CN118271388A - 一种类固醇-阳离子脂质化合物及其应用 - Google Patents

一种类固醇-阳离子脂质化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种式(I)所示类固醇‑阳离子脂质化合物，由其制备的LNP可以高效稳定的将生物活性物质递送至靶细胞或器官；特别地，由其制备的mRNALNP具有较佳的稳定性和转染效率，在动物体内可引起较高的特异性抗体应答和细胞免疫应答。

Description

一种类固醇-阳离子脂质化合物及其应用
技术领域
本发明属于本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于类固醇-阳离子脂质化合物以及在生物活性物质递送中的应用。
背景技术
阳离子脂质体是一种非病毒载体，具有类细胞结构和生物膜的特性，其可利用其正电性与负电性的RNA药物形成稳定复合物用于RNA药物的递送，Felgner等1987年最先使用了N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-氯化三甲铵(DOTMA)用作基因载体运载DNA转染细胞，随后国内外研究者们开始将阳离子脂质体作为基因载体在基因治疗领域进行了广泛的研究。
但是，阳离子脂质体的安全性问题和低转染效率会限制其在临床上广泛应用。具体地，阳离子脂质体相关产品表面可能带有正电荷，易于与带有负电荷的血清蛋白发生非特异性吸附，形成大尺寸的聚合物，该聚合物易被单核吞噬系统清除，从而导致阳离子脂质体基因复合物在血液中的循环能力变差，转染效率降低，因此，需要将阳离子脂质体进行修饰来获得兼顾安全、低毒、稳定的阳离子脂质体。
现有技术中报道了许多修饰后的阳离子脂质，比如专利文献CN103930398A公开了一种结构如下的脂质：该结构能够实现高细胞内表达效率。专利文献CN114787127A公开了一种通式为的脂质，还提供了脂质纳米颗粒(LNP)组合物，专利文献CN 114929205 A公开了一种通式为如下的脂质：专利文献WO 2021/089030A1公开了通式为：的化合物，并公布了其在制备核酸递送试剂中的用途。现有技术通常将修饰后的阳离子脂质与类固醇、中性脂质，PEG-脂质、核酸药物等成分制备成LNP递送系统。例如：专利文献AU2020325221A1公开了一种靶细胞传递LNPs的组合物，包括(i)可电离脂质；(ii)甾醇或其他结构脂质；(iii)非阳离子辅助脂质或磷脂；(iv)PEG脂质和(v)封装在LNP中和/或关联的药剂(例如核酸分子)，这四组分以特定的配比增强靶细胞的递送效率。专利文献WO2021/250263A1公开了一种包括可电离脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和一种或多种核酸，公开了包括小于约1mol％的C14-PEG2000脂质，以及其他脂质的特定百分比。专利CN102712935B公开了一种脂质粒子，其包含：阳离子脂质；中性脂质、两性离子脂质或阴离子脂质；PEG-脂质；甾醇及核酸，并将上述组分组装成具有实体核心的有实体核心的脂质粒子，其实体核心能达到更高的包覆效率。专利文献WO 2021/026358 Al公开了一种靶细胞传递脂质纳米颗粒(LNP)：包括(i)可电离的脂质(ii)甾醇或其他结构脂质；(iii)非阳离子辅助脂质或磷脂；(iv)有效载荷；(v)聚乙二醇脂质，作为一种药物递送系统，兼顾安全性和有效性。
由此可见，现有技术通过对组合物种的各组分的用量进行优化，以及对阳离子脂质进行优化，得到更加安全有效稳定的LNP递送系统，为了进一步获得更加有效、安全、稳定的LNP递送系统，还需要对其组分和各组分的结构进行进一步的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子脂质化合物及其制备方法和应用，通过本发明阳离子脂质化合物制备得到的LNP安全有效、生物相容性好、体内mRNA转染效率高、稳定性高、生物安全性高。
为了实现上述目标，本发明提供一种阳离子脂质化合物，其具有式(I)所示结构：
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Xa和Xb各自独立的选自
其中，R4是C1-C6的烷基；q为1或2的整数；
Z和Z’各自独立地选自S、C或化学键；
R1a和R1b各自独立地选自C1-6的亚烷基或C3-C8的环亚烷基；
R2a和R2b各自独立地选自C1-6的亚烷基；
Ya和Yb独立的选自：-O-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)NRa-、-NRa(C＝O)-、-NRa-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-OC(＝O)S-或-SC(＝O)O-；
Ra为H或C1-C12的烷基，包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12的烷基；
m和n各自独立地选自1、2或3；
R3a和R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；
所述C6-C24的烷基包括不限于C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C23和C24的烷基；
所述C6-C24的单烯基或多烯基包括不限于C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C23和C24的单烯基或多烯基；
所述C6-C24的单炔基或多炔基包括不限于C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C23和C24的单炔基或多炔基；
条件是，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
在一些实施方案中，本发明的式(I)所示的阳离子脂质化合物为式(II)所示的阳离子脂质化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Xa和Xb各自独立的选自
其中，R4是C1-C6的烷基；q为1或2的整数；
Z和Z’各自独立地选自S、C或化学键；
R1a和R1b各自独立地选自C1-6的亚烷基或C3-C8的环亚烷基；
R2a和R2b各自独立地选自C1-6的亚烷基；
Ya和Yb独立的选自：-O-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)NRa-、-NRa(C＝O)-、-NRa-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-OC(＝O)S-或-SC(＝O)O-；
Ra为H或C1-C12的烷基；
R3a和R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；其中，所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；
条件是，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
在一些实施方案中，在本发明式(I)和/或式(II)的阳离子脂质化合物中，所述Xa和Xb选自其中，q为1或2的整数。
在一些实施方案中，在式(I)所示的阳离子脂质化合物中，所述Z和Z’各自独立地选自S或C。
在一些实施方案中，在式(I)所示的阳离子脂质化合物中，所述Z和Z’各自独立地选自S。
在一些实施方案中，本发明式(I)和/或式(II)的阳离子脂质化合物为式(III-1)、式(III-2)或式(III-3)所示的化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b如本文所定义。
在一些实施方案中，在本发明的阳离子脂质化合物中，
所述R1a和R1b各自独立地为C1-C6的亚烷基，包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5和C6的烷基；
所述R2a和R2b各自独立地为C1-C3的亚烷基，包括但不限于C1、C2和C3的烷基；
Ya和Yb各自独立地选自：-O-、-O(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或-C(＝O)-；
所述R3a、R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；其中，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
在一些实施方案中，在本发明的阳离子脂质化合物中，所述类固醇选自：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和/或石胆酸。
在一些实施方案中，本文所述类固醇基团为甾醇基团。
在一些实施方案中，本文所述甾醇为动物甾醇，或者其氧化形式或还原形式；和/或，所述甾醇为植物甾醇，或者其氧化形式或还原形式；和/或，所述甾醇为合成甾醇，或者其氧化形式或还原形式。
在一些实施方案中，本文所述的甾醇选自胆固醇、胆固醇的氧化形式、胆固醇的还原形式、石胆酸烷基酯、豆甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、麦角甾醇和/或谷甾醇。
在一些实施方案中，本文所述的甾醇为胆固醇的氧化形式、胆固醇的还原形式、石胆酸烷基酯、豆甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、麦角甾醇和谷甾醇。
在一些实施方案中，本文所述类固醇基团具有如下所示结构：
其中R为C1-20烷基，包括不限于(C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19和C20的烷基)。
在一些实施方案中，本发明式(I)和/或式(II)的阳离子脂质化合物为式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、式(IV-5)、式(IV-6)、或式(IV-7)所示的化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，R3b选自脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a和R2b如本文所定义。
在一些实施方案中，本发明式(I)和/或式(II)的阳离子脂质化合物为式(V-1)、式(V-2)、式(V-3)、式(V-4)、式(V-5)、式(V-6)、或式(V-7)所示的化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，R3b选自脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a和R2b如本文所定义。
在一些实施方案中，在本发明的阳离子脂质化合物中，R3b选自：
在一些实施方案中，在本发明的阳离子脂质化合物中，所述C6-C24的烷基包括如下中的任一种：
在一些实施方案中，本发明的阳离子脂质化合物选自：
或其或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供一种LNP，包括本发明所述的阳离子脂质化合物。
在一些实施方案中，本发明所述的LNP还包括聚乙二醇脂质和至少一种第二脂质；所述第二脂质选自：中性脂质、两性离子脂质或阴离子脂质。
在一些实施方案中，所述的聚乙二醇脂质选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-(PEG-c-DMA)；
和/或，
所述的中性脂质选自：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)。
在一些实施方案中，所述LNP中本发明所述阳离子脂质：第二脂质：PEG-脂质摩尔比为10～60：20～80：1～30；优选地，本发明所述阳离子脂质：第二脂质：PEG-脂质摩尔比为40～60：40～60：1～10；更优选地，本发明所述阳离子脂质：第二脂质：PEG-脂质摩尔比为49：49：2和/或49.25：49.25：1.5。
在一些实施方案中，所述LNP的氮磷比为(1～15)：1；例如，氮磷比可以为1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10：1、10.5：1、11：1、11.5：1、12：1、12.5：1、13：1、13.5：1、14：1、14.5：1或15：1；优选地，所述LNP的氮磷比为(2～10)：1；更优选地，所述LNP的氮磷比为(4～8)：1；最优选地，所述LNP的氮磷比为8:1。
在一些实施方案中，所述LNP具有15nm～300nm的直径；包括不限于15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、80nm、100nm、150nm、200nm、250nm或300nm。优选的，所述LNP具有50nm～100nm的直径。
本发明中，颗粒的大小、电荷、及表面性质等理化因素可能会影响LNP的递送，合适的LNP粒径能够使生物活性物质有效地进入靶向器官，增强LNP的效力。
在一些实施方案中，本发明还提供一种本发明所述阳离子脂质化合物和由其制备的LNP在制备生物活性物质递送系统中的应用。
在一些实施方案中，本文所述的生物活性物质可以为小分子化合物、核酸、寡肽等；优选地，所述的生物活性物质为核酸。
在一些实施方案中，本文所述的生物活性物质为DNA或RNA。
在一些实施方案中，本文所述的DNA包括非编码DNA(反义DNA)或编码DNA。
在一些实施方案中，本文所述的RNA包括反义RNA、saRNA、mRNA、lncRNA、miRNA、siRNA、piRNA、gRNA、tsRNA、circRNA和自复制mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸用于预防和/或治疗癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫病、感染、精神性病症、血液病、染色体疾病、遗传病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、眼病、生殖性疾病、心脏病、肾病、肺病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、皮肤疾病等。
在一些实施方案中，所述的生物活性物质递送系统为mRNA疫苗。
在一些实施方案中，所述mRNA疫苗可以用于预防癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染等。所述的病毒包括但不限于：诺如病毒、埃博拉病毒、冠状病毒(包括新型冠状病毒SARS-CoV-2)、巨细胞病毒、登革热病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒、肠病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒或麻疹病毒等。
在一些实施方案中，本发明还提供了所述LNP用于制备mRNA疫苗的用途。
本发明的LNP的制备方法可以采用本领域的常规方法，例如微流控技术。
在一些实施方案中本发明还提供一种药物，所述的药物包括本文所述的生物活性物质和LNP。
在一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在一些实施方案中，本发明所述的药学上可接受的辅料例如是载体、佐剂、稀释剂等。
在一些实施方案中，本发明所述的类固醇-阳离子脂质化合物、LNP或药物可以通过口服、吸入或注射的方式递送所述生物活性物质。
在一些实施方案中，本发明所述的药物为基因药物。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种递送生物活性物质的方法，所述的方法包括向有需要的人群施用本发明所述的药物。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述特定结构的阳离子脂质化合物，粒径可控，分布均一，具有单分散性，对带有负电的药物具有很高的包封率，并且兼顾生物毒性低、稳定性好。
(2)本发明所述的阳离子脂质化合物作为mRNALNP具有较佳的稳定性和转染效率，在实验动物体内可引起较高的特异性抗体应答和细胞免疫应答。
附图说明
图1示出生物发光检测HEK293T细胞中Luc-mRNA-LNP的转染效率。
图2a示出ELISA检测小鼠免疫新冠病毒抗原mRNA-LNP后血清抗原特异性抗体滴度。
图2b示出ELSPOT检测小鼠免疫新冠病毒抗原mRNA-LNP后PBMC中IFN-γ+细胞应答水平。
图2c示出ICS检测小鼠免疫新冠病毒抗原mRNA-LNP后脾中特异性CD4+T细胞应答水平。
图2d示出ICS检测小鼠免疫新冠病毒抗原mRNA-LNP后脾中特异性CD8+T细胞应答水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明术语“LNP”，Lipid Nanoparticle，脂质纳米粒，术语“LNP”是指具有纳米量级，例如1nm至1,000nm的颗粒，其包含一种或多种类型的脂质分子。
本发明术语“基因药物”通常由含工程化基因构建体的载体或递送系统组成,其活性成分可为DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞,通过将外源基因导入靶细胞或组织,替代、补偿、阻断、修正特定基因,以达到治疗和预防疾病的目的。
本发明术语“核酸”是指呈单链或双链形式的含有至少两种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA及其杂交物。
本发明术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且通常以难溶于水但可溶于许多有机溶剂为特征。
本发明术语“阳离子脂质”是指能够带正电的脂质分子。
本发明术语“中性脂质”术语是指不带电荷的、非磷酸甘油酯的脂质分子。
本发明术语“聚乙二醇脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。
本发明术语“递送系统”是指调控生物活性成分在空间、时间及剂量在生物体内分布的制剂或组合物。
实施例1化合物1的合成
步骤1：化合物1a的合成
将双(2-羟乙基)二硫化物(100.0g,0.648mol)溶于2.0L二氯甲烷中，加入三乙胺(196.8g,1.945mol)。冰水浴降温至0℃，加入对甲苯磺酰氯(296.5g,1.555mol)，加料完毕后升至室温搅拌16h。取样进行HPLC检测，确认反应完全。分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水各洗涤2次，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩，得到褐色油状物。加入乙酸乙酯，随后在搅拌下缓慢加入正己烷，继续搅拌30min，过滤，得到滤渣，在室温下真空干燥16小时，得到化合物1a(255g，白色固体)，产率85％。
步骤2：化合物1b的合成
将化合物1a(255.0g,0.551mol)溶于3.8L乙腈中，加入碳酸钾(228.2g,1.654mol)，和2-(哌啶-4-基)乙醇(213.7g,1.654mol)，升温至40℃，搅拌16h，HPLC监测反应完全。经硅藻土过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液浓缩至无液体蒸出，加入二氯甲烷，用2.5L 5％碳酸氢钠水溶液洗涤2次，然后用水洗涤2次，有机相经无水硫酸钠干燥，40℃浓缩，得到化合物1b(154g，深棕色油状物)，产率74％。
步骤3：化合物1c的合成
将胆固醇(10.0g，25.86mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入DMAP(0.6g，5.17mmol)，三乙胺(5.2g，51.71mmol)，再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(5.7g，28.44mmol)，室温搅拌反应16h，TCL监测显示反应完全。将反应液滴加入乙腈中，有固体析出，结晶，抽滤，滤饼烘干得到化合物1c(13.0g，白色固体)，产率91％。
步骤4：化合物1d的合成
将化合物1c(10.0g，18.12mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入化合物1b(6.8g，18.12mmol)，EDC·HCL(2.6g,13.59mmol)和DMAP(0.22g,1.81mmol)，室温下搅拌反应16h，TCL监测显示反应完全。将反应液浓缩，加入正己烷溶解后用乙腈搅拌洗涤2次，将正己烷相浓缩，柱层析分离，得到化合物1d(9.7g，淡黄色油状物),产率68％。
步骤5：化合物1的合成
将化合物1d(5.0g，6.30mmol)溶于50mL二氯甲烷中，加入2-己基癸酸(1.63g，6.30mmol)，EDC·HCL(1.8g，9.41mmol)，DMAP(0.16g，1.26mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩。随后加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，将正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物1(2.9g，淡黄色油状物)，产率45％。
MS m/z(ESI):1027.9[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,4H),2.95-2.80(m,8H),2.71-2.50(m,4H),2.47-2.36(m,3H),2.11-1.78(m,9H),1.76-0.85(m,77H),0.70(s,3H)
实施例2化合物2的合成
将化合物1c(10.0g，18.12mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入化合物1b(3.4g，9.06mmol),EDC·HCL(5.19g，27.18mmol)和DMAP(0.44g，3.62mmol)，室温下搅拌16h，TCL监测显示反应完全。将反应液浓缩，加入正己烷溶解后用乙腈搅拌洗涤2次，将正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物2(4.0g，棕色固体),产率37％。
MS m/z(ESI):1203.1[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,2H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,2H),4.20-3.95(m,4H),2.95-2.80(m,8H),2.71-2.50(m,4H),2.47-2.36(m,4H),2.11-1.78(m,14H),1.76-0.85(m,80H),0.70(s,6H)
实施例3化合物3的合成
将化合物1d(5.0g，6.30mmol)溶于50mL二氯甲烷中，加入维生素E琥珀酸单酯(3.34g，6.30mmol)，EDC·HCL(1.8g，9.41mmol)和DMAP(0.16g，1.26mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物3(2.6g，淡黄色油状物)，产率32％。
MS m/z(ESI):1303.2[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,4H),2.95-2.80(m,4H),2.71-2.50(m,8H),2.47-2.36(m,14H),2.11-1.78(m,15H),1.76-0.85(m,82H),0.70(s,3H)
实施例4化合物4的合成
步骤1：化合物4a的合成
将1,6-二溴己烷(244mg，1.0mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，2-(哌啶-4-基)乙醇(223mg，2.5mmol)，碳酸钾(550mg，4.0mmol)，碘化钾(332mg，2.0mmol)，在83℃下搅拌16-20h。将反应体系冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，向得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到化合物4a(215mg，淡黄色油状物)，产率63％。
步骤2：化合物4b的合成
将化合物1c(552mg，1.0mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入化合物4a(341mg，1.0mmol),EDC·HCL(288mg,1.5mmol)和DMAP(25mg,0.2mmol)，室温下搅拌16h，TCL监测显示反应完全。将反应液浓缩，加入正己烷溶解后用乙腈搅拌洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物4b(535mg，淡黄色油状物),产率71％。
步骤3：化合物4的合成
将化合物4b(753mg，1.0mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2-己基癸酸(253mg，1.0mmol)，EDC·HCL(288mg，1.5mmol)和DMAP(25mg，0.2mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩至干，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物4(525mg，淡黄色油状物)，产率53％。
MS m/z(ESI):991.9[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,4H),3.01(t,4H,J＝6.4Hz),2.57-2.36(m,6H),2.11-1.78(m,9H),1.76-0.85(m,86H),0.70(s,3H)
实施例5化合物5的合成
将化合物1d(5.0g，6mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(1.3g，10mmol)，再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(2.2g，11mmol)，反应室温搅拌3h，在此反应液中加入9-十七醇(2.5g，10mmol)，混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完成后，加入20mL二氯甲烷稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到产品5(3.1g，淡黄色油状物)，产率48％。
MS m/z(ESI):1071.8[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,2H),4.20-3.95(m,4H),2.57-2.36(m,4H),2.11-1.65(m,20H),1.76-0.85(m,80H),0.70(s,3H)
实施例6化合物6的合成
将化合物1d(5.0g，6mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(1.3g，10mmol)，再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(2.2g，11mmol)，反应室温搅拌3h，在此反应液中加入十一胺(1.7g，10mmol)，混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完成后，加入20mL二氯甲烷稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到产品6(3.0g，淡黄色油状物)，产率51％。
MS m/z(ESI):986.7[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,4H),3.19(t,2H,J＝5.4Hz),2.57-2.36(m,7H),2.11-1.65(m,6H),1.76-0.85(m,79H),0.70(s,3H)
实施例7化合物7的合成
步骤1：化合物7a的合成
将胆固醇(2.0g,5mmol)和琥珀酸酐(1.0g,9mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入吡啶(1.6g，20.7mmol)和DMAP(0.2g，2mmol)，将反应混合物加热回流6h。取样进行HPLC检测，确认反应完全。减压浓缩，向混合物中加入5％盐酸(10mL)，用乙醚(3×20mL)萃取，合并有机相，用盐水洗涤2次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩。经柱层析纯化，得到化合物7a(0.9g，白色固体)，产率36％。
步骤2：化合物7b的合成
将化合物1b(0.75g，2mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入化合物7a(0.9g，2mmol)，EDC·HCL(0.9g，4mmol)，DMAP(0.1g，0.8mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩完，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物7b(0.68g，淡黄色油状物)，产率40％。
步骤3：化合物7的合成
将化合物7b(600mg，0.7mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入2-己基癸酸(180mg，0.7mmol)，EDC·HCL(270mg，1.4mmol)和DMAP(33mg，0.3mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩完，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物7(364mg，淡黄色油状物)，产率48％。
MS m/z(ESI):1083.8[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,4H),2.95-2.80(m,8H),2.71-2.50(m,14H),2.47-2.36(m,5H),2.11-1.78(m,6H),1.76-0.85(m,72H),0.70(s,3H)
实施例8化合物8的合成
步骤1：化合物8a的合成
将十一醇(0.3g,5mmol)和琥珀酸酐(1.0g,9mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入吡啶(1.6g，20.7mmol)和DMAP(0.2g，2mmol)，将反应混合物加热回流6h。取样进行HPLC检测，确认反应完全。将反应体系减压浓缩，向混合物中加入5％盐酸(10mL)，用乙醚(3×20mL)萃取，合并有机相，有机相用盐水洗涤2次，经无水硫酸钠干燥，浓缩，经柱层析纯化，得到化合物8a(0.6g，淡黄色油状物)，产率43％。
步骤2：化合物8的合成
将化合物8a(600mg，2.2mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入化合物1d(1.7g，2.2mmol)，EDC·HCL(845mg，4.4mmol)和DMAP(100mg，0.9mmol)在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩完，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，正己烷相浓缩至干，柱层析分离，得到化合物8(1.0g，淡黄色油状物)，产率45％。
MS m/z(ESI):1043.7[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,1H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,1H),4.20-3.95(m,6H),2.73-2.66(m,8H),2.71-2.50(m,14H),2.47-2.36(m,4H),2.11-1.78(m,6H),1.76-0.85(m,63H),0.70(s,3H)
实施例9化合物9的合成
将化合物1b(0.75g，2mmol)溶于20mL二氯甲烷中，加入化合物7a(1.8g，4mmol)，EDC·HCL(1.8g，8mmol)和DMAP(0.2g，1.6mmol)，在室温下搅拌16-20h，CAD检测反应完全。将反应液浓缩完，加入正己烷溶解，用乙腈洗涤2次，将正己烷相浓缩至干，柱层析纯化，得到化合物9(1.2g，淡黄色油状物)，产率45％。
MS m/z(ESI):1342.0[M+1]
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.45(t,2H,J＝5.4Hz),4.53-4.40(m,2H),4.20-3.95(m,4H),2.73-2.66(m,4H),2.71-2.36(m,4H),2.11-1.78(m,12H),1.76-0.85(m,102H),0.70(s,6H)
实施例10mRNA-LNP的制备与表征
将本发明的脂质化合物、中性脂质(磷脂)、PEG脂质按照一定的摩尔比溶解在乙醇溶液中(具体配方见表1)，对比例选用的商业化的SM-102、专利文献CN103930398B公开的化合物B-2，专利文献CN114929205A公开的化合物ss-OP以及专利文献CN114787127A公开的脂质化合物39。将mRNA溶解在25mM pH 4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，终浓度135ng/uL。以乙醇相(脂质混合物)：水相(mRNA)流速比1:3，经微流控纳米制备系统制备mRNA-LNP复合物后，使用10倍pH 7.5醋酸钠缓冲溶液稀释后，超滤浓缩，无菌过滤后得到实验样品。取样使用QuantiTM-Ribogreen方法检测mRNA包封率，动态光散射纳米粒度仪检测平均粒径、PDI及Zeta电位。
表1：基于胆固醇阳离子脂质化合物的三组分LNP脂质配方
编号 脂质配方(摩尔百分比) 氮磷比
LNP1 化合物1：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP2 化合物2：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP3 化合物3：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP4 化合物4：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP5 化合物5：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP6 化合物6：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP7 化合物7：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP8 化合物8：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP9 化合物9：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP10 SM-102：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP11 化合物B-2：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP12 化合物ss-OP：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
LNP13 化合物39：：DSPC：DMG-PEG2000＝49.25：49.25：1.5 8
对比例使用到的化合物结构如下，各对比化合物均为天津键凯科技有限公司参照相关的专利文献进行合成，结构表征表明化合物合成正确：
SM-102
实施例11：Luc-mRNA-LNP的制备、表征及体外细胞转染活性评价
我们使用荧光素酶基因Luc-mRNA，参照实施例10提供的制备方法和表1提供的脂质配方，构建了Luc-mRNA-LNP，其包封率、平均粒径、PDI和zeta电势数据如表2所示。结果表明本发明提供的阳离子脂质化合物与磷脂和PEG脂质构建的三组分LNP可以有效的实现对mRNA的包封，其粒径在80-120nm，PDI均小于0.2，mRNA包封率也均高于80％，而在本发明提供的LNP配方下，商业化脂质SM-102和其他已公开的化合物均不能有效包封mRNA，其包封率均低于20％。
表2：Luc-mRNA-LNP的理化参数
编号 平均粒径(nm) PDI Zeta电势(mV) 包封率(％)
LNP1 105.2 0.1247 -3.251 87.11
LNP2 122.1 0.1677 -3.5845 83.98
LNP3 114.9 0.07915 1.3469 93.48
LNP4 100.2 0.1611 4.091 89.40
LNP5 89.15 0.1280 8.343 87.70
LNP6 116.4 0.06409 -5.0535 92.76
LNP7 102.6 0.1161 -3.4055 91.60
LNP8 91.91 0.04902 -4.252 90.85
LNP9 115.42 0.1491 -3.986 82.29
LNP10 82.33 0.1193 -3.5855 0.89
LNP11 96.54 0.1223 -3.611 5.00
LNP12 136.3 0.1087 -9.297 16.36
LNP13 101.9 0.1033 -10.485 7.38
将6.5×105细胞/mL的HEK293T细胞以100uL/孔的量接种到96孔细胞培养板中，24小时后每孔转染100ng Luc-mRNA-LNP后将细胞培养板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，阴性对照组转染等体积生理盐水。培养结束后，参照Fire-LumiTM荧光素酶检测试剂盒使用说明书进行生物发光检测，结果如图1所示。结果表明，使用本发明的阳离子脂质化合物构建的三组分LNP具有更佳的细胞转染效率，可以实现Luc-mRNA在细胞内的高表达，且表达水平显著优于对照组。
实施例12mRNA-LNP动物免疫试验
我们使用新冠病毒S蛋白mRNA来评价mRNA-LNP在小鼠体内的免疫活性，使用的LNP配方参照表1。参照实施例10提供的制备方法进行新冠抗原S蛋白mRNA-LNP的制备。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠按5只/组随机分成组，采用后腿肌肉注射的免疫途径进行免疫。分别在第0天和第14天免疫，免疫剂量为5μg的mRNA-LNP/只。免疫第28天采血并分离血清，小鼠处死后取脾组织。用ELISA法检测针mRNA编码的新冠病毒S蛋白抗原的特异性IgG抗体滴度。分离PBMC后合管进行IFN-γ+细胞ELISPOT检测，脾组织进行抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞ICS检测(IL-2、TNF-α和IFN-γ)，结果如图2a、2b、2c和2d所示。由本发明提供的阳离子脂质化合物构建的LNP递送系统在小鼠递送新冠病毒抗原mRNA时可以诱导更高的抗原特异性抗体滴度和更强的细胞免疫，并且和现有技术相比，其效果显著更佳。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (22)

1.式(I)所示的脂质化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Xa和Xb各自独立的选自
其中，R4是C1-C6的烷基；q为1或2的整数；
Z和Z’各自独立地选自S、C或化学键；
R1a和R1b各自独立地选自C1-6的亚烷基或C3-C8的环亚烷基；
R2a和R2b各自独立地选自C1-6的亚烷基；
Ya和Yb独立的选自：-O-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)NRa-、-NRa(C＝O)-、-NRa-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-OC(＝O)S-或-SC(＝O)O-；
Ra为H或C1-C12的烷基；
m和n各自独立地选自1、2或3；
R3a和R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；
条件是，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
2.根据权利要求1所述的脂质化合物，其为式(II)所示的化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Xa和Xb各自独立的选自
其中，R4是C1-C6的烷基；q为1或2的整数；
Z和Z’各自独立地选自S、C或化学键；
R1a和R1b各自独立地选自C1-6的亚烷基或C3-C8的环亚烷基；
R2a和R2b各自独立地选自C1-6的亚烷基；
Ya和Yb独立的选自：-O-、-O(C＝O)O-、-(C＝O)NRa-、-NRa(C＝O)-、-NRa-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-OC(＝O)S-或-SC(＝O)O-；
Ra为H或C1-C12的烷基；
R3a和R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；其中，所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；
条件是，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
3.根据权利要求1或2所述的脂质化合物，或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Xa和Xb选自其中，q为1或2的整数。
4.根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物，或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述Z和Z’各自独立地选自S或C。
5.根据前述权利要求中任一项所述的脂质化合物，其为式(III-1)、式(III-2)或式(III-3)所示的化合物，
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b如前述权利要求所定义。
6.根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物，或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，
所述R1a和R1b各自独立地为C1-C6的亚烷基；
所述R2a和R2b各自独立地为C1-C3的亚烷基；
Ya和Yb各自独立地选自：-O-、-O(C＝O)O-、-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或-C(＝O)-；
所述R3a和R3b选自天然存在或非天然存在的类固醇基团、脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；
其中，所述R3a和R3b中至少一个为天然存在或非天然存在的类固醇基团。
7.根据前述权利要求中任一项所述的脂质化合物，其中，所述类固醇选自：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、胆固醇的氧化形式、胆固醇的还原形式、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸和/或石胆酸烷基酯。
8.根据前述权利要求中任一项所述的脂质化合物，其中，所述类固醇基团选自：
其中R为C1-20烷基。
9.根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物，选自：
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，R3b选自脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a和R2b如前述权利要求所定义。
10.根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物，选自：
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，R3b选自脂溶性维生素残基、C6-C24的烷基、C6-C24的单烯基或多烯基、C6-C24的单炔基或多炔基；所述烷基、烯基或炔基上的CH2任选地被一个或多个氧原子代替；Z、Z’、Ya、Yb、R1a、R1b、R2a和R2b如前述权利要求所定义。
11.根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物，或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐；其中，R3b选自：
12.根据权利要求1所述的脂质化合物，选自：
或其立体异构体、互变异构体、以及药学上可接受的盐。
13.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其特征在于，包含根据前述权利要求任一项所述的脂质化合物。
14.根据权利要求13所述的LNP，其特征在于，还包括聚乙二醇脂质和至少一种第二脂质；其中，所述第二脂质选自：中性脂质、两性离子脂质和/或阴离子脂质。
15.根据权利要求14所述的LNP，其特征在于，所述的聚乙二醇脂质选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)]、PEG-二甾醇基甘油、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺；
所述的中性脂质选自：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)、油酰磷脂酰胆碱或1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺。
16.根据权利要求15所述的LNP，其特征在于，所述根据前述权利要求任一项所述的脂质：第二脂质：聚乙二醇脂质摩尔比为10～60：20～80：1～30；和/或，所述LNP的氮磷比为(1～15):1。
17.根据前述权利要求任一项所述的LNP，其特征在于，具有15nm～300nm的直径。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的脂质化合物和/或根据权利要求13-17中任一项所述的LNP在制备生物活性物质递送系统中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述生物活性物质为DNA或RNA，所述RNA选自反义RNA、saRNA、mRNA、lncRNA、miRNA、siRNA、piRNA、gRNA、tsRNA、circRNA和自复制mRNA。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述生物活性物质递送系统为mRNA疫苗，用于预防癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染；优选地，所述病毒选自：诺如病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒、肠病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒或麻疹病毒。
21.一种药物，其包含根据权利要求17所述的生物活性物质和根据权利要求11-15中任一项所述的LNP；以及药学上可接受的辅料。
22.根据权利要求21所述的药物，其特征在于，所述药物为基因药物。
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