DK1735343T3

DK1735343T3 - Fremgangsmåde til udvinding af insuliner ved hjælp af forbedret luftgasning af foldningen

Info

Publication number: DK1735343T3
Application number: DK05716149.9T
Authority: DK
Inventors: Franz-Josef Rubroeder; Reinhold Keller; Heike Herbert
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2015-02-02
Also published as: JP5743370B2; ES2527693T3; EP1735343B1; WO2005097827A1; DE102004015965A1; EP1735343A1; PL1735343T3; US7659363B2; PT1735343E; SI1735343T1; US20070106063A1; CY1115923T1; JP2008502594A

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af insuliner eller af et insulinderivat med korrekt forbundne cysteinbroer af et forstadium til insulinen eller til insulinderivatet, idet forstadiet i nærvær af cystein eller cysteinhydrochlorid og af et chaotropt hjælpestof underkastes en foldningsproces, hvorefter der af forstadiet ved hjælp af enzymatisk spaltning med trypsin eller et trypsinlignende enzym og i givet fald endvidere ved hjælp af carboxypeptidase B og efterfølgende oprensning på en adsorberharpiks udvindes en insulin eller et insulinderivat med korrekt forbundne cysteinbroer, kendetegnet ved, at man til udførelse af foldningsprocessen efter hinanden gennemfører følgende trin: (a) sammenblanding af en vandig suspension af forstadiet til insuliner eller insulinderivater med en mængde cystein eller cysteinhydrochlorid, som giver 1 til 15 SH-grupper af cysteinet eller cysteinhydrochloriden pr. cysteingruppe i forstadiet, (b) indføring af den cystein- eller cysteinhydrochloridholdige suspension af forstadiet i en 4 til 9 molær opløsning af det chaotrope hjælpestof ved en pH-værdi på 8 til 11,5 og en temperatur på cirka 15 til 55 °C, idet den opnåede blanding holdes på denne temperatur i ca. 10 til 60 minutter, og (c) indføring af blandingen ved en pH-værdi på 8 til 11,5 og en temperatur på 5 til 30 °C i en mængde vand, som giver en fortynding af koncentrationen af cysteinet eller af cysteinhydrochloriden i blandingen på ca. 1 til 5 mM og af det chaotrope hjælpestof på 0,2 til 1,0 M, idet blandingen i trin (c) gasses i en beholder, således at oxygenkoncentrationen i suspensionen er 1 til 15 mg/1.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, idet forholdet mellem volumenet og overfladen på blandingen i trin (c) er større end 1.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, idet forholdet mellem volumenet og overfladen på blandingen er større end 2.

4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 3, idet oxygenkoncentrationen i blandingen er 2 til 10 mg/1.

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at mængden af cystein eller cysteinhydrochlorid i trin (a) svarer til en mængde, som giver 1 til 6 SH-grupper af cysteinet eller cysteinhydrochloriden pr. cysteingruppe af forstadiet, at indføringen af den cystein- eller cysteinhydrochloridholdige suspension af forstadiet i trin (b) i en 4 til 9 molær opløsning af det chaotrope hjælpestof sker ved en pH-værdi på 8 til 11 og en temperatur på 30 til 45 °C, at den opnåede blanding holdes på denne temperatur i 20 til 40 minutter, og indføringen af blandingen i trin (c) sker ved en pH-værdi på 8 til 11 og ved en temperatur på 15 til 20 °C i en mængde vand, som giver en fortynding af koncentrationen af cysteinet eller af cysteinhydrochloriden i blandingen på cirka 1 til 5 mM og en koncentration af det chaotrope hjælpestof på 0,2 til 1,0 M.

6. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at det chaotrope hjælpestof er guanidin, guanidinhydrochlorid eller carbamid.

7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at koncentrationen af det chaotrope hjælpestof i trin (b) er 7,0 til 9 M.

8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 7, kendetegnet ved, at temperaturen i trin (b) er 40 °C.

9. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 8, kendetegnet ved, at pH-værdien i trin (b) er 10 til 11.

10. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 9, kendetegnet ved, at pH-værdien i trin (c) er 10 til 11.

11. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at mængden af vand i trin (c) giver en fortynding af koncentrationen af cysteinet eller cysteinhydrochloriden i blandingen på 2,5 til 3,0 mM og en koncentration af det chaotrope hjælpestof på 0,5 M.

12. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 11, kendetegnet ved, at koncentrationen af det chaotrope hjælpestof i trin (b) udgør cirka 8 M, temperaturen i trin (b) er cirka 40 °C, pH-værdien i trin (b) er cirka 10,2, pH-værdien i trin (c) er cirka 10,6, og at mængden af vand i trin (c) giver en fortynding af koncentrationen af cysteinet eller cysteinhydrochloriden i blandingen på cirka 2,5 til 3,0 mM og en koncentration af det chaotrope hjælpestof på 0,5 M.

13. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1 til 12, kendetegnet ved, at forstadiet til insulinerne eller insulinderivaterne har sekvensen ifølge den almene formel II i^-R1- (B2-B29) -Y-X-Gly- (A2-A20) -R3 (II) , hvor R2 betegner a) et hydrogenatom, b) betegner en aminosyregruppe af gruppen lysin (Lys) eller arginin (Arg) eller c) et peptid med 2 til 45 aminosyregrupper indeholdende aminosyregruppen lysin (Lys) eller arginin (Arg) på carboxylenden af peptidet, R1 betegner en phenylalaningruppe (Phe) eller en kovalent binding, (B2-B29) betegner aminosyregrupperne i positionerne B2 til B29 i B-kæden i human insulin, animalsk insulin eller et i givet fald i en eller flere positioner varieret insulinderivat, Y betegner en genetisk kodbar aminosyregruppe, X a) betegner en aminosyregruppe fra gruppen histin (His), lysin (Lys) eller arginin (Arg), eller b) et peptid med 2 til 35 aminosyregrupper indeholdende aminosyregruppen lysin (Lys) eller arginin (Arg) på den N-terminale ende og på carboxylenden på peptidet eller c) et peptid med 2 til 35 genetisk kodbare aminosyrer indeholdende 1 til 5 histidingrupper, (A2-A20) betegner aminosyregrupperne i positionerne A2 til A20 i B-kæden i human insulin, animalsk insulin eller et i givet fald i en eller flere af disse positioner varieret insulinderivat, og R3 betegner en genetisk kodbar aminosyregruppe.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at R2 i formel II betegner a) et hydrogenatom eller b) et peptid med 2 til 25 aminosyregrupper indeholdende aminosyregruppen arginin (Arg) på peptidets carboxylende, R1 betegner en phenylalaningruppe (Phe), (B2-B29) betegner aminosyregrupperne i positionerne B2 til B29 i B-kæden i human insulin, Y betegner en aminosyregruppe af gruppen alanin (Ala), threonin (Thr) eller serin (Ser), X betegner aminosyregruppen arginin (Arg) eller et peptid med aminosyresekvensen i C-kæden i human insulin, (A2-A20) betegner aminosyregrupperne i positionerne A2 til A20 i B-kæden i human insulin, og R3 betegner en aminosyregruppe af gruppen asparagin (Asn), serin (Ser) eller glycin (Gly).

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at R2 i formel II betegner a) et hydrogenatom eller b) et peptid med 2 til 15 aminosyregrupper, på hvis carboxylende der befinder sig en arginingruppe (Arg), R1 betegner en phenylalaningruppe (Phe), (B2-B29) betegner aminosyregrupperne i positionerne B2 til B29 1 B-kæden i human insulin, Y betegner en threoningruppe (Thr) , X betegner aminosyregruppen arginin (Arg) eller et peptid med 2 til 35 aminosyregrupper, idet der i starten og enden af peptidet står to basiske aminosyregrupper, navnlig arginin (Arg) og/eller lysin (Lys), (A2-A20) betegner aminosyregrupperne i positionerne A2 til A20 i B-kæden i human insulin, og R3 betegner aminosyregruppen asparagin (Asn) eller glycin (Gly).