DK172712B1 - Fremgangsmåde til udvinding af insulin-forløbere fra reaktionsblandinger, der fremkommer ved foldning af insulin-forløbere - Google Patents

Description

i DK 172712 B1 o

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af insulin-forløbere ved den nedenfor angivne formel I ud fra reaktionsblandinger, der fremkommer ved foldning af insulin-forløbere ud fra S-sulfonater med formlen II, hvilken 5 fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Der kendes en fremgangsmåde til fremstilling af en insulin-forløber med formlen I

10 JA-1) Qy-NH--I!

(A-6) Cys-S-S

| | (A-20) (A—21)

(A—7) Cys---Cys------- Cys —Asn-OH

I f (I) S s

15 | J

S s (B-1) | j

R-HN—Phe---Cys---------- Cys--------Y

(B-7) (B—19) 20 hvori R betyder hydrogen, en kemisk eller enzymatisk fraspaltelig aminosyregruppe eller en kemisk eller enzymatisk fraspaltelig peptidgruppe med mindst to aminosyregrupper, Y betyder r B29 -B30 25 - Lys — Z — hvori Z betyder Ala, Thr eller Ser, idet broen, der strækker sig fra A-l til A-21, er en insulin-A-kæde, broen, der strækker sig fra B-1 til B-30, er en insulin-B-kæde, og X er en 30 bro, der er bundet til aminogruppen i A-l i insulin-A-kæden og til carboxylgruppen i B-30 i insulin-B-kæden, hvor denne bro kan spaltes enzymatisk eller kemisk uden ødelæggelse af A-kæden og B-kæden.

Ved denne fremgangsmåde omsætter man et S-sulfo-

35 nat med formlen II

O

DK 172712 B1 2 {A-t) Giy-KH — --------— :: i (Λ—6) CyS — S—SOj- S-S03" I I ^201 <A-21> (II)

5 j (A—11) I

s-so3- s-so3- s-so3- s-so,-

(B-1) I I

R-HN-Ph·---Cys---------------Cys--------Y

(B-7) (B—19) 10 hvori R, X og Y har den ovenfor angivne betydning, i et vandigt medium ved en pH-vardi på 7-11,5 og ved en S-sulfonat-koncentration på indtil 10 mg pr. ml af det vandige medium 15 med en mængde af et mercaptan, der giver 1-5 SH-grupper pr. enhed SSO^” (jfr. EP-patentskrift nr. 37 255 svarende til japansk offentliggørelsesskrift nr. 81-150051 og US-patent-skrift nr. 4 430 266). Foldningsudbyttet er ved denne fremgangsmåde afhængigt af flere parametre, såsom pH-værdi, 20 forholdet mellem SSO-j og SH, koncentrationen, arten af mercaptanet, temperaturen og reaktionstiden. Under praxis-nære betingelser kan fremgangsmådem optimeres til et foldningsudbytte på ca. 60%.

Med andre ord er der herved tale om fremstilling af 25 en insulinforløber ved foldning under dannelse af den native rumstruktur med tre disulfidbroer, ud fra hvilken det frie-insulin derefter kan fremstilles ved efterfølgende omdannelse med proteaser. Ved omsætningen med proteaserne spaltes de som biprodukter dannede, forkert forbundne insulinforlø-30 bere i brudstykker, der ved hjælp af den samme fremgangsmåde ikke mere kan oparbejdes til de ønskede insulinforløbere.

Ved begrebet insulinforløbere forstås der herved både pro-insuliner og præ-proinsuliner, hvor forstavelsen "præ" refererer til en eller flere yderligere aminosyrer ved N-35 -terminussen i proinsulinet, og hvorved proinsulindelen selv fortrinsvis udviser sekvensen af humant insulin eller abe-

O

DK 172712 B1 3 insulin. Principielt er naturligvis også andre proinsuliner mulige, f.eks. fra svin, kvæg og får, der kan isoleres fra pankreas, eller sådanne med syntetiske sekvenser, der indeholder humaninsulinsekvensen og kan fremstilles ved gentek-5 nologiske metoder eller, når der er tale om svineinsulin, kan oparbejdes semisyntetisk til humant insulin.

Som bekendt er ikke alle disulfidbroer i insulin lige reaktive, idet der ved mild reduktion af disulfidet først sker en åbning af disulfidbroen mellem cysteinerne 10 A7 og B7, før den anden disulfidbro mellem cysteinerne B19 og A20 åbnes. Den foretrukne reduktion af A7-B7-disulfidbroen er ved egne undersøgelser også observeret ved reaktion af insulin-forløber-S-sulfonat med et ringe overskud af mercaptan .

15 Den videre oparbejdning af den foldede insulin-for løber sker ifølge litteraturen ved hjælp af chroma tografiske metoder, f.eks. ved afsaltning ved hjælp af gelchromatografi, f.eks. på "Sephadex G25", efterfulgt af gelchromatografi på "Sephadex G50 superfine", hvorved der i det andet trin sker 20 en adskillelse af "aggregerede former" af native insulin--forløbere,

Det har nu overraskende vist sig, at de ved foldningen af insulin-forløbere ud fra de tilsvarende S-sulfonater fremkomne falske rekombinater, hvis andel sædvanligvis udgør 25 30-50% af den anvendte mængde, kan udfældes direkte fra fold ningsmediet ved en pH-værdi på 4-6, hvorimod den native form af insulinforløbere forbliver næsten fuldstændigt i opløsning. Dette gælder både, når der til foldningen anvendes ca.

2 ækvivalenter -SH pr. S-sulfonatgruppe, og når der anvendes 30 en noget større mængde mercaptan, hvilket under videregående reduktion fører til cysteingrupper og dermed til dannelse af sådanne insulin-forløbere, der kun delvis indeholder disul-fidbroer. Bundfaldet fraskilles derefter på gængs måde, f.eks. ved centrifugering, og omdannes ved sulfitolyse til S-sulfo-35 natet med formlen II. Dette underkastes derefter på ny en foldning.

O

DK 172712 B1 4 I de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med formlen I betyder R hydrogen eller en kemisk eller enzymatisk fraspaltelig aminosyregruppe eller en kemisk eller enzymatisk fraspaltelig peptidgruppe med mindst to amino-5 syregrupper med formlen P -Q -m n I denne formel er P en sekvens af naturligt forekomne amino-10 syrer, hvor m er 0-50, og Q betyder basiske naturlige aminosyrer, især arginin eller lysin, og n er 1-4. Pm kan især være en delsekvens af β-galactosidase, hvor det tilsvarende fragment Pm""Kan være direkte eksprimeret eller først være kommet tilveje ved bromcyanspaltning. Y betyder 15 τ B29 „B30 hvori Z betyder Ala, Thr eller Ser, broen, der strækker sig fra A-l til A-21, er en insulin-A-kæde, broen, der strækker 20 sig fra B-l til B-30, er en insulin-B-kæde, og X er en bro, der er bundet til aminogruppen af A-l i insulin-A-kæden og til t-aminogruppen af B-29 (i hvilket tilfælde der er bun-det OH til den frie binding af Z ) eller til carboxyl-gruppen af B-30 i insulin-B-kæden.

25 Den her omhandlede fremgangsmåde gør det muligt at forøge det samlede foldningsudbytte ved, at andelen af falske rekombinenter ikke mere går tabt, men ved en simpel fremgangsmåde oparbejdes til den ønskede insulin-forløber.

Som det endvidere har vist sig, kan adsorptionen 30 af nativt foldede insulin-forløbere til de falske rekombi-nanter ifølge en foretrukken udføreIsesform overraskende forhindres ved, at der til mediet før udfældningen sættes en lille mængde af et fysiologisk acceptabelt, overfladeaktivt stof. Egnet er f.eks. polymerisater, dvs. homopoly-35

merisater, blandingspolymerisater eller blokpolymerisater med formlen III

O

5 DK 172712 B1 R2-O-X -R3 (III) n hvori Xn betyder en kæde af n led med formlen IV 5 -CH(R1)-CH(R1)-0- (IV) i vilkårlig rækkefølge, n betyder 2 til 80, fortrinsvis 15 til 45, og R3- betyder hydrogen, methyl eller ethyl, idet 1 2 3

grupperne R kan være ens eller forskellige, og R og R

10 uafhængigt af hinanden betyder hydrogen eller en organisk gruppe, dog med det forbehold, at forbindelserne III indehol- 2 3 der mindst 12 carbonatomer. R og R kan f.eks. betyde alkyl med 1-20 carbonatomer, carboxyalkyl med 2-20 carbonatomer eller alkylphenyl med 1-10 alkyl-carbonatomer. Eksem-15 pier på grupperne R og R er methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy eller grupper, der er afledt af lauryl-, myristyl- eller cetylalkohol; carboxylalkylgrupper, der er afledt af eddikesyre, propionsyre, smørsyre, palmitinsyre eller stearinsyre, nonylphenoxy, oleylamino eller stearylamino.

2 3 20 R eller R kan også være afledt en polyvalent alkohol, såsom glycerol eller pentaerythritol, eller en polyvalent carboxylsyre, såsom citronsyre, Polyfunktionel-2 3 le led R eller R kan være forbundet med to eller flere polyalkoxykæder af den ovenfor anførte art, hvorved der op-25 står forgrenede produkter.

De ovennævnte overfladeaktive stoffer, der i almindelighed tilsættes i en mængde på 1-400, fortrinsvis 2-200 mg/liter, kan fremstilles på gængs måde ved kontrolleret addition af alkylenoxider til alkylenpolyglycoler. De ende-30 stillede hydroxylfunktioner kan derefter eventuelt forestres eller forethres.

Som overfladeaktive stoffer kan der endvidere anvendes phospholider med formlen V

35

O

DK 172712 B1 6 H-CH-OR4

CH-OR5 Λ V

• 6

H-CH-O-P - OR

NOH

4 5 5 hvori R og R , der kan være ens eller forskellige, betyder alkylcarbonyl, alkenylcarbonyl, alkandienylcarbonyl, alkan- trienylcarbonyl med hver 8-22 carbonatomer, fortrinsvis 12-22 4 5 carbonatomer, eller hydrogen, med det forbehold, at R og R ikke samtidig betyder hydrogen, og hvori R6 betyder en hydro-10 fil gruppe. Koncentrationen af disse forbindelser er i almindelighed 1-20, fortrinsvis 1-10, især 2,5 - 7,5 vægtprocent. Eksempler på sådanne hydrofile grupper er 2-(trimethyl- ammonium)-ethyl, 2-aminoethyl, 2-carboxyl-2-aminoethyl, 2,3--dihydroxypropyl eller 2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl. Der 10 foretrækkes forbindelser, hvori R og R hver især er alkyl-carbon. Der foretrækkes endvidere forbindelser, hvori R® betyder 2-(trimethylammonium)-ethyl, idet sådanne forbindelser er kendt som lecithiner og sådanne forbindelser, hvori R og R^ hver især betyder alkylcarbonyl med ca, 8-16 carbonatomer 20 eller med ca. 12-16 carbonatomer, og hvori R6 betyder 2-(tri-methylammonium)-ethyl, især sådanne forbindelser, hvori R og hver især betyder octanoyl.

På tale som overfladeaktive stoffer kommer endvidere forbindelser med formlen VI 25

R1-[-0-CH--CH0-0] -Η VI

£ z p hvori R betyder en mættet eller olefinisk umættet carbon-hydridgruppe med 8-15 carbonatomer, og p betyder et helt 30 tal på 2-25. Disse forbindelser tilsættes i almindelighed 7 i en mængde på 0,2-200 mg/liter. R betyder fortrinsvis alkyl med 12 eller 13 carbonatomer, og p betyder fortrinsvis 4-23, især 6-15.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde anvender man 35 i almindelighed de foldningsbetingelser, der er beskrevet i EP-patentskrift nr. 37 255. Dette betyder, at der i al-

O

DK 172712 B1 7 mindelighed arbejdes ved en temperatur på 0-37°C, med 1-5 SH-enheder pr. gruppe SS03~ i et pH-værdiområde på 7-11,5 og en S-sulfonat-insulin-forløber-koncentration på indtil 10 mg pr. ml vandigt medium. Foretrukne mercaptaner er 2-5 -mercaptoethanol, thioglycolsyre eller dennes methylester, 3-mercapto-l,2-propandiol og 3-mercaptopropionsyre eller dennes estere. Foretrukne reaktionsbetingelser er en koncentration på 0,2-1 nig/ml S-sulfonat-insulin-forløber, et pH--værdiområde på 9,5-11, en reaktionstemperatur på 2-10°C, 10 en reaktionstid på 5-20 timer og et forhold mellem SH-grup-per og SS03”-grupper på 2-3. Af praktiske grunde foretrækkes der også en vidtgående udelukkelse af oxygen, selv om denne på ingen måde er nødvendig.

pH-Værdiændringen bevirkes fordelagtigt ved tilsæt-15 ning af fortyndede uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre eller phosphorsyre, men der kan også anvendes organiske syrer, der ikke reagerer med insulin-forløberne, såsom eddikesyre, eller sure salte, såsom phosphater.

Det ved pH-værdiændringen fremkomne bundfald kan 20 let fracentrifugeres. Det omdannes vidtgående igen til S--sulfonatformen ved direkte sulfitolyse, f.eks. som beskrevet af Swan, Nature 180, 643-645 (1957). Denne kan derefter eventuelt renses ved chromatografiske metoder og derefter, f.eks. på den ovenfor angivne måde, fordelagtigt i 25 nærværelse af en lille mængde af et fysiologisk acceptabelt, overfladeaktivt stof af den nævnte art, omdannes til de foldede insulin-forløbere. De kan imidlertid også oparbejdes ifølge en yderligere udførelsesform, nemlig ved, at der til partielt forbundne insulin-forløbere, der er fremstillet 30 med et ringe overskud af mercaptan, sættes et overfladeaktivt stof af den ovenfor nævnte art og bobles oxygen, f.eks. luft, gennem opløsningen og på denne måde fremkaldes oxidation.

Det overfladeaktive stof forhindrer.derved denaturering af insulin-forløberen, f.eks. ved gasbobler.

35 Ved den her omhandlede fremgangsmåde er det altså muligt at forøge foldningsudbyttet, inklusive genvinding af falske rekombinater, til 80 eller endog 90%.

O

8 DK 172712 B1

Eksempler 1. Fremstilling af humant præproinsulin udfra præ-proinsulin-S-sulfonat.

5 1,2 g præproinsulin-S-sulfonat med præsekvensen R = Gly-Asn-Ser-Ala-Arg- og sekvensen af humant proinsulin opløses i 2,5 liter 50 mM afgasset glycinpuffer med en pH--værdi på 10,6 og omrøres forsigtigt natten over ved 4°C med 147 ^il roercaptoethanol. Ifølge analyse ved højtrykvæske-10 chromatografi (HPLC) er foldningsudbyttet i mediet 0,32 mg/-ml (67%), og det bestemmes ved fingeraftryksanalyse med Staphylococcus aureus protease V8, at A7-B7-disulfidbrom foreligger i en andel på 65% og B19-A20-disulfidbroen foreligger i en andel på 93%. Fingeraftryksanalysen gennem-15 føres på følgende måde:

Til 200 jil af en opløsning af 0,5 mg/ml af insulin-forløberen i 50 mM tris-(hydroxymethyl)-methyl-amrooni-umchlorid (tris) med en pH-værdi på 7,5 sættes 0,1 enheder Staphylococcus aureus-protease V8, og opløsningen inkube-20 res i 30 minutter ved 37°C. En portion af opløsningen analyseres derefter direkte ved HPLC. HPLC-analysen gennemføres på en C18-reversfase med en lineær gradient af 20-45% B. Som puffer A anvendes 0,05 M tetraethylammoniumphosphat, 0,25 M natrlumperchlorat og 10% acetonitril i den samlede 25 fase (pH-værdi 3). Som puffer B anvendes 0,05 M tetraammo-nlumphosphat med 90% acetonitril i den samlede fase (pH--værdi 3). Ud fra forholdet mellem de optrædende fragmenttoppe ved ca. 7, 10 og 14 minutter og på baggrund af en standard af humant proinsulin bestemmes de ovennævnte vær-30 dier på 65 og 93%.

Opløsningen indstilles til en pH-værdi på 9, og der tilsættes 25 ml grænsefladeaktivt polyethylen-polypro-pylenglycol. Derefter lader man ca. 50 liter oxygen perle gennem opløsningen i løbet af 1 time under omrøring ved 35 4°C.

O

DK 172712 B1 9

Opløsningen Indstilles med 1 N saltsyre til en pH--værdi på 4,5, hvorved der dannes en uklarhed, som fracentrifugeres. Bundfaldet vaskes med acetone og diethylether eller methyl-tert.butylether og tørres. Det har en vægt på 5 520 mg. Fra den klare ovenstående væske udfældes det native præproinsulin ved tilsætning af 250 g natriumchlorid ved en pH-værdi på 3. Udbytte: 720 mg (60%) .

Det ved en pH-værdi på 5,4 udfældede bundfald eul-fitolyseres i 100 ml 7 M urinstofopløsning med 800 mg natri-10 umsulfit og 600 mg natriumtetrathionat ved en pH-værdi på 7,6 og 4°C, og reaktionsproduktet udfældes ved dialyse mod vandig puffer (pH-værdi 3). Det tørrede bundfald vejer 540 mg, idet andelen af genvundet præproinsulin-S-sulfonat er 382 mg.

Dette reduceres med 40 ^il mercaptoethanol som ovenfor angi-15 vet, hvorved der dannes yderligere 226 mg nativt præproinsulin (individuelt udbytte i dette trin 59%) , således at det samlede foldningsudbytte er 946 mg, svarende til 78,8%.

Ved en anden, analog gentagelse udvindes der fra de ved den første gentagelse fremkomne 144 mg ved fældning ved en pH-20 -værdi på 5,4 yderligere 78 mg (individuelt udbytte i det tredje trin 54%) nativt præproinsulin. Det samlede udbytte af nativt præproinsulin er nu 1,024 g, svarende til 85,3%.

2) Tilbagefoldning af proinsulin fra svin.

25 0,4 g svine-proinsulin-S-sulfonat opløses i 800 ml 50 mM glycinpuffer med en temperatur på ca. 4°C og en pH-værdi på 10,5, opløsningen afgasses, og der tilsættes 49,1 mg thioglycolsyre. Opløsningen omrøres forsigtigt natten over ved 4°C. Opløsningen indstilles derefter med 4 N salt- 30 syre til en pH-værdi på 5,2, hvorved der udfælder et bundfald. Dette fracentrifugeres, vaskes med acetone og dialkyl-ether og tørres. Bundfaldet vejer 115 mg. Den klare ovenstående væske indeholder ifølge HPLC 239 mg (udbytte 60%) proinsulin.

35 DK 172712 B1 o 10

Bundfaldet sulfitolyseres som beskrevet i eksempel 1, hvorved der fremkommer 120 mg, hvoraf der ved den ovennævnte behandling udvindes 88 mg proinsulin-S-sulfonat. Dette tilbagefoldes med 12,3 mg thioglycolsyre analogt med det 5 første trin. Ved en pH-værdi på 5,2 dannes der en svag uklarhed, der efter centrifugering giver yderligere 43 mg tørt materiale.

Den ved centrifugeringen fremkomne ovenstående væske, der indeholder 55 mg proinsulin (62% udbytte svarende 10 til 73,5% kumulativt udbytte), forenes med den ved en pH-vær-di på 5,2 fremkomne ovenstående væske fra det første trin (1,0 liter). Der tilsættes 6 g tris, indstilles til en pH--værdi på 7,2 og tilsættes 0,6 enheder trypsin og 6 enheder carboxypeptidase B. Opløsningen omrøres forsigtigt ved 25°C, 15 og forløbet af reaktionen følges ved HPLC. Efter ca. 3-4 timer er pro-insulinet fuldstændigt forsvundet, og der er i stedet for dette dannet C-peptid og svineinsulin.

Reaktionen standses ved tilsætning af 40 ml 1%'s zinkchloridopløsning og indstilling til en pH-værdi på 5,4.

20 Der fremkommer et fnugagtigt, let centrifugerbart bundfald, der vidtgående består af svineinsulin. Udbytte: 201 mg (91%, beregnet på anvendelse tilbagefoldet proinsulin). Højrensningen af det således isolerede svineinsulin sker ved gængse metoder, f.eks. på en ionbytter.

25 30 35

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af insulin-forløbere med formlen I (A-1) Oly -NH....... ---- !: 5 - ! (A-«i Cy*-5-S I I (A-20) (A-21) (A-7) Cy*---Cys--------- Cyt — A»n-OH I ' <*-"> ί (1) S s I I

10. S· (B-11 I I R-HN-Phe---Cyt---------------Cy*--------Y (B-7) (B—19) hvori R betyder hydrogen eller præsekvensen

15 P -Q - 'J m n hvori P betyder en sekvens af naturligt forekommende aminosyrer, m betyder 0-50, Q betyder basiske naturlige aminosyrer, og n betyder et helt tal på 1-4, y betyder 20 - LysB29 - ZB3° - hvori Z betyder Ala, Thr eller Ser, og kæden, der strækker sig fra A-l til A-21, er en insulin-A-kæde, kæden, der 25 strækker sig fra B-l til B-30, er en insulin-B-kæde, og X er en bro, der er bundet til aminogruppen af A-l i insu- lin-A-kæden og til % -aminogruppen af B-29 (i hvilket til- B30 fælde der er bundet OH til den frie binding af Z ) eller til carboxylgruppen af B-30 i insulin-B-kæden, ud fra reak-30 tionsblandinger, der fremkommer ved foldning af insulin--forløbere ud fra S-sulfonater med formlen II 35

12 DK 172712 B1 o (A-1) Gly —NH ----- —:: (A-6J Cys-S-SOg- S-SOg- I I <*-*" (II) K (A—7) Cy* —----Cy*-----Cys —Asn-OH 5 | (A-m I S-SOg" S-S&j- *-S03- f-SOg- tfr-1) 1 I R-HN-Ph· Cy*---------------Cy$--------Y

10 IB-7) iB—19) hvori R, X og Y har den ovenfor angivne betydning, kendetegnet ved, at de i reaktionsblandingen indeholdte, falske rekombinanter fsides ved indstilling af reak-15 tionsblandingen til en pH-vsrdi på 4-6, bundfaldet fraskilles på gængs måde og omdannes til S-sulfonatet med formlen II ved sulfitolyse, og dette derefter på ny underkastes foldning.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende t e g -20 net ved, at reaktionsblandingen ved udfældningen af bundfaldet indeholder en lille mængde af et fysiologisk acceptabelt, overfladeaktivt stof.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegne t ved, at det overfladeaktive stof er et polymerisat 25 med formlen III R2-0-Xn-R3 III hvori Xn betyder en kæde af n led med formlen IV 30 -CH(R1)-CH{R1)-0- IV n betyder 2-80, fortrinsvis 15-45, oq R1 betyder hydrogen, 2 3 methyl eller ethyl, og R og R uafhængigt af hinanden be-35 tyder hydrogen eller en organisk gruppe, dog med det forbehold, at forbindelserne med formlen III mindst indeholder O DK 172712 B1 13 12 carbonatomer.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at polymerisatet tilsættes i en mængde på 1-400, fortrinsvis 2-200 mg/liter.

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at foldningen gennemføres i nærværelse af en lille mængde af et fysiologisk acceptabelt, overfladeaktivt stof.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg- 10 net ved, at der ved foldningen anvendes et ringe overskud af mercaptan, og oxidationen gennemføres med Oxygen.

7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-6, kendetegnet ved, at foldningen gennemføres under anvendelse af et forhold mellem SH-grupper og SSO^ - 15 -grupper på 1-5 i et vandigt medium ved en pH-værdi på 7-11,5 og en S-sulfonat-insulin-forløberkoncentration på indtil 10 mg pr. ml og ved en temperatur på 0-37°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved mindst ét af de særlige træk, at reaktionen gen- 20 nemføres med 0,2-1 mg S-sulfonat-insulin-forløber- pr. ml vandigt medium, ved en pH-værdi på 9,5-11, en reaktionstemperatur på 2-10°C, en reaktionstid på 5-20 timer og ved anvendelse af et forhold mellem SH-grupper og SSO^ -grupper på 2-3 og ved vidtgående udelukkelse af oxygen.

9. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-8, kendetegnet ved, at mercaptanet er 2-mer-captoethanol, thioglycolsyre eller disses methylestere, 3-mercapto-l,2-propandiol eller 3-mercaptopropionsyre eller disses estere. 30 35