af saponin. Adjuvansaktiviteten i den oprensede fraktion blev målt på følgende måde: CD-I-mus (8-10 uger gamle) blev immuniseret intrader- 10 malt med den følgende formulering: 10 pg BSA (Sigma 7030, fedtsyrefri) og Quillaja- i I adjuvans (ved doser i intervallet ffa 1,5-45 pg carbohydrat som målt ved hjælp af an- j thron) i 200 pi PBS. Sera blev indsamlet to uger efter immunisering. Antistof mod i BSA blev bestemt ved ELISA: Immulon Il-plader blev coated natten over ved 4°C med 100 ml fedtsyrefri BSA (10 pg/ml i PBS) i rækker A, C, E og G. Pladerne blev vasket 15 to gange med PBS. Ikke-specifik binding blev forhindret ved inkubering i 1,5 time ved 37°C med 100 pi fortyndingsmiddel (2% caseinsyrehydrolysat (Oxoid, vægt/vol) i PBS) per brønd i alle brønde. Plader blev vasket fire gange med 0,05% Tween 20 i destilleret vand. Sera i fortyndinger på 10, 102, 103 og 104 blev inkuberet i rækker hen-! holdsvis A + B, C + D, E + FogG + H(100 pl/brønd) i en time ved stuetemperatur.

20 Plader blev vasket som beskrevet ovenfor. Boehringer Mannheim peberrodsperoxida-sekonjugat-gede-antimuse-antistof (1/5000 i 5% BSA i fortyndingsmiddel) blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur (100 pi per brønd, alle brønde). Plader blev vasket som beskrevet ovenfor. Omfanget af peroxidasereaktion blev bestemt ved omsætning med 2,2-azino- bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat (30 minutters reaktion ved . 25 stuetemperatur, absorbans målt ved 410 nm) eller med 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (10 j minutters reaktion ved stuetemperatur, absorbans målt ved 450 nm). Bidraget af ikke- specifik antistofbinding til den samlede antistofbinding blev fjernet ved fratrækning af absorbansen af den antigen-negative brønd fra absorbansen af den antigen-positive brønd for hver serafortynding. Absorbansen på grund af antigen-specifik binding blev 30 optegnet som en funktion af logaritmen af serafortyndingen. (Fig. 11) Typiske ende-punktstitere var typisk ved en serafortynding på 10 eller mindre for immunisering ved I DK 175739 B1 I 32 fravær af adjuvans og var så høje som 103 ved tilstedeværelse af saponinadjuvans. Dia- I lyseret, methanolopløseligt barkekstrakt ved en adjuvansdosis på 12 pg carbohydrat el- I ler højere (carbohydrat analyseret ved anthron) forøgede titere med 2 størrelsesordener I sammenlignet med BSA i PBS. En god adjuvansvirkning blev iagttaget ved doser af I 5 "Quil-A" på mellem 9-23 pg carbohydrat.

I Eksempel 9 I ADJIJVANSUNDERSØGELSE AF HPLC-OPRENSEDE EKSTRAKTKOMPO-

NENTER

I 10 I Ved hjælp af de i eksempel 8 beskrevne kriterier har toppene QA-7, QA-11, QA-12, I QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19 og QA-20 forskellige adjuvansvirkningsgrader, I idet QA-15, QA-17, QA-18, QA-19 og QA-20 er særlig effektive ved en dosis på 3,0 I pg carbohydrat i dette særlige forsøg. På grund af det lille antal mus, som blev anvendt I 15 per immunisering (2) og den naturlige variation i immunreaktion mellem de enkelte mus, kan dette ikke anvendes til kvantitativt at bedømme den relative adjuvansvirkning af disse toppe. Den giver imidlertid en kvalitativ bedømmelse af tilstedeværelsen af ad- juvansaktivitet. Det bør også bemærkes, at fraværet af tilsyneladende virkning med QA-2, QA-3, QA-10, QA-13 og QA-14 ikke udelukker en adjuvansvirkning ved andre 20 adjuvansdoser eller adjuvans/protein-forhold.

H Yderligere adjuvansundersøgelser blev udført med QA-7, QA-17 og QA-18 ved for- H skellige protein/adjuvans-forhold. Generelt blev der iagttaget en god adjuvansvirkning for QA-7, QA-17 og QA-18, når de blev anvendt ved protein-adjuvans-forhold (protein 25 vægt/carbohydratvægt) på omtrentlig 3:1 til 9:1 (fig. 12). QA-21 (kun undersøgt ved denne undersøgelse ved protein/ carbohydrat-vægt på 6:1) udviste også en adjuvans- virkning. Det bør imidlertid bemærkes, at det korrekte forhold mellem adjuvans og pro- tein for optimal immunreaktion er en funktion af både den særlig anvendte saponinad- juvans og det særlig anvendte antigen. Adjuvansforbindelse med antigen spiller en vig- 30 tig rolle for saponinadjuvanseffektens virkningsmekanisme. I tilfældet med saponinbin- ding til protein er hydrofobe interaktioner den dominerende faktor. Forskelle i hydro- DK 175739 B1 33 fobicitet mellem de HPLC-oprensede adjuvanser vil således påvirke bindingskonstanten til hydrofobe proteiner. Endvidere vil antallet af hydrofobe bindingssteder på proteinet også påvirke evnen til at forbinde sig med saponinadjuvanser. Det er således nødvendigt at bestemme den optimale adjuvansdosis for hvert enkelt adjuvans og hvert 5 enkelt antigen. En sådan optimering er også inden for fagmandens område.

HPLC-oprensede adjuvanser blev også sammenlignet med "Freund's Complete adjuvant" og viste sig at resultere i et lignende immunreaktionsniveau (fig. 12, del b).

10 Eksempel 10

FREMSTILLING AF REKOMBINANT FELV-GP70R-DELTA

Inklusionslegemefremstilline 15 Den rekombinante E. coli-klon RI 6-38 blev dyrket i LB-medium suppleret med 1% glucose og 0,1% casaminosyrer ved 32°C til en optisk densitet (560 nm) på 0,4-0,6.

Kulturen blev derefter overført til 42°C og inkuberet i yderligere 2 timer. Ved afslutningen af dette tidsrum blev cellerne opsamlet ved centrifugering ved 4000 g i 30 minutter, vasket med 50 Tris HC1, pH-værdi 7,5 og endelig gensuspenderet i 200 ml 50 20 Tris HC1, hvortil der var sat 1 ml 0,1 M phenylmethylsulfonylfluorid i isopropanol (slutkoncentration = 0,5) og 0,4 ml 5 mg/ml aprotinin (slutkoncentration = 10,0 pg/ml).

Cellerne blev lyseret ved enzymatisk fordøjelse med lysozym (slutkoncentration = 0,5 mg/ml) i nærværelse af 0,2% Triton X-100. Efter omrøring i 30 minutter blev 2 ml MgC12 (0,5 M), 5 ml DNasel (1 mg/ml) og 1 ml 0,1 M phenylmethylsulfonylfluorid 25 tilsat. Efter omrøring i 30 yderligere minutter blev 40 ml EDTA (0,25 M, pH-værdi 7,5) og 4 ml Triton X-100 (10% vægt/vol) tilsat. Præparatet blev centrifugeret ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4°C og pelleten blev gensuspenderet i 50 ml 50 Tris HC1, pH-værdi 7,5. Pelleten blev homogeniseret ved lav hastighed i 15 minutter. Lysozym blev tilsat til en koncentration på 0,5 mg/ml og 0,6 ml 10% Triton X-100 blev tilsat. Ef-30 ter omrøring i 15 minutter blev 10 ml MgCl2 (0,5 M) og 1 ml DNase I (1 mg/ml) tilsat og omrøring blev fortsat i yderligere 15 minutter. Efter indstilling af volumenet til 300 I DK 175739 B1 I 34 I ml med 50 Tris, pH-værdi 9,0, blev 40 ml 10% Triton X-100 og 51,2 ml EDTA (0,25 I M, pH-værdi 7,5) tilsat, og slutvolumenet blev indstillet til 400 ml med 50 Tris, pH- I værdi 9,0. Efter omrøring i 30 minutter blev suspensionen centrifugeret ved 10.000 x g

i 30 minutter ved 4°C og pelleten blev gensuspenderet i 400 ml 50 Tris HC1, pH-værdi I

I 5 7,5, indeholdende 4 M urinstof, 50 EDTA og 1 % Triton X-100. Efter omrøring i 15 mi- I

I nutter blev suspensionen suspenderet ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4°C og pelleten I

I blev gensuspensionen i 400 ml 50 Tris HC1, pH-værdi 7,5, indeholdende 1,0 M NaCl. I

I Efter omrøring i 15 minutter blev suspensionen centrifugeret ved 10.000 x g i 30 mi- I

I nutter ved 4°C, og pelleten blev gensuspenderet i 400 ml 50 Tris HC1, pH-værdi 7,5, I

I 10 indeholdende 6 M urinstof, og 5 EDTA. Efter omrøring i 15 minutter blev suspensio- I

I nen centrifugeret ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4°C. På dette punkt blev inklusions- I

legemepelleten enten frosset til senere brug eller opløseliggjort i 50 Tris HC1, pH-værdi I

I 9,5, indeholdende 6M guanidin HC1, 50 EDTA og 0,5% beta- mercaptoethanol. I

H gp70R-deltapolypeptidet blev derefter oprenset ved en af metoderne ifølge eksempel I

15 11 nedenfor. I

I Eksempel 11 I

I OPRENSNING AF REKOMBINANT FELV-GP70R-DELTA I

20 Procedure I I

I i I

Det opløseliggjorte protein fra eksempel 8 blev dialyseret mod 6 M urinstof, 50 I

I Tris-Cl, pH-værdi 8,0, 5 EDTA og 1 dithiothreitol (DTT). Ca. 120 mg af proteinet blev I

påført en CM-TSK- søjle (EM Science, 1,5 cm ID x 4 cm), som var ækvilibreret med I

25 den samme puffer. Proteinet blev elueret med en lineær gradient af NaCl (0-1,0 M i I

150 ml) i den samme puffer. Fraktionerne blev opsamlet og analyseret ved elektrofore- I

. se på 10% SDS-polyacrylamidgeler. Coomassie-pletning blev anvendt til at identificere I

gp70R-deltaproteinet. Fraktioner 25-31, der elueredes ved ca. 0,1 M NaCl blev bragt I

sammen og anvendt til immunisering. I

I I

DK 175739 B1 35

Procedure II

For at formindske hydrofobiciteten af gp70R-delta blev sulfhydrylgruppeme alkyleret 5 med jodacetamid og lysinresteme blev N-acyleret med citraconsyreanhydrid. Proteinet, der var fremstillet som i eksempel 8, blev opløseliggjort i 6 M guanidin-HCl i 50 mM borat, pH-værdi 9,0, 0,5% beta-mercaptoethanol (vol/vol). Jodacetamid tilsættes i et molært forhold på 1:1 (jodacetamid:samlede sulfhydrylgrupper). Alkyleringen blev udført i mørke i 1 time ved stuetemperatur. Alkyleringen af alle sulfhydrylgrupper (i pro-10 teinet og beta-mercaptoethanol) blev registreret med DTNB (Ellman's reagens) for at sikre fuldstændig alkylering. Proteinkoncentrationen blev indstillet til 2 mg/ml.

Proteinet blev citraconyleret i mørke ved tilsætning af citroconsyreanhydrid (0,0022 ml per mg protein, ca. 50 molær overskud i forhold til frie lysiner). Præparatet blev dialy-15 seret flere gange i mørke mod 50 mM borat, pH-værdi 9,0. Fuldendelsen af acyleringen af proteinlysingruppeme blev bestemt ved omsætning med trinitrobenzensulfonsyre (TNBS), som måler resterende frie lysingrupper. TNBS (200 μΐ af 10 mM) blev sat til 200 pg alkyleret, citraconyleret, dialyseret gp70R-delta i 1 ml 50 M natriumborat, pH-værdi 9,0. Blandingen blev inkuberet i 2 timer i mørke ved 40°C, reaktionen blev 20 standset med 0,5 ml 1 N HC1 og 0,5 ml 1% SDS, og absorbansen blev aflæst ved 340 nm. Koncentrationen af TNP-lysin blev bestemt under anvendelse af en molær ekstink-tionskoefficient på 10.400.

Oprensningen af det alkylerede, citraconylerede gp70-delta blev udført ved pH-værdi 25 9,0 for at forhindre afblokering af lysingrupper. Der blev tilsat urinstof ved en slutkon- centration på 4 M til det modificerede protein. Proteinet blev koncentreret til 3 mg/ml ved ultrafiltrering og påført en Sepharose 6B-Cl-søjle (1,5 x 86 cm). gp70R-delta-pro-teinet blev elueret ved en strømningshastighed på 6,6 ml/time med 4 M urinstof, 50 mM natriumborat, pH-værdi 9,0. Fraktioner (5,3 ml/fraktion) blev opsamlet, og 30 gp70R-deltaet blev bestemt ved proteinanalyse og SDS-polyacrylamidelektroforese til at være i fraktioner 13-15.

DK 175739 B1 36

Citraconyleringen af gp70R-delta blev vendt om ved dialysering af 5 ml alkyleret, ci-traconyleret gp70R-delta (1,0 mg/ml) mod 6 M urinstof i 50 mM natriumcitrat, pH-værdi 5,5, i 48 timer ved stuetemperatur. gp70R-deltaet blev dialyseret mod 6 M urinstof i 100 mM natri umbicarbonat, pH-værdi 8,0, og proteinkoncentrationen blev ind-5 stillet til 0,8 mg/ml før absorption til aluminiumhydroxid.

I Procedure III

I Der udvikledes en modifikation af den ovenfor nævnte oprensning af alkyleret, citraco- I 10 nyleret gp70R-delta. Kort beskrevet modificeres alkyleret, citraconyleret gp70R-delta og dialyseres mod 50 mM natriumborat, pH-værdi 9,0 som ovenfor beskrevet. Urinstof blev tilsat til en slutkoncentration på 8,0 M. Proteinet blev koncentreret ved ultrafiltre- H ring med en PM-30- membran til opnåelse af 2,5 mg protein/ml. Proteinopløsningen blev påført en Sephacryl S-400-søjle (1,5 x 90 cm) i en 50 mM natriumboratpuffer, 15 pH-værdi 9,0, indeholdende 8 M urinstof og elueret med den samme puffer. Fraktioner I (2,9 ml/fraktion) blev opsamlet, og fraktioner 34-37 indeholdende gp70R-delta blev bragt sammen. 21 mg af proteinet fra disse fraktioner blev fortyndet til en slutkoncen- H tration på 4 M urinstof med 50 mM natriumborat, pH-værdi 9,0, og påført en DEAE-TSK-søjle (1,5 x 11 cm). Proteinet blev elueret med en lineær NaCl-gradient 20 (0-0,5 M) i 50 mM natriumborat, pH-værdi 9,0, indeholdende 4M urinstof. 3 ml frakti- H oner blev opsamlet. Fraktioner 89-95 indeholdende gp70R-delta blev bragt sammen og 15 mg gp70R-delta blev udvundet.

Eksempel 12

I 25 IMMUNISERING MED ALUMINIUMHYDROXID-ABSORBERET

I GP70R-DELTA

H Aluminiumhydroxid, som har vist sig at have en adjuvansvirkning for mange proteiner I

H og er almindeligt anvendt i vacciner blev anvendt som en bærer for gp70R-delta. I

H 30 gp70R-delta, som var fremstillet ved procedure I beskrevet i eksempel 11 ovenfor, ab- · I

sorberes tæt til 10% aluminiumhydroxid i nærværelse af 50 mM Tris-Cl, pH-værdi 8,0 I

DK 175739 B1 37 indeholdende 6 M urinstof. Ca. 3 pg gp70R-delta blev absorberet per 100 pg aluminiumhydroxid. gp70R-deltaet, som var absorberet til aluminiumhydroxidet, blev vasket med phosphatpufret saltopløsning (PBS), gensuspenderet i PBS og anvendt til immunisering af dyr.

5 CD-I-mus (8-10 uger gamle) blev immuniseret intradermalt med gp70R-delta, som var absorberet til Al(OH)3 i et samlet volumen på 200 μΐ PBS i nærværelse og fravær af HPLC-oprensede saponiner QA-17 eller QA-18 eller en blanding af QA-17 og QA-18.

20-25 pg gp70R-delta blev injiceret per dosis. HPLC-oprensede saponiner, QA-17 eller 10 QA-18 eller en blanding af QA-17 og QA-18 blev anvendt i en tørvægtsdosis på 10 pg.

To mus blev injiceret for hver formulering. Mus blev indgivet en boosterinjektion af gp70R-delta/aluminiumhydroxid seks uger efter den indledende injektion. Musesera blev analyseret for reaktivitet over for FEA, en FeLV-undergruppe A, 2,4 og 8 uger efter immunisering ved hjælp af en ELISA-immunoanalyse. Fire uger efter immunisering 15 blev der iagttaget en anti-FeLV-reaktion, som var fremkaldt af det rekombinante gp70-delta. HPLC-oprensede saponinadjuvanser QA-17 og QA-18 forstærkede denne reaktion. Reaktionen var to størrelsesordener større fire uger efter immunisering i nærværelse af QA-17 sammenlignet med immunisering ved fravær af saponinadjuvans. Resultaterne fra dette forsøg er vist på fig. 13.

20

Anti-FEA-antistof blev analyseret ved hjælp af en ELISA-analyse. FEA-virus (10 pg/ml i PBS) blev absorberet på Immunolon. Il-plader natten over ved 4°C (100 pl/-brønd). Pladerne blev vasket med PBS og ikke-specifik antistofbinding blev blokeret ved inkubering i 1 time med 10% normalt gedeserum i PBS (100 pl/brønd) ved stue-25 temperatur. Pladerne blev derefter vasket med 0,05% Tween-20 i destilleret vand. Sera blev fortyndet i 10% normalt gedeserum i PBS og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur på pladen ved serumfortyndinger på 10, 102, 103 og 104 (100 pl/brønd). Efter vask af pladerne ved 0,05% Tween-20 i destilleret vand blev de inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med 100 pl/brønd af peroxidase-konjugeret gede-anti-muse-IgG 30 (Boehringer-Mannheim), som var fortyndet 1/5000 i PBS. Efter vask af pladerne med 0,05% Tween-20 i destilleret vand blev mængden af IgG-binding bestemt ved hjælp af I DK 175739 B1 I 38 peroxidasereaktion med 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin ud fra absorbansen ved 450 nm bestemt på en Dynatech-mikrotiterpladelæser.

I Eksempel 13 I 5 IMMUNISERING MED ALUMINIUMHYDROXID-ABSORBERET ALKYLE-

I RET

I GP70R-DELTA

I CD-I-mus (8-10 uger gamle) blev immuniseret intradermalt med 15 pg/dosis alkyleret 10 gp70R-delta, som var oprenset ved hjælp af procedure II beskrevet i eksempel 11 (ab- sorberet til aluminiumhydroxid, som beskrevet i eksempel 12) i 200 μΐ PBS. HPLC-op- rensede adjuvanser QA-7, QA-17, QA-18 og blandinger af de tre adjuvanser blev an- vendt i en tørvægtsdosis på 10 pg. Tre mus blev injiceret for hver formulering. Musese- rum blev analyseret ved hjælp af ELISA 2 og 4 uger efter immunisering for reaktivitet 15 over for FEA, som beskrevet i eksempel 10. Som ved immunisering med ikke-modifi- ceret gp70R-delta som vist i eksempel 10 fremkalder immunisering med alkyleret gp70R-delta en anti-FeLV-viral reaktion fire uger efter immunisering. HPLC-oprense- de adjuvanser QA-7, QA-17, QA-18 forøger alle immunreaktionen sammenlignet med immunisering ved fravær af saponinadjuvanseme. QA-17 og blandinger af QA-17 og 20 QA-18 inducerede den største reaktion, idet de inducerede endepunktstitere, som næ- sten var to størrelsesordener større end ved immunisering i fravær af saponinadjuvan- ser. Resultaterne fra disse forsøg er opsummeret på fig. 14.

Eksempel 14 | I

I 25 TOKSICITET AF QA-7, QA-17, QA-18, QA-19, QA-21 og "QUIL-A"

Med rå-Quillaja-saponiner fremkommer et hovedtoksicitetssymptom hos mus som ne- I

H crose af leveren. Oprensede saponiner blev injiceret i mus for at bestemme virkninger- I

ne på leveren. Mus blev injiceret intradermalt med 150 pg af QA-7, QA-17, QA-18, I

H 30 QA-21 og "Quil-A", råsaponinekstrakten, som blev anvendt som råmaterialet for op- I

H rensning af de andre bestanddele. Dyr, som var injiceret med QA-7, QA-17, QA-18 og I

DK 175739 B1 39 QA-21 forekom lettere syge indledningsvis, men så ud til at komme sig fuldstændigt i løbet af få timer efter injektion. "Quil-A" forårsagede alvorlige symptomer som fortsatte i 48 timer. Alle mus blev aflivet efter 48 timer for post-mortem-undersøgelse af leveren. "Quil-A" forårsagede alvorlig skade på leveren med tydelige multifocale områder 5 med akut necrose. QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21 så ikke ud til signifikant at påvirke leveren. QA-17 og QA-18 blev også undersøgt i killinger med subkutan injektion af 100 pg af hver ved 8 og 10 uger, idet der ikke blev iagttaget nogen toksicitet klinisk eller i blodkemien. I modsætning dertil inducerede "Quil-A" en pyrogen reaktion, som vedvarede i flere uger i killingerne. De oprensede saponiner ser således ud til at være 10 mindre toksiske end "Quil-A" i både mus og killinger, hvilket indikerer, at oprensningsprocessen adskiller disse saponiner fra en eller flere toksiske komponenter, som er til stede i et Quillaja-råekstrakt. En sådan toksisk komponent er forsøgsvis blevet identificeret som QA-19. Doser på 50 pg eller større var lethale hos mus i løbet af få dage fra injektion. Yderligere oprensning af QA-19 viste, at det kunne adskilles i to toppe 15 QA-19a og QA-19b. QA-19a var lethal hos mus i doser på 100 pg eller større, hvorimod QA-19b tilsyneladende var ikke-lethale op til en dosis på 150 pg. Således kan en synergistisk virkning til frembringelse af forøget toksicitet i blandingen af QA-19a og QA-19b ikke udelukkes. Indledende screening af andre mindre toppe, som er isoleret fra "Quil-A" viser, at andre fraktioner også kan være toksiske. Således muliggør op-20 rensningsprotokolleme adskillelsen af adjuvans-aktive saponiner fra lignende men forskellige forbindelser, som er mere toksiske eller som co-chromatograferer med toksiske forureninger.

Eksempel 15 (Sammenligning) 25 QA-18H og QA-21H, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 7 blev undersøgt for adjuvansvirkning sammen med BSA i direkte sammenligning med de ikke-hydrolyse-rede oprindelige produkter QA-18 og QA-21, som var fremstillet som beskrevet i eksemplerne 3 og 4. QA-18 og QA-21 forøgede den humorale immunreaktion over for 30 BSA hos mus med i det mindste en størrelsesorden 2 uger efter immunisering. Hydro-lyseprodukteme QA-18H og QA-21H forøger ved den samme vægtdosis imidlertid ik-

I DK 175739 B1 I

I 40 I

I ke reaktionen signifikant (fig. 15). Således iagttages optimal adjuvansvirkning med de I

I intakte saponiner. Den essentielle struktur, som er nødvendig for adjuvansaktivitet, mi- I

I stes eller ændres, når QA-18 og QA-21 hydrolyseres til henholdsvis QA-18H og I

I QA-21H. I

I I

Efter at opfindelsen nu er blevet fuldstændigt beskrevet vil det fremgå for en fagmand I

I inden for området, at der kan foretages mange ændringer og modifikationer deraf, uden I

I at afvige fra ånden eller omfanget af opfindelsen, som beskrevet i de efterfølgende I

I krav. I

I 10 I

Claims (12)

1. I alt væsentligt ren saponin, der kan opnås fra en rå Quillaia saponaria-ekstrat. hvil-5 ken saponin fremkommer som en top ved analyse af ekstrakten ved omvendt fase- HPLC på en Vydac C4-søjle med en partikelstørrelse på 5 pm, porer på 330 Å, 4,6 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, idet saponinen har immunadjuvan-saktivitet og er mindre toksisk som en adjuvans end Quillaia sanonaria-ekstrakten. til 10 anvendelse som en immunadjuvans.

2. I alt væsentligt ren QA-7-saponin, der kan opnås fra en rå Quillaia saponaria-eks-trakt, hvilken saponin fremkommer som en top betegnet QA-7 i figur 1 på omvendt fa-se-HPLC på en Vydac C4-søjle med en partikelstørrelse på 5 μτη, porer på 330 Å, 4,6 15 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42; vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml /minut.

3. I alt væsentligt ren QA-7-saponin, der kan opnås fra en rå Quillaia saponaria-eks-trakt, idet saponinen har en angivet omtrentlig pseudomolekylionmasse på 1870 ved 20 massespektroskopi-hurtigt atombombardement (MS-FAB).

4. I alt væsentligt ren QA-17-saponin, der kan opnås fra en rå Quillaia saponaria-eks-trakt, hvilken saponin fremkommer som en top betegnet QA-17 i figur 1 på omvendt fase-HPLC på en Vydac C4-søjle med en partikelstørrelse på 5 μτη, porer på 330 Å, 4,6 25 mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, vol/vol) ved en strømningshastighed på l ml/minut til anvendelse som en immunadju-_vans.

5. I alt væsentligt ren QA-17-saponin, der kan opOOOnås fra en rå Quillaia saponaria-30 ekstrakt, hvilken saponin har en angivet omtrentlig pseudo-molekylionmasse på 2310 I DK 175739 B1 I Η I I I ved massespektroskopi-hurtigt atombombardement (MS-FAB) til anvendelse som en I I immunadjuvans. I I

6. I alt væsentligt ren QA-21-saponin, der kan opnås fra en rå Ouillaia saponaria-eks- I I 5 trakt, hvilken saponin fremkommer som en top betegnet QA-21 i figur 1 på omvendt I I fase-HPLC på en Vydac C4-søjle med en partikelstørrelse på 5 μπι, porer på 330 Å, 4,6 I I mm ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, I vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml/minut. I I 10

7. I alt væsentligf ren QA-21-saponin, der kan opnås fra en rå Ouillaia saponaria-eks- I I trakt, hvilken saponin har en angivet omtrentlig pseudo-molekylionmasse på 1988 ved I massespektroskopi-hurtigt atombombardement (MS-FAB). I

8. I alt væsentligt ren saponin, der kan opnås fra en rå Ouillaia saponaria-ekstrakt. I 15 hvilken saponin fremkommer som en top ved analyse af ekstrakten ved omvendt fase- I I HPLC på en Vydac C4-søjle med en partikelstørrelse på 5 μπι, porer på 330 Å, 4,6 mm I I ID x 25 cm L i et opløsningsmiddel af 40 mM eddikesyre i methanol/vand (58/42, I vol/vol) ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, hvilken saponin har immunadju- I vansaktivitet og er mindre toksisk som en adjuvans end Ouillaia saponaria-ekstrakten. I I 20 hvilken i alt væsentligt rene saponin er forskellig fra en saponin betegnet QA-17, idet I saponinen betegnet QA-17 har formlen: I I “ r ,9¾ I γκΓκ 7 m hoT-o.® i I «. Tj v3/ I I tt · - *« i I DK 175739 B1

9. Anvendelse af i alt væsentligt ren saponin ifølge ethvert af kravene I til 8 til fremstilling af et middel til forøgelse af en immunreaktion i et individ over for et antigen.

10. Farmaceutisk sammensætning, der er nyttig til induktion af produktionen af anti-5 stoffer over for et antigen i et individ omfattende en immunogent effektiv mængde af et antigen samt en i alt væsentligt ren saponin ifølge ethvert af kravene 1 til 8 i en mængde, som er tilstrækkelig til at forøge immunreaktionen hos individet over for antigenet.

11. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 10, hvori individet er et menneske eller 10 et dyr.

12. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 10, hvor antigenet er et GP70-holdigt protein.