PT89560B

PT89560B - Dispositivo para ensaio ou fornecimento nao-invasivo iontoforetico de substanscias

Info

Publication number: PT89560B
Application number: PT89560A
Authority: PT
Inventors: Peretz Glikfeld; Richard Henry Guy; Christopher Cullander; Robert S Hinz
Original assignee: Univ California
Priority date: 1988-01-29
Filing date: 1989-01-27
Publication date: 1995-05-31
Also published as: DK179390D0; EP0326398B1; ATE230283T1; AU3183889A; ATE256420T1; ATE129909T1; EP0673622A2; DE68929447D1; DK175443B1; JP2907342B2; AU639888B2; DE68929447T2; JPH04502561A; EP0326398A2; DE68929508T2; ES2085863T3; US5279543A; KR970011449B1; EP0673622A3; DE68929508D1

Description

DESCRIÇÃO

I A presente invenção refere-se a um dispositivo e a um método in vitro para se proceder à recolha de amostras iontoforéticas ou ao fornecimento de substâncias através de uma membrana, tal como a pele nua extraída de um mamífero. Num outro aspecto, a presente invenção, refere-se a um dispositivo para o fornecimento ou recolha de amostras iontoforéticas de substâncias através da pele Intacta de um mamífero, Especificamente, o dispositivo consiste num instrumento que pos sui, colocadas do mesmo lado da pele intacta, um elétrodo positivo, um eléctrodo negativo e um material de isolamento elétrico que separa os elétrodos. Um outro aspecto, ainda, da presente invenção, refere-se a um método iontoforético para monitorizar continuamente os níveis de materiais bio-activos num indivíduo e, a utilização de um mecanismo de realimentação para a manutenção dos níveis efectivos.

DESCRIÇÃO DE ASPECTOS RELACIONADOS COM A TÉCNICA DA ESPECIALIDADE

I

Amostragem In Vitro

C.C. Pectk e outros, Pharmacology Shin, Vol. 1, pp. 201-208, publicado por Karger, Basel, em 1987» divulgaram um método para determinar, in vitro, a migração trans dérmica de tefilina, utilizando o sistema de recolha transdérmicapassiva (TCS). Não foi descrito um aumento da migração por aeção elétrica.

R.R. Burnette e outros, no Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 75» NS 8, pp. 738-743» publicado em Agosto de 1986, descreveram, utilizando a célula difusora normalizada, a comparação entre os transportes iontoforético e passivo, in vivo, da hormona de libertação tirotropina (TRH) através da pele extraída a um rato. Os resultados indicaram que ambos os fluxos, carregados e não carregados, através do tecido extraído, foram superiores aos obtidos apenas por difusão passiva.

No arranjo normalizado (estabelecido na especialidade) para os estudos iontoforéticos, in vitro, (ver Figura 6), colocam-se as duas porções da célula difusora horizontalmente , lado-a-lado, pelo que a pele se localiza vertical mente, entre elas, com o seu lado epidérmico revestindo uma das: porções e, o seu lado interno revestindo a outra. A preparação bio-activa e o elétrodo activo coloca-se na porção epidérmica da célula e o outro lado da célula contém o elétrodo passivo num fluido condutor.

Este arranjo lado a lado, possui diversos inconvenientes e limitações. Uma vez que o elétrodo passivo de encontra, com efeito, dentro” da pele, esta configuração não constitui um bom modelo para a situação in vivo. Os factores que influenciam um tal situação nao fisiológica podem

não ser aqueles que são importantes no caso clínico. Para além disso, existem situações que não podem ser investigadas com, : uma configuração lado a lado, tal como a possibilidade de trans porte horizontal (isto é, no interior das camadas de pele, em vez de verticalmente através da pele) e se um fármaco conduzil do iontoforéticamente é arrancado para o exterior da pele pelo elétrodo passivo.

Uma clasee de sistema de distribuição do fármaco segundo a especialidade iontoforética, o Phoresor, foi vendido pela ilotion Control Inc., 1290 West 2520 South, Suite A, Salt Lake, Utah 84119.

i ‘

Fornecimento In Vitro

Em estudos modelo, a iontoforese é útil para se examinar o transporte químico de materiais carregados através de uma membrana, tal como uma amostra de pele extraída. Por exemplo, N.H. Bellantone e outros, no International Journal of Pharmaceutics, Vol. 50» PP· 65-72, publicado em 1986, descrevem um projecto de uma célula difusora lado-a-lado e a configuração do eléctrodo, de acordo com a técnica conheci da normalizada, para diversos sistemas utilizados para a iontoforese do ácido benzéico (como um composto modelo) (ver Figura 6). Existem numerosas limitações na configuração da célula lado a lado, conforme se discutirá adiante.

Fornecimento In Vivo

A iontoforese consiste no transporte in tensificado de substâncias carregadas, usualmente, materiais bio-activos. 0 procedimento consiste de métodos conhecidos de fornecimento transdérmico do fármaco. Por exemplo, na Patente Norte Americana N2 4 141 559» segundo S.C. Jacobsen e outros, a qual aqui se indica como referência, divulga-se um dispositi vo aperfeiçoado de iontoforese para a administração tópica de

- 3 fárlacos iónicos ou químicos através do tecido epidérmico sem penetração mecânica. Ligam-se os electodos positivo e negativo à pele em localizações separadas. Adiciona-se a forma iónica do fármaco ao eléctodo, sendo conduzida para o interior e através do tecido epidérmico por métodos de corrente directa a partir de uma fonte de energia. Existem diversos problemas neste tipo de distribuição, em que os eléctodos se encontram separados.

Amostragem In Vivo

Existe uma necessidade bem reconhecida e importante de efectuar amostragens e quantificar as substâncias bio-activas do corpo (especialmente, o sangue), Pode ser, por exemplo crucial verificar a presença de uma chave bioquímica endógena com o propósito de diagnosticar uma doença, ou pode s ser essencial seguir e, até, optimizar o nível sanguíneo de um fármaco administrado durante um regime quimioterapêutico. Consegue-se, habitualmente, a determinação desejada por análise de uma amostra de sangue que se retira de modo invasivo através de uma agulha de injecção para dentro de um tubo de recolha.

A recolha transdérmica passiva de teobromo, in vivo, também foi descoberta por Peck e outros, 1987, supra. Não se descobriu intensificação da migração por acção da corrente elétrica.

Não se descobriu literatura que descrevesse um procedimento substancialmente não invasivo para a tiragem de amostras de material biológico da circulação sistémica. Será necessária uma única aplicação de iontoforese para “extrair sistemáticamente moléculas circulantes para o interior de um dispositivo de recolha posicionado na pele ou na superfície de membranas mucosas. A presente invenção não envolve a punção da pele ou de qualquer vaso sanguíneo.

Acção Bio-Sensora In Vivo

Existe uma necessidade de se observar, contí nuamente ou não contínuamente, determinados parâmetros bioquímicos chave nos pacientes hospitalizados e, uma necessidade de novas classes de dispositivos médicos para se obter a quantifi cação contínua do tempo real. Um sensor biológico é um disposi tivo micro-electrónico que utiliza uma molécula bio-activa como o elemento transdutor indicador de sensibilidade.

K. W. Hunter, Jr., nos Archives of Pathological Laborator.-y Medicine, Vol. III, pp. 655-639, publidados em Julho de 1987, divulgam, de um modo geral, a diversidade de dispositivos e as proriedades fisicas observadas.

Hunter incluiu, também, um diagrama geral pa ra um dosímetro trandérmico. Esta referência não proporciona a informação específica adicional necessária para se criar um sis tema operacional de fornecimento de fármacos de realimentação, de acção bio-sensora.

C.C. Pech e outros, no Journal of PharmacoKinetics,and Biopharmaceutics, Vol. 9» NR 1 pp. 41-581 publicado em 195Í» apresenta uma discussão sobre a utilização contínua da recolha transetpidérmica do fármaco (CTDC) na verificação da aceitação do fármaco e efeitos farmacocinéticos. Conclui-se que quando se minimiza a transferência no sentido contrário, a CTDC pode ser um instrumento útil para se ter acesso à totalidade de exposição ao fármaco, etc., mas oferece pouca vantagem sobre a discreta recolha de amostras de outros fluidos orgânicos no estudo de outros aspectos dos efeitos cinéticos do fármaco .

Nas Patentes Norte Americanas com interesse inclui do;

4,329,999; 4,585,652; 4,708,716; 4,689,039; 4,702,732;

4,693,711; 4,717,378} 4,756,314; 4,699,146; 4,700,710;

4,706,680; 4,713,050; 4,721,111; 4,602,909; 4,595,011;

4,722,354; 4,722,726; 4,7«?,88φ; 4,731,049; 4,744,787;

- 5 4,747,819; 4,767,401;

Reveste-se de interesse geram o sistema de fornecimento transdérmico de um fármaco a que se refere a publicação do Pedido de Patente Europeia, N° 252 752 (15 de Janeiro de 1988), de Y. B. 3annon.

As referências com interesse incluem:

W. Scharamm, e outros, The Commericalization of Biosensors, MD&GI, pp. 52-57, publicado em Novembro de, 1987.

A.E. Turner, e outros, Diabetes Mellitus: Biosensors for Research and Management, Biosensors, Vol. 1, pp. 85-115, publicado por Elsevier Applied Science Publishers, Ltd, England, 1985·

Y. Ikarlyaman, e outros, Proc. Electrochem. Soc., 1987, 87-9 (Proc. Symp. Chem. Sens.) 578· CA 107-(22); 207550η.

P.H.S. Tso, e outros Anal Chem., 1987, 59 (19), 2559, CA 107(14); 1262448.

H. Wollenberger, e outros, g. Anal. Lett., 1987, 20(5), 857, CA 107(9); 75551.

P. J. Conway, e outros, D. A, Sens. Actuators 1987, 11(4), 505, CA 107(5); 56151.

M. Mascini, e outros, Clin. Chem., (Winston-Salem, NO) 1987, 55(4), 591 OA 107(5)> 55851h.

I. Hanning, e outros, Anal. Lett., 1988 19(5-4) 461, CA 105(6); 48995q.

M. Shirchirl, e outros, Diabetes Gare, 1986, 9(5), 298 OA 105(5): 58426t.

S.J. Churchouse, e outros, Anal. Proc,, (London) 1986, 2595, 146 OA 105(5) 21117v.

D.A. Gough, e outros, Anal. Chem., 1985» 67(12), 2351. CA 103(15); 11925a.

C. Loo, e outros, Chem. Eng. Sei«, 1985» 40(5), 873 CA 103(5); 54357a.

Todas as referências e patentes aqui referidas, incluem-se aqui, por referência, na sua totalidade.

É desejável possuir um dispositivo e uma metodologia para recolher amostras (ou fornec.er) substâncias (ca; - regadas ou neutras) a partir (ou para) uma membrana (in vitro) ou recolher amostras de (ou fornecer) substâncias (carregadas ou neutras) a partir de (ou para a) pele intacta (mucosa, etcO de um mamífero vivo. A presente invenção atinge estes objectivos.

RSSUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um dispositi vo de célula difusora para utilização na recolha de amostras, por intensificação eléctrica, de uma substância a partir da superfície de uma membrana ou do fornacimento de uma substância no interior ou através de uma superfície de membrana sem penetração mecâniea e, que consiste em pelo menos dois eléctacodos permeáveis de condução eléctrica para contacto com a superfície da membrana, e

meios para isolar electricamente um do outro, cada um dos eléctrodos de condução eléctrica, em que o referido eléctrodo se encontra disposto, essencialmente, numa relação lado a lado, possuindo prolongamentos laterais que terminam numa face de superfície essencialmente comum que eontacta com as porções imediatamente adjacentes do mesmo lado ia referida superfície da membíana.

Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a um dispositivo in vitro para a remoção ou fornecimento quer de substâncias ionizadas quer de substâncias não ionizadas a partir de uma amostra de membrana sem penetração mecânica, compreendendo esse dispositivo:

a) um eléctrodo positivo;

b) um elétrodo negativo, e

c) um isolador eléctrico entre as sub-partes

a) e b) , em que o eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e, o isolador eléctricc se encontram posicionados do mesmo lado da amostra de membrana.

Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a um dispositivo para remoção ou fornecimento de substâncias ionizadas para um mamífero através da pele intacta ou de membranas mucosas, sem penetração mecânica, compreendendo esse dispositivo:

a) um eléctrodo positivo,

b) um eléctrodo negativo, e ι

c) um material de isolamento eléctrico entre as sub-partes a) e b), em que o eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e o material de isolamento se encontram fisicamente posisionadas de tal modo que cada um delas apresenta uma única superfície comum do dispositivo para contacto com o mesmo lado da pele ou da membrana mucosa do mamífero.

Num outro aspecto, a presente invenção refere -se à utilização de iontoforese para determinar o nível de uma molécula carregada ou não carregada num mamífero vivo, e, com a utilização de um mecanismo de realimentação admi n-í st-rar níveis adequados de substâncias terapêuticas, segundo quaisquer vias

de administração disponíveis.

Num outro aspecto, a presente invenção, refere-se à utilização da iontoforese para intensificar a recolha de substâncias carregadas ou neutras, a partir de uma membrana ou da pele de um mamífero vivo, num dos eléctrodos, seguida da análise da concentração da substância por cromatografia gasosa (GC) , espectrofotometria de massa (MS), por cromato grafia líquida de alta pressão (HPLC) , por contagem de citilações e, similares.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1, apresenta uma prespectiva isomátrica da configuração de uma célula difusora, para experimentação, in vitro, para a criação de fornecimento ou remoção iontoforéticos, de uma substância carregada ou neutra.

A Figura 2, apresenta um corte da célula difusora modelo da Figura 1, ao longo da linha 2-2.

A Figura 3i apresenta um corte explodido da célula difusora da Figura 2.

A Figura 4, apresenta um corte explodido da célula da Figura 2, em que o isolador do reservatório inferior que separa os eléctrodos é constituído por vidro compacto. A Figura mostra, ain da, o sistema de circulação para o líquido receptor.

As Figuras j>k a 5'H apresentam um corte de diversas configurações para o eléctrodo positivo, para o eléctrodo negativo e, para os meios de isolamento entre eles, efectuàdo segundo a linha 5A-5A da Figura 1, em direcção ao fundo da parte superior da célula difunsora.

A Figura 6, apresenta uma perspectiva isométrica do modelo de célula difusora lado-a-lado.

A Figura 7, apresenta uma perspectiva isométrica da célula de

iontoforese tal como ê utilizada para o fornecimento, in vivo-» de uma molécula bio-activa, para um ser humano.

A Figura 8, apresenta um corte da célula difusora da Figura 7 segundo a linha 8-8.

As Figuras 9A e 9B apresentam uma perspectiva do topo e do fun do de uma célula de iontoforese das células das Figuras 7 ou 8.

A Figura 10, apresenta um corte de um ensaio de iontoforese em que os eléctrodos se encontram separados.

A Figura 11, apresenta a amostragem iontoforética, in vitro_tda clonidina, utilizando a célula difusora das Figuras 1,2 ou

3.

A Figura 12, apresenta a amostragem iontoforética, in vitro, da teofilina, utilizando a célula difusora das Figuras 1, 2, ou 3.

A Figura 13, apresenta os eléctrodos separados ligados a um porco da índia, quer para um método de fornecimento, quer para um método de de amostragem de uma substância carregada ou não carregada.

A Figura 14, apresenta o fornecimento iontoforético, in vitro, da morfina, utilizando a célula difusora das Figuras 1, 2 ou 3,

A Figura 15, apresenta o fornecimento iontoforético, in vitro, de P.S.O.S. (sacarose octa-sulfato de potássio), utilizando a célula difusora das Figuras 1, 2 ou 3·

DESCRICÂO PORMENORIZADA E FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

- 10 Definições:

De acordo com a terminologia que aqui se utiliza:

“Célula Difusora refere-se ao sistema eléctrico para iontoforese. 0 sistema pode incluir um eléctrodo positivo, um eléctrodo negativo e, um isolador eléctrico entre eles. 0 sistema pode, também, ser constituído por um condutor positivo, um isolador eléctrico e, uma ligação à terra.

Mamíferos diz respeito aos animais de laboratório, usualmente utilizados em ensaios, tais como ratazanas, ratos, porcos da índia, coelhos, macacos e animais semelhantes. 0 termo pode, ainda, incluir cães, gatos, gado, cabras, cavalos e similares. Um mamífero preferido é o ser humano.

Superfície de membrana refere-se quer a uma fina membrana tal como pele extraída, membranas de sintese, membranas mucosas quer à superfície abaixo da pele intacta de um mamífero, de preferência um ser humano.

Um aspecto preferencial para a amostragem ou libertação é a combinação de materiais para os eléctrodos permeáveis.

Um aspecto ainda mais preferêncial dos eléctrodos inclui tuna barra metálica em combinação com um gel o qual se encontra em contacto com a superfície da membrana.

MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS PARA AMOSTRAGEM OU LIBERTAÇÃO DE

MATERIAIS material ou materiais biológicos fornecidos ou recolhidos para amostra incluem quaisquer dos que se encontram no sistema de um mamífero vivo tais como produtos de degradação, iões metáLioos, peptidos, toxinas hormonais, e as espécies semelhantes neutras ou aquelas que transportam ou podem

-11 ser feitas para transportar uma carga eléctrica.

No eléctrodo de amostragem ou de fornecimento (que se encontra aberto), o gel de condução elédtrica é o KENZGELELEC que se encontra disponível na NITTO Electric Indus trial Co., Osaka, Japão.

A voltagem situa-se, normalmente entre cerca de 0,1 e 15 volts, de preferência entre cerca de 1 e 10 volts e, especialmente, à volta de 5 volts para amostragem e forneci mento.

Amostragem In Vitro

Descrição da célula modelo: Refere-se às Figuras 1, 2, 5 ® 4. A célula de difusão iontoforética 10, para a amostragem modelo, in vitro, foi construída de tal modo que a porção 11 da célula se encontra acima da outra porção 12, A pele extraída, 15, encontra-se entreposta, horizontalmente, com a superfície epidérmica, 14, em conexão com a parte superior da célula (ver Figuras 1, 2 ou 5)· A parte superior da cé lula encontra-se dividida por duas paredes verticais, 15A e 15B em três câmadas 16A, 16B e 160. No entanto, as duas camadas ex teriores encontram-se separadas por um espaço intermédio, 16B ( a terceira câmara). A porção inferior da célula, 12, contém o fluido receptor. As paredes 15A e 15B que formam a câmara in termédia 16B na parte superior 11 prolongam-se como paredes 15C e 15D para o interior da porção inferior da célula, 12, mas depois, juntam-se para formar uma calha, 18, que produz um canal, 19, que atravessa o topo da parte inferior da célula, 12.

canal 19 pode possuir orifícios de amostragem para ííemoção de líquido.

As câmaras 16A e 16B, contêm, independentemer te uma da outra, meios ou meio de condução eléctrica 25A (ou 253) seleccionado a partir de um gel, de um líquido, de uma pas

ta, de uma esponja, de emulsão, de metais permeáveis, cerâmicas permeáveis ou combinações destas. Para se completar o circuito eláctrico, colocam-se as barras metálicas usuais ou os eláctrodos 26A e 26B no meio de condução eléctrica, conforme se apresenta na Figura 3· Podem interpretar-se do mesmo modo as outras Figuras semelhantes, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4.

Quando a porção superior da célula, 11, se encontra posicionada sobre a porção inferior 12, de tal modo que as paredes superiores 15A e 15B e as paredes inferiores 15C e 15D coincidam, a faixa de pele 13 entre as paredes fica isolada pele na câmara de eláctrodos em ambos os seus lados su perior e inferior. (Figura 2). As porções de pele nas câmaras de eláctrodos e 16A e 16B, ficam, assim, isoladas fisica e elá ctricamente uma da outra, pelo que se pode investigar o fluxo de corrente e de material biolágico através e no interior da pele. Os orifícios 21A e 21B na porção 12, inferior da célula permitem a perfuêão^õontínua do fluido receptor 17, pelo que a porção inferior da pele 13» permanece húmida. As paredes do ca nal, 150 e 15D, também proporcionam um suporte mecânico para a membrana (pele).

Une-se a parte superior 11 e a parte inferior 12 pelas suas únicas faces planas complementares, estando a amostra 13 entre elas, utilizando molas de pressão 22A e 223 ou outros meios de fixação para nanter a parte superior 11 e, a parte inferior 12, da célula firmemente ηητ, da5.

Na Figura 4, a barreira 18A é feita de vidro para isolar eléctricamente as câmaras 16A e 16C. A Figura 4 apresenta, também, o líquido receptor 17, movendo-se na linha 20B para um reservatório 29A. Desloca-se, então o líquido 29B, de novo para o reservatório (ou vice-versa) utilizando uma bom ba 29. Pode utilizar-se em qualquer das experiências de amostragem ou de fornecimento de substâncias qualquer líquido ade- 13 quado, solução salina, sangue e similares.

Nas Figuras 5A a 5^ apresentam-se diversos aspectos da configuração espacial da célula difusora 10, da presente invenção, ao longo da linha 5A-5A da Figura 1. A Figura ê uma vista de corte transversal do fundo da parte superior da Figura 1 tomado através da linha 5A-5A. Apresentam-se as câmaras 16A, 16B e 160 θ os materiais de isolamento elé ctrico 15A e 15B (por exemplo paredes de vidro) . Na Figura 5B apresenta-se um corte transversal ao longo da linha 5-5 possuú. do as câmaras 16A e 16C e uma únl ca parede de vidro, 15E. A vista de corte transversal 50 possui câmaras quadrangulares 16A, 16B e 16C com as paredes de isolamento eléctrico 15A e 15B. A vista de corte transversal da Figura 50 possui as câmaras quadrangulares 16A e 16C e uma única parede de vidro 15F.

A vista de corte transversal da Figura 5E apresenta uma configuração concêntrica. Apresentam-se as câmaras 16AA(+), 16BB(iso lador) e 16CC(-) tendo as paredes de vidro, isoladoras 15AA, 15BBe, 15EE. A vista de corte transversal da Figura 5F também apresenta uma célula concencrica possuindo as câmaras 16AA(+) e 15GC(-) e as paredes isoladoras 1500 e 15FF. A Figura 50 representa uma vista de corte transversal dos eléctrodos e material de isolamento possuindo dois eléctrodos circulares (câmaras 16A e 16C) e paredes isoladoras de vidro 150 e 15H. A Figu ra 5H representa um corte transversal de um tipo de células concêntricas ao longo da linha 5A-5A possuindo as câmaras 16A e 16G com a parede isoladora 15DD. Estas configurações apareceu no fundo da parte superior 11, e o topo da parte inferior 12 e, e as paredes e câmaras coincidem quando a célula se encontra fechada, conforme se indica na Figura 1.

É evidente que se apresenta o topo da parte superior 11 como tendo um topo aberto para as câmaras 16A e 16C. Pode fechar-se e cobrir-se esta parte superior. Deste modo, as câmaras 16A e 16C que contêm os eléctrodos metálicos po diam posicionar-se em diversos ângulos a partir da vertical, e

- 14 as câmaras 16A e 16C poderiam manter um bom contacto eléctrico com a superfície membranosa.

Para se manter um contacto eléctrico sólido, pode utilizar-se um adesivo químico que não seja sensível à iontoforese, tal como o adesivo químico hipoalérgico que se en contra disponível na 3M Company, St. Paul, Minnesota.

Descreve-se um método e um dispositivo não invasivo para amostragem e monitorização de porções não iónicas, tais como a glicose, a sacarose e similares, utilizando a iontoforese.

Glicose - Diagnóstico médico e cuidados com o paciente baseiam-se na recolha de amostras e análise das substâncias bio-activas do organismo. Usualmente, a amostragem envolve a análise do sangue e do plasma o que implica uma amos tragem de sangue invasiva, inconvenientemente, arriscada (por exemplo, vírus) e, algumas vezes limitada. Um dos casos mais importantes é que são necessárias amostragens, pelo menos diversas vezes por dia, por tempo de vida, é o caso dos pacientes que sofrem de diabettes mellitus. A informação do tempo real no que respeita aos níveis de glicose no organismo (por exemplo, no sangue), é a informação mais importante para o tra tamento do paciente e, em muitos casos, é muitas vezes uma ques tão de vida ou de morte. Descreve-se, agora, um método de amos tragem simples, não invasivo, utilizando amostragens iontoforé ticas.

No sentido de se demonstrar a eficácia de um método de recolha de uma amostra de glicose através da pele, efectuaram-se estudos in vitro, utilizando pele de rato nua, como a pele modelo e, as células de difusão iontoforéticas das Figuras 1-13· Os resultados aqui obtidos podem aplicar-se a uma amostragem in vivo, a partir de um mamífero, especialmente de um ser humano. Colocaram-se dois eléctrodos de gel auto-adesivos (Kenzegellels, da Nitto Eectric Industry Go., Limited, Osaka, Japão), do mesmo lado de uma única porção de pele nua de rato (com a espessura de cerca de 0,5 nua) (SKH: 1 hora, 8-13 semanas de idade). Por debaixo da pele perfundiu-se glicose marcada radioactivamente (^C-U) possuindo uma concentração conhecida em solução, numa solução salina de tampão fosfato ’ (cloreto de sódio a 0,9 %), sendo o pH do fosfato de, aproxima damente 7,4. A temperatura foi a temperatura ambiente.

No primeiro grupo de experiências, a seguir à reunião da cólula e à iniciação da perfuração da solução de glicose, aplicou-se a corrente (0,5 miliamperes) durante 2 horas. A tensão pode variar entre 1 e 10 volts, aproximadamente. Habitualmente é de cerca de 5 volts. 0 parâmetro importante que se deve manter constante é a aplicação da corrente. A tensão pode variar com base na resistência elêctrica do local de amostragem. Depois, desligaram-se os eléctrodos e ensaiou-se o conteúdo radioactivo pelo método convencional de contagem líquida de cintilações. Quando a concentração de glicose sob a pele se alterou de 1,07 mg/ml para 0,153 mg/ml (um factor de 0,143), a quantidade de amostragem recolhida através da pele durante duas horas, alterou-se de 4,9 Λ6 para 0,705 >ug (um factor de 0,144 - ver quadro 1). Os resultados demonstram que para um tempo de amostragem fixo, sob as mesmas condições elétricas, se obtém no eléctrodo (+) uma correlação linear quase perfeita, entre a concentração de glicose na pele e a quantida de de glicose de amostragem. (Condições eléctricas da experiên cia a meama corrente contínua (cc), embora o fornecimento iontof orético também se possa efectuar por corrente por impulsos, etc. A abordagem por impulsos proporcionaria, também, uma via previsível para amostragem)·

QUADRO 1

AMOSTRA DE GLICOSE

Concentração (mg/ml)

A 0,153 B 1,07

Razão A/B 0.145

Fluxo Iontoforêtico amostra (pg/2hr)~

0,705 +/- 0,095 4,9 +/- 0,7 (+/- 14 %)

0,144 (Encontrado)

No segundo grupo de experiências, utilizando condições experimentais semelhantes às anteriores, efectuou

- ~ zl4

-se a perfuração de uma solução de glucose marcada ( 0-U) de

0,54 mg/ml de glucose em solução salina de fosfato tampão e, substituiram-se os eléctrodos de gel de 50 em 50 minutos.

A avaliação da glucose de amostragem no interior do gel do eléctrodo demonstrou uma quantidade repetida de 0,8 ;ug/0,5 horas com uma variação normalizada (SD) de +25% (ver Quadro 2). Uma vez que a pele para cada uma das experiências proveito de um rato diferente, efectuou-se a avaliação de cada célula única de difusão (significa - amostras recolhidas através da mesma porção de pele) , eliminando a primeira amostra (a primeira meia hora foi levemente superior às outras devido às condições experimentais). Os valores experimentais obtidos de 0,79 a 0,74 jig constituem uma média da quantidade de glicose encontrada em quatro células separadas.

- 17 QUADRO 2

Amostragem de glicose

Amostra Tempo (hr) Amostra - glicose (ug)

1	0 - 1/2	0,97 +/- 0,12
2	1/2 - 1	0,79 +/- 0,09
3	1-11/2	0,76 +/- 0,10
4	11/2-2	0,75 +/- 0,21
5	2-21/2	0,74 +/- 0,24
	Média	0,80 +/- 0,19
		(+/- 25 %)

A concentração cie glicose è de 0,54 mg/ml débito da solução de glicose é de 15 ml/hr n = efectuou-se a média de quatro células para cada amostra

Demonstrou-ãe que o S.D. para células difusoras individuais, o que significa ratos individuais, se encon tra compreendido no intervalo compreendido entre 4 e 9 % (exce pto para a célula j=^5) - ver Quadro 5

Quadro 5

Amostragem de Glicose

Quantidade de glicose medida

Célula no Eléctodo de gel, por amostra

0,825 +/- 0,041 (+/- 5 %)

0,965 +/- 0,090 (x/- 9 %)

0,530 +/- 0,115 (+/- 22 %)

0,727 +/- 0,033 (+/- 4 %)

A concentração de glicose é de 0,54 mg/ml débito da solução de glicose é de 15 ml/hr n a Médias de quatro células para cada um dos quatro períodos de tempo

Demonstrou-se que se efectua a amostragem de glicose iontoforéticamente, de um modo preciso, pela presen te invenção. Há uma correlação evidente entre a quantidade de glicose sobre a pele e a quantidade de glicose recolhida para amostra. As quantidades de glicose recolhidas para amostra são significativas e susceptíveis de se repetirem e, por isso, de confiança. Uma vez que se sabe que o transporte iontoforético depende linearmente da corrente e da duração do fluxo de correr te, estes parâmetros são manipulados com segurança (dentro dos limites de segurança para a concentração da corrente) no sentido de se obterem quantidades detectáveis de glicose no eléctro do de gel. Este método não se limita à amostragem transdérmica e, também se pode efectuar através das superfícies mucosas (por exemplo nasal, bucal) em que a barreira para o transporte de espécies não ionizadas é muito mais baixa e, a concentração dos vasos sanguíneos é elevada.

A combinação deste procedimento de amostragem com um biossensor específico para a glicose ( por exemplo,

J.C. Cooper, Ε.Α.Ξ. Hall, Jounnal of Biomedical Engeneering, Vol. 10, pp. 210-219, publicado em 1988), ou eléctrodos selectidos de glicose (R. L. Solsky, Analytical Ch.emistry, Vol. 60, = , 106R-115R, publicado em 1988) , ou com análise in situ (por exemplo, colorimétrica), proporciona a informação do tempo real de glicose. As referências anteriores indicam-se aqui, como referência.

- 19 A combinação cias monitorizações anteriores, que proporcionam informação médica do tempo real com um disposi tivo de fornecimento (por exemplo, a bomba de insulina, disposi tivo de libertação iontoforética de insulina) produz um estreito laço útil no sistema de fornecimento do fármaco de realimer. tação”.

Os fármacos de cujos níveis se efectuam amos tragens e motorizações em seres humanos, de acordo com o preser. te método, incluem mas não se limitam a:

AGENTE

Teofilina

Metotrexato de fluoro-uracilo

Iões metálicos K⁺, Na⁺, Cu, Fe⁺⁺⁺, etc.

Envenanenamento acidental

Concentração do agente suspeito (por exemplo, drogas de abuso)

Níveis hormonais

Prostaglantina (nasal) esterói des (tratamento anabólico do cancro, ajustamentos hormonais masculinos e femininos)

Antidepressivos amitriptideno HCL

PARA

Niveis sanguineos para o tratamento da asma

Níveis sanguineos na quimioterapia do cancro

Exame dos níveis sanguíneos

Quando se deve evitar a recolha de amostras de sangue de modo invasivo

Concentração não invasiva do agente

Monitorização dos níveis sanguíneos

Amostragem e monitorização dos níveis sanguíneos

A presente invenção é útil na determinação dos níveis metabólicos de glicose num mamífero, de preferência, num ser humano. Monitorizaram-se ambas as situações de hipogli cémia e de hiperglicémia, por exemplo, a partir de um nível de glicose em miligramas por mililitro de sangue, cerca de 0,1 g.l/ml a 5,0 mg/ml. Um intervalo preferido para monitorização da hipoglicémia situa-se entre cerca de 0,3 e 0,7 mg/ml. Um intervalo preferencial para a hiperglicémia (diabetes), situa-se entre 1,0 e 5,θ mg/ml. 0 nível normal de glicose no sangue situa-se entre 0,8 e 1,1 mg de glicose/ml de sangue, aproximadamente .

Encontram-se comercialmente disponíveis bio -sensores para detecção de níveis de concentração com interesse, para análise do lactato, álcool, sacarose, galactose, ácido úrico, alfa amilase, colina, L-licina, baseando-se todos eles indirec tamente na corrente eléctrica associada ao consumo de oxigénio ou à produção de peróxido de hidrogénio. Existem alguns bio-sensores, comercialmente disponíveis, que se baseisn em métodos alternativos de detecção. 0 mais importante, de um ponto de vista comercial, é o NAIAD, um detector automático do agente de agressão química.

ExacTech Baxter Traveno1, Deefield, Illinois, um bio-sensor para a glicose, é um bio-sensor de segunda geração associado à corrente eléctrica. 0 oxigénio é substituido por tua eléctrão intermédio arteficial que projecta os ele®troes do componente biológico para o eléctrodo. Estes mediadores revolucionários: 1) apresentam uma participação imediata nas reacções redox com o componente biológico e com o eléctrodc ; 2) apresentam estabilidade nas condições necessárias para o ensaio; 3) não têm tendência a participar em reacções colaterais durante a transferência de eléctrões, tal como na redução do * oxigénio; 4) apresentam potenciais redox muito mais adequados do que os das outras espécies electro-químicas activas que podem encontrar-se presentes nas amostras; 5) não são afectados por uma grande variação de pH; não são tóxidos, especialmente para aplicações in vivo; e, 6) são susceptíveis de imobilização .

Pode efectuar-se, facilmente o teste de gli cose ExacTech e, obter-se um resultado, em 30 segundos, aplicando a totalidade de amostra de sangue numa tira descartável de um dispositivo calibrador. Na utilização geralmente melhora da deste tipo de dispositivo substitui-se a tira descartável colocada no dispositivo por um material humedecido com glicose a qual se extraiu de modo iontoforético através de pele (sem extracção de sangue). A matriz de amostragem é feita de cloreto de polivinilo, bem como a tira descartável ou pode ser constituida por outros materiais com melhores caracteristícas iontoforéticas. Efectua-se a carga da matriz designada como um passo separado ou, de preferência, como uma parte de um ensaio com amostragem simultânea ou combinada e detecção de glicose. A matriz para detecção pode ser uma tira descartável, como nos sistemas correntes de detecção para o sangue , e usar-se apenas ume. vez , ou pode ser um material que permita uma amostragem múltipla. A última matriz pode permanecer no local indefinidamente ou ou pode ser útil apenas durante um certo espaço de tempo (número de ensaios). De preferência justapor-se-à de forma adequada ao eléctrodo para permitir o ensaio combinado. No entanto , configura-se com o dispositivo (sistema de monitorização) no que respeita à amostragem e detecção; aplica-se a matriz humedecida contendo glicose extraída iontoforéticamente sobre a área acessível do eléctrodo na extremidade livre do eléctrodo. Aqui, a glicose oxidase cataliza a oxidação da glicose os electrões originados transferidos para o eléctrodo subjacente através de um mediador.A amplitude da corrente originada é proporccional à concentração de glicose no sangue, na amostra, expressa-se em mg/dl no écran de cristal líquido do monitor. Uma vez que se encontram comercialmente disponíveis outros meios de detecção de glicose comparáveis a estes ou ainda mais sensíveis, podem substituir-se por estes últimos os sistemas de amostragen

de sangue comercialmente disponíveis e anteriormente descritos

Fornecimento In Vitro

Para o fornecimento in vitro de uma substância para uma membrana da presente invenção, utilizar-se-ão, também as Figuras 1, 2, 5» 4 e 5· A Figura 6 apresenta, como referência, o sistema 60 de libertação in vitro estabelicido na especialidade. Os elêctrodos horizontais 61A e 61B combinam com membrana vertical 62. 0 líquido recetor 65, uSo conterá originalmente, qualquer substância do líquido 64. Quando o circuito 65 se completa com o gerador de energia 66, a substância em 64 move-se para o interior através da membrana 62 e, aparece rá no líquido receptor 63.

equipamento e técnica para fornecimento ns, presente invenção, é semelhante ao anteriormente descrito para a amostragem in vitro. Utilizam-se quaisquer matérias condutores como metais (platina, alumínio, etc.), geles condutores (por exemplo, com uma solução de cloreto de sódio, etc.), soluções condutoras (cloreto de sódio em água, etc.), ou quaisquer combinações destes materiais.

Os elêctrodos permeáveis, da presente invençao, possuem dimensões na ordem de cerca de 1 um a 400 cm , de preferência entre cerca de 1 mm a 40 cm » A densidade da 2 2 corrente é de cerca de 0,01 uA/cm a 2 mA/cm , de preferência 2 2 de 1 uA/cm a 0,5 mA/cm . Os elêctrodos podem ligar-se por cin tas, adesivos, faixas e similares.

São pertinentes, aqui, as mesmas membranas descritas na amostragem in vitro, por exemplo, pele de espessura total ou por extractos, membranas mucosas, membranas de poli meros artificiais e, semelhantes.

Amostragem In Vivo

As Figuras úteis na ilustração da amostragem in vivo são os números 5» 7» 8, 9A e 9B. Pode adaptar-se e aplicar-se aqui a informação anteriormente fornecida para a amostragem in vitro.

Na Figura 7 apresenta-se um aspecto da amostragem. 0 topo exterior, 81, da célula, parece muito semelharão topo da parte 1 mas, possui a configuração do topo 81. Os e-Léctrodos parecem ser semelhantes ou idênticos aos das câmaras 16A, 16B e, 160. 0 topo 81 encontra-se ligado por cintas 82, ao mamífero vivo 86 (ser humano). Quando os eléctodos matálicos 26A e 26B se encontram ligados ao gerador de energia através das linhas 84 e 84A o circuito fica completo e recolhe-se a amostra da substância nos geles de condução eléctrica 25A ou 25B. A diferênça principal entre o topo da parte 11 e o topo 81 é que as paredes de vidro 15A 15B, etc. se estendem para formai' uma boa vedação no substrato horizontal da membrana em contacte com a superfície 85· (A fonte de energia 83 pode ser do tamanhe de um pequeno relógio e, portátil).

Sabe-se que os fármacos e os seus metabolitos, tais como o álcool, a aminopirina, a metil-ireia, a acetamida, a sulfo-guanidina, a sulfadiazina, a teofilina e outros não electrólitos de baixo peso molecular são excretados através da pele ou das membranas-mucosas, no suor, na saliva ou similares .

Podem, também, ser excretados através destes fluidos outros compostos e seus metabolitos os quais podem ser indicativos de determinadas situações normais ou de doença, tais como a fenil-aianina (fenilcetonúria), acúcar (diabetes) estriol (gravidez) cálcio (neoplasmas) e cobre (leucemia), por exemplo, assim como metabolitos normais ou anormais de outras substâncias. A recolha de fluido, também se utiliza experimentalmente para determinar as necessidades biológicas de determinadas substâncias como'o magnésio. Se se obtiverem amostras de fluidos e se se analisarem no que respeita a estes materiais, pode detectar-se a presença destes materiais no organismo. Para além disto uma tal recolha de fluidos é útil numa ampla gama de finalidades médicas experimentais, de diagnóstico, terapêuticas e médico-legais. Embora se possam recolher estes fluidos de diversos modos, a presente invenção descreve um método de recolha utilizando uma corrente eléctrica.

Encontram-se compostos adicionais com interesse para amostragem ou fornecimento num ser humano em Iontophoretic Devices for Drug Delivery, de Praveen Tyle, Pharmacei. tical Research, Vol. 3, =6, PP· 318-326. Substâncias específicas, com interesse para amostragem de espécies iénicas ou não iónicas, encontram-se na página 320 e, incluem-se aqui, no Qua dro 4, seguinte.

QUADRO 4

Substâncias com Interesse para Fornecimento ou Amostragem

Fármaco	Situação/Doença	Referência (N2)
1. Azul de metileno e iodeto de potássio	Distúrbios da pele (Por exemplo infecção Demodex)	Jenkinson e Walton (7)
2. Penicilina	Queimaduras	Rapperport et al. (10)
3 · Histamina	Situações de doença dos tecidos moles, bolsas e tendões	Kling e Sashin (11)
4. Iodeto de sédio	Electrélitos	Strohl et al. (15)
5. Fármacos Sulfa	Infecção por pio- genos	von Sallmann (16)

6. Dexametasona, fosfa Situação inflamató- Harris (17)
to de sódio, xilocaí na	ria musculo-esquelética	Delacerda (18)
7. Cobre	Contracepção	Riar e outros (19)
8. Insulina	Diabetes	Karl (21) Stephen e outros (2Í
9o Pilocarpina	Fibrose Cistica	Webster (23)
10. Extracto de pólen de tasneira	Febre dos fenos	Abramson (31)
11. Fósforo		0’Malley e Oester (35)
12 Água	Hiperhidrose	Tapper (43)
! 13· Citrato	Artrite reumatoi- de	Coyer (51)
14. Dexametasona Na- phos e lidocaína HCL	Teudinite primária	Bertolucci (52)
15· Hialuronidase	Homorragia	Boone (52)
16. Monofosfato de vidarabina (Ara-AMP)	Queratite (virus herpes)	Kwon e outros (5 4) Hillse outEOeo(56) > 28)
17· Lignocaína HCL ou lidocaína	Analgésia Tópica	Comeau e outros (9, 28) Russo e outros (12) Echols e outros (27) Siddiqui e outros (38) Petelenz e outros (55) Schleuning e outros

(59)

Gangarosa (60,61) Arvidsson e outros (62)

18. Acetil-beta-metil- Arteriosclerose

Cohn e Benson (57)

-colina Cl

19o Acetil-beta-metil-colina . I doxuri di na

Artrite

Herpes simples, queratite

Martin e outros (58)

Gangarosa e outros (60, 63)

QUADRO 4 (continuação)

Substâncias com Interesse para Fornecimento ou Amostragem Uti lizando a Iontoforese

21. Fluoreto de sódio

22. Succinato de metil -pre dni solona

23. Lidocaína, epinefrina e corticoeste roides

24. Salicilato de sódio

25· Cálcio

26. Ácido Acético

27· Zinco

28. Glucocorticoides esterificados

29· Vassopressina

30. Alcaloides

Lentina

Neuralgia Pós-herpética

Articulação Têmporo-maxilar-sin droma disfuncção dolorosa liofacial

Verrugas do lavra dores

Miopatia

Depósito de cálcio

Distúrbios nasais

Doença de Peyronie

Actividade neural do septo lateral

Dor crónica

Gangarosa (60)

Gangarosa e outros (64)

Ganarosa e Mahan (65)

Gordon e Weinstein (66)

Kahn (67)

Kahn (68)

Weir (69)

Rothfeld e Murray (70)

Marchand e Hagino (7D

Csillik e outros (73)

51. Optidase	Artrose	Ulrich (74)
52. Butazolidina sali	Tromboflebite	Kostadinov e outros
cílica Natrium	Agúda	(75)
55· Penicilina	Pneumonia e abcessos dos pulmões	Sokolov e outros (76)
54. Papaverina e áci-	Osteocondaose cer-	Ostrokhovich e
do nicotínico	vical com simptomas neurológicos	Strelkova (77)
55· Gorduras	Alergia	Shilkret (80)
56. 6-Hidroxi-dopa- mina	Infecção Ocular	Caudil e outros (31)
57. Hetoprolõl	Bloíjueio-Beta (angina pectoris)	Okabe e outros (82)

a) Baseado em impressões clinicas (qualitativa)

b) Baseado em estudos de duplo engano (estudos bem controlados)

c) Baseado em experiências in vitro

d) Baseado em estudos comparativos controlados (quantitativos, mas não de duplo engano).

Fornecimento In Vivo

Pode utilizar-se para a libertação in vivo o mesmo tipo de dispositivo apresentado nas Figuras 7, 8, 9A e 9B e 10, para a amostragem in vivo.

Acção Bio-sensora Utilizando a Iontoforese

São importantes, neste aspecto, as Figuras 5» 7» 8» 9-A e 9B. Tem interesse a descrição anterior para a amostragem in vivo mais um componente de análise.

componente de análise pode ser (ião) eléc

electronicos que efectuem a conecção entre as alterações bioίquímicas específicas e os sinais eléctricos, reagentes colorimétricos e, similares.

A indicação da presença da substância com interesse no tecido de um paciente pode ser qualitativo ou quantitativo. Pode associar-se o valor medido a uma unidade de fornecimento de um fármaco para proporcionar um nível adicio nal de um agente terapêutico.

A amostragem do componente pode efectuar-se por um único eléctrodo de amostragem ionotoforética.

método analítico pode permitir a adminisi!

'tração automática de um nível adequado do agente terapêutico necessário, quando há a sensibilidade de que a substância em questão (ou material bio-activo) se alterou. A mensuração pode, também, alertar simplesmente o operador para a necessidade de se administrar o agente terapêutico por via oral, dermatológica,

Í! rec tal, bocal, intravenosa, ou outras.

Vantagens da Amostragem ou Fornecimento In Vivo ou In Vitro

1. A proposta de amostragem aqui traçada, consiste numa técnica simples, conveniente e indolor para a recolh de materiais bio-activos com finalidades de diagnóstico ou de monitorização. A amostragem pode ser contínua ou periódica.

2. A amostragem é altamente significativa em situações em que não se pode extrair uma amostra de sangue de modo rotineiro, ou em que não é desejável a aqúsição de amostras múltiplas de sangue (por exemplo numa criança).

3. A técnica de amostragem oferece características que podem, finalmente, ser construídas num sistema tipo anel de realimentação biológica. Por outras palavras, o dis- 29 * ι·

[positivo iontoforético, embora permitindo a amostragem pelo méjitodo descrito, também se pode utilizar para fornecer um agente j)terapêutico através de qualquer via de administração (isto é, [em resposta a uma necessidade sentida através da amostragem).

I

I [ 4. A amostragem permitirá a monitorização simples e segura efectuada fora do paciente e, proporcionará a uti lização da iontoforese numa ampla e bastante generalizada aplicação.

í 5. A amostragem ou fornecimento de qualquer material bio-activo pode ser modificada se. o material biológico [de amostragem não atravessar a pele de um modo suficientemente [rápido: podem incorporar-se agentes (por exemplo álcoois, ácidos gordos, glicois, Azona, etc.) que diminuem o funcionamento

Hda barreira local da pele, no dispositivo do eléctrodo, para í!melhorar a extracção ou fornecimento do fluxo, ί

6. A técnica permite a amostragem em ambos os μeléctrodos, isto é, a determinação simultânea de mais do que ¹ um único agente bio-activo (por exemplo, um fármaco e um meta'bolito ou um conjugado do fármaco).

i;

’

7· A técnica, conforme se indicou, não se limita à sensibilidade de material biológico através da pele. Outras superfícies mucosas também são adequadas para este propósito. Os exemplos incluem a mucosa nasal, o recto , a vagina e 0 interior da boca. Utilizam-se, presentemente, estas superfí-, cies como locais de amostragem com graus de sucesso variáveis.

Uma vez que estas superfícies mucosas são, em geral_y bem irriji gadas por pequenos vasos sanguíneos e, devido ao facto destas [ membranas serem menos resistentes ao transporte molecular, quaa do se efectua a amostragem a partir desses tecidos pode utilizar-se uma corrente mais fraca e por espaços ds tempo mais curtos .

da corrente aplicada entre os electrodos e da duração da correnj te. Estas variáveis podem controlar-se com precisão em amostrai gens capazes de serem reproduzidas, permitindo, desse modo, a criação de dados seguros para fins comparativos (por exemplo, comparando os níveis de um material bio-activo especial, antes, durante e depois do tratamento terapêutico). Isto constituirá uma vantagem notável quando se efectuam amostragens a partir do nariz, um local notoriamente difícil para se obter informação reproducível.

9. Os materiais ou substâncias bio-activas carregadas ou não carregadas são candidatos para a administração ou amostragem iontoforéticas. Incluem pequenas proteínas, de di- a polipeptidos, materiais lipofébicos e lipofílicos. Preferenh-se os materiais carregados que muitas vezes, não se podem administrar por outras vias. Ver as substâncias das Patentes Norte Americanas números 3 731 683, 3 797 494, que aqui se indicam como referência.

10. 0 dispositivo torna possivel a amostragem ou administração, in vivo ou in vitro de substâncias (ou material bio-activo) em que os eléctrodos se encontram do mesmo lado da superfície em questão. A amostra encontra-se, geralmente, numa configuração horizontal, enquanto que os eláctrodos são adjacen tes um ao outro e num sentido vertical. Se o topo do dispositivo se encontrar vedado, este pode dispor-se sobie-a‘pelesob quàlauer grau de orientação desde que o contacto com a superfície da mem brana não seja enfraquecido.

11. Este dispositivo e esta técnica tornam possi veis efectuar a amostragem ou fornecimento de fármacos sistémica ou localmente. Por exemplo, é possível utilizar esta técnica para tratar o cancro da pele com metotrexato administrado através da pale.

pretados, apenas a título ilustrativo e exemplificativo. Não devem ser considerados de modo nenhum como um limite à presente invenção.

AMOSTRAGEM EM VITRO i

Verificação da Célula Modelo: as células difusoras de vidro,

I ! conforme anteriormente descrito, (ver Figuras 1, 2, 3 ou 4) i foram fabricadas pela Skin Permeation Systems (L.G.A., Berkeley ί, CA). A célula 10 é uma modificação de uma célula difusora paH drão de fluxo contínuo (catálogo de células de penetração na p pele LGA, n2 1084-MPC), descrita por Gummer e outros, Internais tional Journal of Pharmacology, Vol. 40, p.101 ff, publicado h em 1987.

topo da parte superio» da célula encontra-se dividido em três compartimentos ou câmaras (26A, 16B ou 16C) por duas paredes 15A e 15B, a conexão apenas física/eléctri ca entre as duas câmaras de eláctrodos (16A e 16C nas Figuras

1, 2, 3 ou 4) diminui a possibilidade de fuga entre elas e peri mite investigar questões ligadas à continuidade da pele. 0 topo da parte 12 da célula possui um canal, 18, ou orifício abaixo deste espaço que isola a pele da parte restante da fase do receptor. Preenchendo este canal 18 com o fluído receptor 19, durante uma experiência, mantém-se a pele que se encontra acim^, húmida. A porção do fundo da parte 12 da célula também possui os orifícios 20A e 20B para a circulação contínua da fase receptora 17, e oe orifícios 21A e 21B para circulação da água de arrefecimento 21C. Impediu-se a capilaridade entre as parecteí dos compartimentos e o tubo externo, por sinalização do topo da célula com dicloro-metil-silano (Aldrich Chemical Co., Mil! waukee, WI). As células utilizam-se com um agitador magnético de três posições e uma haste em movimento, 27· (LG-1083, EGA, Berckley).

Eléctrodos Metálicos de barras (26A e 26B) - Tela de platina j (tela Pt - Fisher = B-766-5A, 99,95 % pura).

i Gerador de Energia (29) - controlo de corrente ou de voltagem com um medidor automático (modelo ΑΡΗ 1000M, Kenco, Inc., FlusL hing, NY) . Este gerador possui uma variação < 2 /iA/8 horas no j seu controlo de corrente à saida, um facto importante a considerar se o fármaco for sensível a alterações de~corrente.

Fluido Receptor (17) - solução salina de tampão fosfato (pH = i 7,4, naCl a 0,9 % p/v) .

Corante - Corante azul 1 FD&C em água desionizada.

Fármacos - Clonidina HCL (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo); Clonidina HCL (fenil-4-^Ξ) de actividade específica de 9θ mCi/ /mg (Amersham, Arlington Heigts, IL). Sulfato de morfina (Sigma Chemikal Co., St. Louis, MO); Morfina (N-metil-^H) de activida j

i de específica de 255^mCi/mS (New England Nuclear, Boston, MA).

iiDissolveram-se os fármacos não marcados em água desionizada li ~ , i para formar soluções de lmg/ml, com farmaco marcado suficiente¹

I 1 para se atingir uma actividade de luCi/ml. í

Pele (13) - pele de espessura total, recentemente extraída de ratos fêmeas sem pêlo, de 11 a 15 semanas de vida (estirpe SKh jHR-1 Simonsen Laboratory, Gilroy, CA) .

Ensaios da Célula Modelo - Ensaiou-se a célula difusora 10, se gundo três procedimentos:

1) Ensaios de fuga (sem corrente) utilizando corante e borracha de silico em vez de pele ; 2) ensaios de fuga utilizando corante e pele (sem corrente); e, 3) ensaios iontoforéticos utilizando soluções do fármaco e pele (com ou sem corrente). Avaliaram-se os procedimentos 1) e 2) inspeccionando a célula visualmente. Para o procedimento 3), colocou-se

na câmara 16A 0,6 ml de solução cio fármaco, pipetou-se para a ' câmara 160 0,6 ml de solução salina tampão e, e impês-se entre ,jos eléctrodos, nas duas câmaras uma corrente constante de 0,63

I ί p dmA/cm (com a tensão limitada a 9V). Determinou-se a activida/ de das soluções nas câmaras 16A e 160 antes e depois da ionto-ι dforese. Determinou-se pos-experimentalmente a actividade da pe Hle 13 e das amostras tomadas a partir da câmara receptora. Ca!ída experiência teve a duraçao aproximada de 24 horas, -2 horas; d sendo as amostras recolhidas hora a hora. Agitou-se magnetica! mente (27) o fluido receptor (17), e o débito de recolha foi de 10 ml/hr. Repetiu-se três vezes cada procedimento, i'

RESULTADOS

H Procedimentos 1) e 2): Não se observou fuga

Í!do corante a partir das câmaras laterais 16A e 160 para a camaí !

d ra intermédia 16B, ou a partir de qualquer câmara para o exteii rior da célula, em ambos os modelos de membrana de borracha de ' silicio ou de pele nua de rato.

'' Procedimento 3)^: Quando se substitui o co- I rante na câmara 16A por um fármaco marcado e não houve aplica-í ^! í - z i 'çao de corrente, os farmacos difundiram-se para o interior da j ρ I fase do receptor 17, numa proporção média de 0,05 ug/cm^/hora ί ¹ de clonidina-HCL e de 0,04 ug/cm /hora para o sulfato de morfi/ 'na. Em ambos os casos, não se observou qualquer férmaco na so-I jí lução salina tampão da câmara 160, após 20 horas.

jj j Quando se aplica a corrente entre a câmara ' com o fármaco marcado e a câmara com a solução salina tampão, a permeabilidade aumenta substâncialmente, a proporção de pene i tração do sulfato de morfina através da pele com uma corrente jl de 0,63 mA/cm foi de 2,0 ug/cm /hora em comparação com propor ( ~ p çao de transporte passivo que foi de 0,04 ug/cm /hora. No caso

I ** p da clonidina -HCL, a proporção mudou de 0,05 ug/cm /hora, sem j 2 í corrente, para 15,0 ug/cm /hora com uma força de condução eléc j trica.

- 34 Detectou-se o fármaco marcado na solução salina tampão da câmara 160, com a presença de 1 ug de sulfato de morfina, decorridas aproximadamente 20 horas (ver Figura 14), e com 5 /45 de clonidina após o mesmo período de tempo.

fármaco marcado pode ter penetrado na câmara 160 segundo diversas vias, sendo a mais provável que tenha sido puxado para trás e para cima através da pele sob o eléctrodo passivo. Para se ensaiar esta possibilidade, ligaram -se duas células, por um tubo 95 de tal modo que as suas fases receptoras 92 e 93 fossem comuns mas de tal modo que a pele e os topos das células se encontrassem fisicamente separados (ver Figura 10). Posicionaram-se na câmara 914 da cálula 904 o fármaco marcado e o electrodo positivo. Colocou-se o eléctrodo ne gativo na câmara 91B na cálula 9θΒ· Encheram-se todas as outras câmaras (910, 91D, 92 e 93) com solução salina tampão. Os procedimentos experimentais dos restantes parâmetros eléctricos amostragem, foram idênticos aos do procedimento 5» anterior. Quando as células se encontram ligadas deste modo, o fármaco marcado foi transportado para o interior da câmara 914 da célu la 904, demonstrando, assim, a existência de uma via transdér mica inversa na iontoforese, a qual consiste, de facto na amos tragem por iontoforese.

b) Os materiais adicionais dos quais se espera poder fazer-se uma amostragem de um modo semelhante ao que aqui se descreveu para a cloridina, incluem, por exemplo, morfina, heroína, insulina, neomicina, nitrofurasona e, beta-metasona.

EXEMPLO 2

AMOSTRAGEM IONTOFORÉTICA IN VITRO

A amostragem iontoforética consiste na extracção de substâncias químicas a partir do corpo, através da

pele por meios eléctridos. No sentido de se ensaiar este método utilizou-se uma célula iontoforética in vitro (Figuras 1,

2, 5 ou 4). Colocou-se entre as duas partes da célula a espessura total da pele nua de um rato 15» (8-15 semanas de idade). Fizeram-se circular fármacos de concentração conhecida em solu ção salina de fosfato tampão, a 10 ml/hora, por debaixo da pele. Na porção superior da pele encontravam-se dois elêctrodos de gel auto-adesivos, ligados a uma fonte de energia regulada para uma corrente constante (0,5 mA) . Aplica-se a corrente para medir o espaço de tempo que corresponde a cerca de 0,65 mA/ /cm (cerca de 2 horas). Após o ensaio, tomam-se os elêctrodos de gel para contagem de cintilações, o que reflete a quantidade de fármaco absorvido pelos elêctrodos de gel. Utilizando di ferentes concentrações de fármacos, com a mesma corrente eléctrica durante o mesmo período de tempo, verifica-se uma correlação linear entre a quantidade do fármaco recolhido pelo eléc trodo e a concentração do fármaco, conforme esperado.

Nos gráficos (Figs. 11 e 12), apresentam-se os resultados do método anteriormente descrito , utilizando cio ínidina e teofilina, a diversas concentrações, sendo cada um dos: pontos uma média de pelo menos, duas experiências. A representação gráfica dos dados demonstram a linearidade dos resultados .

FORNECIMENTO IN VITRO

a) Morfina - Utilizaram-se para o forne cimer. to de morfina os procedimentos e condições descritas para a p

amostragem in vitro. Utilizou-se uma corrente de 0,65 mA/cm durante 20 horas utilizando a célula descrita nas Figuras 1, 2, ou 4. Colocou-se a morfina na câmara 16A. Apás iontoforese a morfina encontrava-se na câmara 16C. (ver Figura 14·).

gel de condução eléctrica que se utilizou em todas as experiências foi o gel KENZ-GEL-ELC da Nitto Elec- 56 -

tric Industrial Electric Company, Osaka, Japan.

b) P.S.O.S. (Sacarose octa-sulfato de Potás sio). Colocou-se na câmara 16A P.S.O.S., 0,6 ml de uma solução de 1,5 mg/ml em tampão bórico e colocou-se apenas ácido bórico tampão na câmara 16C das Figuras 1,2 ou 3· Utilizando uma coro rente directa de 0,5 mA (0,65 mA/cm ) observou-se um transporte de P.S.O.S. superior a 5 jig/hora. Utilizando a mesma configuração experimental sem corrente apenas se transferiram alguns nanogramas de P.S.O.S. Ver Figura 15·

AMOSTRAGEM IN. VIVO

Utilizou-se o procedimento e descrição anteriores para a amostragem in vitro excepto no facto da membrana ter sido substituída peLLa parte superior do antebraço de um ser humano, do sexo masculino, de 29 anos de idade. A célula de amostragem que se utilizou foi a das Figuras 7» 8, 9A e 9B. A quantidade de clonidina recolhida para amostra foi semelhante à observada no processo in vitro.

FORNECIMENTO IN VIVO

A Figura 13 apresenta um diagrama de um porco da índia possuindo eléctrodos almofadadas separados para a amostragem de materiais bio-activos a partir do mamífero.

No sentido de se examinar a invenção in vive, levou-se a efeito um ensaio. Aplicou-se um procedimento iontoforético na pele nua do porco da índia, 113· Colocou-se um eléctrodo de gel 132 (+) em continuidade 131, com tiofilina (5,5 jig, 2,4x4-,2 cm) num dos lados da parte posterior do animal e, ligou-se :o outro eléctrodo de gel 132A (-) em continuidade 131A do outro lado da parte posterior do animal (distância aproximada de separação de 7 cm). Após 20 minutos a 1,0 mA (fonte de energia 130) , removeram-se os eléctrodos de gel e, encontrou-se

- 37 1,83 ug de teofilina no eléctrodo negativo. A quantidade de teo filina absorvida pelo corpo do porco da índia foi de 1,2 ug.

ACÇÃO BIA-SENSORA UTILIZANDO A IONTOFORESE

Descreveu-se anteriormente a amostragem da clonidina radioactiva in vitro. Quando se adapta este procedimento para uma amostragem in vivo, num cão, mede-se rapidamente e acuradamente, de modo iontoforético, o nível da clonidina radioactiva. 0 operador é alertado quando tem de administrar uma injecção de clonidina para manter o nível de clonidina desejado no cão em que se efectua o ensaio.

Embora aqui se descrevam apenas alguns aspectos da presente invenção, será evidente para o especialista que se podem efectuar diversas alterações e modificações na célula de difusão iontoforética para a amostragem in vitro e in vivo de moléculas bio-activas e, para o fornecimento in vitro e in vivo de moléculas bio-activas ou de aplicações de acções bio-sensoras sem fugir ao espírito e ao âmbito da presente invenção. Todas estas modificações e alterações que se encontram no âmbito das reivindicações, em anexo, consideram-se abrangidas pelas mesmas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê Dispositivo celular de difusão para utilização na amostragem eléctricamente aumentada de uma substância bioactiva a partir da superfície de uma membrana ou para fornecer uma substância bioactiva à superfície de uma membrana ou através dela sem penetração mecânica, caracterizado por ser constutuido por pelo menos dois electrodos permeáveis condutores de electricidade que contactam a superfície da membrana, e meios para isolar electricamente cada um dos electrodos conductores de electricidade, e por os referidos electrodos se disporem essencialmente numa posição lado a lado, possuindo lados que se prolongam e terminam numa superfície lateral essencialmente comum a qual contacta as porções imediatamente adjacentes do mesmo lado da referida superfície da membrana;

- 2â Dispositivo celular de difusão de acordo com a reivindicação 1, utilizável in vitro para a remoção de uma suix tância carregada ou descarregada, a partir da superfície de uma membrana, sem penetração mecânica, caracterizado por ser constitui do por:

(a) um electrodo positivo;

(b) um electrodo negativo; e (c) isolador eléctrico entre os componentes (a) e (b), e por o eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e o isolador eléctrico estarem colocados do mesmo lado da superfície da membrana.

- 3e Dispositivo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o eléctrodo positivo, o eléctrodo nagativo e o material isolador constituírem uma unidade integrada que apresenta um lado comum voltado para a superfície da membrana.

- 4â Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ainda englobar um reservatório de travessia do outro lado da amostra de membrana, e por os electrodos

- 59 positivo e negativo se ligarem para fechar o circuito eléctrico, possuindo no reservatórico um material electricamente não condutor entre os eléctrodos em contacto com a superfície da membrana.

- ₅ô Dispositivo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o material do eléctrodo que contacta a super fície da membrana se seleccionar entre gel, líquido, pastas, espumas, esponjas, metais porosos, metais, cerâmicas porosas ou uma sua combinação.

- 6& Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os eléctrodos serem uma combinação de um fio metálico em contacto com um gel.

- ₇â Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ainda englobar meios para controlar a temperatura de funcionamento do dispositivo.

- 8& Dispositivo utilizável in vitro para fornecer uma substância carregada ou não carregada através da super fície de uma membrana, sem penetração mecânica, caracterizado por ser constituído por:

(a) um eléctrodo positivo;

(b) um eléctrodo negativo;

(c) isolador eléctrico entre os componentes (a) e (b) e por 0

- 4Ό eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e o isolador elèctrico estarem colocados do mesmo lado da superfície da membrana.

- 9& i

Dispositivo de acordo com a reivindicação

8, caracterizado por o eléctrodo positivo, o eléctrodo negatiίvo e o material isolador constituírem uma unidade integrada que apresenta um lado comum voltado para a superfície de membrana.

- 10 a Dispositivo de acordo com a reivindicação

9, caracterizado por englobar um reservatório de travessia do outro lado da amostra de membrana, e por os eléctrodos positivo e negativo se ligarem para fechar o circuito elèctrico, possuindo uma barreira eléctrica entre os eléctrodos em contac to com a superfície da membrana.

- ll» _ ! Dispositivo de acordo com a reivindicação

8, caracterizado por o material do eléctrodo que contacta a superfície da membrana se seleccionar entre gel, líquido, pasta, papel, espuma, esponja, metal poroso, metal, cerâmica porosa ou suas combinações.

- 12& Dispositivo de acordo com a reivindicação

11, caracterizado por um suporte mecânico e uma área electricamente não condutora constituírem uma tina rasa na metade inferior, contendo um líquido humectante em contacto com a δτηοκtra de membrana.

Dispositivo de acordo com a reivindicação

8, caracterizado por o isolador eléctrico ser o ar, e os eléctrodos serem fios metálicos em combinação com o gel.

I í - 14â Dispositivo de acordo com a reivindicação | íj10, caracterizado por ainda englobar meios para controlar a : !

temperatura de funcionamento do dispositivo.

- 15^ í

Dispositivo para a remoção de pelo menos

Huma substância carregada ou descarregada, a partir de um mamíífero, através da pele ou de uma membrana mucosa intacta, sem penetração mecanica, caraoterizado por ser constituido por;

(a) um eléctrodo positivo;

¹(b) um eléctrodo negativo; e j (c) um material isolador eléctrico entre os componentes (a) e (b), e por o eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e o material isolador estarem colocados fisicamente de forma a que cada um deles apresenta uma única superfície comum do dispositivo para contactar com o mesmo lado da pele ou da membrana mucosa do mamífero.

ί - 16B Dispositivo de acordo comaa reivindicação

15, caracterizado por o material isolador ser seleccionado do grupo que consiste em vidro, cerâmica, ar, plástico ou borracha.

- 17&Dispositivo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os componentes estarem na seguinte ordem eléctrodo positivo, material isolador, eléctro negativo e por os eléctrodos serem uma combinação de materiais.

- 18& Dispositivo de acordo com a reivindicação 15» caracterizado por os componentes estarem numa configuração tubuler concêntrica com um eléctrodo , rodeada pelo material isolador, e por ambos estarem rodeados pelo outro eléctrodo.

- 19& Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os materiais dos eléctrodos serem seleccionados de um gel, líquido, pasta, papel, espuma, esponja, metal poroso, cerâmica porosa electricamente conductores ou suas combinações.

- 20a Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o mamífero ser um ser humano.

- 21 & Dispositivo para fornecimento de substâncias ionizadas a um mamífero através da pele intacta sem penetra ção mecânica, caracterizado por incluir:

(a) um eléctrodo positivo;

(b) um eléctrodo negativo; e (c) um material isolador electricamente entre os componentes das alíneas (a) e (b), e por o eléctrodo positivo, o eléctrodo negativo e o material isolador estarem fisicamente posicionados de forma a que cada eléctrodo apresente uma única superfície comum do dispositivo para contacto com a pele do mamífero.

- 22^ Dispositivo de acordo com .a reivindicação

21, caracterizado por o material isolador ser seleccionado do grupo que consiste em vidro, cerâmica, metal, plástico ou borracha não condutores.

- 23 & Dispositivo de acordo com a reivindicação

22, caracterizado por os componentes estarem na ordem seguinte: eléctrodo positivo, material isolador, eléctrodo negativo e por os eléctrodos serem uma combinação de materiais.

- 24ê Dispositivo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por os componentes estarem numa configuração concêntrica possuindo um eléctrodo, rodeada pelo material isolador, e ambas estarem envolvidos pelo outro eléctrodo.

- 25ã Dispositivo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por os materiais dos eléctrodos serem seleccionados de um gel, líquido, pasta, papel, espuma, esponja, metal poroso, cerâmica porosa electricamente condutores ou suas combinações.

- 26ê Dispositivo de acordo com a reivindicação

21, caracterizado por o mamífero ser um ser humano.

j - 27^ i ί

Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a parte não-iánica ser controlada.

N - 28ê Dispositivo de acordo com a reivindicação

27, caracterizado por a parte não iánica ser um açúcar natural.

- 29 ô Dispositivo de acordo com a reivindicação

28, caracterizado por o açúcar natural ser a glicose.

- 30 â ' ι p Dispositivo de acordo com a reivindicação ii j 29, caracterizado por o nível de concentração de glicose medi! do, estar compreendido entre 0,1 e 5 ,θ mg aproximadamente, de glicose por mililitro de sangue.

- 3ia Dispositivo 30, caracterizado por o nível entre 1,1 e 5,0 mg de glicose

- 32ã Disnositivo de acordo com a reivindicação de glicose estar compreendido por mililitro de sangue.

de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se controlar a parte não-iónica.