PL160475B1

PL160475B1 - Sposób wytwarzania frakcji bialkowej matrycy szkliwa o niskiej masie czasteczkowej PL PL PL PL

Info

Publication number: PL160475B1
Application number: PL1989278257A
Authority: PL
Inventors: Lars Hammarstrom; Leif Blomlof; Sven Lindskog
Original assignee: Biora Ab
Priority date: 1988-03-17
Filing date: 1989-03-15
Publication date: 1993-03-31
Also published as: ES2055159T3; MX170499B; HU203964B; EP0337967A2; KR900700073A; AU613161B2; HU206611B; ZA891818B; IL89460A0; CN1035773A; SE8800980L; NO904023D0; US5098891A; MY104992A; NO904023L; AU3140589A; NZ228309A; ATE89156T1; CN1034630C; KR0175138B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania frakcji bialkowej matrycy szkliwa o niskiej masie czasteczkowej przez odzyskanie frakcji z zawiazków zebów, znamienny tym, ze izoluje sie zawiazki zebów ze szczek ssaka, usuwa sie z tych zawiazków narzad szkliwny, z tych wolnych od narzadu szkliw- nego zawiazków wyodrebnia sie matryce szkliwa, poddaje sie ja homogenizacji w kwasie octowym i wyodrebnia sie frakcje bialkowa o niskiej masie czasteczkowej przy pH wynoszacym okolo 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje sie frakcje bialkowa o masie czasteczkowej od 5000 do 40000. PL PL PL PL

Description

η n	y	t	y	m,	że	wodrębnia	się	eks^tr^aho-
η n	y	t	y	m,	że	wyodrębnia	się	frakcj ę
do	25000.
η n	y	t	y	m,	ze	wyodrębnia	się	frakcj ę

Przedmiotem wyelazku jest sposób w^wrzenia frakcji białkowej mtrycy szkliwa o niskiej misie cząsteczkowej.

Frakcja białkowa mtrycy szkliwa wywarzana sposobem według wynalazku znajd uje zastosowanie w metodach terapeutycznych polegających na wywoyiraniu powiewania żązania m.ędzy częściemi zlm.neΓalizowannj tkanki, np. zębami i kością. Frakcja białkowa mtrycy szkliwa służy do wytwua^s^ia^^a preparatów do leczenia rozchwianych zębów /zapalenie ozębnej czyli periodonnitis/.

Dla umooiiwienla pełnego zrozumienia wynalazku przedstawiono poniżej kilka informcji na temat budowy zębów i chorób przyzębia. Zdrowe zęby są zamocowane w specjalnych wnękach, tak zwanych zębodołach, znajdujących się w szczęce górnej lub szczęce dolnej /żuchwie/. Między korzenifmi zębów i szczęką jest umiejscowiona tak zwane ozębna. Korzenie zęba są zbudowane głównie z mteriału zwanego zębiną. Zębina ta jest otoczona cienką warstwą cementu o grubości około 0,01 - 1 ma. W cemencie występują między innymi włókna kolagenowe ciągnące się od cementu poprzez ozębną i są zamocowane w szczęce. Tak więc cement jest niezwykle ważny dla zamocowaia zęba w szczęce. Grubość ozębnej wynosi około 0,2 ma, a sama ozębna składa się z wżej wspominanych włókien kolagenowych oraz naczyń i nerwów lezących między tymi włóknam.

Szczęka nie sięga korony zęba i w części korzenia nie pokrytej szczęką włókna z cementu korzenia rozciągają się ku dziąsłu otaczającemu ząb. Włókna te wspomaaaaą zamocowanie zęba, a ponadto stabilizują dziąsło. Dzząsło, podobnie jak cała jama ustna, jest pokry te cienką warstwą nabłonka. Nabłonek ten tworzy wokół zęba gruby kołnierz, czy tez rękaw. li sąsiedztwie zębów jest utworzona płytka bruzda oddzielająca zęby od nabłonka.

Stany zapalne tkanek łączących zęby ze szczęką wstępują bardzo często i cierpi na nie, w różnym stopniu, większość ludzi na świecie. Stosowane dotychczas metody leczenia mały na celu głównie haaowonie procesu chorobotwórczego i zapobieganie, w maksyMln^m stopniu, rozchwianiu zębów. Obecnie nie jest znana jakakolwiek praktycznie użyteczna metoda kliniczna pozwotająct na uzyskanie atmocowonit zębów w szczęce w wⁿiku procesu zdrożenia.

160 475

Dodatkowy problem w tej dziedzinie wiąże się z przypadkami wrodzonych wad zamocowania zębów. U takich pacjentów objawy zapalenia ozębnej /periodontttia/ pojawają się juz we wczesnym wieku /tak zwane młodzieńcze zapalenie ozębnne/. Leczenie często polega na usunięciu zęba i zastąpieniu go jakąś konstrukcją mostkową, bardzo kosztowną.

Bakterie na powerzchni zębów powodują przewlekłe stany zapalne dziąseł wokół zębów. Komóóki w stanie zapalnym wddzelają powodujące rozkład enzymy, których rolą jest niszczenie bakterii, lecz jednocześnie enzymy te atakują także włókna kolagenowe przytwierdza jące ząb do dziąsła i szczęki,. Komóóki na powierzchni korzenia zęba, czyli cement, ulegają zniszczeniu, a nabłonek ze śluzówki jamy ustnej wzrasta w dół, wzdłuż zęba, tworząc tak zwaną szczelinę dziąsłową. W szczelinie tej nowe bakterie znajdują środowisko sprzyjające ich rozmrażaniu. W tym właśnie obszarze gromadzą się nowe komórki w stanie zapalnym i rozkład ozębnej pogłębia się. Kommóld. cementu poddają się i kość zębodołu ulega zniszczeniu. Proces ten zachodzi z reguły bardzo powwli, lecz okresowo jego przebieg może ulegać znacznemu przyspieszeniu. Po pewnym czasie zaatakowane zęby tracą całkowicie zamocowanie w szczęce.

Obecne metody leczenia polegają głównie na usuwaniu balrterii z powwerzchni zębów.

Gdy usunie się bakterie stan zapalny dziąsła i ozębnej znika i proces rozkładu zatrzymuje się. Leczenie ma także na celu zapobieganie osadzaniu się bakterii na powerzchni zębów. Tak więc wnikiem leczenia jest zakończenie procesu niszczenia zamocowania zębów w szczęce, ale w procesie zdrowienia nie tworzy się ani ozębna, ani nowy cement.

W trakcie prac badawczych, których rezultatem stał się niniejszy wialazek, wykorzystano znajomość faktu, iż tworzenie się cementu jest ini^cjOT^ane przez cienką warstwę prekursora szkliwa, która w trakcie rozwoju korzenia powwsaje rodłuż całej powierzchni korzenia. Fast ten nie został podany do pUlicznej wiadomości i jak dotąd został jedynie przedstawiony w będących w trakcie równoległego badania zgłoszeniach patentowych, np. w europejskim zgłoszeniu patenowym nr 87850064.0. Dalsze badania i doświadczenia dotyczące mechanizmu powstawania cerantu nieoczekiwanie ujawii^ty, ze prekursor szkliwa, zwany tu dalej mttrycą szkliwa, zawiera jako substancję czynną frakcję białkową, którą można otrzymać z części organicznej tej ratrycy szkliwa. Okrycie to jest tym bardziej nieoczekiwane, że uważa się, iż biologiczna funkcja białek tworzących tę frakcję białkową polega na tworzeniu, a zwłaszcza na mneralizowaniu szkliwa /patrz L. Fischer i D.Ter-mine, Clinical <O?thopadics 600, 1985, 366 - 85//. Białka matrycy szkliwa zawierają część o wsokiej misie cząsteczkowej i część o niskiej rasie cząsteczkowej. Odbito, ze substancją aktywną jest część o niskiej rasie cząsteczkowej, jakkolwiek może nią być także aktywna determinanta tej części,. Część o niskiej rasie cząsteczkowej zaiwrtą w białkach matrycy szkliwa tworzą białka ekstrUowalne krosem octowym, zwane zwy^e amelogeninami, których masa cząsteczkowa wyiosi do około 40000, a zwdtle wnosi około 5000 - 65000.

Okkeślenia prekursor szkliwa i ratryca szkliwa stosowane w niniejzym opisie wyjaśniono dokładnie w dwu publikacjach, a mianowicie w A.R. Ten Cate, Orał Histology, Deyelopram, Structure and Function, The V.C.Kosby Co., St. Louis, St. Zjedn.Ameryki /1980/, str. 186 - 183 oraz w J.A. Mjfr , O.Fejerskov, Humań Orał Embryology and Histology, Kiuiksgaard, Kopenhaga /1986;/, str. 45 - 45. Publikacje te zostały tu przytoczone jako źródła lieeraturowe.

W związku z niniejzzm wnalazkiem stwierdzono, że gdy zębinę wstawi się na działanie komórek ozębnej, np. po wywirceniu otworu w powerzchni korzenia, następuje proces zdrowienia, polegający na tym, ze wywarza się tkanka kostnopodobna, która nie zawera włókien moczących ząb do otaczających go tkanek. Jeśli jednak w^worzony otwór pokryje się aktywną frakcją białkową otrzymaną z matrycy szkliwa, następuje rozwój normalnej mo^uacej tkanki cementowej.

Weeług wymalazku, sposób w^wirzania frakcji białkowej matrycy szkliwa o niskiej masie cząsteczkowej polega na tym, ze izoluje się zrnązki zębów ze szczęk ssaka, usuwa się z tych związków narząd szkliwny, z tych wolnych od narządu szrliwnegr związków wyodrębnia się matrycę szkliwa, poddaje się ją homórentiarji w krosie octowym i wrojrę1^n±r

160 475 się frakcję białkową o niskiej misie cząsteczkowej przy pH wnoszącym około 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje się frakcję białkową o masie cząsteczkowej od 5000 do 40000.

Korzystnym źródłem białek Mitrycy szkliwa są zęby ssaków, takich jak bydło lub świnie. W doświadczeniach na małpach i ludziach stwierdzono, że pokrycie otworu wwierconego w powierzchni korzenia frakcją białkową otrzymaną z matrycy szkliwa pochodzącej od innego gatunku, np. od świni, powoduje tworzenie się cementu.

Frakcja białkowa matrycy szkliwa wytworzona sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie w nowych technikach polegających na wywływaniu powstawania wiązania między częściami zyjącej, zmineralizowanej tkanki poprzez utworzenie świeżej zmineralizowanej tkanki na co najmniej jednej z tych części. Tecirniki te charakteryzuje właśnie stosowanie frakcji białkowej matrycy szkliwa, ewentualnie w postaci środka zawierającego jako substancję aktywną tę frakcję białkową Mitrycy szkliwa lub jej aktywną determinantę.

Jak już wspoimnano, techniki takie są szczególnie przydatne w stomatologii, np. w leczeniu periodontitis, to jest rozchwiania zębów, przy transplantacji zębów, względnie przy mocowniu zębów wybitych w wypadku. Jednak i frakcję białkową mtrycy szkliwa i zawierający ją środek, można stosować także dla ułatwienia przyjmowania się sztucznych wszczepów, np. zębów lub sztucznych stawów biodrowych. Można Je także wykorzystywać do wywoływania powstawania zimneralizowanej tkanki w miejscu wszczepienia takich sztucznych wszczepów, w przypadku których pożądane jest w^two^enie nowego zaczepu ścięgnowego.

Frakcję białkową stosowaną w wyżej opisanych technikach otrzymuje się z imtrycy szkliwa pochodzącej z zębów ssaków będących w stadiim rozwoju. Opcortednim źródłem matrycy szkliwa są uśmiercone zwerzęta rzeźne, np. świnie i cielęta, których ubój następuje bardzo często w okresie rozwoju zębów, np. w przypadku świń w wieku około pół roku. Korzystnymi zwerzętami są bydło i świnie, lecz można wykorzystywać także inne gatunki, np. owce i gryzonie, których zęby ciągle rosną. Alternatywnnym źródłem frakcji białkowej są hodowle komórek lub bakterie modyfikowane techniką rekombinantową DNA /patrz np. opis patentowy St. ZJedn. Aneryki nr 4 672 032/.

środek wywarzony z zastoowaniem frakcji białkowej może zawierać wr^cznie frakcję biakkową lub jej aktywną determinantę, πβ^ω^ΐη^ zWeszane z wodą, względnie obok frakcji białkowej środek może zawertć nośnik, rozcieńczalnik lub nadające się do tego lepiszcze, np. zmoOyflkłaaną celulozę, agar, tlginian lub żelatynę. V zastosowaniach stomatologicznych należy stosować nośniki i rozcieńczalniki dopuszczalne w takich zastosowaniach. Obecnie jako nośnik stosuje się rozpuszczalne w wodzie polimery.

Przykładami., lecz nie jedynymi, takich nośników są sól sodowa karboksymeylocelulozy, celuloza e.lk·okryltaliczta, hydrokayetylocelulozt, hydroksypropyloceluloza, MTylocelulozt, kwis poliakryoowy o wysokiej Misie cząsteczkowej, t^inien sodu, alginian glikolu propylenowego, żywice ksantenowe, żywica gutrowa, żywica z nasion grochodrzewu, zmodyfikowana skrobia, żelatyna 1 pektyna, a także ich połączenia. Po wprowadzeniu do tych rozpuszczalnych w wodzie polimerów aktywnej frakcji białkowej można Je przeprowadzić w postać żelu lub folii. W ten sposób uzyskuje się postać środka, którą łatwo jest nakładać ze wględu na jej korzystne właściwości fizyczne, bródek może ewentualnie zawierać stabilizatory lub konserwanty, dzięki czemu jego trwałość przy przechowzrasta.

Frakcja białkowa matrycy szkliwa wytworzona sposobem według wnaltzku znajduje zastosowanie w leczeniu peΓiodontttis, polegającym nt odtworzeniu zamocowonia zębt w szczęce przez aJwołanic powstawania cementu korzenia i ^tworzenie fizjoOogiztnegł połączenia włóknami kolagenowymi. W sposobie tym nabłonek, o ile jest obecny, usuwa się z korzenia zęba, po czym ząb i korzeń pokrywa się wust^wą odpowóedniej frakcji białkowej otrzymanej z marycy szkliwa. K^ystnie tkankę kolagenową /dziąsło/ przylegającą do powierzchni zębt zaatakowanej chorobą nacina się dla oonażenit powierzchni korzenia. Nabłonek, o ile jest obecny, usuwt się, po czym czystą powerzchnię korzenia powleka się

160 475 warstwą frakcji białkowej lub wao-stwą środka zażerającego frakcję białkową lub jej aktywną determinantę,a następnie tkankę kolagenową umieszcza aię na poprzednim miejscu i ewentralnie przyszywa. Następuje żedy proces zdrowienia.

Jak jut wspomnano, frakcję białkową mtrycy szkliwa lub zawierający ją środek można także stosować w reinplantacji lub transplantacji zębów. Stosinikowo często nastoletnia młodzież ulega spadkom, pociągającym za sobą wyiże jednego lub kilku zębów, szczególnie przednich. Gdy wybity ząb umieści się szybko z powrotem w zębodole, proces zdrowenia przebiega często z utworzeniem normlnego zamocoraaia w szczęce.

W wielu przypadkach zabieg ponownego umieszczenia zęba nie Jest możliwy natychmiast i ząb jest przytrzymywany w nieodpożednim środożsku poza jamą ustną, np. na powierzchni. Kommrki ozębnej na pożeΓzchni korzenia ulegają wówczas zniszczeniu i ząb, po włożeniu go w zębodół, nie odzyskuje fizjologicznego ra]m>coγżnta, a po pewnym czasie ulega rozchżaniu. Do chwili obecnej nie znano sposobu uzyskiwania zamocownia zęba na stałe poprzez regenerację przyległej doń tkanki.

Obecnie możliwy jest zabieg, w myśl którego ozębną usuwa się z wybitego zęba, mechanicznie lub chemicznie,pl czym na odkrytą pożerzchnię korzenia nanosi się środek w postaci frakcji białkowej szkliwa lub zawierający frakcję białkową. Następnie ząb ιΜβΑΚΜ się w zębodole i zamacow-uje w nim lekko na kilka tygodni. Dzięki działaniu frakcji białkowej matrycy szkliwa na pożerzchni korzenia tworzy się nowa warstwa cementu, a zatem powws^je nowe za^c^(^(^^t^ie.

Stwierdzono, że w przypadku transplantacji zębów, to jest wszczepiania zęba jednego osobnika drugiemu, tkanki przeszczepionego zęba zostają zaatakowane przez układ immunologiczny biorcy i w bardzo krótkim czasie ulegają zniszczeniu. Próbowano prowadzić przeszczepy między osobnikami o zgodności iϋlinololicznej, jednak wyniki tych prób nie były zachęcające. Nie można też uznać za rozsądne podejmowanie ryzyka długotrwałego prowadzenia kuracji imminolupΓe8orami dla utrzymania przeszczepu jednego lub kilku zębów. Nie istniała zatem dotąd metoda transplantacji dająca korzystne, długotenmiinowe rokowania.

Dzięki zastosowaniu frakcji białkowej mtrycy szkliwa lub zawe^jącego ją środka problem ten został rozwiązany. Przeznaczony do transplantacji ząb pobiera się od dawcy, usuwa się Mazgę zębowi, oczyszcza kommrę, z której usunięto Mazgę i wycinia ją środkiem do wyceniania korzeni. Ozębną usuwa się mechanncznie lub chemicznie, po czym korzeń zęba pokrywa się środkiem zażerający aktywną frakcję białkową. Tak przygotowany ząb uM-eszcza się. w jamie ustnej biorcy i utrzymuje się go w ustalonej pozycji przez peżen okres czasu. Frakcja białkowa mtrycy szkliwa powoduje odtworzenie endogennej tkanki zmineralizowanej, która pokrywa przeszczepiony ząb i wywrze zamocovwnte.

Środek zawierający frakcję białkową mtrycy szkliwa otrzymaną sposobem według wynalazku może zawerać lepiszcze na osnowie fibrynogenu, czynnika XIII /substancja otrzymana z osocza, biorąca udział w krzepnięciu krw/ i trombiny. Sporządza się wówwzas przedmieszkę złożoną z frakcji białkowej matrycy szkliwa, fib3ztlogjnu i czynnika XIII, a następnie dodaje się do tej przedmieszki trombinę na chwlę przed zastosowaniem w zabiegu chirurgicznym. Do przedmeszki można Μβη^θίπύ wprowadzić aprotyninę, w celu obniżenia szybkości rozkładu. Korzystnym handlowym produktem do stosowania w takiej postaci jest Tiaajel, dwuskładnikowy uszczelniacz fibyynowy, wytwarzany i sprzedawany przez Immuro AG, Wiedeń, Austria. Przedmies^ę frakcji białkowej matrycy szkliwa, fibrynlgjn, czynnik XIII i ewentualnie aprotyniny mesza się z roztworem trombiny, a następnie szybko nanosi na operowane miejsce. W przypadku leczenia peΓlldootttis technika ta bardzo ułatwia zabieg chirurgiczny. Przyleganie środka do korzenia jest w^iw^ias silniejsze, krważenie ustaje, a umieJailiienij płatu śluzówklio-orębnjgo jest znacznie łatwiejsze i nie wymaga zakładania szwów.

Dodatkowymi składnikami środka zawierającego matrycę szkliwa wytwarzaną sposobem według ż'nalarks są pochodne celulozy i alginiany, takie jak kaΓblks;ylejyyocelsllra oraz alginian sodu i alginian glikolu propylenowego.

160 475

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, odnoszące się do doświadczeń stomatologicznych na młpach i ludziach. W przykładach powołano się na rysunek przedstawiający wykresy przebiegu procesu rozdzielania elektroforetycznego na żelu poliakyylommidoiymi /SDS-Page/. Proces elektroforezy zaczynano przy Y n 36, kończono przy Y = 58, stosując przesunięcie Y co 20 jum. Amn wynoiła 0,19, a ł^yn^^iałła 0,7 9 /ś ś A 0,00 - 1,00 A.U./. Owe e główne części frakcji białkowej otrzymanej z matrycy szkliwa, różniące się masą cząsteczkową, nazwano amelogeniną /niska masa cząsteczkowa/ i ena^eeiną /wysoka masa cząsteczkowa/.

Przykład I. Wytwolzanle ekstraktów stosowanych w próbach na zwierzętach.

W celu ustalenia który ze składników matrycy szkliw okazuje aktywność w przypadku modeli zwierzęcych, sporządzono następujące substancje testowe, wszystkie pochodzące z matrycy szkliwa świni.

BI. 0,3 g matrycy /zawrtość białek 27% + 4% roztarto w 3 ml 0,S% NaCl i w trakcie chłodzenia lodem poddano homodenazacji z użyciem Polythrone w ciągu 1 minuty, w odstępach co 10 sekund. Homodenazat zliofilidowaao. Otrzymano 177 mg produktu o zaoaltości białej 47% + 2% według Loiwy*ego.

E2. 0,3 g matrycy roztarto i zhomogenizoolao jak pow^żj, a potem ogrzewano na łaźni wodnej przez 4 minuty. Po liofilizacji otrz;mlao 177 mg produktu o zawartości białek 13% + 3%.

E3. 0,3 g substancji roztarto w 3 ml 0,5 m kwasu octowego /cz.d.a./, zhomogenizowano jak powżej i przez 24 godziny mieszano w temperaturze 4°C dla ^ekstrahowania białek. Następnie przez 10 minut prowadzono wirowanie z prędkością 10000 obrotów/minutę, wytrąconą substancję wyodrębniono i zamrożono, a ciecz z nad osadu zliofllizow£ao. Otrzymano 68 mg liofilizatu o zawrtości białek 27% + 3%.

E4. 0,3 g matrycy roztarto w 3 ml 10% EDTA w 0,03 m buforu Tris /pH 7,4/ i w trakcie chłodzenia przeprowadzono homodenazację jak pow^że. Przez 24 godziny prowadzono mieszanie w niskiej temperaturze w celu uzyskania ekstrakcji, po czym hom^^enń^at odwirowano w ochłodzonej wirówce. Ciecz z nad osadu poddano dializie wobec wody destylowanej i zliofilldowlao. Otrzymano 11 mg produktu o zawaatości białek 33% + 2%.

E5. Substancję ^trąconą po wirowaniu w procesie otrzymywania E4 wyekstrahowano około 10 objętościtmi 0,5 m krosu octowego, stosując podczas ekstrakcji mieszanie w niskiej temperaturze przez 24 godziny. Po odwiroroniu zli^ofii^j^zwaino ciecz znad osadu. Otrzymano 107 mg produktu o zawrtości białek 15% + 3%.

E6. Substancję odó.roroaą w procesie otrzymywania E5 zlJ^ofii^iowvano. Otrzymano 37 mg produktu o zawaatości białek 18% + 4%.

E7. 0,3 g matrycy roztarto w 3 ml 10% EDTA w 0,03 m buforze Tris /pH 7,4/ wraz z 0,4 mumia inhibitora proteinazy PMSP /fluorek fenyiomeeylosulfonylu.1 po czym przeprorodzono homodenazację i ekstrakcję tak samo jak w przypadku E4. Po odwirowaniu i dializie cieczy znad osadu zliofllizowano ją i otrzymano 11 mg produktu o zawrtości białek 41% + 2%.

E8. Substancję odwirowaną, opisaną w E7 ekstrhlowano 0,5M kwasem octowym w ciągu 48 godzin w niskiej temperaturze, odwirowano i przezroczysty roztwór suszono przez zamrażanie. Otrzymano 101 mg produktu o zawartości białka 17% + 1%.

E7. Substancję odm-rowną przy otrzymywaniu E8 zU^ofll^i^zwa^no i otmymano 40 mg produktu o zawaatości białek 30% + 3%.

Substancje otrzymane jako E1 - E7 icharaateyydowlao pod względem zawatości białek, rozruchu masy cząsteczkowej białek /SDS·-Page z Plhast/, punktów izoelektrycznych białek i zawatości węglowodanów.

Pozorny rozrzut masy cząsteczkowej ekstraktów św.ńskiej matrycy szkliwa przedstawiono na rysunku. Po elektroforezie z użyciem żelu pollalrtydaomidoweeo SDS /SDS 8 - 25%, Phast, PharooaCa/ pasma białek poddano transformacji w piki przy użyciu skanera laserowego /IKB Ultrascan XI//. Masę cząsteczkową oszacowano na podstawie kalibracji przy użyciu

160 475 wzorców białkowych /14 - 90 kDa/ i polipeptydowych /2 - 14 kDa/ produkcji Pharracia· Na fig. 1 i 2 przedstawiono w^'k*esy dla ekstraktów E4 i Ε5» zaś dane dla tych 1 pozostałych ekstraktów zestawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Ekstrakt	Itesa cząsteczkowa /SDS-Page/ składników białkowych /kDa/
5/12^b/	6/14^e/	10/15^	16	22	24	67
E1	X	X	X	X	X	X	X
E3	X	X	X		X	/x/
E4		X		X			X
E5	X		X		X	/x/
E7		^X I		X			X
E8	X	1	X		X	/x/

h/ Niskie rnirtości rasy cząsteczkowej uzyskuje się stosując polipepyydowy zestaw do kalibracji, zaś wysokie wartości rasy cząsteczkowej uzyskuje się stosując biakkowy zestaw do kalibracji.

X - duża ilość x - mała ilość /x/ - nieznaczna ilość.

W niniejzzm przykładzie wykazano w^ływ substancji E1 - E9 otrzymanych drogą wieloetapowej ekstrakcji tkanki prekursorowej szkliwa /matrycy szkliwa/ na gojenie się doświadczalnie wywłanych brzeżnych okaleczeń ozębnej. Okaleczenia brzeżne na obrzeżach ozębnej zębów rałpy wytworzono przez usunięcie cementu, ozębnej i obrzeża kości zębodołu na odcinku od szyjki do szczytu korzenia, około 5 mn, przy użyciu świdra dentystycznego. Następnie na doświadczalne okaleczenia nałożono badane substancje 1 pozostawiono je do zagojenia Wytoorzono także okaleczenia kontrolne, które pozostawiono do zagojenia bez nakładania jakiejkolwiek substancji. Po okrasie gojenia tiwającm 8 tygodni przeprowadzono histomorfo ratrycsną ocenę wraików.

W tabeli 2 rezultaty procesu gojenia podano procentowo w odniesieniu do wyjściowego poziomu pokrycia cementem i kością. Proces gojenia obejmował tworzenie się przylegającej warstwy nowego cementu, ozębnej i kości zębodołowej /nowe zamocoronie/.

Tabela 2

Badana substancja	Próba kontrolna	E1	E2	E3	E4	E5	E6	E7	E8	E9
Wyyooenie procentowe /%/	5	93	3	79	4	49	2	0	48	5

Tak więc zamocownie wytworzyło się po zastosowaniu substancji E1, E3, E5 i E8. Zamocownie nie powstało w próbie kontrolnej i przy zastosowaniu substancji E2, E4, E6, E7 i E9, w przypadku których uszkodzenie utrzymało się, a zęby pokryły się wyłącznie nabłonkiem. Wynktl te wskazują na fakt, iż stosowanie frakcji białkowej o niskiej rasie cząsteczkowej, pochodzącej z matrycy szkliwa, wywouje powstanie połączenia Między tkankami w leczeniu peΓiodołiltlt.

160 475

Przykład II. Wytwarzanie odaolonego krosowego ekstraktu mtrycy szkliwa. Zliofilizowany preparat, podobny do preparatu E3 z przykładu I, rozpuszczono w 0,1 m krosie octowym /144 mi/12 ml/ i uMeszczono w kolumnie /15 x 540 mn/ z drobnoziarnistą żywicą Sephadex G-25 w 0,1 m kwasie octowym. Pierwszą bogatą w białka frakcję /E10/ zebrano i zliofillzawanz. Otrzymano 34 mg maeriału o zawartości białek około 72%, co odpowiada zawaatości białek około 85% w mteriale wyjściowym. Resztkowe białka znaleziono we frakcji soli /63 mg zliofillzaaa□ego maaeriału zawierało około 7% białek/. Zl^o^HowKa ną frakcję białkową otrzymaną w ten sposób napełniono 10 ml fiolki /po 20 mg w fiolce/ i wyjałowiono promieniowaniem /35 kGy/ przed próbami na zwierzętach. Substancję E10 poddano próbie opisanej w przykładzie I. Wygożenie procentowe dla E10 ^liosło 72%, zaś wrtość ^gooenia procentowego w próbie kontrolnej wyrosła 4%.

Przykład III. Wygroaz¢anit oczyszczonych frakcji 10 białkowych. W 20 ml 0,1m krosu oct^ego rozpuszczono 200 mg zliof^lizaronego preparatu E3 /identycznego jak użyty w przykładzie II/ i całość umieszczono w kolumnie /25 x 780 z żyWcą Sephadex G-75 w 0,1 m krosie octowym, w temperaturze 4°C. Kolumnę eluowano z prędkością 55 ml/godzinę i odbierano próbki o objętości 4 ml. Eluat monitoroaaiz przy 280 nm /Uvicord/. Frakcje zawierające główną część eluoronego maaeriału połączono i otrzymano 5 frakcji, które poddano analizie elektroforetycznej /SDS-Page/ pod kątem rozrzutu masy cząsteczkowej.

Pięć	pików z c
/1/	50 - 60«
/2/	62 - 801
/3/	90 -100«
/4/	110 -125:
/5/	130 -160«

białka o wysokiej masie cząsteczkowej, enamellny /masa cząsteczkowa powr^ej 40000/, amelogenina o wysokiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa około

000/ amelogenina o około 14 000/ średnio wysokiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa amelogenina o niskiej masie cząsteczkowej /masa cząsteczkowa około 5000 - 10 000/

Po zliofillzawanlu pików /2/, /3/ i /4/ otrzymano 10 mg i 12 mg białek ameeogeninowych o msie cząsteczkowej odpowadnio ^yo^e^j, średnio ^solkej i niskiej /zawartość białek powyżej 90%/.

Celem dośwadczenia było ^kazanie wpływu substancji tmelzgtninowgeh o wy^kej, średnio ^aokiej lub niskiej masie cząsteczkowej, w^rykstrainowangch z tkanki prekursorowej szkliwa /matrycy szkliwa/ na gojenie się doświadczalnie aywaZanyeh brzeżnych okaleczeń ozębnej. Obleczenia brzeżne na obrzeżach ozębnej zębów małpy wytworzono przez usunięcie cementu, ozębnej i obrzeża kości zębodołu na odcinku od szyjki do szczytu korzenia, około 5 mm, przy użyciu śwdra dentystycznego. Następnie na doświadczalne okaleczenia nałożono badane substancje i pozostawiono je do zagojenia. Wyyworzono także okaleczenia kontrolne, które pozostawiono do zagojenia bez nakładania jakiejkolwiek substancji. Po okresie gojenia trwającym 8 tygodni przeprowadzono histomorfometryczną ocenę wyników. Rezultaty próby podano w tabeli 3.

Tabela 3

Badana suZθttiCJt	Próba kontrolna
wysoka masa cząsteczkowa	średnio wysoka masa cząstezzow^E	niska masa cząsteczkowa
Wygozenie procentowe /%/	4	78	21	15

160 475

Tak więc nowe zamocownie powstało przy zastosowaniu amelogeniny o wysokiej rasie cząsteczkowej, a w rniiejszim stopniu przy zastosowaniu amelogenin o średnio wsokiej i niskiej rasie cząsteczkowej. Rezultaty te wskazują na fakt, iz użycie frakcji amelogeninowej o wsokiej masie cząsteczkowej, pochodzącej z ratrycy szkliwa, najskuteczniej wwoi-ije powstanie połączenia między tkankami w leczeniu periodonnitis.

Przykład IV. l^^wazenie kwasowego ekstraktu matrycy szkliwa. Żuchwy uśmierconych świń /wiek około 6 mesięcy, waga rzeźna około 80 kg/ wcięto z miękkiej tkanki i zamrożono w rzeźni. Odpowiednie zawiązki zębów wcięto z połówek szczęk po częśconym rozmrożeniu i wodrębniono matrycę szkliwa.

g ratrycy szkliwa roztarto w 780 ml 0,5 m kwasu octowego /pH 4,1/ i w trakcie chłodzenia lodem poddano homonenizaaJi /homogenńzator Polytron PT 10-30/. Homonenizat mieszano w niskiej temperaturze przez 22 godziny dla wskktrahnwaπia białek rozpuszczalnych przy pH około 4. Nierozpuszczalny materiał odWroirano, a roztwór w kwsie octowym zliofllinlwno. Otrzymano 8,5 g liofilizatu o zawaatnści białek około 20%, co odpowiada wyd^cści odzyskiwania białek około 50%.

ΖΙ^^υ^α^ ekstrakt poddano badaniom na zawartość wody, zawartość octanów, zawartość białek /metoda Loiwy^ego/ i zawrtość węglowodanów /odczynnik Annrona/, analizie składu aminokwasów, analizie elementarnej, analizie rozrzutu masy cząsteczkowej białek /SDS-Page/ i analizie punktów izoelektrycznych białek.

Wyżki badań i analiz homonenizatu ratrycy szkliwa i frakcji białoowch otrz;m>anych z tego homonenizatu przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Wynkii analizy	Homonenizat ratrycy szkliwa /E1/	Ekstrakt kwasow /E3/	Ekstrakt odsolnns /E10/	Frakcja soli /przykłtt 11/
1	2	3	4	5
Analiza elementarna /*/ C	11,3	31	50,4
H	1,7	4,4	6,8	-
N	3,9	4,5	15,5	0,7
0	9,4	27,5	21	-
S	0,2	0,35	1,3	0,1
Cl	5,5	0,6	< 0,1	1.3
P	8,8	3,5	0,1	4,3
Ca	11.9	12	< 0,1	31,6
K	0,2	0,4	<0,1	-
Zawttość białek /%/ Anntiza Low-y^ego	23	20	72	< 4
Analiza aminokwasów	< 23	< 26	< 90	-
Zawatość węglowodanów /%/ Odczynnik Antront		0,4	1,3
Zawatość wody /%/	-	2	6	-
Miareczkowanie meto· dą Katla-Pischert

160 475

c.d. Tab. 4

1	2	-3-	4	5
Zawwrtość octanów Metoda GC		38	4
Analiza aminokwasów Pro		18,0	19,0
Glu	-	17,8	19,0	-
Leu	-	9.0	9,1	-
Hie	-	8,7	9,2	-
Ser	-	4.8	4,6	-
Gly	-	3,2	2,8	-
Tyr	-	6,4	5,3	-
Thr	-	3,6	3,4	-
Val	-	3,6	3,5	-
Met	-	4,3	5,3	-
Ile	-	3,5	3,6	-
Asp	-	3,6	3,0	-
Phe	-	3,8	3,7	-
Ala	-	1,6	1,5	-
Lys	-	2,5	1.8	-
Arg	-	3,0	2,5	-
Trp	-	2,6	2,5	-
Cys	-	0	0	-

Przed próbami kllnccznymi roztwór białek w kwasie octowym przesączono jałowo do jałowych 10 ml fiolek i zliofilizowano w jałowych warunkach.

Celem doświadczeń było wrażenie wpływu substancji £3 na gojenie się brzeżnych okaleczeń ozębnej u ludzi. Pacjentów poddano operacji dla usunięcia kamienia nazębnego i ziarniny. Substancją E3 pomalowano obnażone powierzchnie korzenia, po czym przykryto je płatem śluzsówkowo-ozębnowym. Przebieg procesu gojenia oceniono dokonując okresowych przeglądów klinicznych, mierząc głębokość kieszonek, stopień zamocoirania i wskaźniki pokrycia dziąsłem, a także wykonując zdjęcia rentgenowskie jemy ustnej. Wyniki porównano z ulikami wcześniejszych badań ilosciwych przeprowadzonych u tych samych pacjentów poddanych tradycyjnym zabiegom chirurgcznym na ozębnej i podobnej koniroli·

Wyynki wykazały, iz substancja E3 spiwodowoła znaczny przyrost obrzeża kości zębodołowej /około 4-8 mm/ i zwiększenie stopnia zamocownia /5-9 mu/· Takiego procesu gojenia nie uzyskano nigdy w rezultacie tradycyjnego zabiegu chirurgicznego na ozębnej. Ogólnie proces gojenia wdawał się postępować szybciej, na co wskazywał zarówno wygląd miejsca zabiegu, jak 1 fakt zimnejszenia się głębokości kieszonek bocznych w porównaniu z w^iikami badań przeprowadzonych w przypadku tradycyjnych zabiegów chirurgicznych na ozębnej. Wyynki te świadczą o tym, że pochodząca z mitrycy szkliwa frakcja białkowa o niskiej masie cząsteczkowej wykazuje zdolność O3nvoiynvonir powstawania nowego zamocowania ozębnowego u ludzi, a takiego efektu nie spotkano w przypadku tradycyjnego leczenia.

Przykład V. Wpływ na gojenie się kości.

Wpływ pochodzącej z imtrycy szkliwa frakcji białkowej o niskiej masie cząsteczkowej na gojenie się kości badano na doświadczalnych ubytkach w żuchwach i kościach udowych dorosłych szczurów. Dokonując pionowego nacięcia chirurgicznego skóry i mięśnia

160 475 żwacza odsłonięto kąt żuchwy. W kości żuchwy wnWercono pod osłoną stale przepływającego roztworu aoli fizjologicznej niewielki otwór o średnicy 2 mn. W ten aam apoeób wyWercono otwory tej samej wielkości w kości zbitej kości udowej, na końcu dalszym.

W otworach z prawej strony żuchwy i na prawej kości udowej zastosowano frakcję białkową o niskiej rasie cząsteczkowej, zaś otwory z lewej strony żuchwy i na lewej kości udowej służyły jako otwory kontrolne.

Frakcję białkową o niakiej rasie cząsteczkowej naniesiono albo w postaci gąbczastego materiału zliofilizowanego, albo w niewielkich żelatynowych cylindrach. Otwory kontrolne z lewej strony żuchwy 1 na lewej kości udowej wypełniono żelayynowymi cylindrrni bez frakcji białkowej,zaś u szczurów, w przypadku których zastosowano gąbczasty liofilizat, pozostawiono otwory kontrolne nie wH>ełnione. Szczury uśmiercono po 1 - 5 tygodniach od naniesienia badanej substancji, obszary po zabiegu 1 obszary kontrolne wyizolowano i poddano je obserwacjom mikroskopowym. Już po upływie 1 tygodnia od naniesienia frakcji białkowej o niskiej rasie cząsteczkowej wywercony otwór całkowicie wypalił się kością, a ponadto wstąpiło wyraźne pokrycie kości okoatną. Na obszarach kontrolnych, rówiież pobratała nowa kość, lecz było jej wyraźnie munej, a w/W-ercone otwory nie uległy zagojeniu.

Claims

1. Sptaob wtórzenia frakcji białkooej matrycy szkliwa t niskiej masie cząsteczko wej przez odzyskanie frakcji z zawiązków zębów, znamienny tym, że izoluje się zawiązki zębów ze szczęk ssaka, usuwa się z tych zawiązków narząd szkliwny, z tych wolnych td narządu szkHwnegt zawiązków w/otdębnia się matrycę szkliwa, poddaje się ją htmoteniiaaji w kwasie octowym i wyOrębnia się frakcję białkową o niskiej maaie cząste czkowej przy pH wynoszącym około 4 przez oddzielenie nierozpuszczalnej substancji i odzyskuje się frakcję białkową o cząsteczkowej od 5000 do 40000.

2. Sposób według zastrz. 1, znamię lub trzody chlewnej.

3. Sposób według zastrz. 1, znamię wulną kwasem octowym frakcję amelogeninową.

4. Sposób według zastrz. 3, znamię białkową o masie cząsteczkowej od około 5000

5. Sposób według zastrz. 4, znamię amelogniinową o wysokiej misie cząsteczkowej η n y t y m, że stosuje się zęby bydła