JPWO2016104580A1 - カチオン性脂質 - Google Patents
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Abstract
Description
一実施形態において、本発明は、上記式(1)〜(11)のいずれかで表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であり、カチオン性脂質として用いることができる。カチオン性脂質は、前記塩の水和物又は前記塩の溶媒和物であってもよい。本明細書において、カチオン性脂質とは、一つ以上の炭化水素基を含む脂質親和性領域と、生理的pHでプロトン化する極性基を含む親水性領域を有する両親媒性分子である。即ち、本発明のカチオン性脂質は、プロトン化し、陽イオンを形成し得る。上記陽イオンと対になって、本実施形態のカチオン性脂質が含有し得る陰イオンとしては、薬剤学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン;酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
本発明のカチオン性脂質の製造方法について説明する。下記式(12)に、カチオン性脂質の合成スキームの一実施形態を示す。
本発明は、(I)上述したカチオン性脂質と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、を含有する脂質複合体を提供する。本発明の一実施形態として、脂質複合体は、(I)上述したカチオン性脂質と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、(III)核酸と、を含有する。本実施形態の脂質複合体は、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とする。
一実施形態において、本発明は、(I)上述したカチオン性脂質と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、(III)核酸と、を含有する組成物を提供する。本実施形態の組成物は、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とする。本実施形態の組成物は、上述した脂質複合体、薬学的に許容される媒体、及び場合によりその他の添加剤を含有するものであってもよい。薬学的に許容される媒体、その他の添加剤については後述する。
一実施形態において、本発明は、(I)上述したカチオン性脂質と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、(III)核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程(a)と、混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程(b)とを備える、組成物の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法によれば、核酸を細胞質に効率よく放出することが可能な組成物を製造することができる。
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
TFA:トリフルオロ酢酸
WSC:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
DMAP:N,N−ジメチル−4−アミノピリジン
THF:テトラヒドロフラン
LC−MS:液体クロマトグラフィー−マススペクトルメトリー
ESI−MS:エレクトロスプレーイオン化質量分析
s:シングレット、d:ダブレット、t:トリプレット、q:カルテット、dd:ダブルダブレット、ddd:ダブルダブルダブレット、dt:ダブルトリプレット、tt:トリプルトリプレット、m:マルチプレット。
[実施例1]
(1−((2−ヘキシルシクロプロピル)メトキシ)−1−オキソノナデカン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−102」という場合がある。)の合成)
以下に、YS−102の合成スキームを示す。
セバシン酸ジメチル(200g、868.4mmol)をエタノール(868mL)に溶かした溶液を0℃まで冷却した。その溶液に水酸化カリウム(48.73g、868.4mmol)のエタノール(300mL)溶液を滴下し、滴下後0℃で12時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルと水を加え、未反応物を有機層に抽出することで除去した。水層を塩酸にて酸性にし、酢酸エチルを加えて目的物を抽出した。有機層を水、食塩水で洗浄し、濃縮した。第1工程品モノエステル体(150.3g、652.6mmol、75%)は精製を行わずに次のステップへ用いた。
第1工程品モノエステル体(50.0g、231.2mmol)と触媒量のDMF(23mL)との懸濁液に、塩化チオニル(41.3g、346.8mmol)を滴下した。反応終了後、塩化チオニルを減圧下留去した後、蒸留精製し、第2工程品(25.8g、109.9mmol、48%)を得た。
塩化亜鉛(2.7g、20.1mmol)をTHF(61mL)に溶解させ、−78℃まで冷却した。この溶液に1Mのノニルマグネシウムブロミド(40.2mL、40.2mmol)を窒素雰囲気下−78℃で滴下した。滴下後0℃まで昇温し、0℃で30分撹拌した後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0.58mg、0.5mmol)を投下し、次いで第2工程品(5.0g、20.1mmol)を滴下した。0℃で更に1時間撹拌した後に1M塩酸水溶液を加えてクエンチした。反応溶液より析出物をろ別し、ろ液を酢酸エチルで抽出し有機層を水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第3工程品(5.0g、14.7mmol、73%)を得た。
第3工程品(2.0g、5.9mmol)、2−ノネノール(4.2g、29.4mmol)、チタニウムテトラプロポキシド(0.2g、0.6mmol)の混合液を撹拌しながら、外浴を110℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第4工程品(2.6g、5.8mmol、99%)を得た。
ジエチル亜鉛(8.3mL、8.3mmol)をジクロロメタン(15mL)に溶解させ、0℃まで冷却した。そこへトリフルオロメタンスルホン酸(0.9g、8.3mmol)を滴下し、次いでジヨードメタン(2.2g、8.3mmol)を滴下後、0℃で1時間撹拌した。この溶液に第4工程品(1.2g、2.8mmol)のジクロロメタン(5mL)溶液を滴下し、室温まで昇温した。反応をTLCで確認し、原料の消失を終点として水でクエンチした。析出した固体をろ別し、ろ液を酢酸エチルで抽出、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第4工程品(1.2g、2.7mmol、99%)を得た。
第5工程品(1.0g、2.2mmol)をエタノール(22mL)に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム(0.08g、2.2mmol)を添加し、10分間反応させた。反応終了後1N塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第6工程品(0.3g、0.7mmol、30%)を得た。
第6工程品(0.8g、1.8mmol)を塩化メチレン(7mL)に溶かした溶液中に、WSC(0.7g、3.7mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.04g、0.4mmol)、1−メチルピペリジン−4−カルボン酸(0.5g、3.7mmol)を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で5回洗浄後、1N水酸化ナトリウム水溶液で1度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、下記式(15)で表されるYS−102(0.12g、0.2mmol、12%)を得た。
((Z)−1−(ノン−2−エン−1−イルオキシ)−1−オキソノナデカン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−101」という場合がある。)の合成)
第5工程を行わなかった点以外は実施例1と同様にして、下記式(16)で表されるYS−101を合成した。
(1−オキソ−1−(ウンデカン−5−イルオキシ)ノナデカン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−103」という場合がある。)の合成)
第4工程において、2−ノネノールの代わりに2−ブチルオクタン−1−オールを反応させ、第5工程を行わなかった点以外は実施例1と同様にして、下記式(2)で表されるYS−103を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソノナデカン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−119」という場合がある。)の合成)
以下に、YS−119の合成スキームを示す。
第1工程から第3工程は上述したYS−102の合成と同様に行った。
第3工程品(4.1g、12.0mmol)、2−ブチルオクタン−1−オール(6.73g、36.12mmol)、チタニウムテトラプロポキシド(0.34g、1.2mmol)の混合液を撹拌しながら、外浴を110℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第4工程品(4.5g、9.4mmol、78%)を得た。
第4工程品(4.5g、9.4mmol)をTHF(18.7mL)、メタノール(18.7mL)に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム(1.8g、46.8mmol)を添加し、一時間反応させた。反応終了後1N塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第5工程品(3.1g、6.42mmol、69%)を得た。
第5工程品(2.0g、4.14mmol)を塩化メチレン(8.28mL)に溶かした溶液中に、WSC(1.59g、8.28mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.04g、0.4mmol)、1−メチルピペリジン−4−カルボン酸(1.19g、8.28mmol)を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で5回洗浄後、1N水酸化ナトリウム水溶液で1度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、式(1)で表されるYS−119(1.9g、3.1mmol、74%)を得た。
(1−オキソ−1−(ウンデカン−5−イルオキシ)ペンタデカン−6−イル−1−メチルピペリジン4−カルボキシレート(以下、「YS−111」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにアジピン酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにウンデカン−5−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(17)で表されるYS−111を合成した。
(1−オキソ−1−(ウンデカン−5−イルオキシ)ヘプタデカン−8−イル−1−メチルピペリジン4−カルボキシレート(以下、「YS−112」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにウンデカン−5−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(4)で表されるYS−112を合成した。
(21−オキソ−21−(ウンデカン−5−イルオキシ)ヘンイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン4−カルボキシレート(以下、「YS−113」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにウンデカン−5−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(5)で表されるYS−113を合成した。
(23−オキソ−23−(ウンデカン−5−イルオキシ)トリコサン−10−イル−1−メチルピペリジン4−カルボキシレート(以下、「YS−114」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにテトラデカン二酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにウンデカン−5−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(18)で表されるYS−114を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソヘプタデカン−8−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−115」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(19)で表されるYS−115を合成した。
(21−((2−ブチルオクチル)オキシ)−21−オキソヘンイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−116」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(20)で表されるYS−116を合成した。
(1−(オクタン−3−イルオキシ)−1−オキソヘプタデカン−8−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−117」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにオクタン−3−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(21)で表されるYS−117を合成した。
(1−((S)オクタン−3−イルオキシ)−1−オキソヘプタデカン−8−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−117S」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに(S)−オクタン−3−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(22)で表されるYS−117Sを合成した。
(21−(オクタン−3−イルオキシ)−21−オキソヘンイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−118」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりにオクタン−3−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(3)で表されるYS−118を合成した。
(21−((S)−オクタン−3−イルオキシ)−21−オキソヘンイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−118S」という場合がある。)の合成)
第1工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第4工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに(S)−オクタン−3−オールを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(23)で表されるYS−118Sを合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−120」という場合がある。)の合成)
第3工程において、ノニルマグネシウムブロミドの代わりにデカニルマグネシウムブロミドを反応させた以外は実施例4と同様にして、下記式(6)で表されるYS−120を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(「YS−120」)の合成)
以下に、YS−120の別の合成スキームを示す。
第1工程から第3工程は上述したYS−102の合成と同様に行った。
第3工程品(150.0g、440.5mmol)、ベンジルアルコール(142.9g、1321.4mmol)、チタニウムテトラプロポキシド(12.5g、44.5mmol)の混合液を撹拌しながら、外浴を130℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第4工程品(146.2g、350.9mmol)を得た。
第4工程品(100.0g、240.0mmol)をTHF(480.0mL)、メタノール(480.0mL)に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム(10.9g、288.0mmol)を添加し、10分間反応させた。反応終了後1N塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第5工程品(70.0g、167.2mmol)を得た。
第5工程品(50.0g、119.4mmol)をTHF(480.0mL)に溶かした溶液中に、WSC(45.8g、238.9mmol)、ジメチルアミノピリジン(2.92g、23.9mmol)、1−メチルピペリジン−4−カルボン酸(34.2g、238.9mmol)を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で5回洗浄後、1N水酸化ナトリウム水溶液で1度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第6工程品(37.2g、68.4mmol)を得た。
第6工程品(37.2g、68.4mmol)、パラジウム/炭素(4.9mL)を酢酸エチル(136.8mL)に懸濁させ、水素雰囲気下一晩攪拌した。反応液をろ別し、パラジム/炭素を除いて濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、第7工程品(26.8g、59.1mmol)を得た。
第7工程品(20.0g、44.1mmol)を塩化メチレン(220.0mL)に溶かした溶液中に、WSC(8.9g、46.3mmol)、ジメチルアミノピリジン(1.08g、0.4mmol)、2−ブチルオクタン−1−オール(16.4g、88.2mmol)を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で5回洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、式(6)で表されるYS−120(22.0g、35.4mmol)を得た。
(1−((2Z,5Z)−デカ−2,5−ジエン−1−イルオキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−121」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに(2Z,5Z)−デカ−2,5−ジエン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(24)で表されるYS−121を合成した。
((Z)−1−((2−ブチルノン−3−エン−1−イル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−122」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに(Z)−2−ブチルノン−3−エン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(25)で表されるYS−122を合成した。
((Z)−1−オキソ−1−((5−プロピルノン−2−エン−1−イル)オキシ)イコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−123」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに(Z)−5−プロピルノン−2−エン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(26)で表されるYS−123を合成した。
(1−オキソ−1−((3−ペンチルオクチル)オキシ)イコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−124」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに3−ペンチルオクタン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(27)で表されるYS−124を合成した。
(1−((2,4−ジプロピルヘプチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−125」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに2,4−ジプロピルヘプタン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(28)で表されるYS−125を合成した。
(1−((3,4−ジプロピルヘプチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−126」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに3,4−ジプロピルヘプタン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(29)で表されるYS−126を合成した。
(1−(4−(ヘキシルジスルファニル)−3−((ヘキシルジスルファニル)メチル)ブトキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−127」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに4−(ヘキシルジスルファニル)−3−((ヘキシルジスルファニル)メチル)ブタン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(30)で表されるYS−127を合成した。
(1−((6−(ブチルジスルファニル)−3−(3−(ブチルジスルファニル)プロピル)ヘキシル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−128」という場合がある。)の合成)
第8工程において、2−ブチルオクタン−1−オールの代わりに6−(ブチルジスルファニル)−3−(3−(ブチルジスルファニル)プロピル)ヘキサン−1−オールを反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(31)で表されるYS−128を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルピロリジン−3−カルボキシレート(以下、「YS−129」という場合がある。)の合成)
第6工程において、1−メチルピぺリジン−4−カルボン酸の代わりに1−メチルピロリジン−3−カルボン酸を反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(32)で表されるYS−129を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−メチルアゼチジン−3−カルボキシレート(以下、「YS−131」という場合がある。)の合成)
第6工程において、1−メチルピぺリジン−4−カルボン酸の代わりに1−メチルアザチジン−3−カルボン酸を反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(33)で表されるYS−131を合成した。
(1−((2−ブチルオクチル)オキシ)−1−オキソイコサン−10−イル−1−エチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−132」という場合がある。)の合成)
第6工程において、1−メチルピぺリジン−4−カルボン酸の代わりに1−エチルピペリジン−4−カルボン酸を反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(34)で表されるYS−132を合成した。
(2−ブチルオクチル−10−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)イコサノエート(以下、「YS−133」という場合がある。)の合成)
第6工程において、1−メチルピぺリジン−4−カルボン酸の代わりに4−(ジメチルアミノ)ブタン酸を反応させた以外は実施例16と同様にして、下記式(35)で表されるYS−133を合成した。
[実施例29]
(YS−102)
実施例1のカチオン性脂質(YS−102)を用いて組成物を調製した。核酸としては、センス鎖5’−GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT*T−3’(配列番号1、T:DNA、fU,fC=2’−Fluoro RNA、*=Phosphorothioate linkage)、アンチセンス鎖5’−GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T−3’(配列番号2、T:DNA、fU,fC=2’−Fluoro RNA、*=Phosphorothioate linkage)の塩基配列からなる、Factor VII(血液凝固第VII因子)遺伝子の発現を抑制するsiRNAであり、アニーリング済みのもの(株式会社ジーンデザイン、以下「Factor VII siRNA」という場合がある。)を使用した。
(YS−101)
カチオン性脂質として、YS−102の代わりに実施例2のカチオン性脂質(YS−101)を用いた以外は実施例29と同様にして、実施例30の組成物を得た。
(YS−103)
カチオン性脂質として、YS−102の代わりに実施例3のカチオン性脂質(YS−103)を用いた以外は実施例29と同様にして、実施例31の組成物を得た。
(YS−021)
カチオン性脂質として、YS−102の代わりに下記式(36)で表される1−(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−8−イル−1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(以下、「YS−021」という場合がある。)を用いた以外は実施例29と同様にして、参考例1の組成物を得た。
実施例29〜31及び参考例1の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率を測定した。
封入率(%)=100−(A/B)×100 (F1)
[実施例32]
(YS−111)
実施例5のカチオン性脂質(YS−111)を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例29の組成物で用いたものと同じFactor VII siRNAを使用した。
(YS−112)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに実施例6のカチオン性脂質(YS−112)を用いた以外は実施例32と同様にして、実施例33の組成物を得た。
(YS−113)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに実施例7のカチオン性脂質(YS−113)を用いた以外は実施例32と同様にして、実施例34の組成物を得た。
(YS−114)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに実施例8のカチオン性脂質(YS−114)を用いた以外は実施例32と同様にして、実施例35の組成物を得た。
(YS−115)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに実施例9のカチオン性脂質(YS−115)を用いた以外は実施例32と同様にして、実施例36の組成物を得た。
(YS−116)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに実施例10のカチオン性脂質(YS−116)を用いた以外は実施例32と同様にして、実施例36の組成物を得た。
(ALN−319)
カチオン性脂質として、YS−111の代わりに、特許文献1に記載された下記式(32)で表されるジ((Z)−ノン−2−エン−1−イル)9−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(以下、「ALN−319」という場合がある。)を、特許文献1に記載された方法にしたがって合成して用いた以外は実施例32と同様にして、比較例1の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例32〜37及び比較例1の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径を測定した。表2に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を示す。
[実施例38]
(YS−117)
実施例11のカチオン性脂質(YS−117)を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例29の組成物で用いたものと同じFactor VII siRNAを使用した。
(YS−117S)
カチオン性脂質として、YS−117の代わりに実施例12のカチオン性脂質(YS−117S)を用いた以外は実施例38と同様にして、実施例39の組成物を得た。
(YS−118)
カチオン性脂質として、YS−117の代わりに実施例13のカチオン性脂質(YS−118)を用いた以外は実施例38と同様にして、実施例40の組成物を得た。
(YS−118S)
カチオン性脂質として、YS−117の代わりに実施例14のカチオン性脂質(YS−118S)を用いた以外は実施例38と同様にして、実施例41の組成物を得た。
(YS−119)
カチオン性脂質として、YS−117の代わりに実施例4のカチオン性脂質(YS−119)を用いた以外は実施例38と同様にして、実施例42の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例38〜42の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径を測定した。表3に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を示す。
[実施例43]
(YS−119)
実施例4のカチオン性脂質(YS−119)を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例29の組成物で用いたものと同じFactor VII siRNAを使用した。
(ALN−319)
カチオン性脂質として、YS−119の代わりに、上述したALN−319を用いた以外は実施例43と同様にして、比較例2の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例43及び比較例2の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表4に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
[実施例44]
(YS−119)
実施例4のカチオン性脂質(YS−119)を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例29の組成物で用いたものと同じFactor VII siRNAを使用した。
(YS−120)
カチオン性脂質として、YS−119の代わりに、実施例15のカチオン性脂質(YS−120)を用いた以外は実施例44と同様にして、実施例45の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例44及び45の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表5に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
[実施例46]
(YS−120)
実施例16のカチオン性脂質(YS−120)を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例29の組成物で用いたものと同じFactor VII siRNAを使用した。
(YS−121)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例17のカチオン性脂質(YS−121)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例47の組成物を得た。
(YS−122)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例18のカチオン性脂質(YS−122)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例48の組成物を得た。
(YS−123)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例19のカチオン性脂質(YS−123)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例49の組成物を得た。
(YS−124)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例20のカチオン性脂質(YS−124)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例50の組成物を得た。
(YS−125)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例21のカチオン性脂質(YS−125)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例51の組成物を得た。
(YS−126)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例22のカチオン性脂質(YS−126)を用いた以外は実施例46と同様にして、実施例52の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例46〜52の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表6に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
実施例46〜52の組成物について、密閉したバイアルにて4℃で保管し、保管前、保管後3ヶ月目、及び6ヶ月目の粒子径(Z−平均及び多分散指数)を実施例29の組成物と同様にして測定した。
[実施例53]
(YS−120)
「組成物の調製(6)」と同様にして、実施例16のカチオン性脂質(YS−120)を用いて組成物を調製した。
(YS−124)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例23のカチオン性脂質(YS−127)を用いた以外は実施例53と同様にして、実施例54の組成物を得た。
(ALN−319)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、上述したALN−319を用いた以外は実施例53と同様にして、比較例3の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例53、54、及び比較例3の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表8に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
実施例53、54、及び比較例3の組成物について、各組成物の調製においてsiRNA希釈液と脂質溶液との混合により脂質複合体が生じた直後、該脂質複合体をPBSに透析した後、密閉したバイアルにて4℃で保管後2ヶ月目、及び6ヶ月目の粒子径(Z−平均及び多分散指数)を粒子径測定装置(商品名「Zetasizer Nano ZS」、Malvern社製)により測定した。
[実施例55]
(YS−120)
「組成物の調製(6)」と同様にして、実施例16のカチオン性脂質(YS−120)を用いて組成物を調製した。
(YS−127)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例23のカチオン性脂質(YS−127)を用いた以外は実施例55と同様にして、実施例56の組成物を得た。
(YS−128)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例24のカチオン性脂質(YS−128)を用いた以外は実施例55と同様にして、実施例57の組成物を得た。
(YS−129)
カチオン性脂質として、YS−120の代わりに、実施例25のカチオン性脂質(YS−129)を用いた以外は実施例55と同様にして、実施例58の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例55〜58の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表10に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
[実施例59]
(YS−101)
「組成物の調製(6)」と同様にして、実施例2のカチオン性脂質(YS−101)を用いて組成物を調製した。
(YS−131)
カチオン性脂質として、YS−101の代わりに、実施例26のカチオン性脂質(YS−131)を用いた以外は実施例59と同様にして、実施例60の組成物を得た。
(YS−132)
カチオン性脂質として、YS−101の代わりに、実施例27のカチオン性脂質(YS−132)を用いた以外は実施例59と同様にして、実施例61の組成物を得た。
(YS−133)
カチオン性脂質として、YS−101の代わりに、実施例28のカチオン性脂質(YS−133)を用いた以外は実施例59と同様にして、実施例62の組成物を得た。
(YS−120)
カチオン性脂質として、YS−101の代わりに、実施例16のカチオン性脂質(YS−120)を用いた以外は実施例59と同様にして、実施例63の組成物を得た。
(ALN−319)
カチオン性脂質として、YS−101の代わりに、上述したALN−319を用いた以外は実施例59と同様にして、比較例4の組成物を得た。
実施例29の組成物と同様にして、実施例59〜63、及び比較例4の組成物について、脂質複合体へのsiRNAの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径(Z−平均)を測定した。表11に、siRNAの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
実施例29〜31及び参考例1の組成物を、脂質複合体に封入されたFactor VII siRNA濃度が10μg/mLとなるようにPBSで希釈した。各組成物を、C57/BL6マウス(5週齢、オス)に10mL/kgの投与容量で尾静脈内投与し、投与から24時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のFactor VIIタンパク質濃度を市販のキット(商品名「BIOPHEN FVII」、HYPHEN BioMed社)により定量した。陰性対照として、PBSを投与した群に同様の処理を行った。
実施例32〜37及び比較例1の組成物を「動物実験(1)」と同様にしてC57/BL6マウス(5週齢、オス)に投与し、投与から24時間後の血漿中のFactor VIIタンパク質濃度の相対値及び肝臓に残存していたカチオン性脂質量の相対値を算出した。結果を表13に示す。
実施例38〜42の組成物を「動物実験(1)」と同様にしてC57/BL6マウス(5週齢、オス)に投与し、投与から24時間後の血漿中のFactor VIIタンパク質濃度の相対値及び肝臓に残存していたカチオン性脂質量の相対値を算出した。結果を表14に示す。
実施例43及び比較例2の組成物を、脂質複合体に封入されたFactor VII siRNA濃度が1μg/mL又は5μg/mLとなるようにPBSで希釈した。各組成物を、C57/BL6マウス(5週齢、オス)に10mL/kgの投与容量で尾静脈内投与し、投与から24時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のFactor VIIタンパク質濃度を市販のキット(商品名「BIOPHEN FVII」、HYPHEN BioMed社)により定量した。陰性対照として、PBSを投与した群に同様の処理を行った。
実施例44及び45の組成物を、脂質複合体に封入されたFactor VII siRNA濃度が1μg/mL又は5μg/mLとなるようにPBSで希釈した。各組成物を、C57/BL6マウス(5週齢、オス)に10mL/kgの投与容量で尾静脈内投与し、投与から24時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のFactor VIIタンパク質濃度を市販のキット(商品名「BIOPHEN FVII」、HYPHEN BioMed社)により定量した。陰性対照として、PBSを投与した群に同様の処理を行った。
実施例46〜52の組成物を「動物実験(5)」と同様にしてC57/BL6マウス(5週齢、オス)に投与し、投与から24時間後の血漿中のFactor VIIタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表17に示す。
実施例53、54、及び比較例3の組成物を、脂質複合体に封入されたFactor VII siRNA濃度が2μg/mL又は10μg/mLとなるようにPBSで希釈した。各組成物を、ICRマウス(6週齢、メス)に10mL/kgの投与容量で尾静脈内投与し、投与から24時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のFactor VIIタンパク質濃度を市販のキット(商品名「BIOPHEN FVII」、HYPHEN BioMed社)により定量した。陰性対照として、PBSを投与した群に同様の処理を行った。
実施例55〜58の組成物を「動物実験(7)」と同様にしてICRマウス(6週齢、メス)に投与し、投与から24時間後の血漿中のFactor VIIタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表19に示す。
実施例59〜63、及び比較例4の組成物を「動物実験(7)」と同様にしてICRマウス(5週齢、メス)に投与し、投与から24時間後の血漿中のFactor VIIタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表20に示す。
Claims (8)
- (I)請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、を含有する脂質複合体。
- (I)請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、(III)核酸と、を含有する組成物。
- (I)請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、(II)中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、(III)核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程と、混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程と、を含む組成物の製造方法。
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