DK175443B1 - Ikke-indtrængende iontoforesepröveudtagningsanordning eller -indföringsanordning - Google Patents

Description

DK 175443 B1

BAGGRUND FOR OPFINDELSEN

Opfindelsens område 5

Den foreliggende opfindelse angår en anordning og en in vitro-fremgangsmåde til udformning af iontoforeseprøveudtagning eller -prøveindføring af forbindelser gennem en membran, såsom udskåret hud fra et pattedyr. I et andet aspekt angår opfindelsen en anordning til iontoforeseindføring eller -prøveudtagning af 10 forbindelser gennem den intakte hud af et levende pattedyr. Apparatet er navnlig en anordning, som anbragt på samme side af intakt hud har en positiv elektrode, en negativ elektrode og et elektrisk isolerende materiale, som adskiller elektroderne.

15 BESKRIVELSE AF BESLÆGTET KENDT TEKNIK In vitro-prøveudtaaninq 20 C.C. Peck et al. beskriver i Pharmacology Skin. Vol. 1, side 201-208, publiceret af Karger, Basel 1987, en fremgangsmåde til in vitro-bestemmelse af den udadgående transdermale migration af theophyllin under anvendelse af et passivt transdermalopsamlingssystem (’’transdermal collection system”, TCS). Der beskrives ikke anvendelse af elektrisk forstærkning af migration.

25 R.R. Burnette et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 75, nr. 8, side 738-743, publiceret i august 1986, beskriver under anvendelse af standarddiffusionscelle en sammenligning af den iontoforetiske og passive in vitro-transport af 30

DK 175443 B1 I

thyrotropinfrigørende hormon (TRH) gennem udskåret hud fra nøgne I

mus. Resultaterne antyder, at både ladede og ikke-ladede TRH-strømme I

gennem det udskårede væv var større end de, der opnås ved passiv I

diffusion alene. I

Ved standardarrangementet (kendt teknik) til in vitro-iontoforese- I

undersøgelser (se figur 6) anbringes to halvdele af en diffusions- I

celle horisontalt side om side, således at huden er anbragt verti- I

kalt mellem disse med dens epidermale side mod den ene halvdel og I

10 dens indvendige side mod den anden. Det bioaktive præparat og den I

aktive elektrode anbringes i den "epidermale" halvdel af cellen, og I

den anden side af cellen indeholder den passive elektrode i en I

ledende væske. I

15 Dette side-om-side-arrangement har adskillige ulemper og begræns- I

ni nger. Da den passive elektrode faktisk er anbragt "inde i" huden, I

er denne konfiguration ikke en god model af in vivo-tilfældet. De I

faktorer, der påvirker f.eks. en ikke-fysiologi sk situation, er ikke I

nødvendigvis de, som er vigtige i det kliniske tilfælde. Desuden er I

20 der spørgsmål, som ikke kan undersøges ved en side-om-side-konfigu- I

ration, såsom muligheden for horisontal transport (dvs. inde i I

hudlag snarere end vertikalt gennem huden), og hvorvidt et iontofo- I

retisk drevet medikament "trækkes” tilbage ud af huden med den I

passive elektrode. I

25 I

Inden for fagområdet sælges iontoforesemedikamentindfcringssystemet, I

Phoresor, af Motion Control, Inc., 1290 West 2320 South, Suite A, I

Salt Lake City, Utah 84119, USA. I

30 In vitro-indførinq I

Ved model undersøgel ser er iontoforese anvendelig til at undersøge I

kemisk transport af ladede materialer gennem en membran, såsom en I

udskåret hudprøve. F.eks. beskriver N.H. Bellantone et al. i Inter- I

35 national Journal of Pharmaceutics. Vol. 30, side 63-72, publiceret i I

1986, en inden for fagområdet standard-side-om-side-diffusionscelle- I

udformning og elektrodekonfiguration til forskellige systemer, som I

anvendes til iontoforese af benzoesyre (som model forbindel se) (se I

figur 6). Der eksisterer en række begrænsninger for denne side-om- I

3 DK 175443 B1 side-celleudformning, som beskrives yderligere nedenfor.

In vivo··indføring 5 Iontoforese er den elektrisk forstærkede transport af ladede forbindelser, almindeligvis bioaktive materialer. Proceduren er en kendt metode til transdermal indføring af medikamenter. F.eks. beskrives der i US patent nr. 4.141.359 til S.C. Jacobsen et al., hvilket medtages heri ved denne henvisning, et forbedret iontoforeseudstyr 10 til topisk indgivelse af ioniske medikamenter eller kemikalier gennem epidermalt væv uden mekanisk gennemtrængning. De positive og negative elektroder fæstnes til huden på forskellige steder. Den ioniské form af medikamentet tilføres den passende elektrode og ledes ind i og gennem det epidermale væv ved hjælp af direkte strøm 15 fra en strømkilde. Der eksisterer en række problemer med denne type indføring, hvor elektroderne er adskilte.

In vivo-prøveudtaqnina 20 Der er et velkendt og betydeligt behov for at udtage prøver af og kvantificere bioaktive forbindelser i legemet (typisk i blodet). Det kan f.eks. være afgørende at overvåge tilstedeværelsen af et vigtigt endogent biokemikalie med henblik på diagnose af en lidelse, eller det kan være væsentligt at følge og således optimere niveauet i 25 blodet af et indgivet medikament under en kemoterapeutisk behandling. Almindeligvis opnås den ønskede bestemmelse ved analyse af en blodprøve, som udtages ved indtrængning med en injiceret kanyle til et opsamlingsrør.

30 Den passive transdermale opsamling af theobromin in vivo er også beskrevet af C.C. Peck et al., 1987, se ovenfor. Der beskrives ikke forstærkning af migrationen med elektrisk strøm.

Der er ikke fundet litteratur, som beskriver en i alt væsentligt 35 ikke-indtrængende procedure til prøveudtagning af biologisk materiale i det systemiske kredsløb. Det vil kræve en enestående anvendelse af iontoforese at "udtrække" systemisk cirkulerende molekyler til et opsamlingsudstyr anbragt på overfladen af huden eller slimhinden. Dén foreliggende opfindelse involverer ikke gennemtrængning

DK 175443 B1 I

af huden eller af noget blodkar. I

In vivo-biodetekterinq I

5 Der eksisterer et behov for kontinuert eller ikke-kontinuert over- I

vågning af visse biokemiske nøgleparametre hos patienter på hospital I

og et behov for en ny klasse af medicinsk udstyr til opnåelse af I

tidstro, on-line kvantificering. En biosensor er et mi kroelektronisk - I

udstyr, som benytter et bioaktivt molekyle som det detekterende I

10 signal transducerende element. I

K.W. Hunter Jr. beskriver i Archives of Pathological Laboratory I

Medicine. Vol. Ill, side 633-636, publiceret i juli 1987, på generel I

måde den række udstyr og de fysiske egenskaber, som undersøges. I

15 Hunter-Referencen omfatter også et generelt diagram for et transder- I

maldosimeter. Denne reference giver ikke den yderligere specifikke I

information, der er nødvendig for at skabe et virkende biodetekte- I

rende feedback-medikamentindføringssystem. I

20 C.C. Peck et al. beskriver i Journal of Pharmacokinetics and Bio- I

pharmaceutics. Vol. 9, nr. 1, side 41-58, publiceret i 1981, anven- I

delse af kontinuert transepidermal medikamentopsamling ("continuous I

transepidermal drug collection", CTDC) til fastlæggelse af medika- I

mentindtagelse og farmakokinetik. Det blev konkluderet, at når 25 tilbageoverførsel minimeres, kan CTDC være et nyttigt værktøj til at fastlægge mængden af medikamenteksponering osv., men det giver kun en lille fordel i forhold til særskilt prøveudtagning af andre

legemsvæsker ved undersøgelse af andre aspekter af medikamentdispo- I

si tionskinetik. I

US patenter af interesse omfatter: 4.329.999, 4.585.652, 4.708.716, I

4.689.039, 4.702.732, 4,693.711, 4.717.378, 4.756.314, 4.699.146, I

4.700.710, 4.706.680, 4.713.050, 4.721.111, 4.602.909, 4.595.011, I

4.722.354, 4.722.726, 4.727.881, 4.731.049, 4.744.787, 4.747.819 og I

35 4.767.401. I

Y.B. Bannon, EP patentansøgning publikationsnr. 252.732 (13. januar I

1988) angående et transdermalt medikamentindføringssystem er af I

generel interesse.

5 DK 175443 B1

Referencer af interesse omfatter: W. Scharamm et al., "The Commercialization of Biosensors", MD&GI, side 52-57, publiceret i november 1987.

5 A.F. Turner et al., "Diabetes Mellitus: Biosensors for Research and Management", Biosensors. Vol. 1, side 85-115, publiceret af Elsevier Applied Science Publishers, Ltd., England, 1985.

10 Y. Ikarlyaman et al., Proc. Electrochem. Soc.. 1987, 87-9 (Proc.

Symp. Chem. Sens.) 378. CA 107-(22); 207350η.

P.H.S. Tso et al., Anal. Chem.. 1987, 59 (19), 2339, CA 107(14); 1262448.

15 H. Wollenberger et al., K. Anal. Lett.. 1987, 20(5), 857, CA 107(9); 73551.

P.J. Conway et al., D.A. Sens. Actuators. 1987, 11(4), 305, CA 20 107(5); 36151.

M. Mascini et al., Cl in. Chem.. (Winston-Salem, NC) 1987, 33(4), 591 CA 107(5); 35851h.

25 i. Hanning et al., Anal. Lett.. 1988 19(3-4) 461, CA 105(6); 48993q.

M. Shirchirl et al., Diabetes Care. 1986, 9(3), 298 CA 105(5); 38426t.

30 S.J. Churchouse et al., Anal. Proc.. (London) 1986, 2395, 146 CA 105(3); 21117v.

D.A. Gough et al., Anal. Chem.. 1985, 67(12), 2351 CA 103(15); 11925a.

35 C. Loo et al., Chem. Eng. Sci.. 1985, 40(5), 873 CA 103(5); 34337a.

Alle de heri omtalte referencer og patenter medtages i deres helhed heri ved denne henvisning.

I DK 175443 B1 I

I 6 I

I Det er ønskeligt at have en anordning og en metode til prøveudtag- I

I ning (eller indføring) af forbindelser (ladede eller neutrale) fra I

I (eller til) en membran (in vitro) eller at prøveudtage (eller I

I indføre) forbindelser (ladede eller neutrale) fra (eller til) den I

I 5 intakte hud (slimhinde, osv.) på et levende pattedyr. Ved den I

I foreliggende opfindelse opnås disse formål. I

I OPSUMMERING AF OPFINDELSEN ' I

I 10 Den foreliggende opfindelse angår en diffusionscelleanordning til I

I anvendelse ved elektrisk forstærket prøveudtagning af en forbindelse I

I fra en membranoverflade eller indføring af en forbindelse i eller I

I gennem en membranoverflade uden mekanisk gennemtrængning, hvilken I

I anordning omfatter I

I 15 I

I mindst to elektrisk ledende permeable elektrodeorganer til I

I forbindelse med membranoverfladen og I

I organer til elektrisk isolering af hvert elektrisk ledende I

I 20 elektrodeorgan fra hinanden, I

I hvorhos elektrodeorganerne er anbragt i alt væsentligt side om side I

I med sider, som strækker sig og afsluttes i en i alt væsentligt I

I fælles fladeoverflade, som umiddelbart berører nærliggende dele af I

I 25 den samme side af membranoverfladen. I

I I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en in vitro-an- I

I ordning til fjernelse eller indføring af enten ioniserede eller I

I ikke-ioniserede forbindelser fra en membranprøve uden mekanisk I

I 30 gennemtrængning, hvilken anordning omfatter: I

I (a) en positiv elektrode, I

I (b) en negativ elektrode og I

I 35 I

I (c) elektrisk isolering mellem underdel (a) og (b), hvorhos den I

I positive elektrode, den negative elektrode og den elektriske I

I isolering er anbragt på samme side af membranprøven. I

7 DK 175443 B1 I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en anordning til fjernelse eller indføring af ioniserede forbindelser i et pattedyr gennem den intakte hud eller slimhinde uden mekanisk gennemtrængning, hvilken anordning omfatter: 5 (a) en positiv elektrode, (b) en negativ elektrode og 10 (c) et elektrisk isolerende materiale mellem underdel (a) og (b), hvorhos den positive elektrode, den negative elektrode og det isolerende materiale fysisk er anbragt således, at hver af dem frembyder en enkelt fælles overflade af anordningen til berøring med samme side af huden eller slimhinden hos pattedyret.

15 I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse anvendelse af iontoforese til bestemmelse af niveauet af et ikke-ladet eller ladet molekyle i et levende pattedyr og under anvendelse af en feedback-mekanisme indgivelse af passende mængder terapeutisk 20 forbindelse ad en hvilken som helst af en række tilgængelige indgivelsesveje.

I endnu et aspekt angår opfindelsen anvendelse af iontoforese til at øge indvindingen af en ladet eller neutral forbindelse fra en 25 membran eller huden af et levende pattedyr ved én elektrode fulgt af analyse af koncentrationen af forbindelsen ved gaskromatografi (GC), massespektrometri (MS), højtryksvæskekromatografi (HPLC), scintilla-tionstælling og lignende.

30 Kort beskrivelse af tegningen

Figur 1 viser en isometrisk oversigt over in vitro-diffusionscelle-konfiguration til udformning af iontoforetisk fjernelse eller afgivelse af en ladet eller neutral forbindelse.

35

Figur 2 viser tværsnittet af den udformede diffusionscelle ifølge figur 1 langs linien 2-2.

Figur 3 viser et eksploderet tværsnit af diffusionscellen ifølge

DK 175443 B1 I

figur 2. I

Figur 4 viser et eksploderet tværsnit af cellen ifølge figur 2, hvor

fast glas er isoleringen i det nedre reservoir, der adskiller I

5 elektroderne. Figur 4 viser også cirkulationssystemet for H

receptorvæsken. I

Figur 5A til 5H viser et tværsnit af en række konfigurationer for I

den positive elektrode, den negative elektrode og isoleringsmidlet I

10 derimellem taget langs linien 5A-5A i figur 1 for bunden af den øvre I

del af diffusionscellen. I

Figur 6 viser et isometrisk snit af den kendte side-om-side-ionto- I

foresecelle. I

Figur 7 viser et isometrisk snit af en iontoforesecelle under I

anvendelse til in vivo-indføring af et bioaktivt molekyle i et I

menneske. I

20 Figur 8 viser et tværsnit af diffusionscellen ifølge figur 7 langs I

linien 8-8. I

Figur 9A og 98 viser en iontoforesediffusionscelle ifølge figur 7 I

eller 8 fra oven og fra neden.

25 I

Figur 10 viser et tværsnit af et iontoforeseforsøg, hvor elektroder- ne er adskilte.

Figur 11 viser in vitro-iontoforeseprøveudtagning af clonidin under

30 anvendelse af diffusionscellen ifølge figur 1, 2 eller 3. I

Figur 12 viser in vitro-iontoforeseprøveudtagning af theophyllin I

under anvendelse af diffusionscellen ifølge figur 1, 2 eller 3. I

35 Figur 13 viser adskilte elektroder forbundet til et marsvin i en I

udformning med enten afgivelse eller udtagning af en ladet eller I

ikke-ladet forbindelse.

Figur 14 viser in vitro-iontoforeseafgivelse af morphin under 9 DK 175443 B1 anvendelse af diffusionscellen ifølge figur 1, 2 eller 3.

Figur 15 viser in vitro-iontoforeseafgivelse af P.S.O.S. (kalium-saccharoseoctasulfat) under anvendelse af diffusionscellen ifølge 5 figur 1* 2 eller 3.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN OG FORETRUKNE UDFØRELSESFORMER Definitioner 10

Som anvendt i nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "diffusionscelle" et elektrisk system til iontoforese. Systemet kan omfatte positiv elektrode, negativ elektrode og elektrisk isolering derimellem. Systemet kan også være en positiv ledning, elektrisk 15 isolering og jord.

Udtrykket "pattedyr” betegner sædvanlige laboratoriedyr, der anvendes til forsøg, rotter, mus, marsvin, kaniner, aber og lignende. Udtrykket kan også omfatte hunde, katte, kvæg, får, heste og lignen-20 de. Et foretrukket pattedyr er mennesket.

Udtrykket "membranoverflade" refererer til enten en tynd membran, såsom udskåret hud, syntetiske membraner, slimhinder eller til overfladen eller lige under den intakte hud af et pattedyr, for-25 trinsvis et menneske.

En foretrukken udførelsesform til prøveudtagning eller -indføring er kombinationen af materialer til de permeable elektroder.

30 En mere foretrukken udførelsesform for elektroderne omfatter en metaltråd i kombination med en gel, som er i kontakt med membran-overfladen.

Generelle materialer og fremgangsmåder til prøveudtagning eller 35 -indføring

Biomateriale eller biomaterialer, der indføres eller udtages, omfatter et hvilket som helst materiale, som findes i systemet hos et levende pattedyr, såsom nedbrydningsprodukter, metalioner,

I DK 175443 B1 I

I 10 I

I peptider, hormontoksiner og lignende - neutrale forbindelser eller I

I de, som bærer eller kan bringes til at bære en elektrisk ladning. I

I I prøveudtagnings- og i prøveindføringselektroden (som er åben) er I

I 5 den elektrisk ledende gel Kenzgelelc, der fås fra Nitto Electric I

I Industrial Co., Osaka, Japan. I

I Spændingen ligger almindeligvis mellem ca. 0,1 og 15 volt, fortrins- I

I vis mellem 1 og 10 volt og er navnlig ca. 5 volt for både prøveud- I

I 10 tagning og -indføring. I

I In vitro-prøveudtagnino I

I Beskrivelse af model cel le: Der henvises til figur 1, 2, 3 og 4. En I

I 15 iontoforesediffusionscelle 10 til in vi tro-modelprøveudtagning er I

I konstrueret således, at den ene cellehalvdel 11 er over den anden I

I halvdel 12. Den udskårede hud 13 er anbragt horisontalt med den I

I epidermale overflade 14 mod den øvre halvdel af cellen (se figur 1, I

I 2 eller 3). Den øvre cellehalvdel 11 er af to lodrette vægge 15A og I

I 20 15B delt i tre kamre 16A, 16B og 16C. De to yderkamre er således I

I adskilt af et mellemliggende rum 16B (det tredie kammer). Den nedre I

I cellehalvdel 12 indeholder receptorvæsken. Væggene 15A og 15B, som. I

I udgør midterkammeret 16B i den øvre halvdel 11, fortsætter som I

I væggene 15C og 15D i den nedre cellehalvdel 12 men forenes derpå til I

I 25 dannelse af en rende 18 til frembringelse af en kanal 19, som går I

I tværs gennem toppen af den nedre halvdel 12. Kanalen 19 kan omfatte I

I prøveudtagningsåbninger til fjernelse af væske. I

I Kamrene 16A og 16C indeholder hver især uafhængigt af hinanden et I

I 30 elektrisk ledende middel eller medium 25A (eller 25B) udvalgt blandt I

I gel, væske, pasta, svamp, skum, emulsion, permeabelt metal, permea- · I

I belt keramisk materiale og kombinatiner heraf. For at fuldende det I

I elektriske kredsløb anbringes almindeligvis metaltråde eller elek- I

I troder 26A og 26B hver især i det elektrisk ledende medium som vist I

I 35 på figur 3. De andre tilsvarende figurer, f.eks. 1, 2, 3 eller 4, I

I kan udlægges på tilsvarende måde. I

I Når den øvre cellehalvdel 11 er anbragt over den nedre halvdel 12, I

I således at de øvre vægge 15A og 15B og de nedre vægge 15C og 15D I

11 DK 175443 B1 falder sammen, er strimlen af hud 13 mellem væggene forseglet fra huden i elektrodekamrene på både dens øvre og dens nedre side (figur 2). Huddelene i elektrodekamrene 16A og 16C er således fysisk og elektrisk isoleret fra hinanden, således at strømmen af strøm og 5 biomateriale gennem og i huden kan undersøges. Åbninger 20A og 20B i den nedre cellehalvdel 12 tillader kontinuerlig perfusion af receptorvæske 17. Åbninger 21A og 21B tillader konstant temperaturovervågning af vandkappen 21C. Under et forsøg fyldes kanalen 19 ved toppen af den nedre cellehalvdel 12 med receptorvæske 17, således at 10 undersiden af huden 13 forbliver fugtig. Væggene 15C og 150 tilvejebringer også mekanisk understøtning af membranen (huden).

Den øvre halvdel 11 og den nedre halvdel 12 kombineres ved deres komplementære enkeltplanflader med prøven 13 derimellem under 15 anvendelse af fjederbøjler 22A og 22B eller andre fastgørelsesmidler for at holde den øvre halvdel 11 og den nedre halvdel 12 af cellen tæt sammen.

I figur 4 er en barriere 18A fremstillet af glas for elektrisk at 20 isolere kamrene 16A og 16C. Figur 4 viser også receptorvæsken 17, som bevæger sig i et rør 20B til en beholder 29A. Væsken 29B pumpes derpå under anvendelse af en pumpe 29 tilbage til reservoiret (eller vice versa). Der kan anvendes enhver passende væske, saltopløsning, blod og lignende ved både prøveudtagning af forbindelser og forsøg 25 med indføring af forbindelser.

I figur 5A til 5H er vist flere udførelses former for den rumlige konfiguration af diffusionscellen 10 ifølge den foreliggende opfindelse langs linien 5A-5A i figur 1. Figur 5A er et tværsnit af 30 bunden af den øvre halvdel af figur 1 langs linien 5A-5A. Der er vist kamrene 16A, 16B og 16C samt elektriske isoleringsmaterialer 15A og 15B (f.eks. glasvægge). Figur 5B viser et tværsnit langs linien 5-5 med kamrene 16A og 16C og en enkelt glasvæg 15E, Tværsnittet 5C har firkantede kamre 16A, 16B og 16C med elektrisk 35 isolerende vægge 15A og 15B. Tværsnittet i figur 5D viser firkantede kamre 16A og 16C med en enkelt glasvæg 15F. Tværsnittet i figur 5E viser en koncentrisk koaksial konfiguration. Kamrene 16AA(+), 16BB (isolering) og 16CC(-) er vist med isolerende glasvægge 15AA og 15BB samt 15EE. Tværsnittet i figur 5F viser også en koncentrisk celle

I DK 175443 B1 I

I 12 I

I med kamrene 16AA(+) og 16CC(-) og isolerende vægge 15CC og 15FF. I

I Figur 5G viser et tværsnit af elektroder og isolering med to cirku- I

I lære elektroder (kamrene 16A og 16C) og glasisolationsvsgge 15G og I

I 15H. Figur 5H viser et tværsnit af en type koncentrisk celle langs I

I 5 linien 5A-5A med kamrene 16A og 16C med isolerende væg 15DD. Disse I

I konfigurationer viser sig ved bunden af den øvre halvdel 11 og I

I toppen af den nedre halvdel 12, og væggene og kammer koinciderer, I

I når cellen er lukket som vist i figur 1. I

I 10 Selvfølgelig er toppen af den øvre halvdel 11 vist med en åben top I

I til kamrene 16A til 16C. Denne top kan være lukket eller tildækket. I

I På denne måde kan kamrene 16A og 16C indeholdende elektrodetrådene I

I være anbragt i mange vinkler i forhold til lodret, og kamrene 16A og I

I 16C vil bevare god elektrisk kontakt med membranoverfladen. I

I 15 I

I For at opretholde en solid elektrisk kontakt kan der anvendes et I

I kemisk klæbemiddel, som ikke er modtageligt for iontoforese, såsom I

I det hypoallergene kemiske klæbemiddel, der fås fra 3M Company, St. I

I Paul, Minnesota, USA. I

I 20 I

I Der beskrives en ikke-indtrængende metode og anordning til prøveud- I

I tagning og overvågning af ikke-ioniske enheder, såsom glucose, I

I saccharose og lignende, under anvendelse af iontoforese. I

I 25 Glucose - Medicinsk diagnose og patientpleje afhænger af prøveudtag- I

I ning og analyse af bioaktive forbindelser i legemet. Prøveudtagning I

I involverer almindeligvis analyse af blodet og plasma, hvilket I

I nødvendiggør en indtrængende, ubehagelig, risikabel (f.eks. virus) I

I og nogle gange begrænset blodprøveudtagning. Et af de vigtigste I

I 30 tilfælde, hvor prøveudtagning er nødvendig mindst flere gange daglig I

I hele livet, er det tilfælde, hvor patienten har sukkerdi abetes. I

Tidstro information angående glucoseniveauerne i legemet (f.eks. I

blodet) er en meget vigtig information ved patientens behandling og I

er i mange tilfælde ofte et spørgsmål om liv og død. Der beskrives i I

35 det følgende en enkel, ikke-indtrængende prøveudtagningsmetode, ved I

hvilken der anvendes iontoforeseprøveudtagning. I

For at vise fremgangsmådens evne til at udtage glucoseprøver gennem I

huden udføres in vi tro-undersøgelser under anvendelse af .musehud I

13 DK 175443 B1 uden hår som hudmodel og iontoforesediffusionscellerne vist på figurerne 1-13. Resultaterne heraf er anvendelige i forbindelse med in vivo-prøveudtagning fra et pattedyr, navnlig et menneske. To selvklæbende gel elektroder ("Kenzgelelc" fra Nitto Electric Industry 5 Co., Limited, Osaka, Japan) anbringes på samme side af et enkelt sammenhængende stykke musehud uden hår (fuldstændig tykkelse ca. 0,5 mm) (Skh: hr-1, 8-13 uger gamle). Under huden perfuseres radioaktivt mærket (14C-U)-glucose med kendt koncentration i opløsning i phos-phatpufret saltopløsning (0,9% natriumchlorid), hvor phosphatets pH 10 er ca. 7,4. Temperaturen er omgivelsestemperatur.

I den første række forsøg efter samling af cellen og initiering af glucoseopløsningsperfusionen tilføres strøm (0,5 milliampére) i 2 timer. Spændingen kan variere fra ca. 1 til 10 volt. Den er alminde-15 ligvis ca. 5 volt. Den parameter, som er vigtig at holde konstant, er den tilførte strøm. Spændingen kan variere afhængigt af den elektriske modstand på prøveudtagningsstedet. Derpå afmonteres gel elektroderne og afprøves for indhold af radioaktivitet ved traditionel væskescintillationstælling. Når glucosekoncentrationen 20 under huden er ændret fra 1,07 mg/ml til 0,153 mg/ml (en faktor på 0,143), ændres den mængde, der prøveudtages gennem huden på 2 timer, fra 4,9 /xg til 0,705 /xg (en faktor på 0,144 - jfr. tabel 1). Resultaterne viser, at der for en fastsat prøveudtagningstid under samme elektriske betingelser opnås en næsten perfekt lineær korrelation 25 mellem glucosekoncentrationen i huden og mængden af glucose, der udtages som prøve, ved (+)-elektroden. (Elektriske betingelser under forsøgene - samme konstante direkte strøm (dc), men iontoforeseind-føring kan også virke ved pulserende strøm, osv. (den pulserende metode skulle også virke på forudsigelig måde til prøveudtagning).

30 35

14 I

Tabel 1 I

DK 175443 B1 I

Glucoseprøve I

5 Iontoforetisk flux- I

Koncentration rrog/mll_prøve (ua/2 timeri I

A 0,153 0,705 ± 0,095 I

B 1,07 4,9 ± 0,7 (± 14%) . I

10 Forhold A/B 0,143 0,144 (fundet) I

I den anden rakke forsøg under anvendelse af en tilsvarende forsøgs- I

14 I

opstilling perfuseres en ( C-U)-glucoseopløsning med 0,34 mg/ml

15 glucose i phosphatpufret saltvand, og gelelektroderne udskiftes I

hvert 30. minut. I

Vurdering af den glucose, der udtages som prøve i elektrodegelen, I

vi.ser en gentagelig mængde radioaktiv glucose - 0,8 /zg/0,5 timer med I

20 en standardafvigelse (S.D.) på + 23% (jfr. tabel 2). Da huden til I

hvert enkelt forsøg kommer fra forskellige mus, blev vurderingen af I

hver enkelt diffusionscelle (hvilket betyder prøver indsamlet gennem I

det samme stykke hud) udført under eliminering af den første prøve I

(den første halve time er noget højere end de følgende på grund af I

25 forsøgsbetingelserne). De opnåede forsøgsværdier på fra 0,79 til I

0,74 μg er et gennemsnit af den mængde glucose, som findes i fire I

separate celler. I

Tabel 2 I

30 I

GI ucoseprøveud-taoning I

Prøve Tid (timer) Prøve - glucose foal I

1 Q - * 0,97 ±0,12 I

35 2 V - 1 0,79 + 0,09 I

3 1 - H 0,76 i 0,10 I

15 DK 175443 B1 4 lh - 2 0,75 ± 0,21 5 2-2½ 0,74 ± 0,24

Gennemsnit 0,80 ± 0,19 (± 23%) 5

Glucosekoncentration er 0,34 mg/ml Strømningshastighed for glucoseopløsning er 15 ml/time n * fire celler som gennemsnit for hver prøve 10 Det vises, at S.D. for individuelle diffusionsceller, hvilket betyder individuelle mus, ligger inden for området fra 4 til 9% (med undtagelse af celle nr. 3), jfr. tabel 3.

Tabel 3 15

Glucoseprøveudtaqning

Glucosemængde bestemt i gel-

Celle* elektrode or. prøve (ag) 20 1 0,825 + 0,041 (± 5%) 2 0,963 ± 0,090 (± 9%) 3 0,530 + 0,115 (± 22%) 4 Cellen ødelagt 5 0,727 ± 0,033 (± 4%) 25

Glucosekoncentration er 0,34 mg/ml Strømningshastighed for glucoseopløsning er 15 ml/time n = Gennemsnit for fire celler for hver 4 timers periode 1 2 3 4 5 6

Det vises, at glucose prøveudtages nøjagtigt ved den foreliggende 2 opfindelse ved iontoforese. Der er en tydelig korrelation mellem 3 glucosemængden under huden og den glucosemængde, som prøveudtages.

4

De glucosemængder, der prøveudtages, er signifikante og gentagelige 5 og derfor pålidelige. Da det er kendt, at iontoforetisk transport er 6 lineært afhængig af strøm og strømmens varighed, manipuleres disse parametre på sikker måde (inden for sikre grænser for strømkoncentration) for at opnå påviselige glucosemængder i gel elektroden.

Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til transdermal prøveudtagning og er mulig gennem slimhinder (f.eks. nasale, buccale), hvor

DK 175443 B1 I

16 I

barrieren for transport af ikke-ioniserede forbindelser er meget I

lavere, og koncentrationen af blodkar er høj. I

Kombinationen af denne prøveudtagningsprocedure med specifik gluco- I

5 sebiosensor (f.eks. J.C. Cooper, E.A.H. Hall, Journal of Biomedical I

Engineering. Vol. 10, side 210-219, publiceret i 1988) eller gluco- I

seselektive elektroder (R.L. Solsky, Analytical Chemistry. Vol. 60, I

nr. 12, 106R-113R, publiceret i 1988) eller in situ-analyse (f.eks. I

kolorimetrisk) tilvejebringer tidstro glucoseinformation, og disse I

10 litteraturhenvisninger medtages heri ved denne henvisning. I

Kombination af ovennævnte overvågning, som tilvejebringer tidstro I

medicinsk information med indføringsanordning (f.eks. insulinpumpe, I

iontoforetisk insulinindføringsanordning), tilvejebringer et brug- I

15 bart feedback-medikamentindføringssystem med lukket kredsløb. I

Medikamenter, hvis niveau i et menneske kan udtages som prøver og I

overvåges ved den foreliggende fremgangsmåde, omfatter men er ikke I

begrænset til: I

20 I

Middel_:_Til_ I

TheophyllinbehandTing Blodniveauer ved astma I

Fluoruracilmethotrexat Bioniveauer ved cancer- I

25 kemoterapi - I

Metalioner K+, Na+, Cu, Fe+++, osv. Undersøgelse af blod- I

niveauer I

30 Forgiftning ved ulykke Tilfælde, hvor der skal I

undgås indtrængende blod- I

prøveudtagning I

Koncentration af formodet middel Koncentration af middel I

35 uden indtrængning I

Hormonniveauer Overvågning af blod- I

niveauer I

17 DK 175443 B1

Prostaglandin (nasal)-steroider Overvågning af blod- (anabolsk cancerbehandling, mandlig niveauer eller kvindelig hormonjustering) 5 Antidepressive midler Prøveudtagning og overvåg- amitriptyl en ♦ HC1 ning af blodniveauer

Den foreliggende opfindelse er anvendelig til at bestemme metaboliske glucoseniveauer hos pattedyr, fortrinsvis et menneske.

10 Der overvåges både hypoglycæmiske og hyperglycæmiske tilstande, f.eks. fra et glucoseniveau i mg pr. ml blod på fra ca. 0,1 mg/ml til 5,0 mg/ml. Et foretrukket område ved overvågning af hypoglycæmi er på mellem ca. 0,3 og .0,7 mg/ml. Et foretrukket område for hyper-glycæmi (diabetes) er på mellem 1,0 og 5,0 mg glucose/ml blod. Et 15 normalt glucoseniveau i blodet ligger på mellem ca. 0,8 og 1,1 mg glucose/ml blod.

Biosensorer til påvisning af koncentrationsniveauer af interesse er kommercielt opnåelige til analyse af lactat, alkohol, saccharose, 20 galactose, urinsyre, a-amylase, cholin og L-lycin, og de er alle indirekte amperometrisk baseret på oxygenforbrug eller hydrogenper-oxidproduktion. Der er nogle få kommercielt opnåelige biosensorer, som er baseret på andre detektionsmetoder. Den vigtigste af disse er ud fra et kommercielt synspunkt den automatiske NAIAD-kemisk krigs-25 førelsesmiddeldetektor.

ExacTech (Baxter Travenol, Deerfield, Illinois, USA)-Biosensoren for glucose er en 2. generationsbiosensor med amperometrisk drift.

Oxygen erstattes med en kunstig elektronmediator, som sluser elek-30 troner fra den biologiske komponent ind til elektroden. Sådanne revolutionære mediatorer: (1) udviser let deltagelse i redoxreaktioner med både den biologiske komponent og elektroden, (2) udviser stabilitet under de krævede analysebetingelser, (3) har ikke tendens til at deltage i sidereaktioner under overførsel af elektroner, 35 såsom reduktion af oxygen, (4) udviser passende redoxpotentialer forskellige fra de af andre elektrokemisk aktive forbindelser, som kan være til stede i prøver, (5) er upåvirkede af et bredt pH-om-råde, er ikke-toksiske, navnlig ved in vivo-anvendelser, og (6) kan underkastes immobilisering.

DK 175443 B1 I

ExacTech-Glucoseforsøget udføres let, og et resultat opnås inden for I

30 sekunder fra tilførsel af helblodprøven til et éngangsudstyr af I

pennestørrelse. Ved den for tiden forudsete forbedrede anvendelse af I

denne type udstyr erstattes den éngangsstrimmel, som er anbragt i I

5 udstyret, med et materiale befugtet med glucose, som iontoforetisk I

er trukket igennem huden (uden udtrækning af blod). Prøvematricen er I

fremstillet af polyvinylchlorid ligesom éngangsstrimlen, eller den I

kan være fremsti.ilet af et andet materiale med bedre egenskaber for I

iontoforeseprøveudtagning. Påsætning af den ønskede matrix udføres I

10 som et særskilt trin eller fortrinsvis som en del af analysen med I

samtidig eller fælles prøveudtagning og påvisning af glucose. I

Matricen til påvisning kan være en éngangsstrimmel som i det sæd- I

vanlige påvisningssystem for blod og anvendes kun én gang, eller den I

kan være et materiale, som tillader flere prøveudtagninger. Sidst- I

15 nævnte matrix kan forblive på plads i ubestemt tid, eller den kan I

kun anvendes i et tidsrum (en række analyser). Den vil fortrinsvis I

være i passende sidestilling med elektroden for at tillade den I

samlede analyse. Den er imidlertid konfigureret med anordningen I

(overvågningssystemet) med henblik ‘på prøveudtagning og påvisning, I

20 hvor den fugtede matrix indeholdende iontoforetisk udtrukket glucose I

påføres over det tilgængelige elektrodeområde ved den frie ende af I

elektroden. Her katalyserer glucoseoxidase oxidation af glucosen, I

hvor de frembragte elektroner overføres til den underliggende I

elektrode ved hjælp af en mediator.. Størrelsen af den frembragte I

25 strøm er proportional med blodglucosekoncentrationen i prøven og I

vises i mg/dl på det flydende krystaldisplay, der er indbygget i I

monitoren. Efterhånden som de bliver kommercielt opnåelige, kan I

andre sammenlignelige eller endog mere følsomme midler til påvisning I

af glucose erstattes med det ovenfor beskrevne, kommercielt opnåe- I

30 lige blodprøveudtagningssytem. I

In vi tro-indføring

In vitro-indføring af en forbindelse til en membran ifølge den I

35 foreliggende opfindelse vil også blive illustreret under henvisning I

til figur 1, 2, 3, 4 og 5. Figur 6 viser som reference det hidtil I

kendte in vitro-indføringssystem 60. Horisontale elektroder 61A og I

61B kombineres på en vertikal membran 62. Receptorvæsken 63 vil I

oprindeligt ikke indeholde noget af forbindelsen i væsken 64. Når I

19 DK 175443 B1 kredsen 65 afsluttes med strømtilførslen 66, bevæger forbindelsen i 64 sig ind i og gennem membranen 62 og vil dukke op i receptorvæsken 63.

5 Udstyret og metoden til indføring ifølge den foreliggende opfindelse svarer til det ovenfor beskrevne for in vi tro-prøveudtagning.

Ethvert ledende materiale, såsom metaller (platin, aluminium, osv.}, ledende geler (f.eks. med natriumchloridopløsning, osv.), ledende opløsninger (natriumchlorid i vand, osv.) eller enhver kombination 10 af disse materialer.

De permeable elektroder ifølge den foreliggende opfindelse har en 2 2 2 størrelse på fra ca. 1 μπι til 400 cm , fortrinsvis fra ca. 1 mm 2 '22 til 40 cm . Strømtætheden er fra ca. 0,01 μΑ/cm til 2 mA/cm , 15 fortrinsvis fra 1 μΑ/cm til 0,5 mA/cm. Elektroderne kan fæstnes med remme, klæbemiddel, bånd og lignende.

De samme membraner som beskrevet under in vitro-prøveudtagning er relevante her, f.eks. hud, slimhinder, kunstige polymermembraner og 20 lignende med fuld tykkelse eller delt tykkelse.

In vivo-prøveudtaqning

De figurer, som er anvendelige til at illustrere in vivo-prøveudtag-25 ning, er figur nr. 5, 7, 8, 9A og 9B. Den ovenfor anførte information ved in vitro-prøveudtagning kan tilpasses og anvendes her.

Figur 7 viser én udførelsésform for prøveudtagning. Det ydre af topcellen 81 ligner meget den øverste halvdel 11 men har form som 30 top 81. Elektroderne viser sig at svare til eller være identiske kamre. 16A, 16B og. 16C. Toppen 81 er fæstnet under anvendelse af remme 82 til det levende pattedyr 86 (et menneske). Når elektrodetrådene 26A og 26B er fæstnet til strømtilførslen 83 via ledninger 84 og 84A, fuldendes et kredsløb, og prøven af forbindelsen opsamles 35 i elektrisk ledende gel 25A eller 25B. Hovedforskellen mellem den øverste halvdel 11 og toppen 81 er, at glasvæggene 15A og 15B osv. strækker sig til dannelse af en god forsegling på det horisontale membransubstrat ved kontaktflade 85. (Strømtilførslen 83 kan være af størrelse som et lille ur og bærbar).

20 I

DK 175443 B1 I

Det er kendt, at medikamenter eller deres metaboliter, såsom alko- I

hol, aminopyrin, methyl urinstof, acetamid, sulfauanidin, sul fadia- I

zin, theophyllin og andre lavmolekylære ikke-elektrolyter secerneres I

gennem huden eller slimhinden med sved, spyt eller lignende, Andre I

5 forbindelser eller deres metaboliter, som kan være indikative for I

visse normale tilstande eller sygdomstilstande, såsom phenylalanin · I

(phenylketonuria), sukker (diabetes), estriol (graviditet), calcium I

(neoplasma) og kobber (leukæmi) for eksempel, samt normale og I

unormale metaboliter af andre forbindelser kan secerneres i sådanne I

10 væsker. Væskeindvinding anvendes også forsøgsvis til fastlæggelse af I

biologiske krav for forskellige forbindelser, såsom magnesium. Hvis I

væskeprøver opnås og analyseres for disse materialer, kan tilstede- I

værelsen af sådanne materialer påvises i legemet. En sådan væskeind- I

vinding er derfor anvendelig til en lang række eksperimentelle, I

15 diagnostiske, terapeutiske og retsmedicinske formål. Selv om sådanne I

væsker kan indvindes på talrige måder, beskriver den foreliggende I

opfindelse en fremgangsmåde til indvinding under anvendelse af en I

elektrisk strøm. I

20 Yderligere forbindelser af interesse til prøveudtagning eller I

-indføring til et menneske findes i "Iontophoretic Devices for Drug I

Delivery" af Praveen Tyle, Pharmaceutical Research, Vol. 3, nr. 6, I

side 318-326. Specifikke forbindelser af interesse for prøveudtag- I

ning som ionisk eller ikke-ionisk forbindelse er anført på side 320 I

25 og er indbefattet nedenfor som tabel 4. I

Tabel 4 I

Forbindelse af interesse for indføring eller prøveudtagning I

30 I

Medikament Tilstand/sygdom Referencenr. I

1. Methylenblåt Hudlidelser Jenkinson og I

35 og kaliumiodid Walton (7)a I

2. Penicillin Brandsår Rapperport et al. (10)^ I

3. Histamin Sygdomstilstande Kling og Sahin (ll)a I

i blødt væv, I

bursa og sener I

21 DK 175443 B1 4. Natriumiodid Elektrolyter Strohl et al. (15)d 5. Sul famedikamenter Pycocyanus- von Sallmann (16)d infektion 6. Dexamethason, Husculoskeletale Harris (17)a a 5 natriumphosphat, inflammatoriske Delacerda (18) xylocain tilstande 7. Kobber Kontraception Riar et al. (19)d 8. Insulin Diabetes Karl (21j

Stephen et al. (22)u ^ 9. Pilocarpin Cystisk fibrose Webster (23)d 10. Ambrosiepollen- Høfeber Abramson (31)a ekstrakt 11. Phosphor O'Malley og Oester (35)a 15 a 12. Vand Hyperhidrosis Tapper (43) 13. Citrat Rheumatoid Coyer (51)a arthritis 14. Dexamethason Na Primær tendonitis Bertolucci (52)^· 2Q phos & lidocain HC1 15. Hyaluronidase Blødninger Boone (53)a 16. Vidarabinmono- Keratitis Kwon et al. (54)^j phos. (Ara-AMP) (herpes virus) Hill ét al. (56) 17. Lignocain HC1 Topisk analgesi Comeau et al. (9,28)d 25 eller lidocain Russo et al. (12)

Echols et al. (27)a Siddiqui et al. (38)Γ"

Petelenz et al. (55)

Schleuning et al.a(59) Gangarosa (60,61)a Arvidsson et al. (62)d 30 j 18. Acetyl /J-methyl- Arterio- Cohn og Benson (57) cholin Cl sclerose 19. Acetyl /J-methyl- Arthritis Martin et al. (58)a cholin 1 2 3

Idoxuridin Herpes simplex Gangarosa et al.

35 keratis (60,63) 2

Natriumfluorid Dentin Gangarosa (60)a 3

Methylpredniso- Postherpetisk Gangarosa et al. (64)^ lon-succinat neuralgi

I DK 175443 B1 I

I 22 I

I 23. Lidocain, Temporomandibulær Ganggrosa og Mahan I

I epinephrin og led-myofascial (64) I

I corticosteroid smerte-dysfunk- I

I tion-syndrom I

I 24. Natriumsalicyl at Fodvorter Gordon og Weinstein I

I 6 (66)a I

I 25. Calcium Myopati Kahn (67)a I

I 26. Eddikesyre Calciumaflejringer Kahn (68)a I

I 27. Zink Nasale lidelser Weir (69)a I

I ^ 28. Forestrede gluco- Peyronie's sygdom Roth£eld og Murray I

I cortocoider (70)d I

I 29. Vasopressin Lateral septal MarcJjand og Hagino I

I neuronaktivitet (71) I

I 30. Alkaloider Kronisk smerte Csillik et al. (73)a I

I 15 I

I 31. Optidase Arthrose Ulrich (74)a I

I 32. Natriumsalicyl i- Akut thrombo- Kostadinov et al. (75)c I

I eum-butazolindin phlebitis I

I 33. Penicillin Pneumonia og Sokolov et al. (76)^ I

I 20 abscesser i I

I 1 ungerne I

I 34. Paverin og Cervical osteo- Ostrokhov^ch og Strel- I

I nikotinsyre chondrosis med kova (77)υ I

I neurologiske I

I symptomer I

I 25 35. Græsser Allergi Shilkrat (80)a I

I 36. 6-Hydroxy- Ocular infektion Caudil et al. (81)^ I

I dopamin I

I 37. Metoprolol Beta-blokker Okabe et al. (82)^ I

I (angina pectoris) I

I 30 I

I ****** I

I a Baseret på kliniske indtryk (kvalitative) I

I k Baseret på dobbeltblindforsøg (velkontrolleret forsøg) I

I c Baseret på in vi tro-forsøg I

I 35 ^ Baseret på kontrolleret sammenligningsforsøg (kvantitativt, men I

I ikke dobbeltblindforsøg). I

I In vivo-indførinq I

I Den samme type anordning, som er vist på figur 7, 8, 9A, 9B og 10 I

23 DK 175443 B1 til prøveudtagning in vivo kan anvendes til indføring in vivo.

Biodetekterino under anvendelse af iontoforese 5 I dette aspekt er figur 5, 7, 8, 9A og 9B vigtige. Ovennævnte beskrivelse for in vivo-prøveudtagning er af interesse samt en analyserende komponent.

Den analyserende komponent kan være (ion-)specifikke elektroder, 10 selektive elektroder, elektroniske biosensorer, der forbinder specifikke biokemiske ændringer til elektriske signaler, kolorimetriske reagenser og lignende.

Indikation på tilstedeværelse af forbindelsen af interesse i patien-15 tens væv kan være kvalitativ eller kvantitativ. Den bestemte værdi kan være bundet til en medikamentafgivende enhed til tilvejebringelse af et yderligere niveau af et terapeutisk middel.

Prøveudtagning af komponenten kan være med en enkelt iontoforese-20 prøveudtagningselektrode.

Analysemetoden kan, når den detekterer, at den pågældende forbindelse (eller bioaktive materiale) er ændret, automatisk indgive et passende niveau af det nødvendige terapeutiske middel. Målingen kan 25 simpelt hen også alarmere en operator om, at det er nødvendigt at indgive terapeutisk middel oralt, dermalt, rectalt, buccalt, intravenøst eller lignende.

Fordele ved in vivo- eller in vitro-iontoforeseorøveudtauning eller 50 -indføring 1. Den heri beskrevne prøveudtagningsmetode er en enkel, let og smertefri metode til udtagning af prøver af bioaktive materialer med diagnose- eller overvågningsformål. Prøveudtagningen kan være 35 kontinuert eller periodevis.

2. Prøveudtagningen er meget signifikant i situationer, hvor der ikke kan udtages en. rutinemæssig blodprøve, eller hvor erhvervelse af flere blodprøver er uønsket (f.eks. fra et barn).

I DK 175443 B1 I

I 24 I

I 3. Prøveudtagningsmetoden har karakteristika, som i sidste instans I I kan anvendes til et "biofeedback"-sy$tem af "loop"-typen. Med andre I I ord kan iontoforeseanordningen samtidig med, at den tillader prøve- I I udtagning ved den beskrevne metode, også anvendes til at indføre et I I 5 terapeutisk middel ad en hvilken som helst indgivelsesvej (dvs. som I I respons på et behov, der er detekteret ved prøveudtagningen). I

I 4. Prøveudtagningen vil gøre overvågning af ambulante patienter I I sikker og enkel og tilvejebringe anvendelse af iontoforese med I I 10 udbredt og ret generel anvendelighed. I

I 5. Prøveudtagning eller -indføring af ethvert bioaktivt materiale I I kan modificeres, hvis det prøveudtagne biomateriale ikke går I I tilstrækkeligt hurtigt gennem huden: midler (f.eks. alkoholer, I I 15 fedtsyrer, glycol er, Azon, osv.), som sænker hudens lokale barriere- I I funktion, kan inkorporeres i elektrodeudstyret for at forbedre I I ekstraktions- eller indføringsstrømmen. I

I 6. Metoden kan anvendes til prøveudtagning under begge elektroder, I I 20 dvs. til samtidig bestemmelse af mere end et enkelt bioaktivt middel I I (f.eks. et medikament og en metabolit eller et konjugat af medika- I I mentet). I

I 7. Den anvendte metode er ikke alene begrænset til detektering af I I 25 biomateriale gennem huden. Andre slimhinder er også egnede til dette I I formål. Eksempler omfatter nasalslimhinde, rectum, vagina og inder- I I siden af munden. Disse overflader anvendes for tiden som prøveud- I I tagningsteder med forskellige grader af succes. Da disse slimhinder I almindeligvis er meget perfuserede med små blodkar, og da disse I I 30 membraner er mindre modstandsdygtige over for molekylær transport, I I kan der anvendes tilførsel af mindre strøm i kortere tidsrum ved I I prøveudtagning fra disse væv. I

I 8. Metoden har en effektivitet, som er afhængig af den tilførte I I 35 strøm mellem elektroderne og varigheden af strømmen. Disse variabler I I kan styres nøjagtigt, hvilket muliggør reproducerbar prøveudtagning I I og dermed tillader frembringelse af pålidelige data til sammenlig- I I ningsformål (f.eks. at stille niveauerne af et bestemt bioaktivt I I materiale op som modsætning før, under og efter en terapeutisk I

25 DK 175443 B1 behandling). Dette ville være en påfaldende fordel ved prøveudtagning fra næsen, som erfaringsmæssigt er et vanskeligt sted at opnå reproducerbar information fra.

5 9. Bioaktive materialer eller forbindelser, som er ladede eller uladede, er kandidater til iontoforeseindgivelse eller -prøveudtagning. Disse omfatter små proteiner, di- til polypeptider, lipo-fobe og lipofile materialer. Der foretrækkes ladede materialer, som ofte ikke kan indgives på let måde ad andre veje. Se forbindelser i 10 US patent nr. 3.731.683 og nr. 3.797.494, som medtages heri ved denne henvisning.

10. Anordningen gør det muligt at udtage prøve eller indgive en forbindelse (eller bioaktivt materiale) in vivo eller in vitro, 15 hvorved elektroder er på samme side af den pågældende overflade. En prøve er almindeligvis i horisontal konfiguration, medens elektrodematerialerne er nærliggende hinanden og almindeligvis i vertikal orientering. Hvis toppen af anordningen er forseglet, kan det være i en hvilken som helst orienteringsgrad på huden, når blot den elek-20 tri ske kontakt med membranoverfladen ikke forringes.

11. Denne andordning og metode gør det muligt at udtage prøver eller indgive medikamenter både systemisk og lokalt. Det er f.eks. muligt at anvende denne metode til behandling af hudcancer med 25 methotrexat indgivet gennem huden.

Nedenstående eksempler skal kun være illustrative og tjene som eksempel. De skal ikke på ingen måde betragtes som værende begrænsende.

30 EKSEMPEL 1

IN VITRO-PRØVEUDTAGNING

^ Afprøvning af modelcelle: Glasdiffusionsceller som beskrevet ovenfor (jfr. figur 1, 2, 3 eller 4) blev fremstillet med hudpermeationssy-stemer (L.G.A., Berkeley, CA, USA). Cellen 10 er en modifikation af en standardgennemstrømningsdiffusionscelle (LGA-hudpenetrationscelle katalog nr. LG 1084-MPC) beskrevet af Gummer et al., International

DK 175443 B1 I

Journal of Pharmacology. Vol. 40, side 101 ff, publiceret i 1987. I

Den øverste halvdel af cellen er inddelt i tre rum eller kamre (16A, I

16B eller 16C) med to vægge 15A og 15B, således at den eneste I

5 fysiske/elektriske forbindelse mellem de to elektrodekamre (16A og I

16C i figur 1, 2, 3 eller 4) mindsker muligheden for lækage mellem I

dem og gør det muligt at undersøge problemer, der involverer hudkon- I

tinuitet. Den øverste halvdel af cellen 12 har en kanal 18 eller I

rende under dette rum, som isolerer huden fra resten af receptor- I

10 fasen. Opfyldning af denne kanal 18 med receptorvæske 19 under et I

forsøg holder huden ovenover fugtig. Den nederste halvdel af cellen I

12 har også åbninger 20A og 20B til kontinuert strømning af recep- I

torfasen 17 og åbninger 21A og 21B til cirkulation af vandkappen 21C. Kapillaritet mellem rummenes vægge og den ydre væg blev for-

15 hindret ved at silanere toppen af cellen med dichlordimethylsilan I

(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA). Cellerne anvendes med en I

"trestations" magnetisk omrøringsenhed og omrøringsstang 27. (LG- I

1083-MS, LGA, Berkeley, USA). I

20 Metal elektrodetråde (26A og 26B) - Platintråd (Pt-tråd - Fisher nr. I

B-766-5A, 99,95% ren). I

Strømforsyning (291 - Strøm- eller spændingskontrol med automatisk I

overkrydsning (Model ΑΡΗ 1000M, Kepco, Inc., Flushing, NY, USA). I

25 Denne forsyningsenhed har en specificeret drift på <2 μΑ/8 timer til I

dets strømstyrede output, hvilket er en vigtig betragtning, hvis I

medikamentstrømmen er følsom for ændringer i strømstyrken. I

Receptorvæske (17) - Phosphatpufret saltopløsning (pH = 7,4, 0,9% I

30 NaCl vægt/volumen). I

Farvestof - Blåt farvestof nr. 1 FD&C i deioniseret vand. I

Medikamenter - Clonidin HC1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, I

35 USA); Clonidin-HCl (phenyl-4-^H) med en specifik aktivitet på 90 I

mCi/mg (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Morphinsulfat (Sigma I

Chemical Co., St. Louis, M0, USA); Morphin (N-methyl-^H) med en I

specifik aktivitet på 255 mCi/mg (New England. Nuclear, Boston, MA, I

USA). De ikke-mærkede medikamenter blev opløst i deioniseret vand I

27 DK 175443 B1 til dannelse af opløsninger på 1 mg/ml med en tilstrækkelig mængde mærket medikament til opnåelse af en aktivitet på ca. 1 μ0ι/»η1.

Hud 13 - Hud med fuld tykkelse, frisk udskåret fra 11-15 uger gamle 5 hårløse hunmus (stamme Skh:HR-l, Simonsen Laboratory, Gilroy, CA, USA).

Afprøvning af model cel!en - Diffusionscellen 10 blev afprøvet på tre måder: 10 (1) Lækageforsøg (uden strøm) under anvendelse af farvestof og siliconegummi som hud, (2) lækageforsøg under anvendelse af farvestof og hud (uden strøm), og (3) iontoforeseforsøg under anvendelse af medikamentopløsninger og hud (med og uden strøm). Procedurerne 15 (i) og (2) blev vurderet ved visuel inspektion af cellen. For procedure (3) blev 0,6 ml mærket medikamentopløsning anbragt i kammer 16A, 0,6 ml pufret saltopløsning blev afpipetteret til kammer 2 16C, og en konstant strøm på 0,63 mA/cm (med spændingen begrænset til 9 V) blev påtvunget mellem elektroderne i de to kamre. Akti vi-20 teten af opløsningerne i kamrene 16A og 16C blev bestemt før og efter iontoforese. Aktiviteten af huden 13 og af prøverne udtaget fra receptorkammeret blev bestemt efter forsøget. Hvert forsøg varede ca. 24 timer ± 2 timer, hvor prøver blev indsamlet hver time. Receptorvæske 17 blev magnetomrørt (27), og opsamlingsstrømnings-25 hastigheden var 10 ml/time. Hver procedure blev gentaget tre gange.

RESULTATER

Procedurerne (1) og (2): Der blev ikke observeret farvelækage fra 30 sidekamrene 16A og 16C til midterkammeret 16B eller fra nogen af kamrene til cellens yderside i hverken modellen med siliconegummi-membran eller med hud fra hårløs mus.

Procedure (3): Når farvestoffet i kammer 16A blev erstattet med et 35 mærket medikament, og der ikke blev tilført strøm, diffunderede medikamentet til receptorfasen 17 med en gennemsnitshastighed på 0,05 μg/cm /time clonidin-HCl og 0,04 μg/cm /time for morphinsul fat.

I ingen af tilfældene blev der fundet medikament i den pufrede saltopløsning i kammer 16C efter 20 timer.

I DK 175443 B1 I

I 28 I

I Når der blev sat strøm mellem kammeret med det mærkede medikament og I

I kammeret med pufret saltopløsning, steg permeationen væsentligt. I

I Hastigheden for penetration af morphinsulfat gennem huden ved en I

I 2 2 I

I strømstyrke på 0,63 mA/cm var 2,0 //g/cm /time i sammenligning med I ? m I 5 den passive transporthastighed på 0,04 μς/ατ» /time. I tilfældet med I 2 m I clonidin-HCl ændredes hastigheden fra 0,05 Ag/cm /time uden strøm

I 2 I

I til 15,0 Ag/cm /time med en elektrisk drivkraft. Mærket medikament

I blev påvist i den pufrede saltopløsning i kammer 16C med 1 A9 I

I morphinsulfat til stede efter ca. 20 timer (se figur 14) og 5 A9 I

I 10 clonidin efter samme tidsrum. I

I Det mærkede medikament kan have nået kammeret 16C ad flere veje. Det I

I mest sandsynlige er, at det er blevet "trukket11 tilbage op gennem I

I huden under den passive elektrode. For at afprøve denne mulighed I

I 15 blev to celler forbundet med røret 95, således at deres receptor- I

I faser 92 og 93 var fælles, men således at huden og celletoppene var I

I fysisk adskilte (se figur 10). Mærket' medikament og den positive I

I elektrode blev anbragt i kammer 91A i celle 90A. Den negative I

I elektrode blev anbragt i kammer 918 i celle 90B. Alle andre kamre I

I 20 (91C, 910, 92 og 93) blev fyldt med pufret saltopløsning. Den I

I resterende forsøgsprocedure (elektriske parametre, prøveudtagning) I

I var identisk med ovennævnte procedure 3. Mærket medikament blev I

I transporteret ind i kammer 91A i celle 90A, når cellerne var forbun- I

I det på denne måde, hvilket viste tilstedeværelsen af en "omvendt I

I 25 transdermal" vej ved iontoforese, hvilket faktisk er prøveudtagning I

I ved iontoforese. I

I (b) Yderligere materialer, som forventes at kunne prøveudtages på I

I tilsvarende måde som beskrevet ovenfor for clonidin, omfatter f.eks. I

I 30 morphin, heroin, insulin, neomycin, nitrofurason og /i-methason. I

I EKSEMPEL 2 I

I IONTOFORESEPRØVEUDTAGNING IN VITRO I

I 35 I

I Iontoforeseprøveudtagning består i at trække kemiske forbindelser ud I

I af legemet gennem huden ved hjælp af elektricitet. For at afprøve I

I denne metode anvendes der en in vitro-iontoforesecelle (figur 1, 2, I

I 3 eller 4). Hud 13 med fuld tykkelse fra hårløse mus (8-13 uger I

29 DK 175443 B1 gamle) blev anbragt mellem de to dele af cellen. Opløsninger af radioaktivt mærkede medikamenter med kendt koncentration i phosphat-pufret saltopløsning blev cirkuleret med 10 ml/time under huden.

Oven på huden var to selvklæbende gel elektroder forbundet til en 5 strømforsyning, som var indstillet til en konstant strøm (0,5 mA).

Strømmen blev tilført i et afmålt tidsrum (ca. 2 timer) svarende til o ca. 0,63 mA/cm . Efter forsøget blev gel elektroderne udtaget til scintillationstælling, som afspejler den mængde medikament, som er absorberet af gel elektroderne. Under anvendelse af forskellige 10 medikamentkoncentrationer med samme elektriske strømstyrke i samme tidsrum forventes der en lineær korrelation mellem den mængde, der opsamles af elektroden, og medikamentkoncentrationen.

Resultater fra ovennævnte fremgangsmåde under anvendelse af clonidin 15 og theophyllin i forskellige koncentrationer er anført i graferne (figur 11 og 12), hvor hvert datapunkt er et gennemsnit af mindst to forsøg. Den grafiske fremstilling af resultaterne viser deres linearitet.

20 IN VITRO-INDFØRING

(a) Morphin - De procedurer og betingelser, som er beskrevet for in vitro-prøveudtagning blev anvendt til indføring af morphin: 2

Strømstyrke 0,63 mA/cm i 20 timer under anvendelse af cellen vist 25 på figur 1, 2, 3 eller 4. Morphinet blev anbragt i kammeret 16A.

Efter iontoforese blev der fundet morphin i kammer 16C (jfr. figur 14).

Den elektrisk ledende gel for alle forsøg var KENZ-GEL-ELC-gel fra 30 Nitto Electric Industrial Company, Osaka, Japan.

(b) P.S.O.S. (Kaliumsaccharoseoctasulfat). P.S.O.S., 0,6 ml af en 1,5 mg/ml opløsning i borpuffer blev anbragt i kammer 16A, og borsyrepuffer alene blev anbragt i kammer 16C på figur 1, 2 eller 3.

35 Under anvendelse af en direkte strøm på 0,6 mA (0,65 mA/cm ) blev der observeret transport af P.S.O.S. på op til 5 /xg/time. Under anvendelse af samme forsøgskonfiguration uden en strøm blev der kun overført nogle få nanogram P.S.O.S., jfr. figur 15.

DK 175443 B1 I

30 I

IN VIVO-PRØVEUDTAGNING I

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde og beskrivelse for in vitro- I

prøveudtagning blev anvendt med undtagelse af, at membranen var I

5 erstattet med det øverste af underarmen på en mand på 29 år. Den I

anvendte prøveudtagningscelle er den, der er vist på figurerne 7, 8, · I

9A og 9B. Den udtagne mængde clonidinprøve er sammenlignelig med I

den, der blev observeret i in vi tro-ti 1 fældet. I

10 IN VIVO-INDFØRING I

Figur 13 viser et diagram over et marsvin med adskilte pudeelektro- m der til prøveudtagning af bioaktive materialer fra pattedyret.

15 For at undersøge opfindelsen in vivo er der indtil videre blevet I

udført ét forsøg. Der anvendes en iontoforeseprocedure på marsvinet I

133 uden hår. Den ene gel elektrode 132(+) på linie 131 med I

theophyllin (5,5 pg, 2,4 x 4,2 cm) anbringes på den ene side af I

dyrets ryg, og den anden gelelektrode 132(-) på linie 131A fæstnes I

20 til den anden side af ryggen (med en afstand på ca. 7 cm). Efter 20 I

minutter ved 1,0 mA (strømtilførsel 130) fjernes gel elektroderne, og 1,83 ng theophyllin findes i den negative elektrode. Den mængde, som

er absorberet i legemet på marsvinet er 1,9 /tg. I

25 BIODETEKTERING UNDER ANVENDELSE AF IQNT0F0RESE I

Der er ovenfor beskrevet prøveudtagning af det radioaktive clonidin I

in vitro. Når denne procedure er tilpasset in vivo-prøveudtagning I

fra en hund, bestemmes omfanget af radioaktivt clonidin iontofore-

30 tisk, hurtigt og nøjagtigt. Operatøren alarmeres om, hvornår der I

skal indgives en injektion clonidin for at opretholde det ønskede I

clonidinniveau i forsøgshunden. I

Selv om der kun er blevet vist og beskrevet nogle få udførelsesfor- I

35 mer for opfindelsen, vil det for fagfolk inden for området være I

klart, at der kan udføres forskellige modifikationer og ændringer i I

iontoforesediffusionscellen til in vitro- og in vivo-prøveudtagning I

af bioaktive molekyler til in vitro- og in vivo-indføring af bioak- I

ti ve molekyler eller til biodetekterende anvendelser, uden at der I

DK 175443 B1 31 afviges fra den foreliggende opfindelses ånd og omfang. Det er hensigten, at alle sådanne modifikationer og ændringer, som falder ind under omfanget af de tilhørende krav, udføres hermed.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (14)

32 DK 175443 B1 I PATENTKRAV. I

1. Diffusionscelleanordning til anvendelse ved elektrisk forstærket prøveudtag- I ning af en bioaktiv forbindelse fra en membranoverflade eller indføring af en 5 bioaktiv forbindelse i og gennem en membranoverflade (13) uden fysisk gen- I nemtrængning ved anvendelse af elektrisk strøm, omfattende mindst to elektrisk I ledende permeable elektrodeorganer (26A, 26B) til berøring af membranoverfla- I den (13), og midler (15A-15D) til elektrisk isolering af hvert elektrisk ledende I elektrodeorgan (26A, 26B) fra hinanden, kendetegnet ved at de nævn- I 10 te elektrodeorganer (26A, 26B) er anbragt i det væsentlige side om side med si- I der, som strækker sig til og ender i en i det væsentlige fælles flade, som berører I umiddelbart nærliggende dele af den samme side af membranoverfladen (13). I

2. Diffusionscelleanordning ifølge krav 1 som in-vitro anordning til fjernelse af en I 15 ladet eller ikke-ladet forbindelse fra en membranoverflade uden fysisk gennem- trængning , og som omfatter (a) en positiv elektrode (26A), (b) en negativ elek- I trode (26B), og (c) elektrisk isolering (15A-15D) mellem de nævnte elektroder I (26A og 26B), kendetegnet ved, at den positive elektrode (26A) og den I negative elektrode (26B) og den elektriske isolering (15A-15D) er anbragt på I 20 den samme side af membranoverfladen (13). I

3. Diffusionscelleanordning ifølge krav 2, kendeteget ved at den posi- I tive elektrode (26A), den negative elektrode (26B) og isoleringen (15A-15D) der- I imellem er en integreret enhed og har en fælles side med membranoverfladen I 25 (13). I

4. Diffusionscelleanordning ifølge krav 3, som yderligere omfatter et gennem- I strømningsreservoir på den anden side af membranprøven (13), k e n d e t e g η I et v e d at de positive (26A) og negative (26B) elektroder er forbundet til slut- I 30 ning af det elektriske kredsløb med et elektrisk ikke-ledende materiale i reservoi- I ret (16B) mellem elektroderne (26A, 26B) i kontakt med membranoverfladen I DK 175443 B1 (13). 33

5. Diffusionscelleanordning ifølge krav 1,kendetegnet ved, at elektrodematerialet (25A, 25B) i berøring med membranoverfladen (13) er udvalgt blandt 5 en gel, en væske, en pasta, et skum, en svamp, et porøst metal, et metal, et porøst keramisk materiale eller kombinationer heraf.

6. Diffusionscelleanordning ifølge krav 5, kendetegnet ved, at elektroderne (26A, 26B) er en kombination af en metaltråd i kontakt med en gel (25A, 10 25B).

7. Diffusionscelleanordning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter organer til styring af anordningens driftstemperatur.

8. Diffusionscelleanordning ifølge krav 1 som in-vitro anordning til indføring af en ladet eller ikke-ladet forbindelse i en membranoverflade uden mekanisk gen-nemgrængning, hvorhos anordningen omfatter a) en positiv elektrode (26A), b) en negativ elektrode (26B), og c) elektrisk isolering (15A-15D) mellem den positive og den negative elektrode, kendetegnet ved, at den positive elektrode 20 (26A), den negative elektrode (26B) og den elektriske isolering (15A-15D) er an bragt på samme side af membranoverfladen (13).

9. Diffusionscelleanordning ifølge krav 1 til fjernelse af mindst én ladet eller ikke-ladet forbindelse fra et pattedyr gennem intakt hud eller slimhinde uden fysisk 25 gennemtrængning, og som omfatter (a) en positiv elektrode (26A), (b) en negativ elektrode (26B) og c) et elektrisk isolerende materiale (15A-15D) mellem de nævnte elektroder (26A, 26B), kendetegnet ved, at den positive elektrode (26A), den negative elektrode (26B) og isoleringsmaterialet (15A-15D) er fysisk anbragt således, åt de hver danner en enkelt fælles overflade til kontakt 30 med den samme side af huden eller slimhinden på pattedyret.

34 DK 175443 B1 I

10. Diffusionscellemateriale ifølge krav 9, kendetegnet ved, at isolerings- I materialet (15A-15D) er udvalgt blandt glas, keramisk materiale, luft, plast eller I gummi. I

11. Diffusionscelleanordning ifølge krav 10, kendetegnet ved, at kompo- I nenteme har følgende rækkefølge: positiv elektrode (26A), isolerende materiale I (15A, 15B), negativ elektrode (26B), hvorhos elektroderne er udvalgt fra en kom- I bination af materialer. I

12. Diffusionscelleanordning ifølge krav 9, kendetegnet ved, at kompo- I nenteme har en koncentrisk rørkonfiguration med den ene elektrode (26A, 26B) I omgivet af det isolerende materiale (15AA, 15BB), som begge igen er omgivet af I den anden elektrode (26B, 26A). I

13. Diffusionscelleanordning ifølge krav 9, kendetegnet ved, at elektro- I dematerialerne er udvalgt blandt elektrisk ledende gel, væske, pasta, papir, I skum, svamp, porøst metal, porøst keramisk materiale eller kombinationer heraf. I

14. Diffusionscelleanordning ifølge krav 1 til indføring af ioniserede forbindelser I 20 til et pattedyr gennem intakt hud uden fysisk gennemtrængning, og som omfatter I (a) en positiv elektrode (26A), (b) en negativ elektrode (26B) og c) et elektrisk I isolerende materiale (15A-15D) mellem de nævnte elektroder (26A, 26B), k e η I detegnet ved, at den positive elektrode (26A), den negative elektrode I (26B) og isoleringsmaterialet (15A-15D) er fysisk anbragt således, at de hver I 25 danner en enkelt fælles overflade til kontakt med huden på pattedyret. I