DK164918B - Lipofile muramylpeptidderivater med egenskaber til aktivering af makrofager og midler indeholdende disse muramylpeptidderivater - Google Patents

Description

i

DK 164918B

Den foreliggende opfindelse angår lipofile muramylpeptidderivater med egenskaber til at aktivere makrofager, nærmere betegnet tumoricide egenskaber. Den angår endvidere midler indeholdende disse lipofile muramylpeptidderivater, nærmere betegnet midler 5 på basis af liposomer, eller midler, der er i stand til at danne liposomer, hvori de nævnte lipofile muramylpeptidderivater er inkorporeret.

Aktivering af makrofager er en af hovedmekanismerne i immuno-modulatorers antitumorale virkning: De aktiverede makrofager 10 er i stand til at nedbryde syngenetiske tumorceller, ikke alene in vitro, men også in vivo.

Det har også vist sig, at muramylpeptiderne kan forøge makrofagers antitumorale aktivitet in vitro. Dette er ikke tilfældet in vivo, eftersom disse stoffer anvendes i saltopløsning.

15 Denne inaktivitet skyldes uden tvivl, at muramylpeptiderne langsomt trænger ind i makrofagerne, uden tvivl via pinocytose-væske, og at muramylpeptiderne hurtigt fjernes fra organismen ved hjælp af nyrerne. Det vil således opnås ved samvirke mellem disse to fænomener, at de i saltopløsning injicerede muramyl-20 peptider ikke kommer op på en tilstrækkelig koncentration i makrofagerne til at kunne aktivere dem.

Flere løsninger har været foreslået til at afhjælpe disse ulemper. Specielt er det blevet vist, at indkapsling af muramyl-peptider i liposomer bibringer makrofager en allerede in vi to opnået 25 og in vivo vigtig cytotoksisk aktivitet. Fidler og hans medarbejdere har udviklet dette fremskridt ved anvendelse af multi-lamellare liposomer sammensat af phosphatidylcholin (PC) og phosphatidylserin (PS) i forholdet 7/3 og indbefattende MDP.

De når således frem til at anvende denne immunomodulator som 30 skydeskive eller mål for cirkulerende monocyter, der differentierer sig i aktiverede makrofager under indflydelse af MDP, 2

DK 164918 B

som de indeholder i cellerne (Canc.Res. 42, 161-167 (1982)).

Liposomernes sammensætning og deres natur (multilamellare) gør det muligt at styre dem, især mod lungekredsløbets kar. Monocyterne, der er fagocyter, vandrer derpå ind i lungen, hvor 5 de differentierer sig i aktiverede makrofager: Disse aktive rede makrofager er i stand til at nedbryde svulstmetastaser med tilknytning til lungerne, såsom melanom B^- hos mus.

Anvendelsen af opløselige muramylpeptider er imidlertid behæftet med talrige ulemper. Visse liposomer (især de, hvis sam-10 mensætning begunstiger styringen mod lungekredsløbets monocy- ter, går tabt, d.v.s. at de mister det indkapslede opløste stof. Dette tab er særlig udtalt, når liposomerne PC/PS foreligger i nærværelse af serum. Dette tab forhindrer naturligvis en god bevarelse af liposomerne.

15 Denne ulempe overvindes især ved anvendelse af multilamellare liposomer. Man kan i virkeligheden antage, at de inderste interlamellare rum kan hæmme eller begrænse tabene før liposomernes fagocytose. Denne løsning medfører imidlertid et tab i målrettethedens specificitet. Anvendelsen af liposomer, der 20 er unilamellare eller sammensat af få lameller, kan frembyde fordele for styringen mod andre organer end lungerne (G.Poste og medarbejdere, Cancer Res. 42, 1412-1422 (1982)).

For at råde bod herpå har Fidler og medarbejdere ligeledes allerede anbefalet anvendelse af lipofile derivater af N-acetyl-25 muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin - (MDP) eller af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanin (MTP), såsom MTP-phosphatidyl-ethanolamin.

Det har ligeledes allerede været foreslået at konjugere MDP eller MTP med phosphatidylethanolamin eller med et stearinsyre- 3

DK 164918 B

molekyle med henblik på stimulation af makrofagers cytotoksiske aktivitet. Imidlertid foregår fremstillingen af liposomer indeholdende sådanne derivater ikke uden vanskelighed. Specielt fører dannelsen af fine lipidhinder indeholdende disse 5 muramylpeptidderivater og omdannelsen af disse fine lipidhinder til liposomer ved hjælp af klassiske metoder ikke altid til reproducerbare resultater, og liposomerne kan næppe bevares i lamgere tidsrum.

10 Endvidere er det konstateret, at visse muramylpeptidderivater,' der allerede indeholder visse lipofile grupper, kan udvise toksiske og/eller destabiliserende egenskaber over for makrofager.

Den foreliggende opfindelse tager sigte på særlig effektiv 15 afhjælpning af de ovenfor omtalte vanskeligheder, især ved tilvejebringelse af hidtil ukendte MDP-derivater, der har en betydelig evne til aktivering af makrofager, nærmere betegnet deres tumo-ricide aktivitet in vivo, især når de administreres i form af liposomer.

20

Opfindelsen tager endvidere sigte på angivelse af lipofile muramylpeptidderivater, der bl.a. kan anvendes til fremstilling af liposomer, som indeholder disse, hvilke liposomer samtidig er karakteriseret ved særlig forøgede stimulationsegenskaber over 25 for makrofager og ved en stor stabilitet, for så vidt angår mulighederne for at lagre disse liposomer (eller midler, der let kan omdannes til liposomer) og deres fravær af destabiliserende eller toksisk virkning over for makrofagerne.

30 Muramylpeptidder ivaterne ifølge opfindelsen er kendetegnet ved følgende almene formel: 35

DK 164918B

4 R14° f\mC0CK3 R, X CO-X-NH-CH-CO-R,

1 I

10 CH,

CH2-CO-A-Y

15 hvori substituenterne Ri, R2» Ril# Rl4* X» Y, A og Z har følgende betydninger: - Rj er H eller CH3, 20 - R2 er gruppen -NH2/ -OH eller -0V, hvor V er en hydrocarbon-gruppe omfattende 1-10 carbonatomer, - Ru er et hydrogenatom eller en phenylaminogruppe, 25 - R14 er et hydrogenatom eller en acylgruppe med 1-4 carbonatomer, - X er en aminoacylrest valgt blandt: alanyl, valyl, isoleu- 30 cyl, norleucyl, leucyl, seryl, threonyl, prolyl, glutaminyl, asparaginyl, methionyl, tryptophanyl, phenylalanyl, tyrosyl og glycyl, hvilken aminoacylrest kan være N-substitueret med en lavere alkylgruppe, især methyIgruppen, 35 - Y har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe 5

DK 164918B

-OCH2-CHO(R3)CH2O(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller forskellige, er alkyl- eller acylgrupper omfattende 8 - 100 car-bonatomer, 5 - Z har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe -W-B-CO-CHO(R3)CH2O(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller forskellige, er alkyl- eller acylgrupper omfattende 8 - 100 car-bonatomer, idet methylengrupperne indeholdt i glycerylgrupper-ne, R3 og R4, eventuelt er substitueret med en lavere alkyl-10 gruppe, især methylgruppen, hvorhos imidlertid i det mindste den ene af de to grupper Y og Z altid består af den tilsvarende lipofile gruppe, - W er et oxygenatom eller, når Z er den ovennævnte lipofile 15 gruppe, en NH-gruppe, - A og B er enten direkte bindinger eller brodannende arme, især grupper, der er ens eller forskellige grupper omfattende fra 1 til 3 aminoacylrester, der selv er ens eller indbyrdes 20 forskellige, eller også en gruppe -NH-(CH2)p-CO, hvor p har en værdi mellem 2 og 10, eller -NH-CH2-H2-O-, og en af glutamyl-restens methylengrupper eventuelt er substitueret med en lavere alkylgruppe, især methylgruppen.

25 Foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er karakteriseret ved følgende formel: 30 35

DK 164918 B

6

TN

(V

HO CH NHCOCH3 R-, X CO-X-NH-CH-CO-R„ 1 I 2

10 CH

CH2-CO-AtY

15 hvori substituenterne , R2» X, Y og A har følgende betydninger: - Ri er H eller CH3, 20 - R2 er gruppen -NH2 eller -OH eller gruppen OV, hvor V er en hydrocarbongruppe med 1-10 carbonatomer, - X er en aminoacylgruppe valgt blandt alanyl, valyl, isoleu-25 cyl, norleucyl, leucyl, seryl, threonyl, prolyl, glutaminyl, asparaginyl, methionyl, tryptophanyl, phenylalanyl, tyrosyl og glycyl, - Y har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe 30 -0CH2~CH0(R3)CH20(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller for skellige, er acylgrupper indeholdende fra 8 til 100 carbonatomer, - Z har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe 35

DK 164918 B

7 -W-B-CO-CHO(R3)CH2O(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller forskellige, er acylgrupper indeholdende fra 8 til 100 carbonato-mer, men med det forbehold, at mindst én af de to grupper Y og Z altid udgøres af den tilsvarende lipofile gruppe,

S

- A og B er enten direkte bindinger eller grupper, som er ens eller forskellige, og som omfatter indtil tre aminoacylgrupper, der er identiske eller indbyrdes forskellige, eller en gruppe -NH-(CEL) -CO-, hvor værdien af p ligger mellem 2 og 10. z p 10 I de foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er gruppen X en venstredrejende aminosyrerest (naturligvis, eftersom amino-acylgruppen er andet end glycyl). Særligt foretrukne grupper X er L-alanyl, L-seryl, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-15 threonyl og glycyl. Fortrinsvis udgøres endvidere af en alkyloxygruppe.

Grupperne A og B udgøres fordelagtigt af direkte bindinger, i hvilket tilfælde gruppen Y er direkte bundet til glutamyl-20 gruppens gamma-carboxyl, og i hvilket tilfælde gruppen Z er direkte bundet til oxygenatomet i saccharidgruppens 6-stilling.

A og B kan endvidere være en eller flere aminoacylgrupper med de for X anførte betydninger, fortrinsvis L-alanyl og/eller L-lysyl.

25

Det fremgår af det foregående, at man kan benytte alle de mulige kombinationer, der anvender en eller flere af de nævnte foretrukne grupper, idet disse grupper uafhængigt at hinanden kan kombineres med grundstrukturen af muramylpeptidet, modificeret ved 30 hjælp af den gruppe, der bærer de to lipofile kæder.

En gruppe forbindelser er imidlertid særligt foretrukne. Der er 35 8

DK 164918 B

tale om de'forbindelser, hvori: - gruppen Z udgøres af den tilsvarende lipofile gruppe, såsom den i det foregående definerede, og hvori R2 er en alkyloxy-gruppe omfattende 1-10 carbonatomer, især 4 carbonatomer, 5 især n-butyloxygruppen, - A og'B er direkte bindinger, og - Y er en NH2~gruppe,

Denne sidstnævnte type forbindelser er især bemærkelsesværdige i den henseende, at de praktisk taget fuldstændigt er befriet 10 for pyrogenicitet.

Særligt foretrukne lipofile grupper R3 og R4 udgøres af palmito-ylgrupper.

Opfindelsen angår især liposomholdige midler eller midler, der let kan omdannes til liposomer, hvilke midler indeholder en el-15 ler flere forbindelser ifølge opfindelsen. Inkorporeringen af forbindelser ifølge opfindelsen i liposomer fører til en betydelig forstærkelse af deres stimulerende virkning over for makrofager.

Det skal bemærkes, at tilstedeværelsen af de to lipofile grupper 20 på de to nabostillede carbonatomer i glycerylgruppen medvirker til forankringen af myramylpeptidet ved eller i liposomers lipidvæg og bidrager på væsentlig måde til selve liposomernes stabilitetsniveau og til fraværet af toksisk virkning eller de-stabilisering med hensyn til makrofager, som kommer i kontakt 25 dermed. Dette er i det mindste de iagttagelser, som kan foretages ved forsøg, såvel in vitro som in vivo.

Selv om det ikke er ufravigeligt, kan man som liposomer anvende lipider, der er karakteriseret ved en overgangstemperatur Tm 9

DK 164918 B

over 37°C. Denne overgangstemperatur refererer til middeltemperaturen for overgangen mellem tilstanden "faste krystaller" og tilstanden "flydende krystaller", i hvilke de nævnte li-pider er i stand til at eksistere, nemlig inden i liposomers 5 membraner, ved temperaturer henholdsvis under og over denne temperatur Tm. Anvendelsen af liposomer, der er karakteriseret ved en temperatur Tm over 37°c, begunstiger eksklusivt makrofager som mål. Det er med henblik herpå, at phospho-lipiderne, der er dannet ud fra fedtsyrer, som i deres kæde 10 indeholder 14 - 30, især 16 - 24 carbonatomer, foretrækkes.

Med hensyn til de lipider, der anvendes til dannelse af lipo-somerne (eller de midler, der er i stand til at danne liposomer) , kan man henvise til den tekniske litteratur, der er rig på dette område. Foretrukne lidpidholdige midler er de 15 midler, som anvender phospholipider, såsom phosphatidylcholin (derivat af fedtsyrer omfattende 12 - 20 atomer, især 16 - 20 carbonatomer), phosphatidylserin, phosphatidylinositol, phospha-tidylethanolamin, phosphatidylglycerol og phosphatidsyre.

Disse phospholipider kan anvendes enkeltvis eller i blandinger. 20 Det er særlig fordelagtigt at anvende blandinger af for det første distearylphosphatidylcholin (DSPC) eller syntetisk eller naturligt phosphatidylcholin1 og af for det andet phosphatidylserin (PS) eller phosphaditylglycerol (PG). Liposomerne dannes fordelagtigt ved at gå ud fra blandinger indeholdende sidst-25 nævnte phospholipider i forholdet 7 volumener DSPC eller phosphatidylcholin (PC) til 1-10, fortrinsvis 3 volumener PS.

De biologiske virkninger af liposomer indeholdende derivaterne ifølge opfindelsen manifesterer sig lige·så godt, når liposomerne foreligger i form af unilamellare eller plurilamellare 30 liposomer. Fortrinsvis har liposompartiklerne størrelser over eller lig med 0,1 mikron, f.eks. mellem 1 og 10 mikron.

10

DK 164918 B

Fortrinsvis anvendes forbindelserne ifølge opfindelsen i lipo-somer eller suspensioner af disse liposomer i fysiologisk acceptable vandige opløsninger, fortrinsvis sterile og isotoni-ske, når midlerne er beregnet til administration ad parenteral 5 vej.

Det er fordelagtigt, når suspensionerne af liposomer omfatter fra 4 til 400 mikromol lipider og fra 20 til 200· mikrogram lipofile derivater af muramylpeptider ifølge opfindelsen pr. ml medium.

10 Opfindelsen angår endvidere liposomholdige midler, hvori der er inkorporeret lipofile muramylpeptidderivater i lyofiliseret tilstand, følgelig fuldstændigt vandfri, Det har vist sig, at lyofilisering af sådanne liposompræparater, øjeblikkeligt efter dannelse af en liposomsuspension, medfører en kraftig stimule-15 rende virkning på makrofager. Disse vandfri lyofiliserede midler kan opbevares i flere måneder uden noget tab af aktivitet.

Fremstillingen af forbindelserne ifølge opfindelsen kan ske ved at gå ud fra. muraminsyre, muraminsyre-analoge eller derivater deraf, der tilfælles har den struktur, som i det følgende om-20 tales som "muraminstruktur”: >%

/ N/vn/OH

w HO CH UHCOCH-, /\ 3

R-j^ COOH

hvori har den ovenfor anførte betydning.

DK 164918 B

11

Foretrukne fremstillingsmåder for forbindelserne ifølge opfindelsen omfatter fiksering af peptidkæden med formlen X-D-Glu-(A-Y)-R2/ hvori X, A og Y har de ovenfor anførte betydninger, til muraminstrukturen ved hjælp af traditionelle metoder inden for peptidsynteseområdet, og eventuelt fiksering 5 af gruppen -B-Z i muraminstrukturens 6-0-stilling. Det antages således, at de funktioner, der bæres af reaktionsdeltagerne, og som ikke deltager i reaktionen, efter behov vil være beskyttet i forvejen. De beskyttede funktioner frigøres til sidst i slutfaserne af fremstillingen af forbindelserne iføl-10 ge opfindelsen. De metoder, der er beskrevet i den kendte litteratur og især i beskrivelserne til de franske offentliggørelsesskrifter, hvis omtale findes længere fremme, kan ligeledes anvendes til fremstilling af forbindelserne ifølge opfindelsen.

Substituenten R2 indføres fordelagtigt i glutamylgruppen før 15 syntesen af kæden. På samme måde fikseres gruppen Y fortrinsvis til at begynde med til den C-terminale aminoacylgruppe, før denne integreres i peptidkæden.

Péptidsynteserne gennemføres i overensstemmelse med traditionelle metoder.’ Som eksempel kan man vælge metoderne til carboxyl-20 aktivering, såsom de aktiverede esteres metode, eller metoden kaldet de blandede anhydriders metode, eller den metode, der anvender en forbindelse af carbodiimidtypen, såsom Ν,Ν'-dicyklo-. hexylcarbodiimid eller dermed ækvivalente carbodiimider. En oversigt over traditionelle peptidsynteser findes i J.H.Jones, 25 Chemistry and Industry 723 (1974) . Der kan også henvises til de franske offentliggørelsesskrifter: nr. 2.288.527, nr.

2.343.482, nr. 2.343.483, nr. 2.343.484, nr. 2.358.159 og nr. 2.369.292, og til artikler af Lefrancier et al. (Int. J.Peptide Protein Res. 1977, 9, 249, og 1978, 11, 289, og J.Med.Chem. 25, 30 1982, 87).

12

DK 164918 B

Dannelsen af esterificerede eller amiderede derivater svarende til gruppen R2 opnås på kendt måde. Der kan isår henvises til de ovenfor nævnte franske offentliggørelsesskrifter, især til offentliggørelsesskrifterne nr. 2.343.483, nr. 2.343.484, nr.

5 2.358.159 og nr. 2.369.292.

Når gruppen Y skal dannes ved hjælp af en glycerolgruppe, der bærer to lipofile kæder, opnås den ved esterifikation af gamma-carboxylfunktionen, eventuelt aktiveret, af glutaxningruppen 10 eller (når A ikke udgør en direkte binding) af den C-terminale. aminoacylgruppe ved hjælp af en glycerol, der selv er beta-gamma-diesterificeret ved hjælp af lipofile syrekæder, især af fedtsyrer, hvilken glycerol ikke desto mindre bærer en fri endestillet hydroxylfunktion. Peptidkædens N-terminale funk-15 tion er generelt beskyttet forud for nævnte esterifikations- reaktion, f.eks. ved hjælp af en t-butyloxycarbonylgruppe (BOC). Der kan endvidere henvises til fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.420.545, hvori der ligeledes beskrives fremsti 11 ingsmå-der for peptidkæder, der er modificeret ved hjælp af en glyce-20 rolgruppe, som selv bærer andre grupper. Disse fremstillings-måder er ligeledes anvendelige til fremstilling af modificerede peptidkæder og kan anvendes til fremstilling af forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse. Ligeledes kan syntesen af peptidsekvensen, der bærer den lipofile disubstituerede 25 gruppe, gennemføres.

Syntesen af det tilsvarende muramylpeptidderivat fuldføres således ved kobling med peptidkædens muraminstruktur (eventuelt modificeret ved hjælp af den disubstituerede glycerolgruppe) efter 30 forudgående frigørelse af den N-terminale aminofunktion. Denne muraminstruktur er forinden blevet beskyttet. Den vil f.eks. bestå af alpha-O-benzyl-4,6-O-benzyliden-N-acetylmuraminsyre. Glycopeptidderivaterne opnås til slut i fri tilstand efter fjernelse (f.eks. ved hydrogeno lyse) af beskyttelsesgrupper.

35

DK 164918B

13

En anden fremstillingsmåde består i direkte kobling af det alpha-substituerede derivat (ved hjælp af et amid eller en ester i overensstemmelse med den almene formel) af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre med den forinden fremstillede gruppe 5 H-A-Y, f.eks., men uden at være begrænset dertil, under anven delse af de blandede anhydriders metode.

Derivaterne ifølge opfindelsen, i hvilke gruppen Z- omfatter en beta-glycerolgruppe, som er gamma-diesterificeret ved hjælp af lipofile syrer, især fedtsyrer, kan således opnås ved omsæt-10 ning af de ovenfor nævnte glycopeptidderivater - før fjernelse af beskyttelsesgrupper fra saccharidgruppens 1-, 4- og 6-stil-linger - med den tilsvarende beta,gamma-diesterificerede glycerinsyre .

Andre træk ved opfindelsen vil fremgå af den efterfølgende be-15 skrivelse af et af dens foretrukne eksempler.

EKSEMPEL I.

Syntese af α (N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin) , β,γ -dipalmitoyl-sn-glycerol (MDP-GDP) med formlen HO—, / °\ N-f HO CH NHCOCH, / \ CHo CONH-CH-CONH-CH-CONH„ 3 I I 2 CH3 CH2-CH2-COOCH2 CHOCO(CH 0* CH-I 2 14 3 ch2oco(ch2)14ch

DK 164918 B

14 a- (BOC-L-Ala-D-isoGln) ,β,γ-dipalmitoyl-sn-glycerol (i) .

Til en opløsning i 10 nil THF-DMF (1/1) af 119 mg (0,375 mM) BOC-L-Ala-D-isoGln, 142 mg (0,25 mM) β,γ-dipalmitoyl-sn-glycerol og 180 mg (0,406 mM) BOP sættes 0,05 ml (0,406 mM) N-methyl-5 morpholin og 31 mg (0,45 mM) imidazol. Efter en week-end ved omgivelsernes temperatur ekstraheres produktet med chloroform, hvorpå det renses i en søjle af 20 g Siliciumdioxid 60 G, der er stabiliseret i chloroform, samt elueres i rækkefølge med chloroform (100 ml) , blandingen chloroform-methanol, 50/1 10 · (100 ml) og derpå 25/1. Efter ultrafiltrering af opløsningen deraf i chloroform lyofiliseres (I) ved at gå ud fra opløsningen deraf i dioxan: 73 mg (33,6%).

[a]^:0° (c: 0,5, iseddikesyre).

Analyse: 15 Beregnet for C48H89N3°10' C 66,4, H 10,3, N 4,8.

Fundet, %: C 66,2, H 10,2, N 4,3.

a-(L-Ala-D-isoGln) , β ,Y-dipalmitoyl-sn-glycerol, HCl (II).

521 mg (0,6 mM) af (I) behandles med 1,6 ml af en normal opløsning af saltsyre i iseddikesyre i 45 minutter ved omgivelsernes 20 temperatur. (II) opnås efter afdampning af opløsningsmidlet ved lyofilisering af opløsningen deraf i eddikesyre og benyttes øjeblikkeligt: 480 mg.

a-MurNAc-(a-OBzl-4,6-O-Bzij-L-Ala-D-isoGln,β ,Ύ -dipalmitoyl-sn-glycerol (III) .

25 378 mg (0,47 mM) af (II) , 260 mg (0,55 mM) af MurNAc (a-O-Bzl- 4,6-O-Bzi), 265 mg (0,605 mM) BOP og 0,2 ml (1,75 mM) N-methyl-morpholin opløses i 8 ml chlorofom-DMF (5/2) . Efter 36 timer

DK 164918B

15 ekstraheres forbindelsen ved hjælp af chloroform og renses i en søjle af siliciumdioxid, der er stabiliseret i blandingen chlordform-methanol(15/l), hvorpå der elueres med en blanding af de samme opløsningsmidler (12/1). Efter ultrafiltrering af 5 opløsningen deraf i chloroform lyofiliseres (III) ved at gå ud fra opløsningen deraf i eddikesyre: 545 mg (95%).

[a]^: +40° (c: 0,5# iseddikesyre) .

Analyse:

Beregnet for cggH]_Q8N4°15'5 CH^COOH, %: 10 C 66,2, H 8,8, N 4,5.

Fundety %: C 66,4, H 8,7, N 4,3, a-(MurNAc-L-Ala-D-isoGln) , β,γ -dipalmitoy 1-sn-glycerol (IV) .

535 mg (0,44 mM) af (III) hydrogeneres opløst i 30 ml iseddikesyre i nærværelse af 550 mg 5% Pd på trækul i 40 timer. Efter 15 frafiltrering af katalysatoren opnås (IV) ved lyofilisering ved at gå ud fra opløsningen deraf i eddikesyre, hvorefter der renses i en søjle af siliciumdioxid ved eluering med blandingen chloroform-methanol(5/1). Efter ultrafiltrering af opløsningen deraf i chloroform lyofiliseres (IV) ved at gå ud fra opløsnin-20 gen deraf i iseddikesyre. 348 mg (72,2%).

[a]^: +23,4° (c: 0,7, iseddikesyre).

Analyse:

Beregnet for Ο,^Η^Ν^Ο^,Ι,β CH^COOH, %: C 60,29, H 9,23, N 4,92.

25 Fundet, %: C 60,3, H 9,2, N 5,0.

DK 164918 B

16 EKSEMPEL II.

Syntese af 6-0-(β,γ-dipalmitoyl-L-glyceryl)-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-n-butylester (6-0-GDP-MDPG-0nBu) med formlen: ch3(ch2)14cooch2 ch3(ch2)14cooch C00-1 )-°

V / H

HO 1 1 yCH NHCOCH, / \ 3 ch3 conh-ch-conh-ch-cooch2 (ch2) (ch2) 2ch3 CH3 CH2-CH2-CONH2 5 Benzylester-L-glycerat (I) .

Til 222 mg (0,2 mM) glycerolsyre sættes 483 mg (2 mM) diiso-propylbenzylisourinstof. Efter 3 timers omrøring ved omgivelsernes temperatur tilsættes 5 ml vandfri og deperoxideret THF. Efter 24 timer ved omgivelsernes temperatur køles opløsningen 10 til -15°Cf og diisopropylurinstof fjernes ved filtrering. (I) opnås efter rensning på en siliciumddioxidsøjle i blandingen chloroform-methanol-eddikesyre (120/10/1) : 316 mg (80%) .

[α]£5ϊ -16,6° (c: 0,55, dioxan).

IR-spektrum: 3410-3510 cm ^ (OH), 1735 cm ^ (ester).

15 U.V.-spektrum: 252 nm, 257 nm, 262 nm (benzyl) .

DK 164918B

17 β,γ-dipalmitoyl-benzylester-L-glycerat (II).

316 mg (1/6 mM) af (I) opløses i 3 ml tør pyridin. Ved 0°C og under en argonstrøm tilsættes i løbet af 15 minutter en opløsning i 6 ml tør dichlormethan af 1,382 g (4,83 mM) palmitoyl-5 chlorid. Efter 4 timers omsætning ved omgivelsernes temperatur tilsættes 80 ml tør ether og derpå 60 ml 0,5 N iskold H2S04· Efter 20 minutters omrøring vaskes den organiske fase indtil neutral pH-værdi, tørres over Na2S04, filtreres og inddampes. (II) opnås efter rensning på siliciumdioxidsøjle i 10 blandingen hexan-ethylacetat (8/2): 835 mg (77,5%).

Smeltepunkt 39 - 40°C.

[a]^: -11,5° (c: 1, chloroform) .

Analyse:

Beregnet for C^H^Og, %: 15 C 74,95, H 10,78.

Fundet, %: C 75,2, H 10,6.

β,γ-dipalmitoyl-L-glycerolsyre (III).- 750 ml (1,11 mM) af (II) hydrogeneres i 20 ml THF i nærværelse af 300 mg 5% Pd på trækul. Efter 3 timer ultrafiltreres opløs-20 ningen, hvorpå den inddampes til opnåelse af et pulver: 520 mg (80%) .

[a]p5: -6,35° (c: 0,4, chloroform).

Analyse:

Beregnet for g0g' 25 C 72,12, H 11,41.

Fundet, %: C 72,0, H 11,5.

DK 164918B

18 6-0 (β,γ -dipalmitoyl-L-glyceryl) -1-a-benzyl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-On-butylester (IV).

Til en opløsning i 3 ml DMF af 658 mg (1,2 mM) MurNAc. (a-Bzl)-L-Ala-D-Gln-OnBu sættes 233 mg (0,4 mM) af (III), 50 mg (0,4 mM) 5 4-dimethylaminopyridin, 64 mg (0,4 mM) N-hydroxybenzotriazol og 95 mg (0,46 mM) DCC. Efter tilsætning af 1,5 ml tør dichlor-methan Henstilles reaktionsblandingen under omrøring i 24 timer ved omgivelsernes temperatur, hvorpå 150 ml chloroform tilsættes. Den organiske fase vaskes med 0,5 M HC1, 1 M NaHCO^ og derefter 10 med vand, tørres over Na2S04 og inddampes. (IV) udfældes til at begynde med i absolut ethanol, renses derpå i en siliciumdioxid-søjle, der i rækkefølge elueres med blandingen chloroform-methanol-eddikesyre (18/1/0,1), med blandingen chloroform/eddike-syre (5/1) og derpå med methanol. Efter ultrafiltrering af 15 chloroformopløsningen deraf opnås (IV) efter inddampning: 330 mg (69%) .

Smeltepunkt 157 - 162°C.

[a]^: +46° (c: 0,5, eddikesyre) .

Analyse: 20 Beregnet for cg5HnoN4°16' °'5 H20' C 64,38, H 9,23, N 4,62.

Fundet, %: C 64,3, H 9,1, N 4,4.

6-0- (8,Y -dipalmitoyl-L-glyceryl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-On-butylester (V).

25 120 mg (0,1 mM) af (IV), der er opløst i 15 ml iseddikesyre og 1 ml methanol, hydrogeneres i nærværelse af 120 mg 5% Pd på trækul i løbet af 20 timer. Efter frafiltrering af katalysatoren lyofiliseres (V) ved at gå ud fra opløsningen deraf i iseddikesyre: 107 mg (96%) .

DK 164918B

19 25 o [α]β : +15,4 (c: 0,4, iseddikesyre).

Analyse:

Beregnet for C58Hio4N4°16' 1 CH3C00H/ C 61,41, H 9,28, N 4,77.

5 Fundet, %: C 61,5, H 9,0, N 4,8.

EKSEMPEL III.

Syntese af α (N-acetyl-muramyl-D-alanyl-D-isoglutamin) ,β,Υ“άί-palmitoyl-sn-glycerol (MDP (D-D)-GDP) .

Syntesemetoden er den samme som den, der blev benyttet til fremstilling af MDP-sn-GDP.

10 Den opnåede forbindelse har følgende analytiske egenskaber: 25 o [a]D : +31,5 (c: 0,5, iseddikesyre).

Analyse:

Beregnet for c54H98N4°i3' 1 CH3COOH (1103 546), %: C 60,95, H 9,31, N 5,07.

15 Fundet, %: C 60,68, H 9,22, N 5,17.

' EKSEMPEL IV.

Syntese af α (N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin) -β ,γ -dipalmitoyl-sn-glycerol (MDP - L-Ala -GDP).

Syntesemetoden er anført nedenfor i store linier. Den opnåede 20 forbindelse har følgende analytiske egenskaber:

DK 164918 B

20 [α]ρ5: +15,6° (c: 0,3, iseddikesyre).

Analyse:

Beregnet for C57H103N5O16,2 CH3COOH (1234 50)} %: C 59,34, H 9,06, N 5,67.

5 Fundet, %: C 59,46, H 9,04, N 5,99.

EKSEMPEL V.

Syntese af α(N-acetyl-muramyl-D-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin)-β,Υ -dipalmitoyl-sn-glycerol - (MDP (D - D) - L Ala - GDP) .

[a]^: +25,7° (c: 0,35, iseddikesyre) .

10 Analyse:

Beregnet for C57Hio3N5°16/ 1,5 CH3C00H (1204 56), %: C 59,82, H 9,12, N 5,81.

Fundet, %: C 59,75, H 9,05, N 6,06.

For de to sidstnævnte derivater er syntesemetoden følgende: Til 20 fremstilling af BOC-L-Ala-y-dipalmitoyl-sn-glycerol foretages esterificeringen under de ovenfor beskrevne betingelser for fremstilling af a-BOC-L-Ala-D-isoGln-y-dipalmitoyl-sn-glycerol ved anvendelse af de to koblingsreagenser (BOP-imidazol).

Gruppen BOC fjernes derefter på klassisk vis, og den opnåede for-25 bindelse bliver under anvendelse af koblingsreagenset BOP koblet med dels MDP, dels MDP (D - D). Således opnås til slut efter en første rensning på siliciumdioxidsøjle, der elueres med chloroform-methanol (5/1), og derefter en anden rensning på en søjle af LH 20, der elueres med chloroform-methanol(1/1), dels 30 MPD-L-Ala-GDP, dels MDP (D - D) L-Ala-GDP.

DK 164918B

21 EKSEMPEL VI.

Syntese af 6-0-(β,γ-dipalmitoyl-L-glycerol)-caproyl-N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-n-buty lester (6-0-GDP-aminocaproyl-MDPG-OnBu) .

Fremstilling af liposomer 5 a) Fremstilling af multilamellare liposomer.

PC eller DSPC og PS (i molære forhold, henholdsvis 7:3, 7:0,3 eller 7:0) blandes med MDP-GDP i en vandfri chloroformopløsning. Opløsningen indføres i glasflasker med afrundet.bund og underkastes en roterende omrøring og samtidig en inddampning.

10 Hinden af vandfri lipider, der dannes på flaskernes indre overflade, køles med en opløsning af natriumchlorid, der er pufret med PBS-phosphat, til 20°C i 10 minutter, hvorefter suspensionen underkastes kraftig omrøring ved 60°C i et apparat betegnet "Vortex" til dannelse af liposomer. De relative mængder 15 af MDP-GDP i forhold til phospholipider og de relative mængder af PBS-puffer i forhold til lipider vælges hver gang således, at der i de endelige liposomer i forhold til volumenerne af benyttet suspension opnås relative mængder af phospholipider og MDP-GDP, hvilket er angivet i de tabeller over resultater, der 20 er anført i det følgende. Liposomer indeholdende MDP er blevet fremstillet under de samme betingelser med henblik på at foretage sammenligninger.

Forsøgsliposomer er blevet fremstillet på samme måde, men i fravær af MDP-GDP.

25 b) Fremstilling af lyofiliserede liposomer.

Lyofiliserede liposomer er blevet fremstillet ved opløsning af

DK 164918B

22 DSPC, PS og MDP-GDP i passende mængder i vandfri 2-methyl-2-propanol ved 28 - 30°C.· Aliquot mængder indeholdende relative mængder af bestanddele, som er anført i de efterfølgende tabeller over resultater (total-rumfang: 1 ml) blev anbragt i flasker, 5 der egner sig til lyofilisering. Efter nedkøling af opløsningerne i 2-methyl-2-propanol til +4°C blev flaskerne underkastet lyofilisering i 6 timer ved 20°C. De lyofiliserede lipid-materialer blev opbevaret ved -20°C eller +4°C i forseglede flasker indtil anvendelsestidspunktet. Fremstillingen af liposo-10 mer ud fra disse lyofiliserede materialer kan foretages på ethvert tidspunkt ved tilsætning af det påkrævede volumen PBS-puffer ved 60°C, idet suspensionen derpå underkastes kraftig omrøring i et "Vortex" apparat i 2 minutter, hvorefter den opbevares i et isbad i 30 minutter før udførelsen af forsøg.

15 Liposomerne indeholdende MDP-GDP har en bemærkelsesværdig stabilitet sammenlignet med stabiliteten af liposomer, der er fremstillet med MDP. Liposomer opnået under de samme betingelser, men med muramylpeptider, der er mærket med tritium, har muliggjort følgende iagttagelser: Retentionsforsøg med muramylpeptid 20 i liposomer, der er suspenderet i mediet MEM-FCS (blanding af "milieu essentiel minimum contenant des seis de Searie" og kalve-fosterserum), har vist, at mere end 50% af. inkorporeret MDP er gået tabt efter 4 timers inkubation ved 37°C, og at mere end 80% MDP er gået tabt efter 18 timers inkubation. I modsætning 25 hertil blev MDP-GDP i tilsvarende liposomer bevaret praktisk taget fuldstændigt. Inkorporering af MDP-GDP og stabiliteten af sidstnævnte blev yderligere verificeret ved reaktionsforsøg med monoklonale antistoffer, anti-MDP. Efter inkubation af disse liposomer i det samme medium ved 37°C i 72 timer iagttager 30 man en konstant agglutination af liposomer med antistofferne (95% af liposomerne blev agglutineret), hvilken iagttagelse viser, at der praktisk taget intet tab er af MDP-GDP. Det har vist

DK 164918 B

23 sig, at MDP-delen af muramylpeptidet var placeret yderst på den liposomale membran. Tabet - hvis det fremkommer - vil blive vurderet ved en formindskelse i agglutinationsintensiteten med tiden. Endvidere har analyse af N-acetylmuramyl-sukker 5 ved fremgangsmåden ifølge Morgan-Elson ikke vist noget tab efter inkubation af disse liposomer ved 37°C i 72 timer.

Ganske lignende iagttagelser er gjort med liposomer, der er fremstillet med 6-0-GDP-MDPG-0nBu eller med forbindelser ifølge eksemplerne III, IV, V og VI.

10 Opfindelsen angår således især liposomer, der er lyofiliseret til pulver, som på ethvert tidspunkt kan bringes i suspension i en passende pufferopløsning ved omrøring i et "Vortex"-apparat i løbet af meget kort tid, især i løbet af 2 minutter. Ved de efterfølgende forsøg vil der ofte blive henvist til anvendelsen af 15 "lyofiliserede liposomer". Det vil fremgå, at dette udtryk angår liposomer, der forinden er bragt i suspension under de ovenfor nævnte betingelser, især i en PBS-puffer.

Opfindelsen angår specielt lyofiliserede liposomer af den type, der fastholder 20 - 2.000 mikrogram lipofile muramylpeptider 20 ifølge opfindelsen pr. 4 - 400 mikromol lipid. Fortrinsvis består selve lipiderne af en blanding af DSPC og PS, hvori forholdet DSPC/PS varierer fra 7:1 til 7:10 og især har størrelsen 7:3.

Biologiske forsøg.

25 1) Forsøg med cytotoksisk aktivitet in vitro under anvendelse af makrofager.

Målcellerne, der anvendes ved disse forsøg, består af kulturer af melanomceller fra mus B16-BL6, der opbevares i mono

DK 164918 B

24 lag, som er syngenetiske for mus C57B1/6.

De anvendte makrofager er alveole-makrofager fra F344 hanrotter på 200 g. Makrofagerne opnås ved en lungevask med 9 x 5 ml PBS-medium fra Dulbecco, uden calcium eller magnesium, fra rot-5 ter, der er bedøvet med 0,5 ml 5% Nembutal ip (Laboratoire Abbott S.A.) og befriet for blod ved anvendelse af en kanyle, som er placeret i en nyrearterie. Efter centrifugering bringes makrofagerne i suspension i MEM (Minimum Essential Medium) indeholdende Earle's salte ("Earle's salte" markedsføres af "Flow 10 Laboratories S.A.") og tilsættes 5% inaktiveret kalvefosterserum, glutamin, natriumpyruvat, ikke-essentielle aminosyrer, vitaminer og antibiotika (penicillin og streptomycin).

5

Suspensionen indstilles derpå til 5 x 10 makrofager/ml og fordeles med en mængde på 100 mikroliter pr. skål i en plastbeholder 15 fra Titertek 76-002-05. Efter inkubation i 4 timer ved 37°C i en atmosfære indeholdende 5% CC>2 hæfter makrofagerne til skålenes vægge. De ikke-vedhæftende celler fjernes ved vaskning foretaget med mediet MEM-FCS. Monolagene af makrofager inkuberes derpå med liposompræparater, med ikke-liposomt MDP og forsøgs-20 liposomer indeholdt i et slutvolumen på 200 mikroliter i 24 timer. Monolagene af makrofager vaskes derefter tre gange, hver gang med 200 mikroliter af mediet MEM-FCS pr. skål.

løvrigt blev B16-BL6-målcellerne i eksponentiel vækst- 125 fase inkuberet i nærværelse af 0,2 mikrocurie/ml af I-IdUrd 25 (specifik aktivitet 2200 curie/mmol) i 24 timer. Monolagene blev derpå vasket som anført med MEM uden serum til fjernelse 125 af al ikke-inkorporeret I-IdUrd. Cellerne løsnes der på ved behandling i 1 minut med en opløsning af trypsin (0,25%)/ EDTA(0,02%) i PBS. De løsnede celler suspenderes derpå i me-30 diet MEM-FCS. Efter vaskning ved centrifugering ved 800 g i 10 minutter ved 4°C bringes cellerne i suspension i mediet MEM-FCS til opnåelse af en koncentration af levedygtige celler på 4 25

DK 164918 B

5 x 10 /ml.

Aliquot mængder (100 mikroliter af denne suspension) indføres i skålene i kontakt med monolagene af forbehandlede makrofager, og en samdyrkning foretages i 72 og/eller 96 timer. Effektiviteten 5 af belægning af B16-BL6-celler viser sig af være af størrelsesordenen 90 - 95%.

Ved inkubationstidens slutning vaskes hver skål tre gange med 200 mikroliter opvarmet PBS, og de resterende vedhæftende celler lyseres ved tilsætning af 200 mikroliter 0,5 M NaOH. Lysa-10 tet og vaskevæskerne fra hver skål kombineres og indføres i en væskescintillationstællers beholder. Alle bestemmelserne foretages in triplo. Den specifikke cytotoksicitet i % beregnes ved anvendelse af følgende formel:

Middeltælling (CPM) Middeltælling (CPM) 15 af målceller af målceller + - + _forsøgsmakrofager behandlede makrofager —--- x 100

Middeltælling (CPM) af målceller + 20 Jiorsøgsmakrofager _

Det bemærkes, at dette forsøg beror på den del ADN af B16-BL6-cellerne, der frigøres i mediet ved lysering af nævnte celler, når disse er dræbt af makrofagerne (eller ikke frigjorte, når der er tale om overlevende B16-BL6-celler).

25 Resultaterne af disse forsøg forekommer i tabel I. Denne viser resultaterne af tilbageværende radioaktivitet i celler, der er behandlet under de ovennævnte cytotoksicitetsbetingelser, i % (CPM - standardafvigelse (SD)) (værdier forekommer mellem parenteser i tabel I).

DK 164918 B

26 I den venstre del af tabellen forekommer ligeledes koncentrationerne af MDP eller af MDP-GDP pr. ml liposom suspension eller saltopløsning, når der er tale om fri MDP.

De samme forsøg er blevet udført med liposomer, der bevarer 5 MDP-GDP, som er gendannet ud fra præparater af "lyofiliserede liposomer". Resultaterne forekommer i tabellerne II og III.

De følgende iagttagelser hidrører fra undersøgelse af disse tre tabeller.

Tabel I viser, at liposomer af MDP udøver en sensibiliserings-10 virkning over for makrofager, der er 700 gange større end virkningen af fri MDP. Men liposomerne af MDP-GDP (forstået som MDP-ækvi valenter) er 7.000 gange mere aktive end fri MDP og følgelig 10 gange mere aktive end liposomer af MDP (tabel I) .

Men de lyofiliserede liposomer af MDP-GDP (tabellerne II og 15 III) er betydeligt mere aktive, idet de lyofiliserede liposomer af MDP-GDP yderligere har en stimulerende virkning, der er 500.000 gange større end virkningen af fri MDP (værdier udtrykt i forhold til MDP-ækvivalente doser af MDP-GDP, som er bevaret i liposomerne). Makrofagernes stimulationsvirkning er særligt 20 betydelig, når samdyrkningerne foretages i 96 timer.

Denne cytotoksicitet i forbindelse med liposomernes meget store stabilitet afslører således en ganske bemærkelsesværdig betydning, især når man erindrer, at de i pulver lyofiliserede liposomer kan bevares i flere måneder uden tab af aktivitet.

25 2) Forsøg in vivo.

a) Aktivering in situ af alveolare makrofager, der er opnået ud fra mus, hvortil er administreret lyofiliserede liposomer indeholdende MDP-GDP, og fordeling in vivo af liposomer indeholdende MDP-GDP og 6-O-GDP-MDPG-OnBu.

DK 164918B

27

Lyofiliserede liposomer indeholdende 10 mikrogram MDP-GDP eller 6-O-GDP-MDPG-OnBu i etvolumen på 200 mikroliter PBS indsprøjtes i halevenen på mus C57B1/6J. De alveolare makrofager høstes 24 timer senere under de ovenfor beskrevne betingelser ved vask-5 ning af dyrenes lunger. Efter vaskning med MEM-FCS-pufferen 4 doseres makrofagerne i mikroplade-skåle (5 x 10 makrofager pr. skål) , og B16-BL6-melanomcellerne, der er mærket med 125 1-ldUrd, tilsættes. De cytotoksiske aktiviteter måles under de ovenfor beskrevne betingelser.

10 Lignende forsøg blev udført med forsøgsliposomer og liposomer indeholdende MDP. Resultaterne er anført i tabel IV, af hvilken tabel det fremgår, at makrofagerne opnået ud fra dyr, der havde modtaget liposomerne med MDP-GDP eller 6-O-GDP-MDPG-OnBu, havde en betydelig cytotoksisk aktivitet i forhold til B16-BL6-15 celler, medens makrofager opnået ud fra dyr, der havde modtaget forsøgsliposomerne eller de liposomer, hvori MDP var inkorporeret, viste sig kun at have en cytotoksisk aktivitet, der var steget meget svagt i forhold til aktiviteten af makrofager opnået ud fra ikke-behandlede dyr.

20 b) Fordeling af lyofiliserede liposomer i organerne.

Disse forsøg udføres ved i dyrene, under betingelser der minder om de ovenfor anførte, at injicere liposomer, der bevarer MDP-GDP, men hvori DSPC er blevet mærket med carbon 14.

4 timer efter injektionerne dræbes dyrene, og lungerne, leveren 25 og milten udtages. Den procentiske radioaktivitet, der bevares i disse organer og endvidere i blodet, bestemmes. Disse målinger foretages med forskellige relative mængder af DSPC og PS. Resultaterne er vist i tabel V, hvoraf det fremgår, at tilstedeværelse af væsentlige mængder PS viser, at den relative 30 stigning i mængderne af PS i forhold til DSPC begunstiger en

DK 164918 B

28 pulmonær lokalisering af adsorberede liposomer in vivo. Det molære forhold DSPC/PS på 7:3 giver særligt gunstige resultater. Det er dette forhold, som anvendes i det efterfølgende forsøg.

5 c) Virkninger in situ af lyofiliserede liposomer, der bevarer MDP-GDP, på metastaser indført eksperimentelt i mus ved hjælp af Bl6-BL6-celler.

Tumorale B16-BL6-celler i eksponentiel vækstfase blev høstet ved trypsinering, vasket ved centrifugering og bragt i suspen- 5 10 sion i PBS til opnåelse af suspensioner indeholdende 5 x 10 levedygtige celler pr. ml. 0,2 ml af denne suspension blev injiceret i en lateral vene i halen på mus C57B1/6J. Hver mus blev ad intravenøs vej behandlet med 200 mikroliter af en opløsning af 0,5 mikromol af ovennævnte lyofiliserede liposomer, 15 der bevarer 10 mikrogram MDP-GDP, på dagene 3, 5, 7, 9 og 12 efter dagen for injicering af svulstcellerne. På dag 21 blev musene dræbt ved hjælp af cervikal opskæring, og antallet af lungemetastaser registreredes under et dissektionsmikroskop.

Dyr blev behandlet med forsøgsliposomer, der var befriet for 20 MDP-GDP.

Virkningen af behandlingen på antallet af metastaser blev analyseret under anvendelse af forsøget "u" ifølge Mann-Witney.

Resultaterne forekommer i tabel VI. I denne vises især middeltallet af lungemetastaser, som er fundet i de forskellige grup-25 per af dyr, der er behandlet på dag 21 efter injicering af B16-BL6-=-celler.

Af resultaterne fremgår, at de lyofiliserede liposomer på basis af MDP-GDP er i stand til at fremkalde en meget betydelig

DK 164918 B

29 reduktion af metastaser, medens forsøgsliposomer eller lignende doser af fri MDP er uden virkning på udviklingen af metastaser, som iagttages hos forsøgsdyrene.

Undersøgelsen af størrelsen af tilbageværende metastaser efter 5 behandling viser, at metastaserne med diameter under 2 mm er fuldstændigt udslettet. Der eksisterer kun vigtigere metastaser med en størrelse over 2,5 mm.

Det bemærkes således, at liposomerne ifølge opfindelsen har en særlig effektiv aktivitet over for metastaser, især hvis man 10 erindrer de iagttagelser, som blev foretages af M.E.Key og medarbejdere (J.Natl.Canc.Inst. 69, 1189-1198, 1982), nemlig at metastaser med størrelser over 1 mm ikke påvirkes af en behandling med liposomer, der fastholder MDP.

De in vivo opnåede resultater med repræsentative forbindelser 15 tilhørende klassen af forbindelser ifølge opfindelsen er ligeledes overlegne i forhold til de resultater, som under lignende betingelser opnås med liposomer af MTP-phosphatidyl-monoethanol-amin. Disse viser i virkeligheden ved de samme forsøg en aktivitet af samme størrelsesorden som liposomerne på basis af MDP.

20 Det er endvidere interessant at bemærke, at forbindelserne ifølge opfindelsen har et aktivitetsmaksimum ved slutningen af 96 timer, eller en virknings-varighed på niveau med metabolismen, der ligeledes på favorabel måde kan sammenlignes med sammenlignings-molekylernes, hvis virkning er langt hurtigere.

25 Visse af forbindelserne ifølge opfindelsen har i relativt forøgede doser en vis pyrogenicitet, hvis virkning imidlertid er formindsket under hensyn til det særlig forøgede terapeutiske indeks, de ses at gavne. Muramylpeptiderne, hvori modifikationsgruppen ved hjælp af de to lipofile kæder er fikseret til

DK 164918B

30 saccharidgruppens 6-stilling, og hvis peptidkæde afsluttes af en glutamyl-a-ester-Y-amidgruppe, er således særligt fordelagtige på grund af deres meget formindskede pyrogenicitet. Herom vidner målingerne af sammenlignet pyrogenicitet, der er fore-5 taget på grupper på 3 kaniner med de to særligt undersøgte forbindelser, ifølge forskriften fra den europæiske farmakopé, bind 2, 1971, side 58-60. Man har i virkeligheden opnået følgende resultater, udtrykt ved stigninger i temperaturen, som er iagttaget hos forsøgsdyrene, hvortil der i forvejen er ble-10 vet administreret 1 mg/kg af forsøgs forbindelserne:

For MDP-GDP: 1°, 0,9° og 1°C.

For 6-O-GDP-MDPG-OnBu: 0,2°, 0,3° og 0,5°C.

De med repræsentanter for klassen af forbindelser ifølge opfindelsen opnåede resultater viser, at indføringen af to lipofile 15 kæder eller forgreninger på to naboatomer i en bærende gruppe, der er koblet til et muramylpeptid, gør sidstnævnte særlig egnet til.(især når det bringes på liposomform) at aktivere makrofager og til at bibringe disse en kraftig antitumoral virk-• ning. Det er ligeledes bemærkelsesværdigt, at de lipofile de-20 rivater af muramylpeptiderne ifølge opfindelsen også har bevaret. de for MDP karakteristiske egenskaber, d.v.s. hjælpestofegenskaber og samtidig antiinfektiøse egenskaber (især over for Klebsiella).

Specielt hjælpestofvirkningen af MDP(GDP) og af 6-O-GDP-MDPG-OnBi 25 er blevet afprøvet på svejtsiske hunmus. På dag 0 blev 100 mikrogram C474 injiceret sammen med 500 mikrogram kvægserum-albumin. På dag 30 fik dyrene atter 100 mikrogram af kun antigenet. Der opnåedes følgende resultater:

DK 164918B

31

Primær Sekundær reaktion reaktion 1,21 1.36

Kontrol 1.64 5.09 2 MDP 3.97 8,48 1,7 ++ MDP-GDP 3.64 10.27 0,52++ 6-O-GDP-MDPG-OnBu 2,64 8.6 0,71++ ++p 0,01 5 Styrkerne er udtrykt som Log 2 til den passive hæmagglutinations-styrke. På dag 21 blev serummængderne titreret sammen. På dag 36 blev de titreret separat.

Den antiinfektiøse aktivitet (forøget som det fremgår af de følgende resultater) blev godtgjort ved administration af en su-10 spension af 10 celler af Klebsiella pneumoniae ved intravenøs injektion i 6 - 8 uger gamle svejtsiske mus. I tabellerne VII -IX angives de betingelser, under hvilke forsøgsforbindelserne blev administreret, og i det foreliggende tilfælde iagttoges antallet af overlevende mus 10 eller 15 dage senere tillige med 15 beskyttelsesprocenterne i forhold til kontroldyrene.

Iagttagelserne kan resumeres som følger: 1) De tre forbindelser MDP-GDP, MDP(D,D)-GDP og GDP-MDPG-OnBu har en betydelig beskyttelsesvirkning over for infektion hos mus med dødelige doser af Klebsiella pneumoniae.

20 2) Lignende resultater er opnået med MDP-L-Ala-GDP og 6-O-GDP- aminocaproy 1-MDPG-OnBu.

3) Når de injiceres i liposomer, er MDP-GDP den mest aktive (i 0,1 mikrogram) , men de to andre er ikke desto mindre mere effektive (i 10 mikrogram) , end når de injiceres i vandig su-25 spension.

DK 164918 B

32 4) Ligesom med MDP kan man godtgøre en syner gis tisk virkning med et antibiotikum (gentamicin) .

5) Selv om MDP (D,D) -L-Ala-GDP er aktiv, er den mindre aktiv end MDP-L-Ala-GDP · 5 6) De med Candida udførte forsøg viser, at MDP-GDP er aktiv, at denne virkning forøges ved inkorporering i liposomer, og at den kan føjes til virkningen af Fungizone (Amphoteracin B).

De mod denne sidstnævnte mikroorganisme opnåede resultater fremgår af de efterfølgende tabeller.

10 Opfindelsen angår således biologiske reagenser, der kan være sammensat ved hjælp af forbindelser ifølge opfindelsen. Disse reagenser anvendes som referenceforbindelser eller sammenlignings forbindelser til undersøgelse af forsøgsforbindelsers aktiverende egenskaber på makrofager, især med hensyn til deres tumo-15 ricide egenskaber, især ved en pulmonær lokalisering.

Opfindelsen angår endvidere lægemidler, der som aktivt stof indeholder mindst én forbindelse ifølge opfindelsen, hvilke lægemidler som stimulationsmidler kan anvendes til den person, hvortil de administreres, til aktivering af makrofager. Et særlig 20 foretrukket anvendelsesområde er behandling af tumorale lidelser samt hindring af celledelinger og tumorale metastaser. Anvendelsesområdet for lægemidlerne ifølge opfindelsen strækker sig imidlertid også til behandling af alle infektiøse sygdomme, især mod patogene bakterier, der er blevet resistente over for 25 antibiotika. De lipofile muramylpeptider ifølge opfindelsen kan endvidere anvendes som immunitetshjælpestoffer, der indføres i en vært ved hjælp af et immunogent middel, især et aktivt vaccinestof, specielt når det immunogene middel er svagt.

Der kan henvises til beskrivelserne til de tidligere nævnte

DK 164918 B

33 patenter med hensyn til de særlige betingelser, ved hvilke disse hjælpestoffer kan anvendes.

Lægemidlerne ifølge opfindelsen kan administreres til en vært -dyr eller menneske - på enhver egnet måde til opnåelse af den 5 ønskede virkning.

Opfindelsen angår selvsagt også de forskellige farmaceutiske midler, især på basis af liposomer, der anvender fysiologisk acceptable lipider, hvori forbindelserne ifølge opfindelsen kan inkorporeres, eventuelt sammen med andre aktive stoffer.

10 De farmaceutisk fordelagtige midler består af injicerbare suspensioner af liposomer, der indeholder en effektiv dosis af mindst én forbindelse ifølge opfindelsen. Fortrinsvis opnås disse suspensioner i en steriliseret isotonisk vandig fase, fortrinsvis saltvand eller vand tilsat glucose.

15 Opfindelsen angår især sådanne suspensioner, der kan administreres ved intradermal, intramuskulær eller subkutan injektion, intravenøst eller også ved skarifikation.

Opfindelsen angår endvidere farmaceutiske midler, fortrinsvis i form af liposomer, der kan administreres ad anden vej, især ad 20 oral eller rektal vej, eller også i former, der er beregnet til at komme i kontakt med slim, især øjenslim, næseslim, lungeslim eller vaginalt slim.

Følgelig angår opfindelsen farmaceutiske midler, i hvilke mindst én af forbindelserne ifølge opfindelsen foreligger sammen med 25 farmaceutisk acceptable excipienser, faste eller flydende, som er beregnet til at danne orale, okulare eller nasale administrationsformer, eller sammen med excipienser, der er beregnet til at danne rektale administrationsformer, eller også sammen med

DK 164918 B

34 excipienser, der er beregnet til vaginal administration/ f.eks. gelatinøse excipienser. Den angår endvidere midler, der er beregnet til den pulmonare vej, især opløsninger fremstillet med henblik på administration ved hjælp af et klassisk aerosol-5 apparat.

Som eksempler på doser, der kan administreres til styrkelse af en værts antitumorale forsvar,kan nævnes doser på 10 - 10.000 mikrogram pr. kg legemsvægt, f.eks. 50 - 500 mikrogram/kg, når administrationen foretages ad parenteral vej, eller 10 doser på 1 - 10 mg pr. kg legemsvægt ad oral vej. Disse doser er udtrykt som MDP-GDP-ækvivalenter, der er inkorporeret i lipo-sornerne.

Forbindelserne kan også anvendes til udførelse af intralæsionel-le injektioner i svulster af typen brystsvulster, melanomer og 15 andre faste svulster.

Opfindelsen er selvsagt ikke begrænset til de udførelsesformer, der ovenfor er beskrevet som eksempler, og fagmanden kan foretage modifikationer uden at afvige fra de efterfølgende kravs rammer.

20 Specielt angår de efterfølgende krav også alle forbindelser, der udgør ækvivalenter til dem, der specielt er blevet defineret. I denne henseende udgør alle forbindelser ækvivalenter, hvori koblingen mellem muramylpeptidet og gruppen indeholdende de to ovennævnte nabostillede atomer, på hver af hvilke der ud-25 går en lipofil kasde som den i det foregående definerede, vil kunne gennemføres på en anden måde end de måder, som specielt er taget i betragtning. Som eksempel kan koblingen foretages i 1-stillingen i muramylpeptidets saccharylgruppe. På samme måde udgør de forbindelser ækvivalente til de i kravene definere-

DK 164918 B

35 de forbindelser, i hvilke koblingen udføres ved hjælp af en anden arm eller gren, f.eks. ved hjælp af en aminoalkoholgruppe (-NH-CH-CH2-0) eller en dermed analog gruppe, eller også, f.eks. med hensyn til den modificerede peptidkæde, ved hjælp af en 5 brodannende gruppe, der danner en forbindelsesester sammen med glutamylrestens gamma-carboxylgruppe og ved sin anden ende med glycerylgruppen, der bærer lipofile kæder, ved hjælp af enhver passende forbindelsesmåde. Der kan her eksempelvis henvises til fransk patentansøgning nr. 78 08049, for så vidt angår 10 strukturen af andre arme, samt metoder, der kan anvendes til opnåelse af de koblinger, der kommer på tale inden for den foreliggende opfindelses rammer. Omvendt kan der ligeledes som ækvivalenter betragtes de muramylpeptidforbindelser, hvori eksempelvis glycerylgruppen, der bærer to lipofile kæder, direkte 15 eller indirekte er knyttet til en -NH-gruppe, som selv direkte er bundet til carbonatom nr. 6 i muramylpeptidets saccharid-gruppe.

Det vil endvidere fremgå, at uden at afvige fra kravenes rammer omfatter alle de modificerede muramylpeptider de samme karakte-20 ristiske træk, som dog kun afviger fra de træk, der især er blevet omtalt, ved lokale substitutioner med grupper, der ikke specifikt er omhandlet i de definitioner, der er blevet nævnt. For eksempel er ækvivalenter til de modificerede muramylpeptider ifølge opfindelsen de muramylpeptider, der indeholder substitu-25 tionsgrupper i saccharidgruppens 1-stilling, f.eks. en phenyl-aminogruppe, eller substitutionsgrupper i saccharidgruppens 4-stilling, f.eks. acylgrupper omfattende 1-4 carbonatomer. Ækvivalenter er endvidere i kravene omhandlede forbindelser, hvori den første aminoacylgruppe og/eller den anden aminoacyl-30 gruppe i den modificerede peptidkæde er N-substitueret, f.eks.

med en lavere alkylgruppe, især methylgruppen, eller de af for- 36

DK 164918 B

bindeiserne/ hvori et hydrogenatom, som tilhører en af methylen-grupperne, der findes i glutamylgruppen og/eller eventuelt i glycerylgruppen, selv er erstattet af en lavere alkylgruppe, f.eks. en methylgruppe. De samme iagttagelser gælder muramyl-5 peptiderne ifølge opfindelsen, hvori grupperne eller er alkylgrupper i stedet for at være acylgrupper etc..........

Som konklusion er det vigtigt at understrege, at disse forskellige substitutioner ikke vil bringe de således modificerede forbindelser uden for opfindelsens rammer, eftersom de ikke 10 modificerer de således opnåede muramylpeptiders væsentlige egenskaber, især for så vidt angår deres evne til at aktivere makrofager og til stimulation af deres tumoricide aktivitet in vivo.

Antiviral virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen, især 15 af MDP-GDP.

Den antivirale virkning af dette molekyle blev bedømt i et system til eksperimentel infektion af mus med influénzavirus. Forsøgsforskriften omfatter administration af MDP-GDP ad forskellige veje, især pr. os i en dosis på 0,1 mg pr. mus og sub-20 kutant i den samme dosis. Musenes infektion (10 uger gamle svejtsiske mus) blev foretaget ved intranasal podning med 50 mikroliter af en 1/10.000 suspension af influenzavirus APR/8. MDP-GDP indgives enten 24 timer før infektionen (J - 1) eller 24 timer efter (J + 1). Den antivirale aktivitet bedømmes 25 ved 21 dage efter infektionen at sammenligne antallet af overlevende dyr i behandlingsgruppen med antallet af overlevende dyr i gruppen af ubehandlede kontroldyr.

Ved den benyttede dosis blev en antiviral aktivitet af MDP-GDP godtgjort at være præventiv efter administration, enten ad oral

DK 164918 B

37 vej (56% overlevende) eller ad subkutan vej (44% overlevende).

Disse resultater lader formode, at de doser af forbindelserne ifølge opfindelsen, der kan anvendes til human behandling, kan andrage fra 0,01 mg/kg til 0,5 mg/kg. For så vidt angår de 5 måder, hvorpå molekylerne kan foreligge, henvises især til deres anvendelse i vandig eller olieagtig suspension, i olieagtig emulsion eller i forbindelse med liposomer.

DK 164918B

38

* 1 I

-Pli I

CD I I I

PI I I

•Hil I

>11 I

•Hil I

•Pil I

A! I I I Ό Oh

ns I —. I I UQ

i λ i i s s

0 11 I

Αί I * I I *P 0 03 I -p I Η HH I 0 Ό •η i ø i old o o η h m in in i h g tQ I -4J —· I oo OOOOOOOl T) 0

A4 I -H -P I KK - - >· - - - I (3¾ rQ

01 >01 OO OOOOOOOl ØH P

•P I H +> I I Λ 0 D

01+) -Hl V V VVVVVVVI 0Λ Ό

+> I Μ o I I Λ 0 H

>1 I ø Hl 0.0» OhOiQh ChOhOhOhI P Ό I

o i o m i — i o g «-> I H Ai I to I HH to

Wl Ό 01 - ro ^ vo in H vo oo ^ t'· I mod

PI 0 +> l ΓΟ ^ Γ0 H 00 l£> CM MNNH I >CQ ØH

Øl P 0 I w l ø ct| Γ0 0 I -PI I rl\. ΒΌ øl ø >ι I t'- in σι μπο m-iin nnin^ l Λ U G -o mi Ό 01 oo in r·' oo r- cm m^H ohm·« I Oh -H ·—

01 G I Η «η HH HnNH I Pcq G

P I 0 dø I I 0 Q A! Ό Αί I P w I +1+1+1 +1+1+1 +1 + 1+1 +1 + 1+1 +1 I -P PØ iOljyi I ·Η ^ β SI > Q l οοΓ'οη o η Γ" Hounio l Hø Ό

i 0) to 1 Hinh oicooi ro σι r-' o cm cm r~ I o £ -P

oø 1 cn I (nnh N>ico m co 10 in 10 r- co l PP 00

Oh I 0 +1 I CM CM CM i—l i—li—1 i—! I—li—il—li—i I AiØ 03 AS

I Λ I I -H g P

P I «-» S I I g O M m 0 I H Oh I imps 0 I E< U I IO00

• I -Η I I I O Oh £ P

Η I -P I I I <N -H -H 0

I Oh I I I H -P

J I 0 I I I °ø p w I Oh I I I Oh - IO 0 ml Hl I I — σι Ό

a I >1 I I I G P

Eh|£I I I 0 0 · P - 0

øl I I £ Ό P 0 10 G

PI I I 0 ri 0 -P P P

2! I I H Oh £ m ff| 0 £ I I I O -H -H 0 I £ I 10 I > H +) 10 o 01 i G i o -P h m

Ό I 10 l-P+WECQO

0 I I H 10 ΟπίΊ 0 , Dj pi 10 i m -p P h

Øl I I -H o *h mø H

pi i 10 i ©H

0 1 I J I +> 0» Pj ,Q H *H

Oh I I CO I Ό Q 0 · PI II I HH S >» Oh O.

01 I ID —. — I O O 0 H Q Q

A4I — IH O Ό I »G £ Η H °0 O S

GlølpQ I 0 G P Λ S I

•Hl I Η Η Η I 'd m Oh H

I P I P £ £ £ I G o -pro Q P

pi øiø \= = \= = \= = = i ή 00 p 0 o g m

Øl &>IH &> tJi I —· ø 4J H

£1 0 i h ^ G. 3 iPHH-'mm 01 m i 0 00 1 0 ω η > X 0 0

m I O I O Ο Η I 0>0h 0 H

01 PI OHO OHO 001 0\ + ΙΛ p p

Oh i AS I * i ‘ » ft » * * " I m U - Αί 00

Hl øl O pHOOQHOOOHHcnl 0 Oh Oh 0 C G

Hl £ I G 0 0= = -. o ro Η I PcnQ O 0 O

I I Η £ I H lAiQØAi.-H-H

HI Η I H O Oh Oh I ø \ 03 P -P -P

I 0 I Ό mQ= = Q = = = I g p PU H 0 0 0 mi 1 g o S S i 0 q m tf· p p øl t7> I 0 Oh I I I s S Ai ^ +) -p

I GI+iHP P lOOO^SC

tr> I HIØHØ 0 I H 03 P -P 0 0 0

GI HIÆWHS £ I OØOPOO

Hl Ό I OOO O IX OhH -P AS G G

GI Gi GhPm== m == I H H >h·« O O

AS I ØIØI-PO O I t n H 0 U £ ¢4 «

PI Xi I OS G Oh Oh Oh I

Hl ØIGHO-H Η P = = = I — — — >1 03 I H S « PI PJ S lø Λ orø

DK 164918 B

39

IDI I I

I +j I I

i a) i i • 14-1 I I u +i I Ή I I 54 Φ o) i o i i ω ft σ' 4-) I Ή I Η H r1 rH I S C) (0 -HIM I O O O i—1 O r-i r-I LO Lf> I OS 4-1

> I X I OOOOOOOOOI M O

•HI O I *·>«·*· ‘•‘•““‘•‘I O’H 5-4 4JI4J I OOOOOOOOOI χ ,¾ I o I YVVVVVVVVI -H UH (d (di4-> i OLi0<cuftOLiøj&iO)Oii η ε I >ι I — 15-1

φ I O 5ι I in —sI Ό Φ H

44 I <j) i - Η-ϊ^ιο au^ininio I φ >—l ni

rø i dP g I n oococoin l g H

Η I w Η I w —^ wwwww 1 φ tn

Μ I 4-> I I +> G

X I Q I nr-o cn C'· ro cn roiHr^^ooi φ - ·Η

0 I c/i id 1 όπιό hidoom1 in^næco l H ft G

+J I o I rlWH ri 1—I r-4 .—I CN I Ό Q 44 0 1 + 11 I C O 5c 4·) I I +1 + 1 + 1 +I + I + I+I +I + I+I + I+I I (d\ >1 >1 I S i 14¾¾¾ O I ft I H in ι-» Ομοιο lorfmcnco ι φ Q ε I u i n 'T h hriHin o ro in m cn 1 42 S (d tn 1 1 no\e nnno woon^ 1 54 w 54 I * I N Η Η HHHH I O Φ

φ I 4-> I I H ti M

Cn I φ I I G 54 (0 14-)1 I > <D 0) η ι h i i φ ti ε

o I > I r-IHrHH I rH rH H

54 I Ή I ooom oriin I 43 o +) 44 I 4J I OOOO OOO I £i

<d I 44 I I 5-1 0) ID

glnl I 0000000 I φ ti cn

ΙΟΙ I 4) G

efljj-H I O4O4O1O4O4P4O4 I HH 54* O) I ti I vvvvvvv I Ή Φ Ό I (0 54 I '—' ^ ^.—- *—. -—' .—- i o cn H 5c

DjI54 φ i λ (SlDlDif (ΝΜΗλλ i 5)04 HD

q 1 ε1 κι nnuiN 1 44 \ φ ti

ΟΙφ -Η I wwwww— <— W«—«— 1 -HU H

ι i ti +) ι ι ε Ph mi • i ft I β I CNIDH1 00000400 (O 00 CO CO O I 01 54 —< hi Q ι φ cn ι »«οι lotion Ηοο'ίοοι o Q φιη

Hl S I 54 Γ" ι Η Η Γ0 H CN H CN Η I O E<N

I I ftj I I CN +4 HH

D I Φ I > I +I + I+I +I + I + I + I +I+I + I+I+I I (0 +) ti w I ti I Φ II I ®<o o

9 1 Gltn I CN CN ID 00 ID CN "^l1 COOOOCN I Ο4 54 CN TO

I φ I φ i vd lo cn ro in cn cn ^ r~ N1 m ίο 1 Φ ·—

E-1 I ti I 43 I IflMO Mt'NO nCOKllDK) | G S

HIH I CNCNCN HHHCN Η H CN CN CN I φ O 54 ti O I H ι ι έω φ φ Λ i E4 I I p O 4J ε · φ I I I H dl 154 04 ti I I I O Η Φ 4) Ω

GI I φ I > Η Φ O

HI I G I +> 44 I

ι ι φ i +> - ε u a 5) 1 IH I φ Φ W ft φ I I (d I 54 4-> ε s

gi I — I Η Φ M

01 I 10 O ti I ti Φ * M

Ml I (G I 4-) H -Q <D 54 01 IfQ η Η I ti (¾ DM* a i 11 ε ε lHH>mε¾

HI I ID \ε s ε \= = = = I OH φ I 0 Q

HI I Η Cn tn I Dl O H ID M S

i (dim 5 g ιφ-G-Qho

φ I I O I ti Cu ffl 0< H

til 54 1 54 σι O IGM4JH54 φ I ΦΙΦ OCJIOO Hl HO φ 54 H +4 54 I tn I H - - - - -I Λ 4-> Φ

φ I (C IH OOOOO OOOHO I 54 CU Η Η Η H

«I 4-4ΙΦ H O O H I φ > H (ti (d

Hl O I Cl in Η I &1H Η φ

Hl 54 I 1(βΟ·υθ5|54

Hl 44 I ft I <4-4 ε 44H φ Φ

Hl <d I bl 5) Q: : : I OG (d ®<d G G

01 Ε I G Φ U 154 ε o O

>1 I IH Ε I I 44 O · 44 HH

Hl HIH O CM I (d 00 54 MTO 4-) 4-> I (d I ti M Q ε s s I E ^ Φ H O (d (d

Hl IGOS I gMH5)5j (dl tn i (d Ρί ι i ^ cn H 44 + +1 I GID! H 54 I O Gi 4-> O X G C! .tnl ΗΙφΗφ ΙΗ\+)φΦ GI HI.QC/1HE I O^OmOCl

HI til U 0 O IHPhCN+J GG

GI G I G ft 54 Μ=εε I CO >1 tn O 0 441 (d I φ I +»· O I in Q H CJ O ft ft

54 I -GI tnS G P< 1¾ I

Hl Φ I G g O H Q = = = = I — — '-'O

>1 m 1 h S ft i-3 S lid -Q Otl

DK 164918B

40 m

S

I g I

I Η I I O Pi tn I gi H i in p ro GI \ I 0HHIOS0

-Hl Hl O O O I Di H

Ml 0 1 ·»»·« I H O

-a i g i ooo i h o x

H I Λ G 1 v v v I G

Ti I I Di Gi Di I 'GO m G I - Η I 10¾ -η i -P i ^ i ε H tn

10) Ml 'tf flrliflH I o O

Η I ~ (!) Ol ^ VD'tfH'^l -I-> XI

-HI-H+J'O'tfl —'—’ —’ I 01 <D M

4-> I > o -H I vo 00 rgfMCNVOl Η Ό O

l-H-PDi I ro ro cn vocoH'tfl OG tn Μ I -P Η Η I H Η Η Η I G H (d O I 44 O H I i rd h

g I OH O I +1+1+1 +I + I + I + I I XJ CO O

o i o ω xj i i o P4 m tn i h 44 Di I nna o -tf o cn o I Λ \ Λ! O ι Ό O to ivocoo ΜΜο·ν i M o fd

Di I rd -P O i cn cn cn co Η ιο o I o ft g

Η I H o rG IHHH HHHI M CD

Η I -P Di I I Q H

I 0) >ι I HHHH I ^ (d

0 I TJ O «Η l O O O O I O H

Ό i G mi oooo lH(d tn

O I Ο ύθ I ^ ΙΛ G

MIM'-'OI OOOO I Μ H

Ο I IB Η I I M OG

in I > P O I Di Di Di Di I Og 44

Η I O CO X5 I V V V V I 4-1 O M

η i t n τι i »— i h tn >i Η I (ti + i GI 00H00OH I Η o Ό ΙΗΙΛ-ΗΙ -- CO Γ' O 00 I o Di g O I Hg Ol I MH (ti

>1 I rift M Ol N0OW CONNN I 44 H tQ

H IBU M 'tfl ocn in voooro I H

I o I cm H H mm I ε "O ω

H I ε i I o M

• I I O I +1 + 1+1 +1 + 1 + 1+1 I O ε o h i +> i t n i i o ε

Η I Ό i O liX'tfCNJO'tfCOVO I MM H

HI HI Di I t-^H'tf NOIMH I O 4-J · 10 I H lOMO'tf'tfM'tf I o(ti Η Ό

p I x! I P I CM CM CM I Dl H t£> M

w I O I I i o cn D

pa I Ό I I I G Ό

< I G I I I O — Μ H

E-ι I Η I I I g Μ O I

I I I GO +>—·· Οι · I I I Η T3 Hin Pi

P Μ I I I O H OCM P

0 φ I I I > Di H O

1 tn I lo I H -P Ό I

Pitdl IG Ι-υπεΟΡι

PHI 10 10 0 0 -η O

g O I IH I XJ +>^ g

Ml I rd — I H Di 01 i i o i w o 'G t n rd (ti 1 I tø Ι-ΡΟΛΟΜ

gi I P Η Η I -dxi g O

GI I CQ g g I H Di k* ε OHI l| \= s = \s = I O O-P 0

Gi i id tn tn I x! Η h O tn o-pi -+ ih δ 5 loo xa 44 o

Hol 1,1 I rn cn cn cn I Og MDi

-P -P I , I oo o o O I GG -P g H

rdHl « IM OOOO oooool H O g η M^l O 1 φ - s «-->.«. I CO +>

4-1 Η I t?IH 00 Ο O O HOOO I Μ H * H

G -P I I rH Η I OM > io rd

0441 ^10 I tno · HD

ordi ?io itdHM+)pM

GI hl Pi I Η H O 44 I O

O 44 I -¾ I P = = = Pi I Ο O ε (d to G

44 in I 2 I tn M O P = = = I ΜΗ H O

Hl g I G O I O I 44 O +) 44 m H

H tn I ih g Pi I i rd co tn -P

rd 44 I IH O P = = = pi I g '—’ 'tf Η M rd

ol ^1¾ tn g Qsss| CM tn O M

O-PI I G 0 I S I 'tf CQ 44 H 4-1

»1 O I g'IrdDi I I o pi H OH G

H 4-1 I S I XJ Η Μ M I H \ -POO

O >i I ^jlOHO 0 I Cl OOO

TJ O I £ I X! ω Η ε g I XftP 41H G

>i I ^ I U O O O I CO P >i»(d o H G I S I G IM M tn = s = tn: : i i inpoog« «η o i 2 i o i -p o o i

Ό I ·£ I tna G Dl Dl I

G Η I ® I G Μ o Η -H I ~ ~

Hid i « i h S W P P ltd Λ O

DK 164918 B

41 i +j 1 > ,

I <D I I I

o) i +) i J

Ό i ή i j o c* I 01 I I ·· H +>

Φ i J i I Ό P P 01 O

rrflOI I H 0) t n 0) 0) +> H I +J i I ft g 3 0>4J >1 OIOI I Ή o (If IU4J o rj i jJ I 1 H oi tnH (0 φ I >, I I O O O oi 0)

rrilOI 1 -3 ftP P H +J

c; I I I ft-H φ Λί Η p •H I <#> I I 01 i-H > (0 -P "S.

1 I Η I o .3 £ H

Hil O H I +3 P P Ό

Siqi o oi ft φ - φ φ 3 g i rn i ·. » I H S P tnH · ΟΙ I O Ol Η H ft (0 Cd ft

mi +ii i omcnmiD

oil V vi g O 0 O 3 P

ft s I I 3 ft I φ P P o

h i S i ft ft ! ^ ω IH

hiui i - in s ft h cd cn

I i ._. ^ ^ ______ I *- Q li g ιβ H

m i - i ro cm I o Cng Η Ό

. rrt | +) | '--'-'p' I ^5 I OM*' 0 P

φ φ I dl I w w I ft Q O P ffl ,¾ p i +) i ooo'tfro vovdhI wo Q η P4 > X Φ I -Η I WHOOIO NHtn I ftrio <d (ti 01 I >1 >—I i—I ΓΊ H HHH i I ‘ ^

p Ή I *H I I U Ό O ¢) <D

01 H I +j I +I+I + I + I + I +1 + 1 + 1 i ft 5¾ 1 510 21 tn η i ,¾ i i to £» o ιί fi

i©, m I Φ i cs σι ΐϋ n oo m· ud I Q > *h H

MO 101 ro rP r"- r- ro cn ud o I -P CjmD ιβ C

P >, i -H i OOCOOrP ud ro o I Η Φ 3. Η Φ P

OH I <0 ί M CN Η Η Η HHHI lUO Φ tn Ω <0 m i id i i c o xi (d si

rr) I p I I P (d Η H

C φ I I I φ Η Η · φ

φ g I φ I I g-QtncdH'd'Q

ιφ ΙΌΙ I o OP P tn c m i c i i oi co Φ tnD 3 i cd 3 ι φ i i o ft ft -P CdP · g I p I I ftX Q (d Η H C! Φ (d i tn i (ti I 1 HU pH 3 I M >

> I o (d > I i Hft\ pi- P H

ΗΙΡΙΦΙ I W ft 3 fflin >i +> I φ «Η I tn I I Ό Q Q φ 0ΚΝ Ό P4 P5 I +) i (d i i o g PH £ (d ΜΙΜΡΙΛΙ I SPHid-onj m I p φ I Η I I Φ 6>ιί O Μ Φ rtj I ©. tn I HI I +) g 3. P -n .* Ε·! I <H cd I E-c « 1 00 0)0)---03-¾

in i I φ φ I ip 01 O 01 P P H

ΟΙ I G 3 I ΌΟΗΗΗΌΟ)

Hl i φ Φ I fi ft φ H ffl 6 P

V| ί ip Η I (d H 01 Ό £ Η φ cdi i cd <d i ,3 η h 3 +> _ g I I I Φ > 0) · -P 3 . i i \o ud i ji » m > φ omd ffl Φ 3 I I p P I β p)4<n β

H pa I I m CQ I >rOH(d0)PO

id £ I i I I I 0) ·· O β IB P I

Η o I I ud ud 31 Hr-+!OOgOO

oil I H H 3 PQ I Λ 3 0) 01 +) ft Φϋΐ i pq PQ pq ϋ i ό φ > g

>p.| I G O I UD H +3 P UD Φ S

HQI I P POII \0 ‘fflj , .

(dSI I φ Φ I U I HÆJlHgfflP +

Il I ip ft HUftl CQ P Ό 3.H I £ M-l ft I I H Q HftQI tOC PVDO 0)

(dQlcdl 0) S oagl m Η φ o H +> G

ΟΙ i o O S I UOO^ftOlp 3 11 Gi + I + I +) H CN CN Q) Φ +) O I -PI - ft * ft i 01PO p Λ ε

Hil Hl tn PPQ tnQPI 3ffl-3*d+)®^0

Mvoi oli G φ φ O 3 U φ I gHOftOH>01 i i .. η ε ε i h i ε i οόόηφο 3 P I 31 tn H OOft Μ Η o O I H £ 3 3 3 Φ H ft

ΗΦΙ Hl T&tJ 0101Q tn Ό I oi I Cd Η Φ 3 U ,3 H

Hl 1013 0 02 « βΌΟ I - g > H

tnH I tnl pcd ftftl oi cd I ft I P Ol Ol 3 Oro +» H

3 φ I 31 0,3 HHp P ί PH I OftftH300 0 Η I η I Μ-l CL) Η ιΡ φ o Φ 0) Η I ft W O H +) p p ft ί ni ,Q HH g H ,3 £ Η ί ftU U > > Η·Ρ φ Q I Ό I φ OOO OOI 3 ft ft φ >4 O 3

> O I 3 1+) 3 P P 01 P 3 ffl P I Pt/lC/)+>H HO

Hil cdi οΐφ +)+)o φ o) o +» i oqq o)J3m ra « +)ftl +31 p tnoi 3 S ft Ό O1 ft 3 i P4QI 0)1 O- 3 ffl O O H 3 3HOI ^ I CQI ftHft^MH ri3HPl«| Cd

DK 164918 B

42

I 4J I I

1 0) I I

1-4-)1 I i I -Η I I Ai

10 1 I O

i h i i ·· ή +)

I W I I ΌΜ P 10 O

I ^ I I H O O' O O -P

O I O I I ft g C! θ'-P >1 •σ i -p i i-Honsm-Po βίοι I H dl tnMH ed

<D I -P I I O O O w O

Ό I >c I I ,β ft P P Η -P

Η I O I I ftH <1) X ·Η p 0 1 I HHlWH>ed-P'Si ,β I e#> I O Η O I 0 -P 6 Μη 0) I'— I O O O I ,β P 1-4¾ Ό I I -«.«.I ft φ - φ O β β I Q I OOOI Η P P 0Ή

Η I CQ I I Η H ffl S) iS

I I VVVl 0 O β Η ΜΗ O

P I +1. I I £ O 0 0 β O I S I ft ft ft I 3 ft I O p p £ I ft I I 0> M 0)

OlOl I in g ft H cd O' W 1 I — — — I - Q Cd £ cd O I -I — — —.—.in in o l o big Μη

ft i -Pi h cm cm m cm h I wSi ο-ψ O

Η I φ I I ft Q C P

Η I -P I I O o Q Η X

i -Hl mo'pnncoffimr.cTi i ft h 0 cd • Μη i >ι οωιηΌΝ'ίΜΠΗ i \ i · x £ Φ Cd 1 Η I Η Η HHHHH I U Ό O 0 .¾ I -P I I ft φ i β cn M-4 M ft I I +1 + 1+1+1+1 + 1+1 + 1 + 1 I CO £ vo Φ cd « H I cd I I Q > M-4 P fB I Ol OrHouo^r"iou) i +j δΜΜ! β w ·η i -Hl voor-'-ocninror'-Hl μη Φ d Η Φ tn λ i Ό I nnNnNf4inr"f I idd cd t n o O. I Id I ««OJNNCNHHH I β O .β (d

I I W Ό I P I 1 P cd Η H

I P O 1 I I φ ι-l H

Λ I O > I φ I I £ ,Q t n cd Η Ό · >IM-c Itfl I 0 OP P O'

Hl dl I β I I U) CG O ΟΌ β

I O P I O I I O ft ft -P β *d H

PJ I ·ΓΊ £ I p I I ft\ Q ed Η Η β WIO Iffil I -H U OH β I ,¾

§1 O cd · 1 > I I H ft \ -P .—> P

i P p ft i Φ i i to ft β Wm >t E-< I -P M-4 Q 1 O' I 1-0000 IflCM Ό Ο I Cd I log MHH £ ΡιΙΛΙ i EP iwdd id Φ — Il-Hi I O O' (d 0 dl tnQI-HI I -P £ 3 P -r»

cdlEHl I O O O O —1 W

Μη Q I ΙΦ I H dl O dl -P P

O—· I Ιβ I Ό0ΗΗΜΗΌΦ P ft I Ιφ I β ft O fx! O £

J4QI I -Η I id-H ΟΌ £ H

cdgl led I ,β Η Η β -p

Eli I O > O · -P

PI I VO I -II) > φ Oio ooi iPi i -d β p^o)

Pr-il I Ο 1 > ro H cd O P

ed Η I II I O ·· O β W P

•HOI I ID I Η Γ- ,β Ό O £ O

οι i pH o p i λ β o ω -p OPI i o m — m i . ·ΰ o > *·μη > CQ I I βΟ β I ΙΟΗί P VO o Ηβ| lp o o i \ o - o o

cdoi 10 IQ I I H il OH £ CQ -P

ii ih u—øfti hpusti i s ΜΠΟΙ - I h ftftft ft O I r-θβ^-ρνοο

Idftledl o OQO O 0 I inMHOO H-P Ql I O ggg gll U 'dOM'IBllI

P g I PI I— I .μ H cm cm o

Pil -PI - + + + ft ft Q I dl P O ΡΛ

Hftl Hl O' P O O 1 PSXJocd-PO

raoi en ι β o ø ø o i £ h o ft o h >

Øl IH £ I I -—-I O'd'tJHO

β I I βΙ H o ftOftl ΜΗ £ β fi β O H

ΗΟΙΗΙΌ dl . OIOI cd HOPO-Q

_ I I I β O g VO g I - £ >

tnvo 1 tn 1 nJ ft , . ί I P co en p Mdro -P

β I β I ,β H 1 1 1 I O ft ft H p O O

H-IHI o H = = = u I· ft w o H-P

P ft I Hl ,0 Η m I ft O 0 > > H

O Q I Ό I O £ I P ft ft O X O

>01 β I β P o = = I P CG CO -P H H

Hil (dl o -P w I 0 Q o o Λ m 01

-P ft I Λ I tnco β X, I

Λίοιοίβραο -ίΤ i —

CglpqiHftM o led

DK 164918 B

43 •

P · TJ

Φ Ό C

M P g Od)

(UQ) O · iH

I I m oo 10 i g g to S Λ O

ΙΌ| ·.·.·.! Og O (d M

ιοί i-qoiHi ra a Φ a 0>h Ό .—. I I—I I +1 +| +1 I O P +> H PS s

O I ffl I σι σι Π I 0(0 W Η O H

I I *·*»·»! Η I Φ · S

Sq i i rq on η I H A A H · P

<D i I I Q (d P A Di • I Ό I I I Φ S C _ A , <di q i i i c ta tn _p ci al i ~ i mug · c c ®. ~

Ml -Hl 1¾¾ I > Ό Η φ Ai O

(Dl Hil I Φ fl &| i—I P P ··

Cl 01+11 ΗΓΜΗΙ ΗΦΟ Η TS. W Γ~ (dl ΛΙΗΙ - - - i (drø H Ai g

Cn i A I Η I oool AH- +> P Ό mi ra 1 S 1 +1 +1 +1 1 O Φ tn jd ffl h

01 01 I ^fOUJl Hil M g g> O

I .c I i - - - 1 (d Φ Φ Φ HA

-Η I Al 1 es cn Η I MOS MMq+J M

^ I II I φ C Φ Η id A! O

(Q I Mq I I I +J*rlW (d Ή I (dl I I (d H qj o

Ο, I I I I H Μ H C *H qJ

Q I Q)l I -tf O CO I tf Φ +> Φ Ό P

Ol ral I - - - l C-Pg OtdIB

II Η I Μ I 00 in Η I Φ AH +> O P H

Λ I φ I φ I +1 +1 +1 I H +) Φ P _ O

Q I rQ I > I OfOCOl HH +) ftC g • I SI Η I φ I » - - I OH· -P __Φ w >1 I Olpl LO) I CN I C A H >1 gid

I <ui .Cl 1 h m *a> I OA ran C O U

Jl-dl φ I I I HCQOUOraHA

MICI O' I I I +> O A Λ (d Μ

(ΏΙΦΙ (dll I Μϋ ill S L +1 P

3 I Ό I A I I I φ A P Φ > X <x>

E-t|HI HI I I τη Ό Μ Φ >1 H

01 Η I I I C H ®. Η P g (d A I +> 1 I «-> I Η Ο ΦΛ A qJ 0

ΦΙ I I Ό I ECP H Ora M

ΌΙ dP I φ I I Ό g Φ <d g 3 Φ ci 1 O' 1 η h cn 1 φ rag 0 q->g HI ICI ---1 >U1 3 tn P Ai 0 I ICIHOOI - S Η φ>ιΐη

Ml IPI+l+l+ll WO (d - P 0

(D I I ID Ο) Ί I φ ^ W H +J A

P| 1 -- - I > · <D A Η Ό H

01 I 00 Η Η I Η H ra U 3 H

cn i i i 0>a< 3H Cn 01 i i oh φ ο cp p A I I I C ο Ό Φ Φ 0

Hl I I HCOHUP Ή HI I I 0 CN O A Ό· i i i ο a λ co λ: ό ρ (D I I I \Μ«ΰφΡΡ0Φ d I I I Η cd A O' cd Η ί> ΦΙ i i m u id g g A 0

Ml I I r- C Λ Φ H

(Dl I I ΙΟΌΦΗΗΗΦΗ wl I I UΦgHH(dAΦ

HI I I g 3 qJ Φ X

HI -.1 I MH gCPW

HI A I I 3 qJ Ο Φ Φ0Ρ HI I I g φ > Αί Ό (OH 0

0 1 — I I M m H H H

>tl Ό I I LO) M q-> Η Ο Φ Φ

HI HI I Μ Φ +> A Of C -P

I 01 I «(dgCPHMC

Η I AC I I A Η φ Ο Ο Φ (d

(dl Ml I - Ο H A +> A

I 01 I M CO — Ο φ(ΰΗ

ΦΙ 4q i I oa»cr>M+>tjiq->H

Cl I I A\ 3 A P <d Η H ·

Hi co+il I AU ft) Λ 3 C ιοί HI API I 3 A o C Η H to Coo <Di \ (¾ I cn 1 ΡωΗφΟΗφΗ- -o I UHl - I UP'-'O S Eq « too

Ml A Ο I fO O Ο I

0 1 CO g I ......I ·~ — — ~ A I p — 1 r~- t— r- 1 (d A ϋ Ό

DK 164918 B

44 (1) • I I I 5-1 Ό

~ I I ~ I Φ G

(0 1 λ I 'ϋ I H φ m ιοί i η ό 'ϋ ns U) I ^ I Η I φ H <D Φ

p I I Η I O I O O > tn G

PQ I DJ ni I o I +! d G — li tn > f - i m φ +3 η φ >i o I d G I o I o Ό φ ^ i—t φ Η I 3 Φ I .. I H d G Φ Ή d PQ I r—I +J I v I Η φ O Φ-Ρ

I GI ft I +3 O Η O H

m I m Η I I Φ CQ H -n j2

(ti I cti — I — —. —* I > ft ·η d m I

1 GI (M o m I H \ d H (ti G

gi r-i φ i ^ m ^ mi tn u -g c φ I (ti CO | | | Η I I fd PUG G (ti

CQ I +1(01 σ>00 I CNI'CJ CQ > Φ Φ S

(tilH+MiHHCNCNl -G Q Φ + tn +ji φ in i — ·—- '—' —' i h m d <d

CQ I Ό (ti I I φ m Λ φ -G CD

(til Ό +3 I H m oo in I C (ti G H

+3 i η Φ I m m ml φ cqcm φ Φ I S β I I > G PQ H om

SI I I Φ Φ ft HH

I I I H g tn -n otti I I I (ti OGO G = ft I I I Λ Dl d H pi II I O efl =

ft I 1 IH fto G

Q I I I (ti -Η O - Φ tn ΟΙ I I G H CM t'» +> "©.

til i φ m co

ft 1 I I +3 -«(ti -OG

• i D i i i (ti .—. ftin O

(ti i S i i i h »o h m

Hil I I H G *· ej ^ > i Φ i cq i i d ft φ m i ’d i di i φ -η s tn cq P I d 1 SI I H d Φ (ti d

Hl ΦΙ i m oo oo oo i -g og d Ό S

ml'dl Η I Η I +J 0 Φ H

Si hi φ i i d ft > tn «φ o

S· I 0 1 +> I 1 0 CQ (ti ft G

x3 i d i i -g o +> *d +3 Φ I <3 1 I +3 £! φ CQ d •0 1 I I M ft 0(0 φ o

dl I I Φ -G ft +1 M

•G I I I ·η H S

I I I G O ft Φ Φ H

GI I I H S Q G +> H

Φ I I I SS Φ CQ +3 si I I Ό ^ > Φ οι I 1 Φ in -G Φ J3 Ό

CQ I I I > H G Η H

Oli i om (ti G o ft I I I > ~ Λ · Φ +5

HI I I Φ tn O CO G

HI I I H CQ 2H (ti o il i Λ ft ^(ti tn +J m

φ I I I m \0 G (ti CQ

Ό I I tn I \ UH ΦΌ Cti H

Φ I I 3 I H ft +3 +3

GI I I PQ CQ G (ti oiti φ H

ΦΙ I o I r- Q φ H ft S Φ CQ I I H I in · Η φ μ

•GI I I U O G H d tn CQ

Hl I -I φ Φ φ p d G

hi i ft i cq t n S PQ G o mi i GQ i ditiOftmiH m οι I Φ C3 I S'dCQPdvo >1 i i SI i 0 Ό H m +> hi ^ i o ft i medftlOHiti d I Λ I CQ CQ Q I (ti ft H ft M (ti mi imos i ηρηφ+3·λ;

(til tnl ftftl tn I GvoHåOdOvoH

i di w h g di φ ρ o Ό G h p m

tnl Hl Η φ ^ I ftra G t n ΰ Φ H PQ H

dl Hl HH Sol ftl +33ΦΗ (01 d

Hl Ό I o O O Hl 3 '•O d > H +3 co tn

dl GI G G CQ I GHOOdOGHH

Αί I (til +3 +3 O *· I O CQ Η H (ti O < PQ CQ

GI +11 d G ftftl

Hl φ I O 0 Η P I —. - ^ — — >1 PQ I W Η P S I Φ Λ O Ό

DK 164918 B

45 3 μ m i I Q) C © o© I *-> I i—I I OHO > OT3 Ω,Ι Η I H in o I ί Η I HH ffl i i © i oool CM © U © £

cl, i © > I ..«.».I tDDjX

q i εη μ I oool O h Q Hl C

o I c © I I H Q S Q n © · II3-PI vvvi CMS I Q 0» ~ I H O 1 CM CM G, | Ή 5

Q I -H i IH &> Q · © -H

1-1 I H*-* I ~ 1 2 3.U <U ' G

p i id i -s oo —. ^ ^ i £ i C σΐ'Ρ X

—- i μι oo o o o η i ©o o © © μ μ η, I H (D I <y\ Η ^ Γ' ΠΙ 'Hl M 3 p i © w i i i i i li m . cd © ό *o p, i 4J (d I O LO H oo N I ""O Η Η H £ I H 4-1 I «d* 'S* CN H Hl O © &> © Ild μ i d) οι i " i —&>— ω © I *5 © i i fin Η I Ό H I Γ-' η H CM 00 I CD +1 O H HCM Cfl H I -H O) I UJ r~ n 'M* Hl P, OH li PJH μ © i S S I I \Ό μ -P ©J © φ i i u c &> © æ o ε

Cl I I PM © O -P ω ·η H

m i i i co h id *h —< -P

Cl I I Q Λ PM H ©

Oil I Q O«) II I I iWtDOfiUOOi

rn i I I (d PM \ Φ <D S

ft I I I \ o, -P μ

p I I I Μυα^Ή-Ρ O

SI I I (1) (¾ g « W O 4J

|| I I £ CO .¾ «Μ Ο, I I I 0 Q tJMll μ Φ

• I Q I I I w ^ μ * S

rj I ø I I I 0 Ih Η © £ W

Hil I I I CM © O © μ ©

> I O I I I Η £ Η ^ © * -P

III ωΐ i H o c) fi vo £

i_q i vo i 01 I o o O O J O

Ξι I £1 I ©5 o -H > c/l PQ -P

OQI^I I O CTv o O CTi I © o, > PJ I W

^ I ft I HIH I £ H W © P <45 © hiqi ©i i h ©j © η λ

Øl +J I I +> H ©3 £ PQ

|| Cl I © ». O © H 4-> ρ,ι <i i η -χΛ > +j μ ©

Q| I I ©MS © -P

a I I I β .. J) »'ϊΗτΙ I I I lihilHiNH ϋ φ I I I Λ 5 © Ή hi i i od o p ο oi ci i i λ h ©3 o © x

© I I I o fi O On O

©J | I I > .q © om C o +> HI I I © μ ©3 3 H o O l I I Η O H «S > 4-1 ,C I I 3 I Λ 4-1 0 CM1© X >1 © I I pi X! fi © r^l i C i co -P © C m ci i o i \ μ ©3 © > © HI I I I H (¾ C £ © © 4-1 • i i ø cm i pq η ·η 3 η © μ μνοί I PM P I r- o Η X) +> & ©hi i o o i © εω o -ρμ

En i i Sii u pm > μ © ©3

Oli I I — I © to 3

Dl vo I I Ρ,Ρ,ΡΙ 01 Cfl U -P &>H H

ohi i μ p p i 3 pm pm © © -h o,m i i © ø o p i g'xco >μ+i ©

Hl I £1 I w I O P H O fi η h i ^ i -vOpmopmi ή pm μμμ ©i ©i co wQ i pi © co μ © ©

Hl IpOScoSI P©P!©CnCn ©μι tnl CM CM I I II μ £ © £ © © ©i c i ·— η μ i © .. o tn mm h

tjitol Hl Η© I Pi© æ © O O

c © i hi HH g i cm-h o μ μ μ μ Η -Ρ I ©3 I Ο 0 Ο I 3 Ο, CM Φ © ,¾ Α< ο η i c ι μ μ © - = ι μ η η > η © © ^;©Ι ©I -Ρ Η Ο I 0 Η Η ,© Ο £ £ μ +1 I X! I c fi CM ι Η © I © I Ο 0 Η I — > £ I ffl ι H SscJ Η I ©

DK 164918B

46 TABEL VII.

Beskyttelsesvirkning af MDP-GDP og derivater deraf, som i vandig suspension injiceres i mus, der er inficeret med Klebsiella pheumoniae,

Behandling på dag -1 (iv) Overlevende Beskyttelse (15 dage) (%)

Kontrol 1/56 MDP, 100 *ig 30/56 52 MDP-GDP, 100 /ig 32/48 65

Kontrol 0/32 MDP, 100 jag 15/32 47 MDPG-OnBu, 100 /ig 20/32 62,5 6-O-GDP-MDPG-OnBu, 100 jag 22/32 68,7

Kontrol 0/24 MDP, 100 μg . 12/24 50 MDP (D,D) , 100 ^ig 5/24 20,8 MDPG(D,D) , 100/ig 20/24 83,3

Mus inficeret med 10^ K.pneumoniae.

47

DK 164918B

TABEL VIII.

Beskyttelsesvirkning af MDP-GDP og derivater deraf, der er inkorporeret i liposomer, i mus, som er inficeret med Klebsiella pneumoniae.

„s i /-i,,λ Overlevende Beskyttelse

Behandling pa dag -1 (xv) (15 dage) (%)

Liposomer uden 2/24

Liposomer-MDP-GDP, 0,01 /ig 6/16 31,2 " " " , 0,1 /ag 18/24 66,7 " " ", 1 Aig 18/24 66,7 " " " , 10 jag 20/24 75

Liposomer uden 2/24

Liposomer-6-O-GDP-MDPG-OnBu, 1 ja g 8/24 25 " " , 10 jag 15/24 54

Liposomer uden 2/24

Liposomer-MDPG (D,D) , 1 flg 4/24 8 " " , 10 jag 14/24 50 4

Mus inficeret ad venøs vej med 10 K.pneumoniae.

DK 164918 B

48 TABEL IX.

Forøgelse af beskyttelsesvirkningen mod Klebsiella pneumoniae ved at kombinere MDP eller MDP-GDP med en svag dosis anbiotika.

Behandling på dag -1 Overlevende Beskyttelse * (15 dage) (%)

Kontrol 0/24

Gentamicin 5/24 21 MDP, 30 /ug 1/24 4 MDP + gentamicin 14/24 58 MDP-GDP, 30 /ug 4/24 16 MDP-GDP + gentamicin 14/24 58 4

Mus inficeret ad venøs vej med 5 x 10 K.pneumoniae.

Gentamicin, 10 /ug ad subkutan vej 2 timer efter infektion.

MDP eller MDP-GDP, 30 /ug ad venøs vej 24 timer før injektion.

N.B. Ved disse forsøg foretages infektionen med et større antal bakterier end sædvanligt for at komme i en situation, hvor MDP kun har en svag virkning.

49

DK 164918B

TABEL X.

Beskyttelsesvirkning af andre forbindelser tilhørende GDP-rækken i mus, der er inficeret med Klebsiella pneumoniae.

Behandling på dag -1 (iv) Overlevende Beskyttelse (15 dage) (*;

Kontrol 2/16 MDP-L-Ala-GDP 12/16 63

Kontrol 2/16 MDP(D,D)-L-Ala-GDP, 100 Mg 6/16 25

Kontrol 0/16 6-O-GDP-aminocaproyl-MDPG-OnBu, 100 Mg 9/16 56

Mus inficeret ad venøs vej med 10^ K.pneumoniae.

50

DK 164918 B

TABEL XI.

Kombination af MDP-GDP og Amphotericin B.

Behandlina Overlevende Beskyttelse

Behandling (10 dage) (|)

Kontrol 0/16

Amphotericin B, 3 /ag 2/16 13 MDP-GDP, 100 jug/dag/4 dage 3/16 19 MDP-GDP + Amphotericin B 11/16 69 MDP (D,D) -GDP, 100 /ag/dag/4 dage 0/16 MDP(D,D)-GDP + Amphotericin B 3/16 19

Mus inficeret ad venøs vej med 2 x 106 Candida albicans.

MDP-GDP injiceres ad venøs vej i en mængde på 100 /ag/dag i 4 dage (-4, -3, -2 og -1),

Amphotericin B, 3 /ag, injiceres ad subkutan vej på infektionsdagen.

TABEL XII.

Beskyttelsesvirkning af MDP-GDP mod en infektion med Candica albicans.

Behandling Overlevende Beskyttelse (dag -4, -3, -2 og -1) (10 dage) (%)

Kontrol 0/8 MDP-GDP i vandig suspension (100 /ag x 4) 6/8 75 MDP-GDP i liposomer (10 /ag x 4) 5/8 62,5 " " " " (30 /ag x 4) 6/8 75

Mus inficeret ad venøs vej med 106 Candida albicans.

Claims (11)

1. Muramylpeptidderivater, kendetegnet ved følgende 5 formel : Z -1 1—0 / \/v**OR, , io Ri4°NHCOCH3 R, 'CO-X-NH-CH-CO-R-X I £

15 CH, CH2“CO-A~Y 20 hvori substituenterne Rj, R2, Ru, R14, X, Y, A og Z har følgende betydninger: - Rj er H eller CH3,

25. R2 er gruppen -NH2, -OH eller -0V, hvor V er en hydrocarbon- gruppe omfattende 1-10 carbonatomer, - Ru er et hydrogenatom eller en phenylaminogruppe,

30. R14 er et hydrogenatom eller en acylgruppe med 1-4 car bonatomer, - X er en aminoacy1 rest valgt blandt: alanyl, valyl, isoleu- cyl, norleucyl, leucyl, seryl, threonyl, prolyl, glutaminyl, 35 asparaginyl, methionyl, tryptophanyl, phenyl al any1, tyrosyl og glycyl, hvilken aminoacy1 rest kan være N-substitueret med en lavere alkylgruppe, især methyl gruppen, DK 164918B - Y har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe -0CH2"CH0(R3)CH20(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller forskellige, er alkyl- eller acylgrupper omfattende 8 - 100 car-bonatomer, 5 - Z har samme betydning som R2 eller er en lipofil gruppe -W-B-C0-CH0(R3)CH20(R4), hvor R3 og R4, der er ens eller for skellige, er alkyl- eller acylgrupper omfattende 8 - 100 car-bonatomer, idet methylengrupperne indeholdt i glycerylgrupper- 10 ne, R3 og R4, eventuelt er substitueret med en lavere alkyl-gruppe, især methyl gruppen, hvorhos imidlertid i det mindste den ene af de to grupper Y og Z altid består af den tilsvarende lipofile gruppe,

15. W er et oxygenatom eller, når Z er den ovennævnte lipofile gruppe, en NH-gruppe, - A og B er enten direkte bindinger eller brodannende arme, især grupper, der er ens eller forskellige grupper omfattende 20 fra 1 til 3 aminoacylrester, der selv er ens eller indbyrdes forskellige, eller også en gruppe -NH-(CH2)p-CO, hvor p har en værdi mellem 2 og 10, eller -NH-CH2-H2-O-, og en af glutamyl-restens methylengrupper eventuelt er substitueret med en lavere alkylgruppe, især methylgruppen. 25

2. Derivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gruppen X er en venstredrejende aminosyrerest, undtagen når aminoacylgruppen er andet end glycyl, såsom fortrinsvis L-alanyl, L-seryl, L-valyl, L-leucyl, L-isoleucyl, L-threonyl 30 eller glycyl.

3. Derivater ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R2 udgøres af en alkylgruppe.

4. Derivater ifølge ethvert af kravene 1 - 3, kende tegnet ved, at grupperne A og B udgøres af direkte bin-di nger. DK 16491S B S3

5 -R2 er en alkyloxygruppe omfattende 1-10 carbonatomer, især 4 carbonatomer, specielt n-butyloxy, og - Y er gruppen NH2. 10

6· Derivater ifølge ethvert af kravene 1 - 5, kende tegnet ved, at R3 og R4 udgøres af palmitoylgrupper.

5. Derivater ifølge krav 4, kendetegnet ved, at - gruppen Z udgøres af den nævnte tilsvarende lipofile gruppe,

7. Middel af liposomer eller middel, der let kan omdannes til liposomer og indeholdende en eller flere forbindelser ifølge 15 ethvert af de foregående krav sammen med lipider, der muliggør produktion af liposomer, kendetegnet ved en, overgangstemperatur Tm over 37°C, idet lipiderne især er phosphor-lipider dannet ud fra fedtsyrer, der i deres kæder har fra 14 til 30, fortrinsvis 16 - 24 carbonatomer. 20

8. Middel ifølge krav 7, kendetegnet ved, at lipo-somerne er dannet ud fra blandinger af distearylphosphatidyl-cholin (DSPC) eller diphosphatidylcholin (PC) og phosphatidyl-serin (PS) i forholdet 7 volumener DSPC eller PC til 1-10 25 volumener PS, fortrinsvis 3 volumener PS.

9. Middel ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at det er dannet af suspensioner af liposomerne i fysiologisk acceptable vandige opløsninger, fortrinsvis sterile og isoto- 30 niske, hvilke 1 iposomsuspensioner især omfatter fra 4 til 400 mikromol lipider og fra 20 til 2.000 mikrogram lipofile mura-mylpeptidderivater ifølge ethvert af kravene 1-6 pr. ml.

10. Stabile 1iposommidler ifølge krav 7 eller 8, kende-35 tegnet ved, at liposomerne foreligger i lyofiliseret ti Istand. DK 164918B

11. Liposommiddel ifølge krav 10, kendetegnet ved, at de lyofi 1iserede liposomer fastholder fra 20 til 2.000 mikrogram lipofile muramylpeptider ifølge ethvert af kravene 1 -6 pr. 4 til 400 mikromol lipid. 5 10 15 20 25 30 35