DK159147B

DK159147B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af blandede salte af essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og nitrogenfrie analoger heraf

Info

Publication number: DK159147B
Application number: DK163180A
Authority: DK
Inventors: Mackenzie Walser
Original assignee: Univ Johns Hopkins
Priority date: 1979-04-18
Filing date: 1980-04-17
Publication date: 1990-09-10
Also published as: FI70206B; LU82369A1; FR2454434A1; SE8002900L; IT1141482B; DK159147C; JPS5653641A; DE3015076A1; GB2048867B; US4296127A; NL191583B; ES8102804A1; DE3015076C2; SE460902B; IT8021498A0; NL191583C; ES490649A0; NL8002297A; IE49586B1; FR2454434B1

Description

DK 159147 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte blandede salte af essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og nitrogenfrie analoger heraf.

5 De essentielle aminosyrer hos mennesker er L-iso- leucin, L-leucin, L-valinf L-methionin, L-phenylalanin, L-histidin, L-lysin, L-tryptophan og L-threonin. De semi-essentielle aminosyrer for mennesker indbefatter L-tyrosin, L-cystin og L-cystein, som anses for at være 10 nødvendige for optimal vækst hos små børn. Arginin er essentiel hos børn, som mangler ét af enzymerne i urinstof-cyclen, men det anses almindeligvis ikke for essentielt eller semi-essentielt hos normale mennesker, selv om det kan have ernæringsmæssig værdi. Ornithin an-15 ses almindeligvis heller ikke for essentielt eller semi-essentielt hos mennesker, men kan erstatte arginin. For at lette henvisningen vil arginin og ornithin alligevel i den foreliggende beskrivelse blive grupperet sammen med og refereret til som semi-essentielle aminosyrer, 20 undtagen hvad angår kombinationerne med keto-analoger med forgrenet kæde, som allerede er blevet beskrevet i norsk patentskrift nr. 151.119.

Nyrelidelser (såsom uræmia), leverlidelser (såsom hyperammonæmia og portal-systemisk encephalopathia) 25 og andre protein- eller nitrogen-spildende sygdomme hos mennesker fører til alvorligt underskud af essentielle og/eller semi-essentielle aminosyrer, som er nødvendige til opbygning af protein i legemet. Individer, der lider af nyre- og leversygdomme, må således enten underkastes 30 begrænsninger med hensyn til deres indtagelse af protein i kosten som følge af nyrernes manglende evne til at udskille nitrogenholdige affaldsstoffer, eller også tåler de ikke protein i kosten som følge af den opkastning, uro, lethargi og de svækkede mentale og fysiske proces-35 ser, som optræder efter proteinindtagelse.

Den kendte behandling af disse protein- eller nitrogen-spildende lidelser har indbefattet administrering af visse essentielle aminosyrer for at afhælpe protein- 2

DK 159147 B

underskuddet, såsom beskrevet i US-patentskrift nr.

2.457.820. Tilsvarende beskriver US-patentskrift nr. 3.764.703 anvendelsen af en blanding af otte essentielle aminosyrer, eventuelt kombineret med det ene af eller 5 både L-arginin og L-histidin, der i patentskriftet betegnes "semi-essentielle" aminosyrer, til behandling af uræmiske lidelser forårsaget af nyreinsufficiens.

Senere er behandlingen af disse lidelser blevet forbedret ved anvendelse af blandinger af nitrogenfrie 10 analoger af de essentielle aminosyrer, nemlig α-keto- og a-hydroxy-analoger af de fleste af de essentielle aminosyrer, sammen med de essentielle aminosyrer som sådanne, hvis analoger ikke er tilgængelige eller effektive. Eksempler på sådanne blandinger og behandlinger er beskre-15 vet i US-patentskrifterne nr. 4.100.160, 4.100.161 og 4.100.293, udstedt 11. juli 1978. En anden behandling af disse lidelser er beskrevet i norsk patentskrift nr. 151.119.

En væsentlig hindring for anvendelsen af essentielle aminosyrer som sådanne eller blandinger af nitrogen-20 frie analoger af essentielle aminosyrer til behandling af disse nitrogen- eller protein-spildende lidelser er den ubehagelige smag af disse forbindelser. Således er næsten alle de essentielle aminosyrer som sådanne og alle keto-analogerne (som de frie syrer) utiltalende og har 25 ubehagelig smag. Calcium- og natriumsaltene af analogeme er ikke helt så ubehagelige som de essentielle aminosyrer som sådanne, men kan næppe beskrives som velsmagende, og frembyder derfor en begræsnning af den orale anvendelse af disse forbindelser til terapeutiske formål. Det ene-30 ste orale produkt, der findes på markedet, og som udelukkende indeholder essentielle aminosyrer, er et produkt, Æ) som markedsføres under handelsbetegnelsen "AMIN-AID" , og som har en yderst ubehagelig smag. Den ubehagelige smag kan maskeres ved overtrækning eller tablettering 35 af de essentielle aminosyrer eller analoger heraf, men dette fører stadig til klager over en grim eftersmag.

En anden væsentlig hindring for anvendelsen af essentielle aminosyrer som sådanne er deres begrænsede 3

DK 159147 B

opløselighed i vand, således at de almindeligvis ikke kan administreres parenteralt i en koncentreret opløsning. Det eneste kommercielle produkt, som for nærværende er på markedet, og som alene indeholder essentielle 5 aminosyrer til injektion, er et produkt, som markedsføres under handelsbetegnelsen "NEPHRAMINE". Denne 5,1% vandige opløsning af otte essentielle aminosyrer (eksklusive histidin) er meget nær opløselighedsgrænsen ved 0°C.

Det rumfang vand, som må administreres, begrænser an-10 vendeisen af dette produkt, navnlig ved alvorlig nyresvigt.

Selv om lysin og threonin er meget opløselige som sådanne, er tyrosin og cystin meget uopløselige som sådanne. Af denne grund har inkorporeringen af tyrosin el-15 ler cystin i opløsninger til parenteral administrering til små børn været umulig. Cystein er ret opløseligt, men bliver spontant oxideret til dets dimer (cystin) i neutral eller alkalisk opløsning eller ved udsættelse for luft. De resterende essentielle og semi-essentielle ami-20 nosyrer har varierende lav opløselighed.

Syresaltene af neutrale aminosyrer, såsom hydro-chloridsaltene, er meget opløselige. Imidlertid er hydro-chloridsaltene også ret sure i opløsning, og da de ikke eksisterer over ca. pH 2, anvendes de aldrig. De basiske 25 aminosyrer anvendes derimod ofte som hydrochloriderne, da de er mindre sure og eksisterer ved fysiologisk pH.

α-Ketosyreanalogeme og α-hydroxysyreanalogeme er for det meste med vand blandbare væsker, med undtagelse af analogeme af tryptophan, phenylalanin og tyrosin, der 30 er faste stoffer med begrænset vandopløselighed. Natriumsaltene af alle analogeme er opløselige, men anvendelsen af natriumsaltene er ofte udelukket som følge af den medførte natriummængde, der kan være skadelig for patienter med leversygdom eller navnlig nyresygdom. Calcium-35 saltene af analogeme er ret uopløselige.

Flere forskellige temmelig besværlige metoder er blevet udtænkt eller foreslået for at omgå disse opløse- 4

DK 159147 B

lighedsproblemer. F.eks. vil sammenknytning af tyrosin med en anden aminosyre, såsom alanin,i en peptidbinding løse opløselighedsproblemet, men det er en meget dyr vej at gå. Keto- eller hydroxy-analogeme af tyrosin vil for-5 modentlig være effektive, og de er i nogen grad opløselige, men de er også meget dyre at fremstille.

De ovennævnte problemer ved den kendte teknik mindskes ved hjælp af forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilke forbindelser 10 omfatter reaktionsproduktet af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre med en nitrogenfri analog af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre. De omhandlede blandede saltforbindelser dannes i vandigt medium efterfulgt af fjernelse af vandet til opnåelse af et tørt 15 pulverprodukt. Forbindelserne er uden smag eller smager behageligt, og i de fleste, men dog ikke alle tilfælde er der en væsentlig forøgelse i vandopløseligheden af forbindelserne sammenlignet med den mindst opløselige af den aminosyre og den nitrogenfri analog, som omsættes 20 til dannelse af forbindelsen.

Som det er tilfældet med ct-keto- og a-hydroxy-analogerne som sådanne af de essentielle aminosyrer, er forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (i det følgende betegnet de omhandlede for-25 bindeiser) effektive som precursorer, der omdannes i legemet til essentielle og semi-essentielle aminosyrer, som kan udnyttes af legemet til proteinsyntese. Følgelig er blandinger af de omhandlede forbindelser nyttige til behandling af nyre- og leverlidelser og andre nitro-30 gen- eller protein-spildende sygdomme, som er karakteristiske ved underskud af nogle af eller alle de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer i legemet.

Opfindelsen angår således en analogifremgangsmåde til fremstilling af blandede salte af essentielle eller 35 semi-essentielle aminosyrer og nitrogenfrie analoger heraf, hvilke salte er nyttige som precursorer for essentielle og semi-essentielle aminosyrer i legemet og har den almene formel 5

DK 159147 B

AK·x H20 hvori A betegner en essentiel aminosyre valgt blandt L-isoleucin, L-leucin, L-valin, L-methionin, L-phenyl-alanin, L-histidin, L-lysin, L-tryptophan og L-threonin 5 eller en semi-essentiel aminosyre valgt blandt L-tyro-sin, L-cystin, L-cystein, L-arginin og L-ornithin, K betegner en nitrogenfri analog af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre valgt blandt a-keto-analoger og α-hydroxy-analoger deraf, forudsat at når A er 10 L-ornithin eller L-arginin, er K ikke en a-keto-analog af en forgrenet essentiel aminosyre, og x er 0 eller et positivt tal, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en essentiel eller semi-essentiel aminosyre med formlen A omsættes i vandigt medium med en nitrogenfri 15 analog af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre med formlen K.

Der kan benyttes en række hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen som angivet i krav 2-7.

20 De ni essentielle aminosyrer og fem semi-essenti- elle aminosyrer er anført i tabel I, efterfulgt i de fleste tilfælde af deres tilsvarende α-keto- og a-hydro-xy-analoger i nogle tilfælde er de nitrogenfri analoger kendte scm eller antages at være ineffektive som precursorer 25 for den tilsvarende essentielle aminosyre i legemet, og dette er i de pågældende tilfælde angivet i tabel I i stedet for angivelse af navnet af analogen. Analogeme af arginin og ornithin er ikke nitrogenfri og er tilbøjelige til at cyclisere, således at de sandsynligvis er in-30 effektive som aminosyre-precursorer.

DK 159147 B

6

Tabel I

Essentielle og semi-essentielle aminosyrer og deres tilsvarende keto- og hydroxy-analoger (nitrogenfrie analoger) I. Essentielle aminosyrer (EM)

Neutrale aminosyrer Keto-analoger Hydroxy-analoger

L-threonin IE IE

L-valin a-ketoisovaleriane- PIE

syre

L-leucin α-ketoisocapronsyre PIE

L-isoleucin (R,S)-a-keto-|3- PIE

methylvalerianesyre L-methionin a-keto-γ-methiol- (D,L)-a-hydroxy-γ- smørsyre methiolsmørsyre L-phenylalanin phenylpyrodruesyre L-phenylmælkesyre L-tryptophan Indolpyrodruesyre Indolmælkesyre

Basiske aminosyrer Keto-analoger Hydroxy-analoger

L-lysin IE IE

L-histidin Imidazolpyrodruesyre Imidazolmælkesyre II. Semi-essentielle aminosyrer

Neutrale aminosyrer Keto-analoger Hydroxy-analoger L-tyrosin p-hydroxyphenyl- L-p-hydroxyphenyl- pyrodruesyre mælkesyre L-cystin ββ-dithiodipyro- iH^’-dithiodimælke- druesyre syre L-cystein β-mercaptopyro- L-β-mercaρtomælkesyre druesyre

Basiske aminosyrer Keto-analoger Hydroxy-analoger

L-arginin NNF NNF

L-omithin NNF NNF

IE = ineffektiv som aminosyre-precursor PIE = sandsynligvis ineffektiv som aminosyre-precursor

NNF = ikke nitrogenfri og PIE

7

DK 159147 B

De essentielle aminosyrer og semi-essentielle a-minosyrer som sådanne er kommercielt let tilgængelige, og desuden kendes der fremgangsmåder til fremstilling af dem i teknikken. I tilfælde af de basiske aminosyrer, 5 nemlig L-lysin, L-histidin, L-arginin og L-ornithin, anvendes de essentielle aminosyrer i form af deres fri ba ser. I tilfælde af de neutrale aminosyrer, som omfatter de resterende essentielle aminosyrer og tre semi-essen-tielle aminosyrer, anvendes de i form af de respektive 10 frie aminosyrer.

De fleste af de nitrogenfrie analoger af essentielle og semi-essentielle aminosyrer er også kommercielt tilgængelige, almindeligvis som calcium- eller natriumsaltene deraf. Fremgangsmåder til fremstilling af de ni-15 trogenfrie analoger kendes også i teknikken. De frie syrer af analogerne kan fremstilles ud fra saltene deraf ved tilsætning af overskud af saltsyre og påfølgende ekstraktion med ether og inddampning.

Ikke alle de mulige kombinationer er blevet undersøgt, men 20 der er undersøgt et tilstrækkeligt antal af dem til, at man kan være rimeligt sikker på, at de omhandlede forbindelser som klasse betragtet har fordele i forhold til de tilsvarende essentielle og semi-essentielle aminosyrer som sådanne og i forhold til de tilsvarende nitrogenfrie 25 analoger deraf, hvadenten analogerne anvendes som deres natrium- eller calciumsalte eller som frie syrer.

Eksempler på de omhandlede forbindelser, som er blevet undersøgt, indbefatter dem, der er anført i tabel II med deres opløselighed og smagsegenskaber.

30 Til sammenligning er opløseligheden af den mindst opløselige af de to essentielle eller semi-essentielle aminosyrer, som det dannede salt svarer til, anført i tabellens tredie kolonne efterfulgt af faktoren for forøgelsen i opløselighed i den fjerde kolonne. I 35 nogle tilfælde, hvor de to tilsvarende aminosyrer ligger tæt på hinanden med hensyn til opløselighed, er opløseligheden af begge anført i tabellen.

8

DK 159147 B

De omhandlede forbindelser er almindeligvis langt mere velsmagende end de tilsvarende essentielle eller semi-essentielle aminosyrer som sådanne eller de tilsvarende nitrogenfrie analoger.De af de omhandlede 5 forbindelser, som er blevet afprøvet, er således almindeligvis enten uden smag eller har en svagt sød smag, som er ganske behagelig. Desuden er de omhandlede forbindelser som klasse betragtet meget mere opløselige end de tilsvarende essentielle eller semi-essentielle 10 aminosyrer og visse nitrogenfrie analoger. Mest bemærkelsesværdigt er det, at den i høj grad uopløselige semi-essentielle aminosyre L-tyrosin bliver letopløselig, når den kombineres med keto-analogen af leucin.

DK 159147 B

•fa 60 9 & M S § .

g i "I S 2 £ .¾ ρ Θ co ή to p u Som p p 0) 60 60 Ό co to — *p _ w totootoptoTO« T3 É 0 TO 60 UH *D ,5-1 μ ©· mm ·ηφ c: C ^ m r« 60 i—C 0) TO .

Ρ ·Η tf tf TO ^ tf σι J? 60 V 4J r-1 00 TO TO *U 60 <U C C ·Η TO 60 60 Τ3·Η Ό fl C 3 3 Μ Εΰσΐ’Η^

Vi *H ·Η & r-ι 33tuØ-&C3 viC0 '"J

¢,-1,-1 m o) »(0 » W Ή P -u E

ρ to to oo β e cn ^ ©· e co b p 5 M 60 60 P TO TOTO-h60TO*“CQ TOP<U5°2 60« cd 60 Λ PPP'^ul'£>CTO££.tf d i O TO Ρ «ΜθΜ·Η·Η«(0<ι-·Η«ΗΟ 4j tHpqffl top aaij.tdCQMMcJiuCQ'-'^

r-H <d CO

0) *o

0) TO

'd ·Η 0) fi 60 X5 § -H Qi 60 r—l r-i CO *rH ^ ^ G *0/ α; X Μ XX XXX X XX ® <0 d) 60 CO Zm

T3 p ©©· cm I-. vO OO CO U6 O Cvl U0*cr C

TO O V H O 1-1 r-l 0 O ft Λ i-l

,Η O Ή O

•pH

a

CO

e 0)

P

HH

o cd S i—i

* S ^ oo oo s S

P g S .-11-1¾ 2 gioæ oj m 60 * * SS s co co r-tCd*H ΓΗ ^ CO O O UO .P ^ O'-1 λ,,-ι ro S n cm co i r'' g ^ “ “

g jj 0) 2 Λ ·· ·· O λ οι cm csiOO

S fl BI O oo O tf tf O 0-- 00* CO TO Ο- 1-1 -Η ·Η ·Η « O O rH O ·· p p r-l I''· ·· ·> ·· tfCO * g to 60 ft , O »»Ci cd CO G U ·Η ·γ4 ·· *H o« v π) Φ U W ·· 3 G O Η Η Ή 3 Ό 'ΰ β 'U O C5 Γ-Ι £ « O d tf .S >> >, co Q) -Η *H 'Η .H 4J ·Η d^^'dC-HrH OÆ G * O rH4J4JCJ4Jaa ft d) r—I tf ·Η iP O tf P TO TO P ° 01 2 H 2 5? 2

TOP ft *H ø TO rn TO TO Ρ Ρ >» ™ ·Ρ ·* l3 S

H TO O B TO ί> H PS A ft H H JS g P W H P

P

CO

tf (0

60 P

TO i—i co g Cd 60 T3 CO g a p p ga gga s

co ω TO g g S S

•H'tf O CM <t- CO uo 60 Ud

60 iP tf CM iP iP lO oo co vO <t<P O

O o) cd n « » Λ ·> « * ·> ·* *. *

CQ I—I H CS r-t OOO O r-lO O

itf & P

d) i—c p ft>w 60 O cd

•H

1-1 JJ

· I TO cd >-i ft « TO I -U CEL I h p 9-

O TO I O >1 TO ICQ-TO^TO

V CQ n X -u o I r-j & ϋ dJi ftO O-UP O TOTO o

HO cd!-l TOTOd) -P >6) CO

TOP CJTOJ r-l > Jd 0) O O *rl

>0) O to c-ltfl P cow I

op cop to p σ L ·η·η o

CQ I "ri I CrOl O II

•H S IS (U ft ^O I o o TO

0 I O I P p r—l CO / v PP p p^p P TO ftcO“t!'Z>ti 2 2 i*

P TO CO TO TO P p I tf id TO *>TOPP S

r—i p »>P p ‘ >, ft TO^P PP 1 I I

TO I PTO I QPPP I TO ' <U S S tf CO e5 —^ r—i tf ' 3 '— ft tf rP I r-J I I TO

1 i to i I P I L ,rl S S 5 5 "S

Ptftfi>tfCi-ltftfCOr>vj>^J-P ft

TO ·Ρ ·γΙ ri ·Ρ ·Ρ O ·Ρ ·Ρ OH HH ΐ 3 O

P CO CO kO CO co *p CO CO I-1 >> *1-J ζ> ‘ri Ti Λ c >>6ftp tfttop p^tfttop PP p p ft C^^H-UrH^+JtHrW-U-PCOHJCOCO >*

f_I I I m I i 0) I I I tf *rH ti *ri *rj W

PiiliilSpPØPPi-løWøgW H

DK 159147 B

B t 10

•r* « I

μ μ S +. « 03 ™ μ .,4 μ 5¾ * » c

-¾ ·> S

™ oo oo μ ’* 9 01 r-4 ·ι-1 Λ .M dl <0 03 ¢0 in · J> OO cd 00 60 <0 CO fi rt cd 60 dl S α)θθ Ό u w P5 to cn 3

I—C

cO · cn σ> dl

T3 K

dl Ό <U

Ό ·Ηί) Ό

C oo £. C

Cd -ι-f di 00 f—t· r-c 1-1 01 ·Ή X μ i μ I—I I—I rid 0) c <0 dl (U 00 01 μ -ri Ό μ & & Λ <U 00 <u μ μ r-c S c

i-ι £ O 3< CO

rH O *M O CO

•H 5-· <0 μ 03 ^ g μ ·η S <u μ oo μ tu Cfl dl μ

oco , C

Λ * μ ·η ^ x dl 3

μ μ S

οι di *μ oo - μ ·η to i-C Cd -H ft ® i μ α 1-1 co μμ μ S * οι “ Μ ο δ Ό 03 Ο CO g

ΙΜ ϋ os Ο I

ν_/ ,Μ xi 1-C ·· di oo cu αι C ·η , h v-i o μ ·μ S *y Η ιμ ι-ι >ι 3 ™ °» <β dj μ 03 3 τ-Η 03 03 Ο 01 ® 'Ο

di μ ·& Ό 3 τί Ή S

,£3 01 1-1 C ·μ Ο Εί *?η S J3 ft'rf β * <u op η λ ο £ $ Η £·μ

yj tu I—I

M > «

A 03 CO

5 33 00 μ ·μ di ι-c — w S' 03 * Cd U η ° 60 Ό 03 S S 1 CO 0» g ^ £ § S-S 33 μ -S *3

g* 3 § * μ -g I

« 3-° ^ 00¾ 5 o.«« Μ· 3 f ω o co S. *3 i *J 'co * 1 - ♦ S g· 8

Ti CH

β* I T-t μ α cQ. o to μ i 6 -o ι μ /-S μ Ό 01 ..cau χ> αι μ μ *ι cd 3 /3 μ 3 pd μ οο -ο- *5 ν*/ dl ο ·γ» Ή 05 ι r-C ο r-l c 3 co in d> to μ .μ > cm 03 iJ 9 "· s- 3 3 o t n "d r-ι dl

S o) ^3 dl 0*Q

Cd μ μ > O

s g 8 * it * 11

DK 159147 B

Almindeligvis er fremgangsmåderne til fremstilling af de omhandlede forbindelser forholdsvis enkle og ligetil. I tilfælde af de basiske essentielle aminosyrer suspenderes eller opløses omtrent ækvimolære mængder 5 af den frie base af den valgte aminosyre og den frie syre af den valgte nitrogenfri analog i en vandmængde, som er mere end tilstrækkelig til at opløse det Ønskede salt, der er reaktionsproduktet af den fri base og den frie syre. Omrøring og om nødvendigt forsigtig opvarm-10 ning kan anvendes til opløsningsprocessen.

Ved fremstilling af saltene af de basiske aminosyrer har det vist sig, at den titreringskurve (med pH som ordinaten og antal mol tilsat aminosyre pr. mol nitrogenfri analog som abscissen), der opnås, når man 15 sætter den frie base af aminosyren til syreanalogen, har et vendepunkt, som viser sig at falde sammen med det punkt, ved hvilket ækvimolære mængder af den frie base og syreanalogen er blevet forenet.

Vendepunktet viser sig desuden at svare i det mindste 20 tilnærmelsesvis til det isoelektriske punkt eller IP af den af det blandede salt dannede opløsning. Dette vendepunkt vil derfor i det følgende for nemheds skyld blive betegnet som det "isoelektriske punkt" eller "IP". Tegningen viser som eksempel pH-kurven for titre-25 ring af α-keto-isocapronsyre med fri lysin-base. Som det ses af tegningen er IP det punkt, hvor pH-værdien ændrer sig mest med den mindste tilsætning af syre.

Det foretrækkes at titrere syreanalogen med den frie base af aminosyren til det isoelektriske punkt, 30 da dette viser sig at give forbindelser med den bedste smag og sandsynligvis den største opløselighed. Det antages, at den optimale smag opnås ved dette punkt, da den frie base og syreanalogen må have forenet sig fuldstændig (i ækvimolære mængder), 35 således at der ikke skulle være noget overskud af hverken den frie base eller syreanalogen til frem kaldelse af nogen som helst ubehagelig smag fra et sådant overskud. Titrering til det isoelektriske punkt 12

DK 159147 B

er også fordelagtig derved, at det ofte er vanskeligt at sikre ækvimolære mængder af reaktanter, når man arbejder med flygtige væsker (syreanaloger) og ufuldstændigt tørrede faste stoffer (frie baser).

5 Den opnåede produktopløsning inddampes derefter, indtil der begynder at fremkomme et bundfald. Produktet opnås ved at holde opløsningen ved ca. 4°C natten over, med eller uden tilsætning af alkohol eller acetone, efterfulgt af filtrering og tørring. I stedet for ved 10 udfældning kan produktet fordelagtigt udvindes ved lyo-filisering eller forstøvningstørring for at undgå den forvridning af det molære forhold, som optræder, når der anvendes et organisk opløsningsmiddel. Alternativt kan opløsningen anvendes, som den er, eller koncentreres el-15 ler fortyndes på passende måde til anvendelse ved intravenøs injektion.

Når den essentielle eller semi-essentielle aminosyre er en neutral aminosyre, er det nødvendigt at anvende et væsentligt overskud af den fri syre af den ni-20 trogenfri analog i forhold til aminosyren. Overskuddet af fri syre opløses og fjernes ved hjælp af i udfældningstrinnet anvendt alkohol. Den almene fremgangsmåde er i Øvrigt den samme.

I begge tilfælde er det opnåede reaktionsprodukt 25 et tørt hvidt pulver, som ikke er særlig hygroskopisk. Reaktionsproduktet synes ikke at indeholde noget overskud af fri syre eller fri base, da tilstedeværelsen af frie syrer (som er væsker) ville forhindre dannelsen af tørt pulver, og tilstedeværelsen af fri base ville gøre 30 fjernelsen af vand næsten umulig.

De ved omsætning af neutrale aminosyrer og nitrogenfrie analoger dannede salte er noget sure, idet de giver en pH på ca. 3 i vand. Salte dannet ud fra L-lysin eller L-arginin og forskellige nitrogenfrie analoger giver 35 en pH på ca. 5 i vand. L-Histidin-salte giver en pH på ca. 4 til 4,5 i vand.

Stabiliteten af de omhandlede forbindelser viser sig at være sammenlignelig med stabiliteten af de til-

DK 159147 B

13 svarende natrium- eller calciumsalte af de nitrogenfrie analoger. Dvs., at de almindeligvis er stabile i tør tilstand ved stuetemperatur. Saltene sønderdeles langsomt i opløsning ved stuetemperatur, hurtigt i kogende opløs-5 ning og slet ikke i frossen opløsning.

De omhandlede forbindelser synes med sikkerhed at have de samme fysiologiske og terapeutiske virkninger som de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og de nitrogenfrie analoger, som de svarer til. Det er også 10 usandsynligt, at forbindelserne skulle have nogen som helst andre virkninger på det menneskelige legeme end virkningerne af de tilsvarende aminosyrer og nitrogenfrie analoger. Valget af de særlige salte blandt de omhandlede, som skal fremstilles og anvendes til behandling af nyre-15 og leverlidelser, vil følgelig blive baseret på i det væsentlige de samme kriterier, som tidligere anvendtes ved udvælgelse af de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer som sådanne eller de nitrogenfrie analoger son sådanne. Dog vil smags-: og opløselighedsegenskaber ikke 20 længere være begrænsende faktorer.

De omhandlede forbindelser vil almindeligvis ikke blive brugt hver for sig, medmindre der er en indikation af, at patienten er i underskud med hensyn til kun to af de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer. Det er imidlertid 25 sandsynligt, at patienter med nyre- eller leversygdarme, som er på begrænset proteinindtagelse, nyder gavn af blandinger af de omhandlede forbindelser, som svarer til mere end to af de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer.

Valget af de salte, der skal fremstilles og anvendes til 30 behandling af patienter med nitrogen-spildende lidelser, vil almindeligvis være baseret på den i patienternes plasma eller muskelceller observerede grad af formindskelse af koncentrationerne af de enkelte essentielle og semi-essentielle aminosyrer.

35 Når det ønskes at administrere salte blandt de omhandlede til tilvejebringelse af mere end to precur-sorer for essentielle eller semi-essentielle aminosyrer, kan dette gøres på flere forskellige måder. F.eks. kan 14

DK 159147 B

særskilte salte fremstilles hver for sig, idet hvert salt svarer til to af de essentielle eller semi-essenti-elle aminosyrer, for hvilke der ønskes precursorer i det terapeutiske præparat. De særskilte salte vil man deref-5 ter sammenblande enten i tør pulverform eller i opløsningsform til henholdsvis oral eller parenteral administrering .

Alternativt kan alle de essentielle og/eller se-mi-essentielle aminosyrer· og nitrogenfrie analoger, som 10 skal anvendes, blandes sammen i det samme vandige medium til dannelse af en blanding af alle de mulige kombinationer af disse aminosyrer med disse bestemte analoger.

Ved denne fremgangsmåde opnås de reaktanter, som skal være til stede i form af nitrogenfrie analoger, som de 15 frie syrer af analogeme og blandes med et passende rumfang vand (de fleste af disse er væsker, som er blandbare med vand, eller faste stoffer med rimelig høj opløselighed i vand). Til denne opløsning sættes derpå de essentielle og/eller semi-essentielle aminosyrer, som skal 20 udgøre kationerne i saltene (de basiske aminosyrer tilsættes som frie baser, medens de neutrale aminosyrer tilsættes som sådanne). Efterhånden som de basiske aminosyrer tilsættes, stiger blandingens pH-værdi, og ved en pH-værdi på ca. 4 til 5 standses tilsætningen af basiske 25 aminosyrer. Vandet fjernes derpå ved afdampning, og remanensen genopløses i ethanol og tørres derpå i luft.

I tilfælde af en i høj grad uopløselig essentiel eller semi-essentiel aminosyre, såsom L-tyrosin, kan det være fordelagtigt simpelt hen at sætte aminosyren som 3Ό sådan til den tørre blanding af salte, efter at de er blevet fremstillet. I et sådant tilfælde vil tyrosinet eller en anden i tør tilstand tilsat aminosyre ikke indgå i en kemisk reaktion eller danne en ny kemisk enhed. Reaktionsprodukterne kræver således et vandigt medium 35 til deres dannelse.

Undtagen, når der skal anvendes en tør aminosyre, såsom L-tyrosin, i blandingen, kan alle forbindelserne, alene eller i kombination, indgives intra- 15

DK 159147 B

venøst i vandig opløsning. Som tidligere angivet er pH-værdien af opløsninger af omhandlede forbindelser, for hvilke der er anvendt basiske aminosyrer til titrering af syreanalogerne, . ca. 5, hvis der titreres til det 5 isoelektriske punkt. Ved det isoelektriske punkt er således f.eks. pH-værdien af lysinsalte ca. 5,1 til 5,3, og pH-værdien af histidin-a-keto-isovalerat er ca. 4,3.

Da de omhandlede salte er så stærkt associerede, at de er meget dårlige ledere, er det vanskeligt at opnå pH-må-10 linger på fortyndede opløsninger. Man har imidlertid observeret, at tilsætning af 10 rumfang vand til koncentrerede opløsninger af saltene ikke ændrer pH-værdien kendeligt.

Selv om surheden af opløsninger af omhandlede 15 salte med en pH-værdi på ca. 5 kan være irriterende i en perifer vene, kan opløsningerne administreres gennem en central vene uden at fremkalde nogen irritation. Dette er betydningsfuldt i betragtning af fordelene ved den høje opløselighed af disse salte ved denne pH-værdi. Den 20 høje opløselighed muliggør således administrering af de nødvendige doser af essentielle aminosyrer med en minimal mængde vand til individer, som har en begrænset evne til udskillelse af vandmængder. Dette vil være særlig vigtigt i tilfælde af akut nyresvigt og vigtigt i mindre 25 grad hos patienter med kroniske leverlidelser eller kronisk nyresvigt.

Der er en række faktorer, som skal tages i betragtning ved bestemmelse af, om en given essentiel aminosyre eller semi-essentiel aminosyre skal omsættes i 30 form af aminosyren som sådan eller hydroxy- eller keto-analogen heraf for at danne forbindelser blandt de omhandlede. Som angivet i tabel I er for det første en række af analogeme enten ineffektive eller sandsynligvis ineffektive, og i sådanne tilfælde må det sandsynligvis 35 foretrækkes at anvende aminosyren som sådan. For det andet er det i de ovenfor anførte patentskrifter angivet, at især ketosyrerne med forgrenet kæde kan udøve anabo-liske virkninger, som ikke deles af aminosyrerne med for- 16

DK 159147 B

grenet kæde som sådanne. Selv om der er nogen strid med hensyn til sådanne virkninger, er det " overførings *'-fæ-nomen, som gentagne gange er blevet observeret efter administrering af ketosyrer med forgrenet kæde, ikke ble-5 vet observeret efter administrering af aminosyrerne med forgrenet kæde som sådanne. I tilfælde af valin, leucin og isoleucin kan det derfor være at foretrække at anvende keto-analogeme deraf til dannelse af forbindelser blandt de omhandlede.

10 Et tredje kriterium kan være prisen, hvis andre faktorer ikke er bestemmende. Således er f.eks. hydroxy-analogen af methionin meget billigere end methionin som sådan. For det fjerde kan de omhandlede forbindelser som angivet i tabel II adskille sig betydeligt med hensyn til 15 smag og opløselighed, således at disse faktorer kan være bestemmende afhængig af, om forbindelsen skal anvendes til henholdsvis oral eller intravenøs administrering.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. · 20 Eksempel 1

Det observeres, at plasmaet eller muskelceller hos uræmipatienter har underskud af de essentielle aminosyrer valin, leucin, isoleucin, histidin, threonin og lysin og den semi-essentielle syre tyrosin. De synes ik-25 ke at have underskud af andre essentielle aminosyrer, nemlig phenylalanin, methionin og tryptophan. Underskuddet af valin er større end underskuddet af nogen anden af aminosyrerne. Der fremstilles derfor en blanding af salte ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse 30 ved omsætning af følgende forbindelser i vandigt medium i følgende relative molære mængder: 4 dele a-keto-isovalerianesyre, 1 del α-keto-isocapronsyre, 1 del a-keto-(3-methylvaleri-anesyre, 1 del histidin, 2 dele threonin og 2 dele lysin, efter følgende fremgangsmåde: 35 De frie ketosyrer (som er flydende) afvejes i de ønskede mængder som angivet ovenfor og sammenblandes. 1 Rumfang af denne blanding sættes til 1 rumfang vand.

ψ 17

DK 159147 B

Threoninmængden tilsættes derpå som den tørre aminosyre.

Fri lysin-base sættes til en næsten mættet opløsning af fri histidin-base i et molært forhold på 2:1. Denne basiske opløsning anvendes derefter til titrering af den 5 førstnævnte opløsning, indtil den samlede opløsning har en pH-værdi på ca. 4,5. Der fjernes vand fra den samlede opløsning ved afdampning ved 40°C, indtil opløsningen begynder at se uklar ud. Der tilsættes et lille rumfang ethanol, og blandingen anbringes i køleskab ved 4°C aat-10 ten over. Derpå tilsættes der 5 rumfang ethanol, og produktet opsamles ved filtrering og lufttørres. Efter at produktet er fuldstændig tørt, formales det med 1 mol tyrosin til opnåelse af en komposition indeholdende pre-cursorer for seks essentielle aminosyrer i form af for-15 bindeiser ifølge den foreliggende opfindelse og den se-mi-essentielle aminosyre tyrosin som sådan.

Det bemærkes, at den ovennævnte blanding af reaktionsprodukter, uden den efterfølgende tilsætning af tyrosin, tydeligvis er en blanding af hidtil ukendte for-20 bindeiser frem for simpelt hen en fysisk blanding af de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og de nitrogenfrie analoger. Når de samme bestanddele sammenblandes uden tilsætning af vand og påfølgende fjernelse heraf, dannes der således en utiltalende og ildelugtende 25 pløret blanding. Grunden hertil er, at både den frie ly-sin-base og de frie keto-analoger er yderst ildelugtende og utiltalende, og i fraværelse af vand reagerer de ikke fuldstændigt til dannelse af de omhandlede forbindelser.

Eksempel 2 30 En anden komposition, som kan anvendes til be handling af nyresvigt, fremstilles ved i tør tilstand at blande følgende forbindelser blandt de omhandlede plus aminosyrer som sådanne i følgende relative molære forhold: 1 del lysin-a-keto-isovalerat, 1 del histidin-a-35 keto-isovalerat, 1 del lysin-a-keto-isocaproat, 1 del ly-sin-a-keto-ji-methylvalerat, 1 del threonin og 1 del tyrosin. Hvert af de blandede lysin- og histidin-salte 18

DK 159147 B

fremstilles ved at titrere α-keto-analogen i vand med henholdsvis fri lysin- eller histidin-base, indtil det pågældende isoelektriske punkt er nået. Hver forbindelse udvindes derefter i tør form ved udfældning og tørring 5 som beskrevet ovenfor. Da threonin og tyrosin ikke smager særlig dårligt, anvendes de som sådanne ved blanding og formaling med de tørre lysin- og histidin-salte. En fordel ved denne komposition i forhold til kompositionen i-følge eksempel 1 er, at de omhandlede forbindelser kan 10 fremstilles og opbevares i tør form og derefter kombinereslige før administrering. Denne blanding kan administreres til patienter, som lider af nyresvigt, i doser på fra ca. 10 til 15 g af blandingen pr. dag.

Eksempel 3 15 De omhandlede forbindelser kan fordelagtigt an vendes til behandling af leverlideIser, navnlig portalsystemisk encephalopathia, i kombination med ornithin-salte af ketosyrer med forgrenet kæde, som er beskrevet i norsk patentskrift nr. 151.119. En passende blanding 20 af denne type kan omfatte 1 mol af hvert af de tre ornithin-salte af ketosyrer med forgrenet kæde, 1 mol af hvert af de tre ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede lysin-salte af ketosyrer med forgrenet kæde og 1 eller 2 mol threonin. Alle disse 25 forbindelser har en rimeligt behagelig smag og kan sammenblandes i tør form.

Yderligere kompositioner omfattende blandinger af salte fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse til behandling af nyre- og leverlidelser og andre nitrogen-spildende 30 sygdomme vil den sagkyndige kunne nå frem til på grundlag af den foreliggende beskrivelse. F.eks. kunne der som ovenfor fremstilles en blanding af forbindelser repræsenterende alle ni af de essentielle aminosyrer i enten aminosyreformen eller i form af de nitrogenfrie ana-35 loger. En sådan blanding af omhandlede .forbindelser ville være lige så effektiv som en simpel blanding af de ni essentielle aminosyrer som sådanne og ville have den for- r 19

DK 159147 B

del, at den er meget mere velsmagende, og derfor tilfredsstillende til oral terapeutisk administrering.

Til behandling af protein-spildende sygdomme og dårlig ernæringstilstand kan der fremstilles en kompo-5 sition under anvendelse af forbindelser fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, som samlet indeholder alle de essentielle aminosyrer plus arginin, bortset fra at me-thionin (hvis salte har en ubehagelig smag) fortrinsvis ville anvendes i kapsel- eller tabletform for at maskere 10 dets smag.

Det fremgår klart af den forøgede opløselighed og den ændring i smag, som indtræder, når man ifølge den foreliggende opfindelse kombinerer de essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og nitrogenfrie analoger der-15 af, at der er dannet nye kemiske enheder. Den omstændighed, at titreringskurven, som fremkommer ved tilsætning af fri base til syreanaloger, har et vendepunkt, som falder sammen med ækvimolær tilsætning, er også et godt bevis på dannelsen af nye kemiske enheder.

20 Uden ønske om at binde sig til nogen bestemt teo ri, antages det, at den nye kemiske enhed kan være til stede i opløsning eller i tør pulverform i enhver af eller alle de tre former, som omfatter: (1) et blandet salt, hvori aminosyren er kationen, og ketosyre- eller 25 hydroxysyre-analogen er anionen, (2) en carbinolamin, og (3) den Schiff-base, som dannes ved spontan og reversibel dehydratation af carbinolaminen. Disse tre former skulle forekomme i en ligevægt, hvis relative mængdeforhold er ukendte, men som kan gengives ved de nedenfor anførte 30 formler, hvori er carbonhydridskelettet af den essentielle eller semi-essentielle aminosyre, og er carbonhydridskelettet af analogen af en essentiel eller se-mi-essentiel aminosyre.

20

DK 159147 B

(1) R2“CHCOOH + R-j-ijj-COCf Blandet salt

Nh3+ 0 Λ j 2 jl (2) HOOC-CHNHC-COOH Carbinolamm 1J'

Ro R-i 1 ^ I ^ (3) HOOC-CHN=C-COOH Schiff-base H2°

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af blandede salte af essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og nitrogenfrie analoger heraf, hvilke salte er nyttige som precursorer for essentielle og semi- 5 essentielle aminosyrer i legemet og har den almene formel AK-x H20 hvori A betegner en essentiel aminosyre valgt blandt L-isoleucin, L-leucin, L-valin, L-methionin, L-phenyl-10 alanin, L-histidin, L-lysin, L-tryptophan og L-threonin eller en semi-essentiel aminosyre valgt blandt L-tyro-sin, L-cystin, L-cystein, L-arginin og L-ornithin, K betegner en nitrogenfri analog af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre valgt blandt a-keto-analoger 15 og α-hydroxy-analoger deraf, forudsat at når A er L-ornithin eller L-arginin, er K ikke en a-keto-analog af en forgrenet essentiel aminosyre, og x er 0 eller et positivt tal, kendetegnet ved, at en essentiel eller semi-essentiel aminosyre med formlen A 20 omsættes i vandigt medium med en nitrogenfri analog af en essentiel eller semi-essentiel aminosyre med formlen K.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-n e t ved, at reaktionsproduktet udvindes i tør form 25 ved fjernelse af vand.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den essentielle aminosyre er valgt blandt de basiske aminosyrer L-lysin og L-histidin, og at den essentielle aminosyre og den nitrogenfrie analog omsættes 30. omtrent ækvimolære mængder.

4, Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den nitrogenfrie analog titreres med den frie base af den basiske aminosyre, indtil det isoelek-triske punkt for reaktionsblandingen er nået.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendeteg net ved, at den essentielle eller semi-essentielle aminosyre er en neutral aminosyre, og at den nitrogenfrie DK 159147B analog tilsættes i et væsentligt overskud til den neutrale aminosyre.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de essentielle aminosyrer L-lysin og L-5 histidin og de semi-essentielle aminosyrer L-arginin og L-ornithin omsættes i form af frie baser, og at de øvrige essentielle eller semi-essentielle aminosyrer og de nitrogenfrie analoger omsættes som frie syrer.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendete g-10 net ved, at den nævnte frie base og/eller frie syre opløses eller suspenderes i en vandmængde, der er i det mindste tilstrækkelig til at opløse reaktionsproduktet.