DK157007B - Vitamin d3 derivater, farmaceutiske praeparater indeholdende disse forbindelser, samt anvendelse af disse forbindelser til fremstilling af farmaceutiske praeparater til behandling af neoplastiske sygdomme eller til induktion af differentiering i maligne celler - Google Patents

Description

DK 157007 B

Den foreliggende opfindelse angâr hidtil ukendte vitamin D derivater, som er ejendommelige ved, at de har den i krav l's kendetegnende del angivne formel.

5 Desuden angâr opfindelsen farmaceutiske præparater, som er ejendommelige ved det i krav 4's og 7's kendetegnende dele angivne, og endelig angâr opfindelsen anvendelse af de i krav 1 omhandlede derivater til fremstilling af farmaceutiske præparater til behandling af neoplastiske 10 sygdomme eller til induktion af differentiering i maligne celler.

Det er velkendt, at vitamin D regulerer calcium og phos-phormetabolisme hos dyr og mennesker, og det er nu helt 15 klart bevist, at den biologiske effektivitet af vitamin D afhænger af vitaminets stofskiftemæssige omsætning in vivo til hydroxylerede derivater. Sâledes hydroxyleres vitamin D3 in vivo til 25-hydroxyvitamin D3 i leveren, der for sit vedkommende omdannes til la,25-dihydroxyvi-20 tamin D3 i nyrerne. Det er sidstnævnte forbindelse, der nu anerkendes som værende den cirkulerende hormonale form af vitamin D.

Pâ grund af deres biologiske evne til at fremme calcium-25 og phosphortransport i tarmen og til at mobilisere og mineralisere knogler er disse former af vitamin D vig-tige farmaceutiske forbindelser, der er særdeles veleg-nede til anvendelse ved behandlingen af forskellige knoglesygdomme.

30

Vitamin D derivater og deres fremstilling og anvendelse er omtalt i en hel række patentskrifter og inden for den videnskabelige litteratur. F. eks. omhandler USA patent-skrift nr. 3 565 924 25-hydroxycholecalciferol; USA pa-35 tentskrift nr. 3 697 559 omhandler 1,25-dihydroxychole-calciferol; USA patentskrift nr. 3 741 996 omhandler la- 2 hydroxycholecalciferol; USA patentskrift nr. 3 786 062 omhandler 22-dehydro-25-hydroxycholecalciferol; USA patentskrift nr. 3 880 894 omhandler 1,25-dihydroxyergo-calciferol; USA patentskrift nr. 4 201 881 omhandler 5 24,24-difluor-ΐα,25-dihydroxycholecalciferol og OSA pa tentskrift nr. 4 196 133 omhandler 24,24-difluor-la,25-dihydroxycholecalcif erol.

De omhandlede vitamin D forbindelser har nu vist sig at 10 udvise glimrende vitamin D lignende virkning, og af den grund kan de let anvendes som en erstatning for vitamin D sâvel som dettes derivater til velkendte anvendelser som f. eks. behandling af forskellige sygelige tilstan-de, der viser sig i forbindelse med calcium og phosphor 15 ubalance som hypoparathyroidisme, osteodystrophi, osteo-malacia og ostéoporose.

Disse derivater er 26-homovitaminer og eksempler pâ disse er la,25-dihydroxy-22E-dehydro-26-homovitamin D3 20 og la,25-dihydroxy-26-homovitamin D3. Derivaterne er i besiddelse af den overraskende fordel i forhold til la,25-dihydroxy-vitamin Ü3, at de uventet udviser h0jere anti-leukæmisk til calcemisk virkende forhold end dette.

25 De omhandlede forbindelser afbildes med den almene formel : ôc 35 hvori R1-R5 har de i krav 1 anf0rte betydninger.

3

DK 157007 B

I den skematiske og detaljerede beskrivelse af fremstil-lingen af de omhandlede forbindelser betyder samme numre samme forbindelser.

5 REAKTIONSSKEMA

oh

MO«*TO λΛ HOMO S. ttOflO

10 ïrP r¥r° —* rW-1 tiona 1 ί J.

J 4— Af^3-1 «— -MP

jf. hA'A-J1 20 „„.ΧΧ0Η Z 4 R=mn g · 5 6 R^c 25 ιΓ^Ύη ^

Ho-'*^^oh 10 9 30 Λ-/ 35

DK 157007B

4

Fremgangsmâden til fremstilling af omhandlede derivater beskrives nærmere nedenfor: la,38-dimethoxymethoxy-23,24-dinorchol-5-en-22-al omsat-5 tes med vinylmagnesiumbromid til fremstilling af allyl-alkoholen 1. Denne alkohol underkastedes Claisen omlej-ring ved at omsætte den med trimethylortho-n-butylat og en katalytisk mængde propionsyre til opnâelse af esteren 2 i godt udbytte (97%). Forbindelsen 2 omdannedes til 10 dennes enolat form ved behandling med n-butyllithium og THF, der herefter behandledes med oxygen og dernæst re-duceredes med triethylphosphit til indf0rsel af en hy-droxylgruppe ved C-25-stillingen i molekylet. Herefter omdannedes 27-esteren 3 til alkoholen 4 ved behandling 15 f0rst med lithiumaluminiumhydrid til opnâelse af den tilsvarende diol efterfulgt af behandling med methansul-fonylchlorid og pyridin til opnâelse af mesylatet, der for sit vedkommende behandledes med lithiumaluminiumhy-drid.

20

Fjernelse af MOM-gruppen ved behandling med syre gav (22E, 25ξ)-1α,38,25-trihydroxy-26-homo-cholesta-5,22-dien 5, der acetyleredes til opnâelse af diacetatet 6. Allylbromering af 6 med N-bromsuccinimid og herefter med 25 tetça-n-butylammoniumfluorid gav 5,7,22-trienen 7, der bestrâledes og isomeriseredes ved opvarmning til opnâelse af la,25-dihydroxy-(22E)-dehydro-26-homovitamin D3 8.

(25Ç)-la,25-dihydroxy-26-homovitamin D3 11 fremstilledes 30 ved selektiv hydrogenering af 5,22-dienen 6 til opnâelse af 5-enen 9, der omdannedes til 5,7-dienen 10 og herefter til 26-homo-vitamin 11 som beskrevet ovenfor. 1 den efterf0lgende detaljerede beskrivelse af frem-35 gangsmâden bestemtes smeltepunkterne med varmt-trins mikroskop og er angivet ukorrigeret. ^H-NMR-spektrene

DK 157007 B

5 blev optaget med et Hitachi R-24A (60 MHz) i CDCI3 med

Me4Si som en indre standard, med mindre andet er angi- vetMassespektre blev opnâet med Shimadzu QP-1000 mas- sespektrometer ved 70 eV. UV spektre blev optaget i 5 ethanol-opl0sning med et Shimadzu UV 2000 dobbeltstrâ- lespektofotometer. S0jlechromatografi udf0rtes under anvendelse af silicagel (E. Merck, Kieselgel 60, 70-230 mesh). Præparativ tyndtlagschromatografi udf0rtes pâ præcoatede plader af silicagel (E. Merck, Kieselgel 60 10 f254' 0,25 mm tyk). Sædvanlig oparbejdning er fortynding med vand, ekstraktion med et organisk opl0sningsmiddel, der er angivet i parantes, vask af ekstrakten indtil neufcral reaktion, t0rring over vandfrit magnesiumsulfat, filtrering og fjernelse af opl0sningsmidlet under redu- 15 ceret tryk. F0lgende forkortelser anvendtes: THP-tetra- hydropyranyl; THF-tetrahydrofuran; ether-diethylether,

MeOH-methanol, MOM-methoxymethyl, LDA-lithiumdiisopro- 0 pylamid. Temperaturer er angivet i C.

20 (22E)-la,36-dimethoxymethyloxy-26-homocholesta-5,22- dien-27-syremethyl ester (2)

En opl0sning af allylalkoholen 1 (390 mg, 0,844 mmol), trimethylortho-n-butylat (0,7 ml) og propionsyre (3 drâ-25 ber), i toluen (6 ml) opvarmedes 2 timer med tilbagesva-ling under argon. Fjernelse af opl0sningsmidlet under reduceret tryk gav den urensede forbindelse, der hældtes pâ en s0jle af silicagel (20 g). Eluering med hexan-ethylacetat (5:1) gav esteren 2 (446 mg 97%) som en 30 olie. 1H-NMR δ:0,68 (3H, s, I8-H3), 0,88 (3H, t, J = 7

Hz, -CH2CH3), 0,98 (3H, d, J = 6 Hz, 21-H3) 3,03 (3H, s, I9-H3), 3,38 (3H, s, -OCH3), 3,43 (3H, s, -OCH3), 3,68 (3H, s, -CO2CH3), 3,76 (1H, m, 18-H), 4,68 (2H, s, 3β-0-CH2-Ô-), 4,69 (2H, ABq, J = 7 Hz, AB = 11 Hz, la-0-CH2~ 35 O), 5,27 (2H, m, 22-H og 23-H), og 5,56 (1H, m, 6-H).

DK 157007B

6 (22E,25ξ) -Ια, 3 8-dimethoxyntethyloxy-25-hydroxy-26-homocholesta-5,22-dien-27~syre methylester (3)

Til en opl0sning af LDA (fremstillet med diisopropyla- min) (0,13 ml, 0,929 mmol), 1,56 mmol n-butyllithium (0,59 ml) og THF (2 ml) sattes esteren 2 (437 mg, 0,800 5 mmol) i THF ( 5ml), og blandingen omr0rtes under argon o ved -78 C i 30 minutter. Oxygen bobledes gennem opl0s-ningen, og herefter tilsattes triethylphosphit ( 0,14 ml, 0,817 mmol). Sædvanlig oparbejdning (ether til ekstraktion) gav en urenset forbindelse, der pâf0rtes en 10 S0jle af silicagel (25 g). Eluering med hexan-ethyl- acetat (5:1) gav hydroxyesteren 3 (303 mg, 67%) som en olie. 1H-NMR 6:0,68 (3H, s, I8-H3), 0,85 (3H, t, J = 7 Hz, -CH2CH3), 0,98 (3H, d, J = 6 Hz, 21-H3), 1,02 (3H, s, I9-H3), 3,08 (1H, bs, Wx/2 = 3 Hz, -OH), 3,38 (3H, s, 15 -OCH3), 3,42 (3H, s, -OCH3), 3,76 (3H, s, -CO2CH3) 4,68 (2H, s, 38-0-CH2-0-), 4,68 (2H, ABq, J = 7 Hz, AB = 11 Hz, la-0-CH2-0-), 5,32 (2H, m, 22-H og 23-H), 5,55 (1H, m, 6-H).

20 (22E,25ζ)-1α,3B-dimethoxymethyloxy-25-hydroxy-26-homo- cholesta-5,22-dien (4)

Til^en opl0sning af hydroxyesteren 3 (294 mg, 0,539 mmol) i THF sattes lithiumaluminiumhydrid (20 mg, 0,526 25 mmol), og blandingen omr0rtes ved stuetemperatur i 30 minutter. Oparbejdning som sædvanlig (ether til ekstra-tion) gav en urenset diol. Denne behandledes med methan-sulfonylchlorid (0,04 ml, 0,517 mmol) og pyridin (1,5 ml) ved stuetemperatur i 30 minutter. Sædvanlig opar-30 bejdning (ether til ekstraktion) gav et urenset mesylat.

Til en opl0sning af det urensede mesylat i THF (5 ml) satfees lithiumaluminiumhydrid-(20 mgr 0,526 mmol), og blandingen opvarmedes 30 minutter med tilbagesvaling.

Sædvanlig oparbejdning (ether til ekstraktion) gav en 35 7

DK 157007 B

urenset forbindelse, der pâf0rtes en s0jle af silicagel (20 g). Eluering med hexan-ethylacetat (5:1) gav alkoho-lenr4 (190 mg, 70%) som en olie. ^H-NMR 6:0,71 (3H, s, I8-H3), 0,90 (3H, t, J = 7 HZ, -CH2CH3), 1,03 (3H, d, J = 6 Hz, 2I-H3), 1,03 (3H, s, I9-H3), 1,12 (3H, S, 27-H3), 3,36 (3H, s, -OCH3), 3,40 (3H, s, -OCH3), 3,74 (1H, 5 m, 10-H), 4,66 (2H, s, 30-O-CH2-O-), 4,67 (2H, ABq, J = 7 Hz, AB = 11 Hz, la-0-CH2-0-), 5,35 (2H, m, 22-H og 23-H) og 5,54 (1H, m, 6-H).

(22E,25ζ)-Ια,30,25-trihydroxy-26-homocholesta-5,22-dien 10 151

En opl0sning af dimethoxymethyletheren 1 mg, 0,349 mmol) i THF (5 ml) behandledes med 6N HCl (1 ml) i 1 1/2 time 0 ved 50 C. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat til 15 ekstraktion) gav et urenset produkt, der pâf0rtes en s0jle af silicagel (15 g). Eluering med hexan-ethylacetat (1:2) gav triolen 5 (147 mg, 98%) med smeltepunkt 85-87 C (hexan-dichlormethan), ^H-NMR 6:0,69 (3H, s, I8-H3), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz, -CH2CH3), 1,02 (3H, s, 20 I9-H3), 1,13 (3H, s, 27-H3), 3,85 (1H, m, 10-H), 3,98 (1H, m, 3a-H), 5,40 (2H, m, 22-H og 23-H) og 5,60 (1H, m, 6-H).

( 22Ε,25ζ)-1α,30-άί3σ6ίοχγ-25-ΙινάΓθχν-26-Ιιοπιοο1ιοΐ65ί3-25 5,22-dien (6)

En opl0sning af triolen 5 (100 mg, 0,233 mmol) i pyridin (1 ml) behandledes med eddikesyreanhydrid (1 ml) ved stuetemperatur i 15 timer. Sædvanlig oparbejdning (et-30 hylacetat til ekstraktion) gav en urenset forbindelse, der pâf0rtes en s0jle af silicagel (10 g). Eluering med hexan-ethylacetat (5:1)-gav diacetatet 6 (101 mg, 85%) som et amorft fast stof. ^H-NMR 6:0,68 (3H, s, I8-H3), 0,88 (3H, t, J = 7 Hz, -CH2CH3), 0,98 (3H, d, J = 6 Hz, 35

DK 157007 B

8 21-H3), 1,08 (3H, s, I9-H3), 1,12 (3H, s, 27-H3), 2,03 (3H, s, acetyl), 2,06 (3H, s, acetyl), 4,98 (1H, m, 3a-H), 5,06 (1H, m, 16-H), 5,37 (2H, m, 22-H og 23-H) og 5,53 (1H, m, 6-H).

(22E,25ξ)-Ια,3β,25-trihydroxy-26-homocholesta-5,7,22-5 trien (7)

En opl0sning af 5,22-dienen 6 (38 mg, 0,0739 mmol) og N- bromsuccinimid (19 mg, 0,107 mmol) i carbontetrachlorid (3 ml) opvarmedes 20 minutter under argon med tilbage- 10 svaling. Efter afk0ling til 0 °C frafiltreredes det

fremkomne bundfald. Filtratet koncentreredes under 40 °C

til opnâelse af en remanens. En opl0sning af denne reraa- nens i 5 ml THF behandledes med en katalytisk mængde te- tra-n-butylammoniumbromid ved stuetemperatur i 50 minut- 15 ter. Herefter behandledes blandingen med en opl0sning af tetra-n-butylammoniumfluorid i THF (0,3 ml, 0,3 mmol) ved stuetemperatur i 30 minutter. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat til ekstraktion) gav en urenset trien. Den- ne trien i THF (5 ml) behandledes med 5% KOH-MeOH (4 mi) 20 ved stuetemperatur i 14 timer. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat til ekstraktion) gav en urenset forbindel- se, der underkastedes præperativ tyndtlags chromatografi (benzen-ethylacetat, 1:1, fremkaldt 6 gange). Bândet med

Rf-værdien 0,45 blev skrabet af og elueret med ethyl- 25 acetat. Fjernelse af opl0sningsmidlet gav 5,7,22-trienen 7 (8,7 mg, 40%). UV \EtOH : 293, 282, 271 nm.

max (22Ε,25ζ)-1α,25-άΐ1ιγάΓθχν-22-ά6ΐιγάΓο-26-Ιιοιηονί±3ΐη1η 0-¾ 30 (8)

En opl0sning af trienen 7 (4,4 mg, 0,0103 mmol) i foemzen (90 ml) og éthanol (40 ml) bestrâledes med en medium tryk kviks0lvlampe gennem et Vycor-filter ved fl *C i 2 35 9

DK 157007 B

1/2 minut under argon. Reaktionsblandingen opvarmedes 1 time med tilbagesvaling under argon. Fjernelse af opl0s-ningsmidlet under reduceret tryk gav en urenset forbin-delse, der underkastedes præparativ tyndtlags-chromato-5 grafi (benzen-ethylacetat, 1:1, fremkaldt 6 gange). Bân-det med Rf-værdien 0,49 blev skrabet af og elueret med ethylacetat. Fjernelse af opl0sningsmidlet gav den vita- min D3 analoge 8 (0,91 mg, 21%). ÜV λ Et0H : 265 nm, max 10 λ Et0H : 282 nm. MS m/z: 428 (M+), 410, 392, 374, 338, min 320, 287, 269,251, 141, 134, 123, 73. 1H-NMR (400 MHz) δ:0,56 (3H, s, I8-H3), 0,91 (3H, t, J = 7,6 Hz, -CH2CH3), 1,04 (3H, d, J = 6,8 Hz, 2I-H3), 1,13 (3H, s, 15 27-H3), 4,23 (1H, m, W1/2 = 18,4 Hz, 3a-H), 4,43 (1H, m,

Wl/2 = 16,9 Hz, 1β-Η), 5,00 (1H, bs, Wi/2 = 3,2 Hz, 19-H), 5,32 (1H, bs, Wi/2 = 3,2 Hz, 19~H), 5,37 (2H, m, 22-H og 23-H), 6,02 (1H, d, J = 11,5 Hz, 7-H) og 6,38 (1H, d, J = 11,5 Hz, 6-H).

20 (25£)-la,38-diacetoxy-25-hydroxy-26-homocholest-5-en (9)

En blanding af 5,22-dienen 6 (35 mg, 0,0681 mmol) og 10%

Pd-C (4 mg) i ethylacetat (4 ml) omr0rtes under hydrogen 25 3 timer ved stuetemperatur. Palladium-katalysatoren fra- filtreredes, og filtratet koncentreredes til opnâelse af en remanens, der underkastedes præparativ tyndtlagschro-matografi (hexan-ethylacetat, 2:1, fremkaldt én gang).

Bândet med Rf-værdi 0,46 blev skrabet af. Eluering med 30 ethylacetat gav 5-enen 9 (30 mg, 85%) som et amorft fast stof. 1H-NMR δ:0,66 (3H, s, I8-H3), 0,88 (3H, t, J = 7 Hz, -CH2CH3), 1,08 (3H, s, 19-H3), 1,12 (3H, s, 27-H3), 2,02 (3H, s, acetyl), 2,04 (3H, s, acetyl), 4,97 (1H, m, 3a-Hr), 5,04 (1H, m, lp-H) og 5,51 (1H, m, 6-H).

35

DK 157007 B

10 ( 25ζ)-Ια, 3β, 25-trihydroxy--26-homocholesta-5,7-dien ( 10) 5-enen (22 mg, 0,0426 mmol) omdannedes som beskrevet for forbindelsen 6 til 5,7-dienen 10 (6,7 mg, 37%).

5 OV λ Et0H Ï 293, 282, 271 nm. max (25C)-la,25-dihydroxy-26-homovitamin Dq 11 10 Dienen 10 (4,8 mg, 0,0112 mmol) omdannedes som beskrevet for forbindelsen 7 til den vitamin D3 analoge 11 (1,3 mg, 27%). ÜV λ EtOH : 265 nm, λ EtOH : 228 nm. MS m/z : max min 430 (M+), 412, 394, 379, 376, 287, 269, 251, 152, 134, 15 116, 73, 55.

Eventuelt kan de omhandlede forbindelser let fâs i kry-stallinsk form ved omkrystallisation med passende opl0s-ningsmidler som hexan, ethere, alkoholer eller blandin-20 ger heraf, sâdan som det vil være klart for fagmanden.

Biologisk aktivitet

Knoqlecalcium mobiliserende virkning af la,25-(OH)9-26-25 homo-Dq forbindelser.

Han-fravænnede rotter blev indk0bt fra Holtzman Co.,

Madison, Wis. og fodret ad libitum med en lav-calcium, vitamin D fattig diæt som beskrevet af Suda et al (J.

30 Nutrition 100:1049, 1970) og vand i 3 uger. Herefter op-deltes rotterne i 4 grupper med 6 i hver, og der blev indgivet intrajugulart henholdsvis 650 pmol af enten la,25-(OH)2-26-homo-D3, la,25-(OH)2-(22E) Δ 22-26-homo-D3 eller la,25-(OH)2D3 opl0st i 0,05 ml 95% éthanol 7 35 timer inden aflivning. Rotterne i kontrolgruppen fik 0,05 ml 95% éthanol 7 timer inden aflivning. Rotterne i

DK 157007 B

11 kontrolgruppen fik 0,05 ml éthanol bærestof pâ samme mâ-de. De blev aflivet ved at hugge hovedet af, blodet op-samledes og centrifugeredes til opnâelse af sérum. Sérum calcium koncentrationen bestemtes med et atom-absorp-5 tions spektrofotometer (Perkin-Elmer model 214) i nærvæ-relse af 0,1 % lanthanumchlorid. Resultaterne er angivet i tabel 1 nedenfor: TABEL 1 10

Administrerede Sérum calciumkoncentration forbindelser (mg/100 ml) éthanol 3,4 ± 0,3 * a) 15 la,25-(OH)2-26-homo-D3 4,6 ± 0,2 b) la,25-(OH)2”(22E) Δ 22-26-homo D3 4,6 ± 0,3 b) la,25-(OH)2D3 4,5 ± 0,2 b) * standard afvigelse fra gennemsnit 20 b) er signifikant forskellig fra a) P< 0,001

Af ovenstâende resultater kan det konkluderes, at i det vitamin D responderende System hos vitamin D manglende dyr udviser de omhandlede forbindelser samme aktivitet 25 som la,25-dihydroxy vitamin D3, den cirkulerende hormonale form af vitaminet.

De omhandlede forbindelser kan let administreres for at udnytte deres calcemiske virkning som stérile parentera-30 le opl0sninger ved injektion eller intraven0st eller per os i form af perorale doser eller ved suppositorier eller transcutant. Doser pâ fra ca. 0,1 yg til ca. 2,5 yg per dag er i stand til at opnâ det fysiologiske calcium-balancerespons, der er karakteristisk for vitamin D-lig-35 nende virkning med vedligeholdelsesdosis pâ fra ca. 0,1 yg til ca. 0,5 yg.

DK 157007 B

12

Det har for nylig vist sig, at la,25-dihydroxy vitamin D3 (laf25-(OH)2D3) og dens strukturelt analoge forbin-delse Ια-hydroxy vitamin D3 (la-OH-D3) ud over deres veletablerede calcemiske virkning omtalt ovenfor ogsâ udviser kraftig anti-cancer virkning. Specielt har det vist sig, at ovennævnte forbindelser var i stand til at 5 bevirke differentiering af maligne humane celler som leukæmi-celler i kultur til ikke-maligne makrofager, og anti-cancer virkningen pâ celler in vitro kunne korrele-res med helbredende virkninger in vivo ved at vise, at administreringen af disse forbindelser forlængede leve-10 tiden hos leukæmiske mus (i forhold til kontroller) og kraftigt forbedrede tilstanden hos leukæmi patienter.

Baseret pâ disse observationer er 1 α-hydroxylerede vitamin D forbindelser blevet foreslâet som terapeutiske lægemidler ved behandlingen af leukæmoide sygdomme (Suda 15 et al, USA patentskrift nr. 4 391 802).

Sk0nt disse kendte Ια-hydroxy vitamin D forbindelser af-pr0vet af Suda et al (supra) nemlig Ια-hydroxy vitamin D3 (la-OH-D3) og la,25-dihydroxy vitamin D3 (la,25-20 (OH)2D3) faktisk er kraftig virkende med hensyn til at forârsage differentiering af leukæmiske celler, er der en alvorlig ulempe ved deres anvendelse som anti-leukæ-miske midler, som f0lge af den uundgâelig hpje calcemiske virkning af disse forbindelser. Sâledes er la,25-25 (OH)2D3, den kraftigste vitamin-afledte anti-leukæmiske hidtil kendte forbindelse, ogsâ det kraftigste calcemiske middel, og den anti-leukæmiske virkning af IC1-OH-D3 er pâ samme mâde korreleret med h0j calcemisk virkning.

Administrering af disse forbindelser i dosis-mængder, 30 hvor de er effektive som anti-leukæmiske lægemidler Jf. eks. 1 yg /dag som angivet i eksemplerne i nævnte Suda et al patentskrift) vil uundgâeligt frembringe forh0-jede, potentielt for store, calcium-niveauer med med£0l-gende alvorlige medicinske komplikationer, specielt hos 35

DK 157007B

13 patienter, der allerede lider af en yderst alvorlig sygdom. Pâ grund af den h0je intrinsikke virkning af de kendte Ια-hydroxy vitamin D forbindelser til ât hæve calcium niveauerne, er deres anvendelse som anti-5 leukæmiske midler udelukket.

En foretrukken metode til behandling af maligne sygdomme ville klart være administreringen af forbindelser, der er karakteriseret ved et h0jt anti-leukæmisk til calce-10 misk virkende forhold dvs. forbindelser, der udviser en for0get effektivitet til at udvirke differentiering af leukæmiske celler i forhold til deres evne til at hæve serumcalcium-niveauer.

15 De omhandlede forbindelser er ogsâ i stand til at in- ducere differentiering af maligne celler til ikke-malig-ne celler dvs. de udviser antineoplastisk virkning màlt ved leukæmicelledifferentiering, og disse forbindelsers antineoplastiske virkning er stærkere end virknigen af 20 la,25-(OH)2-D3, mens de ikke er mere aktive end la,25- dihydroxyvitamin D3 med hensyn til deres virkning pâ calciummetabolismen. Pâ grund af denne enestâende og uventede kombination af egenskaber, repræsenterer de omhandlede sidekæde homovitamin D forbindelser foretrukne 25 lægemidler til behandling af leukæmisygdomme og andre neoplastiske sygdomme.

Nâr de omhandlede sidekaede-homovitamin D forbindelser administreres til humane promyelocytiske leukæmiceller 30 (HL-60 celler) dyrket i kultur frembringer de differen tiering af disse celler til makrophager (monocytter). I adskillige standardfors0g til mâling af differentie-ringsvirkningen viste forbindelserne sig at være mere effektive end la,25(OH)2D3, det hidtil mest aktive kend-35 te vitamin D dérivât. Fors0g udf0rtes pâ f0lgende mâde: 14

DK 157007 B

Fors0g over homovitamin D forbindelsernes differen-tierende virkninq

Den humane promyelocytiske leukæmicellelinie (HL-60) 5 blev vedligeholdt i suspensionskultur i RPML 1640 substrat (Gibco, Grand Island, NY) tilsat 10 rumfang/rum-fang-% varmeinaktiveret f0talt kalveserum 100 mg/ml pe-nicillin, 100 pg/ml streptomycin og 0,25 ug/ml fungizo-ne. Cellerne dyrkedes i en befugtet atmosfære med 5% 10 CO2. Cellelevedygtigheden blev unders0gt ved standard-fors0g f. eks. tryphanblâ eksklusion. Morphologisk be-d0mmelse blev gjort pâ Wright-farvede objektglaspræpa-rater.

15 Cellerne blev udsâet i 1,5 - 2 x 10^ celler/ml i 10 ml substrat i vævsdyrkningsskâle. Efter 20 timers forl0b behandledes doublet plader herefter med hver af fors0gs-forbindelserne i forskellige koncentrationer soin angivet i tabellerne nedenfor. Fors0gsforbindelserne blev tilsat 20 som opl0sninger i 100% éthanol, sâledes at den totale ethanolkoncentration i hver dyrkningsskâl ikke oversteg 0,2%. Kontrolkulturerne behandledes med samme koncentra-tion éthanol. Efter 4 dages (96 timers) inkubation med fors0gsforbindelserne h0stedes cellerne fra dyrknings-25 skâlene og celletal og levedygtighed blev bestemt. Gra-den af differentiering opnâet med de unders0gte vitamin D derivater blev udtrykt som procent celler, der udviser funchonale og enzymatiske mark0rer, der er karakteritis-ke for monocytter. De to anvendte mark0rer var a) cel-30 lernes evne til at phagocytisere d0d gær og b) cellernes evne til at frembringe superoxid (reducere nitrotetrazo-liumblàt), nàr de stimuleres med phorbolestere.

35 15

DK 157007 B

a) Phaqocytoseunders0gelse for differentierende virkninq:

De indh0stede celler opslæmmedes i RPML substrat inde-5 holdende 20% AB sérum og 20% f0talt kalveserum til op-nâelse af et præparat indeholdende 2 x 10® celler/ml.

Til 0,5 ml (10® celler) af ovennævnte cellesuspension sattes herefter 0,5 ml af en suspension (i phosphatpuf-ret saltvand) af varmeinaktiverede saccharomyces cere- p 10 visiae celler (1 x 10° celler), der var farvet med try-phanblât. Efter inkubering af denne blanding i 1 time ved 37 °C blev antallet af phagocytiske celler tait (be-stemt ved tryphanblâfarvet gær, der forekommer intracel-lulært) og udtrykt som en procent af de totalt tilste-15 deværende levende celler. Denne "% phagocytiske celler" angiver differentieringsprocenten induceret af fors0gs-forbindelserne. Resultaterne er angivet i tabel 2 neden-for.

20 25 30 35

DK 157007 B

Ω

G

•H J-i £ . ω nj Ό

P

•H “* > σ> ia Ό t-- en ω i p

£ ο O

iH 4-1 p x en r- oo d) 00 CO Γ~-- CO 0)

i—I

Ό -H

G -H

(0 —' H

X X Φ 01-- J*

Xi ο ω

I CO 00 <3· · P

P O +1 +1 +1 HO

0) H r- co co O 4-i

P X CO [ Γ"- G

G i—I U DJ

P JG s-

r—i PP

g ω

je ^ P

0) XI P «J

I—I —' fl)

H CO HS

0) I Ό W

0 O M CN O -H CO

H -H +1 -H £ 0 x t'- 04 O 0) +1 co h n· r- r- en

1 G P

xi -H fl) œ H ex1

P <—· MP

H fl) XI TQ. ·Η

P — H G

p -h en ûi en cn en h i O £ (fl \ O -¾1 LO co fl)

H P H H +1 +1 +1 13 G

co fl) Xl O X co G1 CO flJG

H X! £ £HCN<*^ £0) (fl fl) — en

Eh P P oo

p c ω p Q

O H fl)

p · -HO Τ3 C G

0) P PH G en H

, HO) (Π I (fl Q) £ h g po x p m

fl) o PH 0) 0) P

UH C X 00 00 CN X) XI H

P fl) Lf) CN 00 -4* >

— (fl U GP O

0) P C G Q) £

Ό P O ^ G O

fl) G KO G 00 X

PO) H > 0 û I

fl) Ο I d) H CO

-H G O H O G CN

PO H XJ -X H I

G je Xr-C0CN £ O

Q) 00 H CN CN Pfl) (fl P

P fl) Q) (fl · P Ό ai en p ω a) h >1 p -h g-η en > x

PH P Ό G O ÛJ

-h h ^ in m in H (fl £ Ό

Ό D X--- GHCnOI

— je ** h r-1 h je X W

(fl (0+1+1+) Q) P CN I CN

fljp — O O O H fl) CO CN

je 0 O H H H H > P CN I

(fl P fl) H O) I >1 h o en en >1 x

p -H G (fl X O

>i * ·* (0 P O ih U 0) * G fl) p Ό oc p -KH (aoGT3>i

01 P Q) oo H H û)G0>iX

(flû) P fl) Q >PPXH

Xen Q) (fl CN · · Hû) H Ό

ft H P H — X X G P > Ό I

fl) P û) ft P P H (fl fl) LD

p Ό (fl Ό O O O OPHlDCN

GG -H G— PP P H X CN

φ.h ghldii pg -S

οχ -HXCN00 GeflPdH

OP £ P - £ £ O fl) D H

PO Ό O S O O K Λ > * ftp < P H X X (fl X X * * 17

DK 157007B

Resultaterne i tabel 2 viser, at homoforbindelserne er signifikant stærkere virkende end la,25-(OH)2 D3. Ved aile koncentrationer bevirker homoforbindelserne en st0rre differentieringsgrad af leukæmicellerne end la,25-(OH)2 D3, den hidtil mest aktive kendte forbindel-se. F. eks. giver en koncentration pâ 10”® mol af homo-5 forbindelserne en differentiering pâ 70%, medens la,25-(OH)2 D3 i samme koncentration kun giver ca. 47% diffe-rentierede celler. For at opnâ 50% differentiering kræ-ves en koncentration pâ 1 x 10”^ M af homoforbindelserne, men ca. 1 x 10”® M af la,25-(OH)2 D3 dvs. en forskel 10 i aktivitet pâ ca. 10 gange.

b) NBT-reduktionsfors0g for differentiering:

Dette fors0g udnytter evnen hos monocytlignende leu-15 kæmiske celler til at reducere nitroblât tétrazolium (NBT) reagens til et blâsort bundfald (formazan), dersom de stimuleres med phorbolestere. Fors0get blev udfort soin beskrevet generelt af Yen et al (J. Cellular Physi- ol. 118, 277 (1984)). Cellerne blev h0stet soin nævnt 20 ovenfor og herefter opslæmmet i RPMÏ substrat; til 0,2 ml af denne suspension (indeholdende ca. 1,4 x 10® cel-ler/ml) sattes 0,2 ml nitroblât tétrazolium (NBT) reagens. (NBT reagenset blev fremstillet ved at blande en opl0sning indeholdende 50 mg nitroblât tétrazolium i 50 25 ml phosphatpufret saltvand med 10 μΐ af en acetone/vand (1:1) opl0sning indeholdende 0,5 mg/ml 48-phorbol-12-my-ristat-13-acetat). Efter henstand i vandbad i 30 minut-ter faites de differentierede celler (dvs. celler, der udviste formazanblâ aflejringer som indikation pâ NBT 30 reduktion) med et hæmocytometer og blev udtrykt som procent af totale tilstedeværende levende celler. Resultaterne af fors0get er angivet i tabel 3.

35

DK 157007 B

P

Φ

-P

U-i >

0) (U

ι—1 φ r' xi

β I

> ο σ> φ .π u oi x m co ο oi C en io r» oo p

0 O

•H P

-P

.X X>

3 XJ U

Ό — <U

φ Γ- > v< i γί in · x:

O -H -H -H H

^ h σ\ σ\ en Ο ρ

Eh X ιο r·* C Φ CQ Η «0 "Ό 5 Λ -Η

—- 4J

6 αι - 3 θ'

-Η XI +J S

η · — αι οι

Ou 00 Η H

ν αι ι ό ο Φ β ο μ1 ιη η -η ρ VJ ο Η -Η -Η -Η ε JJ -rj χ II) ΙΝ Ο 01 Û) ω ρ η Γ' Γ" en ρ Ρ Φ C Η VJ ·Η ·Η ρ ρ— C ^ •φ c Vi λ 01 01 Η 0) αι X» ΒΙ Ό XI Ο Ρ — Η (0 Ο β ·Η 0\ Di η ρ Ο Η ι ο αι P JS4 \ Ο *d> Γ^- 'd* Μ Η ·Η Η Η Ή -Η -Η Ό Ρ co ο) β φ οχ η <η φ η xi en ε η η <f ^ ε ρ φ ρ ·η «ο

Eh ni η ρ η 01 Η β 0) g Û

Η φ Ο Η W

> Λ! -Η Ο Ό Μ β Ό 01 Ρ Η β -Η 3 Ρ Φ I (0 -Η ε ορο χ: <d

Ιι U ΡΗ φ P P

φ β X Γ' H -d* XI Φ -H

Ό -H 01 if) ΓΊ 'd* 'd* P >

Ο β P O

* p β 3 ·η ε ρ φ O id β Ο Φ ω « ο οι η χ:

ρ η ι—ι t* ε Ω I

3 Φ I φ φ ΙΟ Ρ Ό Ο Η β β (Ν

Η β Η Λ β ·Η I

3 -η χ ιη cm Φ εο J* XI ΓΟ rH Ν (Ν Ρ θ' Ιί Ρ φ ρ Φ Ρ Ό Η Ο Ρ Ρ -Η >1 HP 3 Φ ί> χ: φ Ρ Ρ Ο Φ Ο Ω ^ ιη ιο m ηφ ε Ό XI ^ ‘ 3 Ρ οι

Ο β - Η Η Η -X β X0W

VO-H Φ -Η -Η -Η ΦΦ ΙΟΊ

ΐε — ΟΟΟ Η 01 VOCN

XI Φ Ο Η Η Η Η (ϋ 0)1 Κ Ρ Φ Ρ I >ι

-Η Ο Di · >ϊ X

-Η > Φ Φ X Ο * ··> ρ σ> ο ρ ρ Ό η-κββΡΌ ΦΦ ρ Ω*Η Φ Φ Φ Ό >ι η ε φ ηη φ β en >ι χ: Η Ρ φ CM > Ρ X! Η φ en φ 10 Λ.. ΗφΓΊΗΌ Οβ PH K XI Λ βρ ΌΙ -ρ ΡΦ Ο ρ ρ Η Φ Ρ ιη ρ η οι Ό «— ο Ο Ο Ρ Φ ιη <ν

β Ό -η β ι ρ ρ ρ Η en fM

φβ β·ρ ιη ι ι ρ 3 Φ ^ a οφ η χι η)θθ β οι ρ a η οχ: ε ρ * ε ε οΦβπ ρφ ό ο a ο ο ΜΟαίΦ * ω χι <<ιρ η χ: χ: φ ρ en * *

DK 157007 B

19

Resultaterne i tabel 3 viser igen, at de unders0gte ho-moforbindelser er mere aktive end la/25-(OH)2 D3 til at inducere en differentiering af humane myeloide leukæmi-celler til normale celler in vitro. For at opnâ en 60% differentiering af leukæmiske celler mâlt ved denne NBT reduktionsmetode kræves en koncentration pâ 2 x 10-^ M 5 af homoforbindelserne; for at opnâ samme grad af differentiering med la,25-(OH)2 D3 kræves en koncentration pâ 3,5 x 10~8 M, en 17 fold forskel i aktivitet.

Sâledes bekræfter begge ovennævnte fors0g den kraftige 10 aktivitet af de omhandlede homovitamin D forbindelser til at inducere differentiering af leukæmiske celler.

Herudover viser ovennævnte resultater, at med hensyn til denne differentieringsvirkning er homovitamin D forbin-delserne betydeligt mere virksomme end la,25-(OH)2 D3.

15

Da differentieringsvirkningen er udtrykt i humane leukæmiske celler (HL-60), er det klart, at de omhandlede homovitamin D forbindelser kan anvendes effektivt mod leukæmi hos mennesker. Pâ samme tid udviser disse for-20 bindelser ikke for0get calcemisk virkning, men er om-trent lige sâ aktive som la,25-(OH)2 D3. Homovitamin D forbindelserne er sâledes karakteriseret ved et h0jt forhold mellem antineoplatisk og calcemisk virkning. Pâ grund af denne hidtil ukendte og 0nskede biologiske 25 egenskab, vil sidekæde homoforbindelserne virke som glimrende terapeutiske midler til behandling af maligne sygdomme.

Til behandling af human leukæmi administreres de om-30 handlede homovitamin D forbindelser til patienter i doser, der er tilstrækkelige til at inducere differentiering af leukæmiske celler til makrophager. Passende doser er fra 0,2 pg til ca. 5 yg pr. dag, idet dosis na-turligvis skal justeres afhængigt af sygdommens svær-35 20

DK 157007 B

hedsgrad eller af patientens respons eller tilstand, hvilket er klart for fagmanden.

Til behandling kan de omhandlede forbindelser fremstil-les i dosisformer ved at forene dem med et ikke toxisk farmaceutisk acceptabelt bærerstof, som er velkendt in-5 den for fagomrâdet. Sâdanne bærerstoffer kan være enten faste eller flydende som f. eks. majsstivelse, lactose, saccharose, jordn0ddeolie, olivenolie, sesamolie og vand. Dersom et fast bærerstof anvendes kan dosisformer af de omhandlede forbindelser være tabletter, kapsler, 10 pulvere, drageer eller sugetabletter. Dersom et flydende bærerstof anvendes kan dosisform være bl0de gelatinekap-sler eller sirup- eller væskesuspensioner, emulsioner eller opl0sninger. Doseringsformerne kan ogsâ indeholde £ hjælpestoffer som konserveringsmidler, befugtningsmidler 15 eller emulgatorer og opl0sningsfremmere. De kan ogsâ indeholde andre terapeutisk virksomme forbindelser.

Den administrerede dosis til patienten afhænger natur-ligvis af det specielle tilfælde, der skal behandles, af 20 det 0nskede slutresultat i det specielle tilfælde, af patientens fysiske tilstand og af andre faktorer, der er velkendte for fagmanden.

Forbindelserne kan med fordel administreres ved injek-25 tion eller ved intraven0s infusion af passende stérile opl0sninger eller .i form af perorale doser gennem ford0-jelsessystemet.

30 35

Claims (10)

1. D-vitaminderivater kendetegnet ved, at de har den almene formel 5 'V^S'V' Πώ^0*5 10 6.^¾ hvori Ri, R2 og R3 er valgt blandt hydrogen, en acyl-gruppe med fra 1 til 4 carbonatomer og benzoyl, og R4 og 15 R5 hver især betegner hydrogenatomer eller sammen danner en carbon-carbonbinding.

2. Dérivât if0lge krav 1, kendetegnet ved, at RX, R2 og R 3 betegner hydrogen, og R4 og R5 betegner hy- 20 drogenatomer.

3. Dérivât if0lge krav 2, kendetegnet ved, at det er i krystallinsk form.

4. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder derivatet if0lge krav 2 og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof.

5. Dérivât if0lge krav 1, kendetegnet ved, at 30 Ri, R2 og R3 betegner hydrogen, og R4 og R5 sammen betegner en carbon-carbonbinding.

6. Dérivât if0lge krav 5, kendetegnet ved, at det er i krystallinsk form. 35 DK 157007 B

7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder derivatet if0lge krav 5 og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof.

8. Dérivât if0lge krav 5, kendetegnet ved, at Δ22 bindingen er i E-konfigurationen. 5

9. Anvendelse af D-vitamin derivater if0lge krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af neoplastiske sygdomme.

10. Anvendelse af D-vitamin derivater if0lge krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til induktion af differentiering i maligne celler. 15 20 25 30 35