DK175731B1

DK175731B1 - Præparat til anvendelse ved sammenbinding af dele af levende mineraliseret væv

Info

Publication number: DK175731B1
Application number: DK198901280A
Authority: DK
Inventors: Lars Hammarstroem; Leif Blomloef; Sven Lindskog
Original assignee: Bioventures B V
Priority date: 1988-03-17
Filing date: 1989-03-16
Publication date: 2005-02-07
Also published as: YU55389A; DK128089D0; SE8800980D0; EP0337967B1; KR0175138B1; PL278257A1; FI90011B; NO904023L; HUT54884A; MX170499B; NZ228309A; DE68906455T2; RU2008915C1; CZ284330B6; HUT58199A; US5098891A; NO178284B; SK163789A3; DK128089A; NO904023D0

Description

DK 175731 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår et præparat til anvendelse ved sammenbinding af dele af mineraliseret væv ved nydannelse af mineraliseret væv på mindst én af delene, men eventuelt også på den anden del. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremkaldelse af sådan binding, fx til behandling af periodontitis.

5

Den foreliggende opfindelse angår en ny, biologisk baseret teknik, som er nyttig til tilvejebringelse af binding mellem dele af mineraliseret væv, fx tænder og knogle.

Selv om opfindelsen er generelt anvendelig til tilvejebringelse af en sådan binding, vil den i den foreliggende sammenhæng hovedsagelig blive illustreret i forbindelse 10 med behandling af tænder, der er ved at blive løse, dvs. ved såkaldt periodontitis.

Det skal imidlertid bemærkes, at denne væsentlige illustration af opfindelsen ikke skal fortolkes begrænsende. Før opfindelsen beskrives mere indgående, er det hensigtsmæssigt, for at lette forståelsen af opfindelsen, at give en kort baggrundsinformation om de biologiske betingelser i forbindelse med tandsygdomme og lig-15 nende. Ved normal dental status er tænderne forankrede i specielle hulrum, såkaldte alveoler, i kæbebenet. Mellem tandens rødder og kæbebenet findes en såkaldt periodontal membran. Tandens rødder består i hovedsagen af et præparat i kaldet dentin. Dette dentin er perifert overtrukket med et tyndt lag af de såkaldte cementum med en tykkelse på ca. 0,01-1 mm. I denne cementum findes blandt 20 andet collagenfibre, der strækker sig fra cementum og gennem den periodontale membran, og som er forankret i kæbebenet. Dette cementum er således yderst vigtigt for fastgørelsen af en tand til kæbebenet. Den periodontale membran har en tykkelse på ca. 0,2 mm og består af de ovenfor omtalte collagenfibre samt kar og nerver beliggende mellem disse fibre samt celler til dette væv.

25 Kæbebenet strækker sig ikke hele vejen op til tandkronen, og i den del af roden, som ikke er dækket af kæbebenet, strækker der sig fibre fra rodens cementum til den omgivende tandgumme, gingiva. Disse fibre bidrager til forankring af tanden og stabiliserer endvidere tandgummen. Tandgummen er som hele mundhulen 30 dækket med et tyndt lag epitel. Dette epitel danner en tæt krave eller manchet rundt om tanden. Omkring tanden dannes en hul fure mellem tanden og epitelet.

DK 175731 B1 I

Betændelsestilstande i det væv, der fastgør tænderne til kæbebenet, er ret hyppigt I

optrædende og rammer i varierende omfang hovedparten af befolkningen over hele H

verden. De hidtil anvendte behandlingsmetoder har i hovedsagen sigtet pi at re- H

tardere en pågående sygdomsproces og i videst muligt omfang hindre løsning af I

5 tænderne. For nærværende findes der ikke nogen klinisk anvendelig metode, der

tilvejebringer heling på en sådan måde, at tænderne på ny kan blive fastgjort til H

kæbebenet. H

Et andet problem inden for dette område af betændelsestilstande består af med-

10 fødte defekter ved tandbefæstelsen. Patienter med sådanne defekter udvikler peri- I

odontitis-symptomer i tidlig alder, såkaldt juvenil periodontitis. Behandlingen om- I

fatter ofte tandudtrækning og erstatning med broer, som har en betydelig pris. I

Bakterierne på tandoverfladen forårsager kronisk inflammation i tandkødet omkring

15 tanden. Inflammatoriske celler afgiver enzymer, som skal dræbe bakterierne, men I

i dette tilfælde angriber enzymerne også de collagenfibre, som fastgør tanden til I

gingiva og kæbebenet. Cellerne på overfladen af tandroden eller cementum de- H

strueres således, og epitelet fra den orale slimhinde vokser nedad langs tanden og I

danner en såkaldt gingival lomme. I denne lomme møder nye bakterier gunstige I

20 vækstbetingelser, og nye inflammatoriske celler invaderer dette område, således at

dekomponeringen af vævet i den periodontale membran skrider yderligere frem. I

Cementumcellerne dør, og knoglen i det alveolære område destrueres. Processen I

foregår almindeligvis særdeles langsomt, men undertiden kan den forløbe særdeles I

hurtigt. Efter nogen tids forløb vil den angrebne tand fuldstændig miste forbindel- I

25 sen til kæbebenet. I

Den nuværende behandling er i hovedsagen rettet på fjernelse af bakterieafsæt- I

ninger på tandoverfladerne. Når bakterierne fjernes, standses inflammationen af I

gingiva og den periodontale membran, således at ødelæggelsesprocessen standses. I

30 Denne behandling sigter også på at forhindre dannelse af nye bakterieaflejringer på I

tandens overflade. Herved standses ødelæggelsen af fastgøringen af tanden til kæ- I

bebenet, men ved denne helbredelsesmetode dannes der ikke nogen ny periodon- I

tal membran eller ny cementum. I

H

Ι· DK 175731 B1

Ved den forskning, der har ført til den foreliggende opfindelse, har man udnyttet en viden, som består i, at dannelse af cementum initieres med et tyndt lag af en emaljeprecursor, som ved udviklingen af roden dannes langs hele dennes overflade. Det skal bemærkes, at det ikke er alment kendt, at emaljeprecursoren kan in-5 ducere dannelse af cementum. Denne viden er imidlertid beskrevet i ligeledes verserende patentansøgning EP-A-0 263 086. Dette dokument nævner imidlertid ikke, hvad der er den aktive del af emaljeprecursoren. WO-A-8502199 er endnu et eksempel på kendt teknik, som angår dental proteinkemi, men som angår dannelse af emaljekrystaller og ikke har nogen indvirkning på problemet, som ligger til 10 grund for denne opfindelse, dvs. inducering af binding såsom til behandling af periodontitis.

Yderligere research og eksperimenter vedrørende mekanismen for dannelsen af cementum har overraskende vist, at precursoren til tandemalje, såkaldt 15 emaljematrix, som aktiv bestanddel indeholder en proteinfraktion, nemlig eddike-syreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, hvilken proteinfraktion stammer fra den organiske del af emaljematricen. Denne erkendelse er så meget mere overraskende som den biologiske funktion af de proteiner, der udgør nævnte proteinfraktion, formenes at bestå i dannelse og især 20 mineralisering af tandemalje (jvf. Fischer, L. & Termine, D, Clinical Orthopaedics 200, 1985, 362-85). Proteinerne i emaljematricen omfatter en højmolekylvægtsandel og en lavmolekylvægtsandel, og det har vist sig, at deres aktive bestanddel udgøres af lavmolekylvægtsandelen, idet den også kan udgøres af en aktiv determinant for denne. Denne lavmolekylvægtsandel af 25 emaljematrixproteinerne består af eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, som har en molekylvægt på op til ca. 40.000, men som hovedsagelig har en molekylvægt i intervallet fra ca. 5000 til ca. 25.000.

I forbindelse med de her anvendte termer "emaljeprecursor" og "emaljematrix" 30 henvises til følgende litteratursteder, hvor betydningen af disse udtryk er gjort fuldstændigt klar, nemlig: A.R. Ten Cate, Oral History, Development, Structure, and Function, The C.V. Mosby Co., S:t Louis, USA (1980) pp 183-83.

I DK 175731 B1 I I.A. Mjor, O. Fejerskov, Human Oral Embryology & Histology, Munksgaard, Copen- I hagen (1986) pp 44.45.

B

B I forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at dersom dentin ] B 5 blotlægges til cellerne i den periodontale membran, fx ved mekanisk dannelse af B en hulhed på rodens overflade, vil der foregå heling i form af dannelse af et knoglelignende væv, som mangler de fibre, der fastgør den sunde tand til det omgivende væv. Hvis overfladen med den kunstigt dannede hulhed imidlertid dækkes med en aktiv proteinfraktion hidrørende fra en precursor til tandemalje, 10 hvilken precursor i det følgende betegnes ’’emaljematrix", har det vist sig, at der dannes normalt cementumforankrende væv.

H Emaljematrixproteinerne tilvejebringes fortrinsvis fra et pattedyr, fx kvæg- eller H svinearter. Eksperimenter har vist, at man kan inducere dannelse af cementum hos H 15 aber og mennesker ved at dække en hulhed i rodens overflade med en protein- fraktion hidrørende fra emaljematrix fra andre arter, fx fra en svineart.

Den i det følgende beskrevne opfindelse åbner således mulighed for en ny teknik til tilvejebringelse af binding mellem dele af levende mineraliseret væv ved nydannel-20 se af mineraliseret væv på mindst én af delene. Denne teknik er kendetegnet ved påføring af emaljematrixproteiner hidrørende fra en precursor til tandemalje, så-^B kaldt emaljematrix, til inducering af binding. Opfindelsen angår endvidere et præparat til sådan anvendelse, hvilket præparat som aktiv bestanddel indeholder sådanne emaljematrixproteiner eller en aktiv determinant.

M Som tidligere nævnt er opfindelsen særligt anvendelig i forbindelse med dentalbe- H handling, fx ved behandling af periodontitis, dvs. en tandløsning, ved tandtrans- H plantation eller ved genindsætning af tænder, der er udrevet ved ulykkestilfælde.

^B Opfindelsen kan imidlertid også anvendes til lettelse af fastgørelse af kunstige 30 implantater, fx tandimplantater eller kunstige hofteled. Opfindelsen kan endvidere ^B anvendes til induktion af dannelse af mineraliseret væv på kunstige implantater, når der ønskes tilvejebragt en ny senefastgøreise.

Den proteinfraktion, der benyttes ved anvendelse af den her omhandlede teknik, 35 fås passende fra emaljematricen af et pattedyr, hvis tænder er under udvikling. En I DK 175731 B1 passende kilde for emaljematrix er slagtede dyr, fx grise eller kalve, som ofte slagtes, medens tænderne stadig er under udvikling, når der er tale om grise ofte ved en alder på ca. 6 måneder. Foretrukne pattedyr er således udvalgt fra kvægeller svinearter (dvs. kalve eller grise), men man kan også arbejde med andre ar-5 ter, fx får og gnavere, som har kontinuerligt voksende tænder. Som en alternativ kilde til denne proteinfraktion kan man også anvende dyrkede celler eller bakterier modificeret ved rekombinant-DNA-teknik, jvf. fx US-patentskrift nr. 4 672 032.

Det præparat, der ifølge opfindelsen anvendes til terapi, kan alene bestå af en så-10 dan proteinfraktion eller en aktiv determinant for denne, passende blandet med vand, men præparatet kan også indeholde proteinfraktionen kombineret med et bærestof, et fortyndingsmiddel eller et klæbemiddel, fx modificerede celluloser, agar, alginater eller gelatine, som er acceptabelt i denne sammenhæng. Til dental anvendelse bør bærestoffet eller fortyndingsmidlet være dentalt acceptabelt. For 15 nærværende foretrækkes anvendelse af en bærer omfattende vandopløseiige polymerer. Som ikke begrænsende eksempler på sådanne polymerer kan følgende nævnes: natriumcarboxycellulose, mikrokrystallinsk cellulose, hydroxyethylcellulo-se, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, højmolekylvægtspolyacrylsyre, natri-umalginat, propylenglycolalginat, xanthangummi, guargummi, johannesbrødgum-20 mi, modificeret stivelse, gelatine, pektin eller kombinationer af disse stoffer. Efter inkorporeringen af den aktive proteinfraktion kan disse vandopløselige polymerer om ønsket omdannes til geler eller film, hvorved der fås præparatr, der let kan påføres på grund af deres fordelagtige fysiske egenskaber. Præparatet kan eventuelt indeholde stabilisatorer eller konserveringsmidler for at forøge 25 opbevaringsstabiliteten.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et præparat til anvendelse i behandlingen af periodontitis, ved hvilken der tilvejebringes fornyet fastgørelse af tanden ved inducering af dannelse af 30 rodcementum og kæbeben med en fysiologisk collagenfiber-fastgørelse mellem disse. Denne proces er karakteriseret ved, at epitelet, hvis dette forefindes, fjernes fra tandens rod, hvorpå roden forsynes med et lag af den relevante proteinfraktion hidrørende fra emaljematrix.

I DK 175731 B1 I

I 6 I

I Ved den foretrukne anvendelse af opfindelsen til behandling af periodontitis foreta- I

I ges der en indskæring i det coliagene væv (gingiva) omkring den angrebne tand, I

I således at rodens overflade frilægges. Eventuelt tilstedeværende epitel fjernes, I

I hvorpå den rene overflade af roden overtrækkes med et lag af ovennævnte prote- I

I 5 infraktion eller et præparat, der som den aktive bestanddel indeholder en sådan I

I proteinfraktion, som aktiv bestanddel, hvorefter collagenvævet (gingiva) føres på I

I plads og eventuelt sys, således at heling kan foregå. I

I Som tidligere nævnt kan opfindelsen ikke blot anvendes til behandling af periodon- I

10 titis, men også til reimplantat eller transplantation af tænder. Det hænder relativt I

I ofte, at unge mennesker i alderen 10-15 år kommer ud for ulykker, der fører til I

I fjernelse af én eller flere tænder, som oftest fortænder. Ved hurtig tilbagesætning I

af de udslåede tænder kan der tilvejebringes god heling med normal fastgørelse til I

I kæbebenet. I mange tilfælde kan en sådan genindsætning af udslåede tænder ikke I

15 gennemføres øjeblikkeligt, og tanden må holdes i et uegnet medium uden for mun- I

den, fx i luft, i et vist tidsrum. Herved ødelægges cellerne i den periodontale mem- I

I bran på rodens overflade. Nar tanden så sættes tilbage i munden, vil den ikke gen- I

I vinde en fysiologisk fastgørelse, men til sidst løsnes. Indtil nu har man ikke rådet I

over nogen metode, ved hvilken man kan tilvejebringe permanent tandfastgørelse I

20 ved regenerering af forbindende væv. I

Ved den her omhandlede teknik kan den døde periodontale membran på den ud- I

slåede tand imidlertid fjernes på passende måde ad mekanisk eller kemisk vej, I

hvorefter præparatet indeholdende eller bestående af ovennævnte proteinfraktion I

25 påføres den nøgne tandoverflade. Derpå sættes tanden tilbage i sin alveol, idet den I

fastholdes let i nogle uger. Takket være tilstedeværelsen af proteinfraktionen eller I

præparatet indeholdende denne på rodens overflade vil der genereres et nyt ce- I

mentumlag, og herved vil tanden fastgøres på ny. I

30 I forbindelse med tandtransplantation, dvs. overføring af tænder fra ét individ til et I

andet, har det vist sig, at vævet i de transplanterede tænder angribes af modta- I

gerens immunforsvar og dekomponeres på særdeles kort tid. Man har forsøgt at I

H foretage transplantation mellem immunologisk forenelige individer. Resultaterne af I

H disse forsøg har imidlertid også været nedslående. Da langtidsbehandling med im- I

H 35 muno-suppressorer med henblik på bevarelse af én eller flere transplanterede I

DK 175731 B1 7 tænder ikke er hensigtsmæssig på grund af den hermed forbundne risiko, findes der i dag ikke nogen klinisk anvendelig metode til transplantering af tænder med gunstig langtidsprognose.

5 Ved anvendelse af den her omhandlede teknik kan man imidlertid tilvejebringe en sådan metode, og problemet kan løses ved fjernelse af den tand, som skal transplanteres, fra donoren, hvorefter man fjerner den dentale pulpa, renser pulparum-met og påfører et rodfyldningsmiddel i pulparummet. Den periodontale membran fjernes ad mekanisk eller kemisk vej, hvorefter tandens rod dækkes med 10 præparatet indeholdende den aktive proteinfraktion. Derpå placeres tanden på sin nye position i modtagerens mund. Tanden fastholdes i en vis periode, og på grund af proteinfraktionen gendannes endogent mineraliseret væv, som dækker den transplanterede tand og fører til fiksering af denne.

15 Ved et andet foretrukket aspekt af den foreliggende opfindelse kan præparatet indeholdende den aktive proteinfraktion tilføres et vævsklæbende middel baseret på fibrinogen, faktor XIII, som er en plasma-afledt koagulationsfaktor, og thrombin. Dette præparat kan bestå af et præmix af emaljematrix og fibrinogen og faktor XIII, idet thrombin tilsættes umiddelbart før præparatet påføres ved det 20 kirurgiske indgreb. Præmixet kan eventuelt indeholde aprotinin til reduktion af dekomponeringshastigheden. Et nyttigt kommercielt produkt til anvendelse i et sådant præparat er Tisseel, et to-komponent fibrin-forseglingsmiddel fremstillet og solgt af Immuno AG, Wien, Østrig. Ved anvendelse af et sådant vævsklæbemiddel blandes præmixet af proteinfraktion, fibrinogen, faktor XIII samt eventuelt 25 aprotinin med en thrombinopløsning, hvorefter det fremkomne præparat hurtigt påføres ved det kirurgiske indgreb. Ved behandling af periodontitis fører denne teknik til en betydelig forenkling af det kirurgiske arbejde. Således tilvejebringes en forøget vedhæftning af præparatet til roden, blødning standses, og anbringelsen af den muco-periosteale lap forenkles i betydelig grad, fordi anvendelse af sutur 30 elimineres.

De produkter, der for tiden foretrækkes til anvendelse i et sådant præparat ifølge opfindelsen, er cellulosederivater og alginater såsom carboxymethylcelluloser og natrium- eller propylenglycolalginater. · 35

I DK 175731 B1 I

I I

I I det følgende illustreres opfindelsen nærmere ved en række eksempler. Disse I

I eksempler er valgt som dentale eksperimenter gennemført på aber og mennesker. I

I I denne sammenhæng henvises til tegningen, som viser en SDS-PAGE, polyacryl- I

I amidgelelektroforese-separation. De to hovedkomponenter af den fra emaljematrix I

I 5 udvundne proteinfraktion, baseret på molekylvægt, kaldes amelogenin (lav mole- H

I kylvægt) og enamelin (høj molekylvægt).

I EKSEMPEL 1 I

I I

I Fremstilling af ekstrakter til dyreforsøg I

I Med henblik på at undersøge, hvilke komponenter i emaljematrix, der er aktive i I

I dyremodeller, blev der fremstillet følgende testpræ parater. Alle præparater I

I 15 hidrører fra emaljematrix fra svin. I

I E_1 0,3 g matrix (proteinindhold 27 +4%) blev opslæmmet i 3 ml 0,9% NaCI og I

homogeniseret under afkøling med is med en Polytron i 1 minut med intervaller på I

I 10 sekunder. Det homogeniserede præparat blev derpå frysetørret. Udbytte I

I 20 199 mg, proteinindhold ifølge Lowry 47%+ 2%. I

I E_2 0,3 g matrix blev opslæmmet og homogeniseret som ovenfor beskrevet og I

I derpå opvarmet på vandbad i 4 minutter. Ved frysetørring fremkom et produkt I

I med et udbytte på 199 mg, indhold af opløseligt protein 13% + 3%. I

I 25 I

I E_3 0,3 g præparat blev opslæmmet i 3 ml 0,5M eddikesyre (p.a.), homogeniseret I

som ovenfor beskrevet, hvorefter det fik lov at henstå under omrøring ved 4°C i 24 I

timer til ekstraktion af protein. Derpå blev der foretaget kold centrifugering til I

10.000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter. Det udfældede materiale blev udvun- I

30 det og frosset, hvorpå supernatanten blev frysetørret. Udbytte af lyofilisat: 68 mg, I

I proteinindhold 29%+ 3%. I

I E_4 0,3 g matrix blev opslæmmet i 3 ml 10% EDTA i 0,03M Tris buffer, pH 7,4, I

I hvorefter der blev homogeniseret under afkøling som ovenfor beskrevet. Derpå I

I 35 blev der ekstraheret ved omrøring i kold tilstand i 24 timer, hvorefter homogent- I

I ! I

Η H

I DK 175731 B1 satet blev centrifugeret bort i en kølecentrifuge. Supernatanten blev dialyseret mod destilleret vand og frysetørret. Udbytte: 11 mg, proteinindhold 33% + 2%.

E 5 Det ved centrifugeringen fremkomne udfældede materiale (E 4) blev ekstra- I

5 beret med ca. 10 volumendele 0,5M eddikesyre under langsom omrøring i kold til- I

stand i 24 timer. Derpå blev der foretaget en ny centrifugering, og supernatanten I

blev frysetørret. Udbytte: 109 mg, proteinindhold 15% + 3%. I

E 6 Det udfældede materiale fra centrifugeringen beskrevet i E 5 blev frysetørret. I

10 Udbytte: 37 mg, proteinindhold 18% + 4%. I

E 7 0,3 g matrix blev opslæmmet i 3 ml 10% EDTA i 0,03M Tris buffer, pH 7,4, I

med 0,4 mM proteinase-inhibitor PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) og homogeni- I

seret og ekstraheret som beskrevet i E 4. Efter centrifugering og dialyse af super- I

15 natanten blev der foretaget frysetørring. Udbytte: 11 mg, proteinindhold 41% +

E 8 Det udfældede materiale fra centrifugeringen i E 7 blev ekstraheret med 0,5M I

eddikesyre i 48 timer ved lav temperatur, derpå blev der centrifugeret, hvorefter I

20 supernatanten blev frysetørret. Udbytte: 101 mg, proteinindhold 17% + 1%. I

E 9 Det udfældede materiale fra centrifugeringen beskrevet i E 8 blev frysetørret.

Udbytte: 40 mg, proteinindhold 30% + 3%.

25 De i eksemplerne E 1-9 fremkomne præparater blev karakteriseret i henseende til proteinindhold, proteinmolekylvægtsfordeling (SDS-PAGE med Phast), isoelektriske punkter for proteinerne og carbohydratindhold. Fordelingen af den tilsyneladende molekylvægt for ekstrakter fra emaljematrix fra svin er vist på tegningen. Efter ’ SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS 8-25%, Phast, Pharmacia) blev 30 proteinbåndene transformeret til toppe med en laserscanner (LKB Ultroscan XL).

Molekylvægtene blev bestemt ved kalibrering med protein-( 14-90 kDa) og polypeptid- (2-14 kDA) referencer (Pharmacia). Diagrammerne er givet for ekstrakterne E 4 og E 5, og disse og de andre ekstrakter er beskrevet nedenfor.

I DK 175731 B1 Η I 10 I Ekstrakt Proteinkomponenter (SDS-PAGE-molekylvægte) I nr. ca. 5/12* 6/14* 10/15* 16 22 24 67 kDa 1.5

I El x x χχΧχ X

I E 3 x x x X (x)

I E 4 x x X

I E 5 x x X (x)

I 10 E 7 x x X

I E 8 x x X (x) * De lavere molekylvægte fas, nir man anvender polypeptid-kalibreringskit, og de H 15 højere molekylvægte, når man anvender protein-kalibreringskit.

Η X = stor mængde, x = lille mængde, (x) = mindre mængde.

Formålet med dette eksempel er at vise indflydelsen af de ved trinvis ekstraktion H fra precursorvævet til tandemalje (emaljematrix) fremkomne præparater E 1-E 9 H 20 på helingen af eksperimentelt frembragte marginale periodontale beskadigelser.

Defekter i det marginale periodontium på abetænder blev frembragt ved fjernelse af dental cementum, periodontalmembran og marginal alveolærknogle til en cervi-co-apiacal afstand på ca. 5 mm med et tandlægebor. Derpå blev præparaterne på-ført de eksperimentelt frembragte defekter, hvorpå såret fik lov at hele. Der blev 25 også frembragt kontroldefekter, som fik lov at hele uden påføring af noget præparat. Efter en helingsperiode på 8 uger blev resultaterne evalueret histomorfometrisk.

Resultaterne af helingsprocessen er udtrykt i procent af det originale niveau for 30 cementum- og knogledækning (tabel 1). Helingsprocessen omfatter dannelse af et omgivende lag af ny cementum, periodontal membran og alveolærknogle (ny fast- gørelse).

^1

IB

DK 175731 B1

Tabel 1

Præparat Kontrol El E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9

Heling (%) 5 93 3 79 4 49 2 0 48 5

Man konstaterede således fastgørelse efter påføring af præparaterne El, E3, E5 og I

E8. Dette var ikke tilfældet ved kontrolforsøget samt med tænder behandlet med I

præparaterne E2, E4, E6, E7 og E9, hvor defekterne stadig var til stede, medens 1

tanden blot var blevet dækket med oralt epitel. Disse resultater viser, at påføring- I

10 en af lavmolekylvægtsfraktionen af proteindelen af emaljematrix fremmer vævs- I

fastgørelse ved behandling af periodontitis. I

EKSEMPEL 2 I

15 Fremstilling af afsaltet svreekstrakt fra emaliematrix I

Et frysetørret præparat svarende til præparatet i det foregående eksempel (E 3) I

blev opløst i 0,1M eddikesyre og overført (144 mg/12 ml) på en 15 x 540 mm ko- I

lonne med Sephadex G-25 superfine i 0,1M eddikesyre. Den første proteinrige I

20 fraktion (E 10) blev opsamlet og frysetørret. Udbyttet var 34 mg præparat inde- I

holdende ca. 72% protein svarende til 85% af proteinerne i udgangspræparatet. I

De resterende proteiner blev fundet i saltfraktionen (63 mg frysetørret præparat I

med et proteinindhold på ca. 7%). I

25 Den således fremstillede frysetørrede proteinfraktion blev fyldt i hætteglas på I

10 ml (20 mg i hvert) og steriliseret ved bestråling (35 kGy) før anvendelse ved I

dyreforsøg. I

Præparaterne blev analyseret som beskrevet i det foregående eksempel. Resulta- I

30 terne fremgår af nedenstående tabel 2. I

TabeL? I

Præparat Kontrol E 10 I

35 Heling (%) 4 72 I

Η I

I DK 175731 B1 I

I 12 I

I EKSEMPEL 3 I

I Fremstilling af rensede proteinfraktioner I

5 I

200 mg frysetørret præparat E 3 (identisk med det i eksempel 2 anvendte) blev I

I opløst i 20 ml 0,1M eddikesyre og påført en 25 x 780 mm kolonne med Sephadex I

I G-75 i 0,1M eddikesyre ved 4°C. Kolonnen blev elueret med en hastighed på I

I 55 ml/h, og der blev opsamlet prøver pi 4 ml. Eluatet blev overvåget ved 280 nm I

I 10 (Uvicord), og prøverne indeholdende hoveddelen af det eluerede materiale blev I

I forenet, således at der fremkom fem fraktioner, som blev analyseret ved elektro-

I forese (SD5-PAGE) for molekylvægtsfordeling som vist i det følgende. Fem toppe I

I fra elueringschromatogrammet (0-1 A) 15 Fraktion Prøve H (1) 50 - 60; højmolekylvægtsproteiner, I "enameliner" (MV > 40.000) (2) 62 - 80; højmolekylvægtsamelogenin (MV ca. 24 kDalton) (3) 90 - 100: mellemmolekylvægtsamelogenin (MV ca. 14 kDalton) 20 (4) 110 - 125: lavmolekylvægtsamelogenin (MV ca. 5-10 kDalton) (5) 130 - 160; salte

Efter frysetørring gav toppene (2), (3) og (4) henholdsvis 10 mg, 7 mg og 12 mg højmolekylvægts-, middelmolekylvægts- og lavmolekylvægtsamelogenin-proteiner 25 (proteinindhold >90%).

Formålet med dette eksperiment var at vise indvirkningen af amelogenin-præparater med høj, middel og lav molekylvægt ekstraheret fra precursorvæv til emalje (emaljematrix) på heling af eksperimentelle marginale periodontale 30 beskadigelser. Der blev frembragt eksperimentale defekter i det marginale periodontium på abetænder ved fjernelse af dental cementum, periodontal membran og marginal alveolærknogle til en cervico-apical afstand på ca. 5 mm med et tandlægebor. Derpå blev præparaterne påført de eksperimentelt frembragte defekter, hvorefter sårene fik lov at hele. Der blev også frembragt 35 kontroldefekter, som fik lov at hele uden påføring af noget præparat. Efter en DK 175731 B1 13 helingsperiode på 8 uger blev resultaterne evalueret histomorfometrisk.

Resultaterne fremgår af nedenstående tabel 3.

Tabel 3 5

Præparat Kontrol Amelogenin: Høj* Mellem- Lav-

MV MV MV

Heling (%) 4 78 21 15 10 Ny fastgørelse fremkom således efter påføring af højmolekylvægtsamelogenin samt i ringere grad efter påføring af middelmolekylvægtsamelogenin og lavmolekyl-vægtsamelogenin. Disse resultater viser, at en påføring af højmolekylvægtsfraktionen af amelogenin hidrørende fra emaljematrix giver den mest effektive fremskyndelse af vævsfastgørelse ved behandling af periodontitis.

15 EKSEMPEL 4

Fremstilling af svreekstrakt af emaliematrix i 20 Underkæber fra slagtede grise (alder ca. 6 måneder, slagtevægt ca. 80 kg) blev skåret fri for blødt væv og nedfrosset i slagtehuset. Passende rodanlæg blev udtrukket fra de frosne kæbehalvdele efter delvis optøning, og man foretog isolering af emaljematrix.

25 38 g emaljematrix blev opslæmmet i 780 mg 0,5M eddikesyre, pH 4,1, og homogeniseret under isafkøling (homogenisator Polytron PT 10-30). Det homogeniserede præparat blev omrørt i kulden i 22 timer til ekstraktion af protein, som var opløseligt ved en pH-værdi på ca. 4. Uopløseligt præparat blev bortcentrifugeret, og eddikesyreopløsningen blev frysetørret.

30

Herved fremkom 8,5 g lyofilisat med et proteinindhold på ca. 20% svarende til et proteinudbytte på ca. 50%.

Det frysetørrede ekstrakt blev analyseret i henseende til vandindhold, acetatind-35 hold, proteinindhold (Lowry), carbohydratindhold (Antron-reagens), i

I DK 175731 B1 I

I 14 I

I aminosyresammensætning, grundstofanalyse, protein-molekylvægtsfordeling I

I (SDS-PAGE) samt for isoelektriske punkter for proteinerne. I

I Før anvendelsen ved klinisk afprøvning blev den proteinholdige eddikesyreopløs- I

I i 5 ning steril-filtreret ned i sterile hætteglas på 10 ml og frysetørret under sterile be- I

I tingelser. I

I Formålet med dette eksempel var at vise indflydelsen af præparatet E 3 på heling I

I ved behandling af marginal periodontitis hos mennesker. Efter godkendelse af den I

I 10 svenske sundhedsstyrelse og den regionale etiske komité blev præparatet anvendt I

I som supplerende behandling ved gængs kirurgisk behandling af patienter med I

I marginal periodontitis. Patienterne blev opereret til fjernelse af dental calculus og I

I granulationsvæv. Præparatet E 3 blev "malet" på de nøgne rodoverflader og dæk- I

I ket med en mucoperiostal lap. Helingsresultaterne blev vurderet ved periodisk kli- I

I 15 nisk inspektion, måling af lommedybde, fastgørelsesniveau og gingival-index, men I

H også ved undersøgelse af intraorale radiografier. Resultaterne blev sammenlignet I

I med resultater opnået ved tidligere kvantitative studier, ved hvilke der blev an- I

vendt gængs periodontal kirurgi og lignende kontrolområder for de samme patien- I

I I

H 20 I

Resultaterne viste, at præparat E 3 havde fremkaldt en betydelig forøgelse af den I

H marginale alveolære knoglehøjde (interval 4-8 mm) og fastgørelsesniveau (interval I

5-9 mm). Dette var et helingsresultat, som aldrig var set under anvendelse af I

gængs periodontal kirurgi. Generelt syntes helingen at forløbe langt hurtigere både I

25 i henseende til klinisk udseende og reduktion af marginal lommedybde I

sammenlignet med tilsvarende studier, hvor der blev anvendt gængs periodontal I

kirurgi. Disse resultater viser, at lavmolekylvægtsproteinfraktionen fra I

H emaljematrix har evnen til at fremkalde ny fastgørelse via periodontalt væv hos I

H mennesket, et resultat, der ikke har været set ved gængs behandling. I

I 30 I

I I

15

Tabel 4 DK 175731 B1

Analyser af emaljematrix-homogenisat og proteinfraktioner hidrørende fra emalje-matrix-homogenisat.

5

Analyse Emaljematrix- Syreekstrakt Afsaltet Saltfraktion homogenat (E 1) (E 3) ekstrakt (Eks. 2) (E 10) 10

Grundstof analyse (% væat/væat!

15 C 11,3 31 50,4 IB

H 1,7 4,4 6,8 IB

N 3,9 4,5 15,5 0,7

O 9,4 27,5 21 IB

s 0,2 0,35 1,3 0,1 20 Cl 5,5 0,6 <0,1 1,3 p 8,8 3,5 0,1 4,3

Ca H,9 12 <0,1 31,6

K 0,2 0,4 <0,1 IB

25 Proteinindhold (% vægt/vægt!

Lowry-analyse 23 20 72 <4 30 Aminosyre- analyse <23 <26 <90 IB i

Carbohydratindhold (% vægt/væat!

Antron-reagens IB 0,4 1,3 IB

(fortsættes) 35

I DK 175731 B1 I

I I

I (fortsat) I

I Analyse Emaljematrix- Syreekstrakt Afsaltet Saltfraktion I

I homogenat (El) (E 3) ekstrakt (Eks. 2) I

I : (E10) I

I 5 I

Vandindhold I

(% vægt/vaeot) I

I Karl Fischer- IB 2 6 IB I

I 10 titrering 1 I

Acetatindhold I

(% vægt/vægt) I

I : GC-metode IB 38 4 IB I

I 15 I

H Aminosyre- I

analyse I

(rest % vægt/vægt I

af total rest) I

I 20 I

Pro IB 18,0 19,0 IB I

I Glu 17,8 19,0 I

I Leu 9,0 9,1 I

I His 8,7 9,2 I

25 Ser 4,8 4,6 I

I Gly 3,2 2,8 I

I Tyr 6,4 5,3 I

Thr 3,6 3,4 I

Val 3,6 3,5 I

30 Met 4,3 5,3 I

Ile 3,5 3,6 I

I Asp 3,6 3,0 I

Phe 3,8 3,7 I

Ala 1,6 1,5 I

H 35 Lys 2,5 1,8 I

Arg 3,0 2,5 I

I Trp 2,6 2,5 I

Cys "00 I

[IB: ikke bestemt] I

17 DK 175731 B1

Forbedring af knoalehelino

Virkningen af "lavmolekylvægtsandelen af proteinfraktionen af emaljematrix" pi benheling blev afprøvet pi eksperimentelle hulheder i mandibularis og femur på 5 voksne rotter. De angulære dele af mandibularis blev blotlagt ved en lodret kirurgisk indskæring i huden og tyggemusklen. Der blev boret et lille hu! (diameter 2 mm) gennem den mandibulære knogle under en konstant strøm af fysiologisk saltopløsning. Pa samme måde blev der fremstillet huller af samme størrelser gennem den kompakte knogle i den distale del af femoralis. På højre mandibularis 10 og femoralis påførtes "lavmolekylvægtsdelen af proteinfraktionen fra emaljematrix", medens hullerne i venstre mandibularis og femoralis blev anvendt som kontrolhuller.

"Lavmolekylvægtsdelen af proteinfraktionen af emaljematrix” blev påført i hullerne 15 enten som et frysetørret, svampet præparat eller i små gelatinecylindre. Kontrolhullerne i mandibularis og femoralis på venstre side af disse rotter blev fyldt med gelatinecylindre, som ikke indeholdt "lavmolekylvægtsdelen af proteinfraktionen af emaljematrix". Intet blev påført kontrolhullerne på venstre side af rotterne, som blev behandlet med tørt, frysetørret, "lavmolekylvægtsdel af proteinfraktionen fra 20 emaljematrix".

i j

Rotterne blev dræbt 1-5 uger efter påføringen af præparatet. De eksperimentelle områder og kontrolområderne blev fjernet og præpareret til undersøgelse under lysmikroskop.

25

Så tidligt som én uge efter påføringen af lavmolekylvægtsandelen af proteinfrakti- I

onen fra emaljematrix i det udborede hul var dette fuldstændigt fyldt med knoglemateriale, og desuden havde der været en markeret periosteal apposition af knoglen. I kontrolforsøgene, hvor der ikke blev foretaget behandling i henhold til 30 den foreliggende opfindelse, var der også dannet nyt ben, men i betragtelig mindre omfang, og det udborede hul var ikke helet.

35 1 i

Claims

1. Præparat til anvendelse ved inducering af sammenbinding af dele af levende I I 5 mineraliseret væv ved regenerering af dette på mindst én af delene, kendetegnet I ved, at præparatet som aktiv bestanddel indeholder en proteinfraktion, nemlig I I eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, hvilken I I proteinfraktion kan tilvejebringes fra en precursor til tandemalje, såkaldt I I emaljematrix, idet calciumioner udelukkes derfra. I I 10 I

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den aktive bestanddel har en I I molekylvægt på op til ca. 40000. fl

3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den aktive bestanddel har en I I 15 molekylvægt mellem 5000 og 25000. I

4. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at det I I indeholder proteinfraktionen i konbination med en dentalt acceptabel bærer, I I diluent eller et dentalt acceptabelt klæbemiddel. I I 20 I

5. Præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at bæreren, diluenten eller I I klæbemidlet er dentalt eller biologisk acceptabelt. I

6. Præparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at bæreren, diluenten eller I I 25 klæbemidlet omfatter en vandopløselig polymer. I

7. Præparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den vandopløselige polymer består I I af et cellulosederivat eller et alginat. , I I 30

8. Proteinfraktion, nemlig eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt I I betegnes amelogeniner, hvilken proteinfraktion stammer fra fra en precursor til I tandemalje, såkaldt emaljematrix, til anvendelse i behandling. I

9. Proteinfraktion, nemlig eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt I I 35 betegnes amelogeniner, hvilken proteinfraktion stammer fra fra en precursor til I DK 175731 B1 tandemalje, såkaldt emaljematrix, til anvendelse i fremstillingen af et medikament til behandling af sygdomme eller lidelser, der kræver regenerering af mineraliseret væv.

10. Proteinfraktion, nemlig eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, hvilken proteinfraktion stammer fra fra en precursor til tandemalje, såkaldt emaljematrix, til anvendelse i fremstillingen af et medikament til behandling af periodontitis.

11. Farmaceutisk præparat til behandling af periodontitis, hvilket præparat som aktiv bestanddel omfatter en proteinfraktion, nemlig eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, hvilken proteinfraktion stammer fra fra en precursor til tandemalje, såkaldt emaljematrix, idet calciumioner udelukkes derfra. 15

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat til anvendelse ved inducering af sammenbinding af dele af levende mineraliseret væv ved regenerering af dette på mindst én af delene, kendetegnet ved, at tandbakterier isoleres fra pattedyrskæber, bakterierne frigøres fra emaljeorganet, emaljematricen genvindes 20 fra de befriede bakterier, emaljematricen homogeniseres, en proteinfraktion, nemlig eddikesyreekstraherbare proteiner, der generelt betegnes amelogeniner, separeres fra den homogeniserede emaljematrix, og proteinfraktionen blandes eventuelt med en dentalt eller biologisk acceptabel bærer, diluent eller et dentalt eller biologisk acceptabelt klæbemiddel. 25

13. Fremgangsmåde analog med fremgangsmåden ifølge krav 12, hvor isoleringen foretages fra en bovin eller porcin kilde.