DK171440B1 - Fremgangsmåde til undertrykkelse af uønskede thio-reaktioner under spaltning af peptider med cyanogenbromid - Google Patents

Description

i DK 171440 B1

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til undertrykkelse af uønskede thiol-reaktioner under spaltning af peptider med cyanogenbromid.

Fremkomsten af rekombinant-DNA-metodikken har medført 5 et behov for udvikling af et antal procesparametre til produktbeskyttelse, udvinding og rensning. De produkter, der frembringes ved rekombinant-DNA-processer, opnås sædvanligvis i første omgang som "sammensatte gen-produkter", dvs. aminosyresekvenser, der indeholder en leder-10 sekvens og/eller en efterfølgende sekvens, som er knyttet til aminosyresekvensen af det ønskede produkt. Det har derfor vist sig væsentligt at udvikle en metodik, hvormed man kan spalte det ønskede peptid fra ethvert fremmed peptid. En af de anerkendte kemiske metoder til dette 15 formål har været anvendt i vid udstrækning. Denne metode omfatter anvendelsen af cyanogenbromid (CNBr) til at inducere fraspaltningen af en vilkårlig indre methionyl-rest ved peptidets carboxy-terminal. Den nøjagtige lokalisering af en methionyl-rest ved sammenknytningspunk-20 tet mellem amino-terminalen af det ønskede produkt og -det fremmede peptid, som er tilknyttet uden tilgængelige methionylrester i det ønskede produkt, gør CNBr-spalt-ningen til en potentielt meget vigtig metode til fremstilling af produkter i rekombinant-DNA-processer. 1 2 3 4 5 6

Anvendelsen af CNBr til fremkaldelse af specifikke spalt 2 ninger er imidlertid ikke uden ulemper. En af disse 3 ulemper er særlig tydelig ved bearbejdningen af pepti 4 der, der indeholder thiol-holdige aminosyrerester. Cya 5 nogenbromid vides at kunne fremskynde omdannelsen af 6 thioler til disulfider, hvilket, under CNBr-fraspaltningen, kan føre til dannelse af uønskede biprodukter.

Ho et al., Synthetic Communications 3, 317 - 320 (1973), beskriver omsætningen af CNBr med alkyl- og arylnatrium- 2 DK 171440 B1 thiolater til frembringelse af de tilsvarende disulfider.

Abe et al., J. Org. Chem. 39253 - 255 (1974), beskriver omsætningen imellem homocystin og homo-mercaptoethanol, hvorved der dannes homocystein og det blandede disulfid af homocystein og 2-mercaptoethanol. Reaktionen forlø-5 ber både i nærværelse og i fravær af CNBr. Mængden af det blandede disulfid forøges stærkt i nærværelse af CNBr under samtidig reduktion af mængden af homocystein.

Ud fra et andet perspektiv beskriver Sekita et al.,

Keio J. Med. 24, 203 - 210 (1975), CNBr-spalthingen 10 af urease og phosphorylase b. Disse forskeres under-« øgeiser antyder, at spaltningen kan fremskyndes ved tilsætning af 2-mercaptoethanol. Imidlertid postulerer de ikke nogen definitiv basis for denne effekt. Det anføres endvidere, at denne effekt hverken opnås ved 15 anvendelse af dithreitol eller ved anvendelse af thio-diglycol.

Det har nu overraskende vist sig, at den uønskede disulfid-udveksling og den irreversible cystein-modifikation, som fremkaldes af CNBr på faste fermenteringsprodukter, 20 der er opnået ved rekombinant-DNA-processer, kan formind skes eller elimineres ved tilsætning af en lille mængde thiosulfationer forud for CNBr-spaltningen. Fremstillingen af thiol-holdige peptider ved rekombinant-DNA-metoder involverer rutinemæssigt en begyndende fermentering 25 af de rekombinante organismer, en udvinding af faste fermenteringsprodukter, en spaltning af det sammensatte gen-produkt ved anvendelse af CNBr og en sulfitolyse af det spaltede produkt til opnåelse af et S-sulfoneret peptid, som umiddelbart kan kombineres med et uafhængigt 30 opnået S-sulfonat-peptid, eller som kan foldes omkring sig selv til frembringelse af det ønskede disulfid-holdige produkt. Gennem en efterfølgende sulfitolyse af produktblandingen har det vist sig, at indvirkningen 3 DK 171440 B1 af CNBr på thiol-holdige materialer fører til en frembringelse af mængder af irreversibelt modificerede derivater, som komplicerer de chromatografiske rensningspro·-cesser og formindsker udbyttet. Det har vist sig, at 5 begge disse ulemper signifikant kan formindskes eller elimineres ved tilstedeværelse af thiosulfationer.

Det har endvidere vist sig, at anvendelsen af thiosulfationer under CNBr-spaltningen af et thio-holdigt peptid indebærer en yderligere fordel. Der tilvejebringes nemlig 10 et mellemprodukt, sandsynligvis sulfenyl-S-sulfonatet, som letter den sulfitolyse-reaktion, der sædvanligvis følger efter. En sulfitolyse involverer traditionelt en behandling af thiol-peptidet med natriumsulfit i nærværelse af et oxiderende middel, blandt hvilke natrium-15 tetrathionat har vist sig at være mest effektivt. Mellemproduktet, som dannes under CNBr-spaltningen i nærværelse af thiosulfationer, kan let omdannes til det sulfi-tolyserede produkt ved behandling med natriumsulfit i fravær af det kostbare natriumtetrathionat-reagens.

20 Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til at inhibere uønskede thiol-reaktioner hos thiol-holdige peptider under fraspaltning af methionyl fra sådanne peptider under anvendelse af CNBr, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man gennemfører fraspaltningen 25 i nærværelse af thiosulfationer.

Den omhandlede fremgangsmåde involverer en vekselvirkning imellem et peptid, CNBr og thiosulfationer. Det ønskede peptid skal indeholde mindst en methionin-rest, som kan angribes og fraspaltes af cyanogenbromid, samt mindst 30 en thiol-holdig aminosyre. Som eksempler på peptider, der opfylder de ovennævnte kriterier, kan nævnes væksthormoner, proinsuliner, insulin A-kæde og insulin B-kæde.

4 DK 171440 B1

Spaltningsreaktionen ifølge opfindelsen gennemføres i nærværelse af et vandigt surt opløsningsmiddel. Typiske syrer, som kan anvendes, omfatter trifluoreddikesyre, eddikesyre, saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, myre-5 syre og lignende. Myresyre er særlig foretrukkent. Selv om man kan inkludere andre ikke-vandige, ikke-sure opløsningsmidler i opløsningsmiddelblandingen, foretrækkes det i høj grad, at man omhyggeligt kontrollerer forholdet imellem syre og vand. Uanset om opløsningsmiddel-10 blandingen omfatter ikke-sure, ikke-vandige komponenter eller ikke, vil den tilstedeværende mængde syre optimalt findes i et molært overskud i forhold til vandet. I særdeleshed når der er tale om myresyre, er den foretrukne syre-vand-blånding 67,5% (v/v) myresyre.

15 Cyanogenbromid inkorporeres i blandingen i en mængde, der på mol-til-mol^-basis i det mindste er tilstrækkelig til at opveje hver methioningruppe, der er til stede i peptidet, som anvendes som udgangsmateriale. Man kan anvende et stort overskud af CNBr, uden at dette har 20 skadelig indflydelse. Derfor er CNBr generelt til stede i et molært forhold på 6 - 10 gange i forhold til pepti-dets methionylrester. Hvis man ikke anvender, hvad der normalt ville være et overskud af CNBr, er det endvidere nødvendigt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen at til-25 sætte en yderligere mængde CNBr, som på molær basis er tilstrækkelig til at opveje den mængde thiosulfatio-ner, som inkorporeres i blandingen. Sammenfattende er det imidlertid sådan, at man kan opnå den krævede mængde CNBr ved at sikre sig, at der er et stort overskud af 30 CNBr til stede i forhold til summen af methionylresterne og thiosulfatet.

Essensen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligger i tilsætningen af thiosulfationer. Typisk vil man in- 5 DK 171440 B1 korporere thiosulfatet i form af et uorganisk salt, generelt et alkalimetalsalt, såsom natriumthiosulfat, kaliumthiosulfat eller lignende. Det foretrukne salt er natriumthiosulfat.

5 Den anvendte mængde thiosulfat er direkte afhængig af den mængde thiol, der er til stede i blandingen. Det er nødvendigt at anvende mindst et mol thiosulfat for hvert mol thiol, og såfremt der er forurenende nucleofile forbindelser til stede i reaktionsblandingen, er det 10 nødvendigt at sikre en tilstrækkelig mængde thiosulfat til at neutralisere disse forbindelser. Derfor kan og bør man generelt anvende et stort overskud af thiosulfat, f. eks. et overskud på op til omkring 10 gange i forhold til thiol-indholdet, og dette overskud kan anvendes 15 uden risiko. Det skal imidlertid bemærkes, at selv om der praktisk talt ikke er nogen øvre grænse for den mængde thiosulfat, som kan anvendes i processen, vil thiosulfatet forbruge cyanogenbromid, hvilket nødvendiggør, at CNBr er til stede i en mængde, der overstiger 20 den mængde, som kræves under normale betingelser. Der for vil man fortrinsvis kontrollere mængden af thiosulfat på en sådan måde, at man begrænser det overflødige forbrug af CNBr til et minimum.

Spaltningsreaktionen ifølge opfindelsen gennemføres 25 ved en temperatur på mellem ca. 15 °C og kogepunktet for CNBr (omkring 35 °C). Fortrinsvis gennemføres reaktionen ved en temperatur på mellem ca. 15 og ca. 30 °C, idet man især foretrækker en temperatur på mellem ca. 20 og ca. 25 °C. 1

Reaktionen gennemføres i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at fuldføre methionyl-fraspaltningen, hvilket tidsrum generelt er op til omkring 12 timer. Normalt er 6 DK 171440 B1 reaktionen forløbet til ende efter omkring 6 timer.

Når methionyl-fraspaltningen er fuldstændig, inddampes generelt til næsten tørhed under reduceret tryk og ved en temperatur på omkring 25 °C. Inddampningsresten opløses 5 i vand, til omkring 2 gange den oprindelige koncentration, hvorefter opløsningen lyofiliseres. Sulfitolysen af det-rå lyofiliserede faste stof gennemføres generelt med 50 g produkt pr. liter 7 M urinstof i nærværelse af 0,1 M natriumsulfit, 1 mM cystein og 0,1 M ethylendi-10 amin ved pH 8,5 og 22 °C i 8 timer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særdeles fordelagtig til at begrænse irreversible sidereaktioner til et minimum og til at frembringe peptid-mellemprodukter, der er særligt egnede til let og bekvem omdannelse af 15 sulfitolyseprodukter, som derefter kan anvendes til fremstilling af det ønskede disulfid-slutprodukt.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende ikke-begrænsende eksempler.

EKSEMPEL 1 20 Fremstilling af insulin A-kæde spaltet fra et sammensat gen-produkt

Til 500 mg lyofiliseret fast A-kæde-holdigt fermenteringsprodukt sattes 10 ml 67,5% (v/v) myresyre. Efter 15 minutters omrøring tilsattes 15 mg (3 vægt-% af det rå 25 fermenteringsprodukt) natriumthiosulfat-pentahydrat.

Efter solubilisering af natriumthiosulfatet tilsattes cyanogenbromid til en koncentration på 0,05 M (53 mg). Reaktionen var fuldstændig efter 12 timer ved 22 °C.

Produktet blev inddampet i vakuum, solubiliseret til to 30 gange den oprindelige koncentration i vand og derefter lyofiliseret.

7 DK 171440 B1 EKSEMPEL 2

Fremstilling af insulin B-kaede spaltet fra et sammensat gen-produkt

Til 900 mg lyofiliseret fast B-kæde-holdigt fermenterings-5 produkt sattes 10 ml 67,5% (v/v) myresyre. Efter 15 minutters omrøring tilsattes 27 mg (3 vægt-% af det rå fermenteringsprodukt) natriumthiosulfat-pentahydrat.

Efter solubilisering af natriumthiosulfatet tilsattes cyonogenbromid til en koncentration på 0,10 M {106 mg).

10 Reaktionen var fuldstændig efter 12 timer ved 22 °C.

Produktet blev inddampet i vakuum, solubiliseret til to gange den oprindelige koncentration i vand og derefter lyofiliseret.

EKSEMPEL 3 15 Fremstilling af proinsulin spaltet fra et sammensat gen-produkt

Til 1 g lyofiliseret fast proinsulin-holdigt fermenteringsprodukt sattes 10 ml 67,5% (v/v) myresyre. Efter 15 minutters omrøring tilsattes 30 mg (3 vægt-% af det 20 rå fermenteringsprodukt) natriumsthiosulfat-pentahydrat.

Efter solubilisering af natriumthiosulfat tilsattes cyanogenbromid til en koncentration på 0,10 M (106 mg). Reaktionen var fuldstændig efter 12 timer ved 22 °C.

Produktet blev inddampet i vakuum, solubiliseret til 25 to gange den oprindelige koncentration i vand og derefter lyofiliseret.

EKSEMPEL 4

Sulfitolyse af spaltede sammensatte gen-produkter I spaltede sammensatte gen-produkter opnået i eksempler- 8 DK 171440 B1 ne 3 blev underkastet sulfitolyse, idet man anvendte den følgende procedure:

Til 500 mg CNBr-spaltet fast fermenteringsprodukt opløst i 10 ml 0,1 M ethyldiamin/7 M deioniseret urinstof ved 5 pH 8,5 sattes natriumsulfat til en koncentration på 0,1 M og cystein til en koncentration på 1 mM. Efter at bestanddelene var gået i opløsning, var reaktionen fuldstændig efter 8 timers forløb ved 22 °C.

Sulfitolysen af produkterne opnået i de ovenfor angivne 10 eksempler 1-3 blev sammenlignet med sulfitolyse af et produkt opnået ved CNBr-spaltning gennemført i fravær af natriumthiosulfat. Som det fremgår af den efterfølgende tabel, bevirker tilstedeværelsen af natriumthiosulfat under CNBr-spaltningen en væsentlig forøgelse af den 15 mængde produkt, der er til rådighed til sulfitolysen, og af mængden af sulfitolyseret produkt pr. enhed af det faste materiale.

9 DK 171440 B1

TABEL

Sulfitolyse- Na^SO^ ved Na2S40g Produktudbytte (mg/g) udgangsmate- spaltning ved sulfi- ved fastlagt reaktions- riale_ _ tolyse tid, timer_ 2 6 24

Insulin A-kæde nej nej 1,8 5,0

Insulin A-kæde ja nej 7,1 6,8

Insulin A-kæde nej ja 6,5 ---

Insulin B-kæde nej nej 8,4 9,6 —

Insulin B-kæde ja nej 11,5 12,4

Insulin B-kæde nej ja 9,4 ---

Proinsulin nej nej 0,8 3,0 4,1

Proinsulin ja nej 7,8 9,4 9,1

Proinsulin nej ja 5,4 ---

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til inhibering af uønskede thiol-reak-tioner hos thiol-holdige peptider under fraspaltning af methionylgrupper fra sådanne peptider ved anvendelse 5 af CNBr, kendetegnet ved, at man gennemfø rer fraspaltningen i nærværelse af thiosulfationer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at thiolsulfationerne inkorporeres i reaktionsblandingen i form af et alkalimetalsalt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at alkalimetalsaltet er natriumthiosulfat.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at thiosulfationerne sættes til reaktionsblandingen i en mængde, som er tilstrækkelig til 15 at udgøre mindst et mol thiosulfat for hvert mol thiol.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 4, kendetegnet ved, at methionyl-fraspaltningen gennemføres i nærværelse af et vandigt surt opløsningsmiddel.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet 20 ved, at syren i det vandige sure opløsningsmiddel er myresyre.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at blandingen af myresyre og vand indeholder 67,5 volumen-% myresyre. 1

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at spaltningsreaktionen gennemføres ved en tempe- DK 171440 B1 ratur mellem ca. 15 og ca. 35 °C.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at temperaturen er mellem ca. 20 og ca. 25 °C.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at man sætter CNBr til reaktionsblandingen i en mængde, der er tilstrækkelig til at repræsentere mindst ét mol CNBr pr. mol methionylgrupper og pr. mol thiosul-fat.