DK156716B

DK156716B - Fremgangsmaade til fremstilling af 1-fluorerede vitamin d-forbindelser eller 1-fluor-5,6-trans vitamin d-forbindelser eller 1-fluor-3,5-cyclovitamin d-forbindelser

Info

Publication number: DK156716B
Application number: DK127580AA
Authority: DK
Inventors: Hector F Deluca; Heinrich K Schnoes; Jr Joseph L Napoli; Bruce L Onisko
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1978-07-26
Filing date: 1980-03-25
Publication date: 1989-09-25
Also published as: GB2026494A; DK127580A; DK127480A; US4188345A; NL7920012A; JPS55500428A; NL7920016A; IL57801A; IE791496L; JPS6312867B2; WO1980000338A1; DK156716C; JPS6312868B2; SE8001747L; CH650237A5; AU4920679A; FR2433514A1; IE48463B1; FR2433514B1; DK154211B

Description

DK 156716 B

Opfindelsen angâr en særlig fremgangsmâde til fremstilling af hidtil ukendte 1-fluorvitamin D forbindelser eller 1-fluor-5,6-transvitamin D forbindelser eller l-fluor-3,5-cyclovitamin D forbindelser.

5 Vitamin og D2 er velkendte midler til at kontrollere calcium- og phosphorhomeostase. Disse forbindelser sti-mulerer hos normale dyr eller mennesker tarmcalciumtrans-porten og knoglecalciummobiliseringen, og de er i stand til at forhindre rakitis. Videnskabelige undersogelser i lo-*0 bet af det sidste deceniiium har imidlertid vist, at vitamin D2 og D^ ma omdannes til deres hydroxylerede former, inden de udviser biologisk aktivitet. Nylige undersogelser har f. eks. vist, at 1,25-dihydroxyvitamin D^, det dihydro-xylerede omsætningsprodukt af vitamin D^, er den forbindelse , 15 der er ansvarlig for de tidligere nævnte biologiske virk-ninger. Pâ lignende mâde er 1,25-dihydroxyvitamin D2 den aktive form af vitamin D2.

Henvisninger til forskellige vitamin D derivater findes inden for patent- og anden litteratur. Se f. eks. USA pa-20 tent numrene: 3 565 924, der omhandler 25-hydroxychole-calciferol; 3 697 559, der omhandler· 1,25-dihydroxy- cholecalciferol; 3 741 996, der omhandler. la-hydroxy-cholecalciferol; 3 745 661, der omhandler - 5,6-trans- 25- hydroxycholecalceferol; 3 907 843, der omhandler la-25 hydroxyergocalciferol; 3 715 374, der omhandler 24,25- dihydroxycholecalciferol; 3 739 001, der omhandler 25, 26- dihydroxycholecalciferol ; 3 786 062, der omhandler..· 22-dehydro-25-hydroxycholecalciferol; 3 847 955, der omhandler 1,24,25-trihydroxycholecalciferol; 3 906 014, 30 der omhandler^ 3-deoxy-la-hydroxycholecalciferol; 4 069 321, der omhandler fremstillingen af forskellige si-dekædefluorerede vitamin derivater og sidekædefluorerede dihydrotachysterol^ analoge.

2

DK 156716 B

Det har nu vist sig, at 1-fluorerede vitamin D forbindel-ser ogsâ er i besiddelse af vitamin D-lignende virkning. Sâdanne fluoranaloge er derfor værdifulde forbindelser ved behandling af forskellige sygdomme som f.eks. osteomalacia, 5 osteodystrophi og hyperparathyroidisme.

Specielt angâr opfindelsen en fremgangsmâde til fremstil-ling af fluorvitamin D forbindelser med den almene formel I og 5,6-trans-fluorvitamin D forbindelser med den almene formel II

ςώ ç6

y J

I °S

I II

• hvor R betegner en steroid sidekæde med formlen O*6 ✓ν' ^ 3

DK 156716 B

hvor R1 er valgt blandt hydrogen, hydroxy, 0-lavere alkyl 3 4 5 eller 0-acyl, og hvor hver af R , R og R er valgt blandt hydrogen, hydroxy, 0-lavere alkyl, o-acyl og fluor, og g hvor R betegner hydrogen eller lavere alkyl.

5 Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmâde til fremstil-ling af 1-fluorvitamin D forbindelser eller l-fluor-5,6-trans-vitamin D forbindelser eller 1-fluor-3,5-cyclovita-min D forbindelser, hvilken fremgangsmâde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

10 Velegnede udgangsmaterialer til denne fluorering omfatter hydroxyvitamin D forbindelser med den almene formel III angivet nedenfor eller hydroxy-5,6-trans-vitamin D forbindelser med den almene formel IV eller hydroxy-3,5~cyclo-vitamin D forbindelser med den almene formel V ligeledes 15 angivet nedenfor.

R ΐ 1 çb çd ço 'Y y zoy\

Γ Y 1 ÛH

p. · OH OK R1

III IV V

DK 156716 B

4 hvor R betegner en steroid sidekæde med fonulen R3 R6 Rjf T r4 eller | |WR4 og hvor er valgt blandt hydrogen, hydroxy, 0-lavere 3 4 5 alkyl og 0-acyl, og hver af R , R og R er valgt blandt hydrogen, hydroxy, 0-lavere alkyl og 0-acyl, og hvor R^ 5 betegner hydrogen eller lavere alkyl., og hvor Z betegner 1avéré alkyl.

I den foreliggende beskrivelse med krav betegner udtryk-ket "lavere alkyl" en carbonhydridgruppe indeholdende fra 1-5 carbonatomer, der kan være lige eller forgrenet 10 (f.eks. methyl, ethyl, isopropyl), og udtrykket "acyl" betegner en alifatisk acylgruppe indeholdende 1-5 carbonatomer (f.eks. acetyl, propionyl) eller en aromatis.k eller substitueret aromatisk acylgruppe (f.eks. benzoyl eller nitrobenzoyl).

15 Fluorvitamin D forbindelserne med den almene formel I

fremstilles ud fra udgangsmaterialerne med den almene formel III, medens fluor-5,6-trans-vitamin D forbindelserne med formel II fremstilles ud fra forbindelserne med formel IV, og fluorering af cyclovitamin D udgangsr 20 materialet med formel V efterfulgt af omdannelser som beskrevet nedenfor forer til begge de fluorerede forbirf-delser I og II.

Udgangsmaterialerne for fluoreringen f.eks. forbindelserne med den almene formel III - V kan fremstilles ved vel-25 kendte metoder. Hydroxyvitamin D forbindelserne med den almene formel III kan sâledes tilvejebringes ved syntese

DK 156716B

5 eller som isolerede naturlige forbindelser, (se f. eks.

Schnoes og DeLuca, i Bioorganic Chemistry, E. E. Tamelen,

Vol. 2, kap. 12 p. 299 - 335, Academie Press, NY 1978).

5,6-trans-vitamin D forbindelseme med den almene formel 5 IV kan fremstilles ud fra tilsvarende 5,6-cis forbin- delser (almen formel III) ved den velkendte isomeriserings-reaktion, hvor man anvender iodkatalysator (Verloop et al.

Rec. Trav. Chim. Pays-Bas. 78, 1004 (1969).

3,5-cyclovitamin D forbindelseme med den almene formel 10 V kan fremstilles ved fremgangsmâdeme beskrevet af

Sheves og Mazur, J. Am. Chem. Soc. 97, 6249 (1975), og Paaren et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 2080 (1978).

Jones et al. (USA patentskrift nr. 4 069 321) har beskrevet fremstillingen af forskellige sidekædefluorerede vi-15 tamin derivater og sidekædefluorerede dihydrotachyste-rolanaloge. Fremgangsmâdeme beskrevet i disse patenter indebærer fluorering af et precursorsteroid og efterfol-gende omdannelse af fluorsteroidet til den onskede fluor-vitamin D forbindelse.

20 Det har nu imidl-ertid vist si g, at ring A- og eventuelt sidekadef luoferéde-v.itamin D. foaibindelser - eller analoge med de almene formler I og II meget let kan fremstilles ved direkte indforelse af fluor i de intakte hydroxy-vitamin D forbindelser og analoge deraf med formlerne III -25 V ved hjælp af et fluorerende middel, der er et dialkyl-aminosvovltrifluorid f. eks. diethylaminosvovltrifluorid.

Ved hjælp af disse reagenser kan en eller flere fluor-substituenter indfores i et vitamin D molekyle ved direkte ombytning af hydroxyfunktionen/funktionerne i udgangs-30 materialet.

Middleton (J. Org. Chem. 40, 574, (1975)) har beskrevet anvendelsen af diethylaminosvovltrifluorid til ombytning

DK 156716 B

6 af hydroxyfunktioneme med fluor i organiske forbindelser, men hans anvendelse er begrænset til enkle og stabile mo-lekyler , der ikke giver nogen basis for at bedomme reagensets effektivitet til direkte indforelse af fluor i vitamin D 5 forbindelser uden forandring af den f0lsomme trienchro- mophor . Det er derme kemiske reaktivitet af vitamin D chro-mophoren, der har ledt andre inden for dette felt til at anvende indirekte og besværlige veje, nâr man har forsogt at syntetisere fluorvitamin D forbindelser. P. eks. har 10 Jones et al. i USA patentskrift nr. 4 069 321 foreslâet fremgangsmâder til fremstilling af adskillige fluorvitamin D analoge, idet der anvendtes diethylaminosvovltri-fluorid kun til indforslen af fluor i precursorsteroider-ne, der herefter omdannedes til de fluorvitamin D ana-15 loge. Der er faktisk kun en tidligere anvendelse af di- ethylaminosvovltrifluorid til direkte syntese af 25-fluor-vitamin ud fra 25-hydroxyvitamin D^ (se Qnisko, Schnoes og DeLuca, Tetrahedron Letters (No. 13) 1107 (1977)).

Det har nu vist sig, at det tidligere nævnte diethylamino-20 svovltrifluoridreagens kan anvende s ikke alene til indfor-slen af fluor ved forskellige stillinger (f. eks. carbon 24, 25, 26) i vitamin D molekylets sidekæde eller analoge heraf, men ogsâ til indforslen af fluor ved carbon 1, og at det sâledes udgor en effektiv og direkte vej til de onskede 25 1-fluorprodukter sâvel som C-l- og sidekædefluorerede forbindelser. Disse C-l-fluorvitamin D og C-l-fluor-5,6-trans-vitamin D forbindelser er hidtil ukendte forbindelser.

Den direkte med held udforte fluorering ved carbon 1 i vitamin D molekylet er særlig bemærkelsesværdig og overrask-30 ende, fordi tilgængelige informationer har antydet, at vitaminchromophoren, der er stærkt tilbdjelig til at omlejres, ville undergâ uonskede og irréversible foran-dringer efter fluorindforsel ved carbon 1. Faktisk er den tilsyneladende analoge reaktion nemlig indforsel af fluor 35 ved carbon 3 ved at behandle en C-3-hydroxyvitamin D^ for-

DK 156716 B

7 bindelse eller analog heraf med diethylaminôsvovltrifluorid ikke mulig netop pâ grund af chromophoromlejring. Ombytning af hydroxyfunktionen ved derme stilling med diethylamino-svovltrifluorid forer til en uonsket forbindelse, i hvil-5 ken den chromophore er forandret. Den lette fremstilling af 1-fluorvitamin D forbindelser og vitamin D analoge er derfor et hidtil ukendt og uventet résultat. Det har og-sâ vist sig, at mere end et fluoratom. kan indfores sam-tidig simpelthen ved at underkaste fler-hydroxylerede (f. eks. 10 di-;trihydroxy) vitamin D udgangsmaterialer for fluorering.

Da fluoreringen medforer ombytning af den frie hydroxy-gruppe' /grupper, er det nodvendigt at éventuelle .andre'hy-droxyfunktioner i udgangsmaterialet, der ikke skal ombyttes med fluor, beskyttes pâ passende mâde ved acyïering soin f.

15 eks. acetylering og benzoylering. Specielt, dersom C-3- hydroxyfunktionen findes i udgangsmaterialet, er det nod-vendigt at beskytte ved acyïering, da som allerede nævnt behandling af C-3-hydroxyvitamin D forbindelser eller analoge med diethylaminôsvovltrifluorid forer til uonsket 20 chromophoromlejring. Beskyttelse af hydroxygrupperne kan let udfores ved velkendte metoder, og efter fluoreringen kan acylgruppeme naturligvis let fjernes, dersom det on-skes, ved hydrolyse under basiske betingelser.

Det vide anvendelsesomrâde for den direkte fluoreringsproces, 25 hvor fluorvitamin D forbindelser med den almene formel I og fluor-5,6-trans-vitamin D forbindelser med formel II kan fremstilles ud fra udgangsmaterialerne med formlerne III, IV og V illustreres nærmere ved folgende typiske om-dannelser.

30 (l) la,25-dihydroxyvitamin D^-3-0-acyl-^1,25-difluor- vitamin D^-3-O-acyl (2) Ια-hydroxyvitamin D^-3-0-acyl —> 1-fluorvitamin D^-3-0-acyl

DK 156716 B

8 (3) la,25-dihydroxy-6-methoxy-3f5-cyclovitamin ί-τΗ ni 1 , · --— - l,25-difluor-6-metlioxy-3,5-cyclovxtamxn (fluorering) -^- 1^25-difluorvitamin + 1,25 difluor-5,6- (solvolyse) trans-vitamin 5 Sont det vil fremgâ, er det foranstâende reaktionsskema kun illustrerende. Eksempleme er opfort for at vise, at fremgangsmâden tilve j ebringer en bekvem indforsel af fluor i ring A og eventuelt i steroidmolekylets sidekæde, og specielt, at vitamin D forbindelser og analoge med fluor-10 substituenter ved carbonatom 10g et vilkârligt eller ved flere af carbonatomerne 24, 25 eller 26 let kan fremstilles ud fra de tilsvarende hydroxylerede udgangsmaterialer.

Som angivet ovenfor i skemaet giver fluorering af udgangs-materialeme III eller IV de tilsvarende 1-fluorforbin-15 delser direkte, men afhængigt àf det anvendte udgangs-materiale og det onskede produkt, kan et forudgâende hydroxybeskyttelsestrin (acylering) og et efter-folgende trin for f jemelse af beskyttelsen være nodven-dig. Med cyclovitamin D udgangsmaterialet med formel V .

20 er âen totale procès og specielt fluoreringstrinnet det sam- me, bortset fra at efter fluorindforslen kan der tilf0j.es et solvolysetrin for at udvinde bâde cis- og trans-formerne af fluorvitaminforbindelserne. Solvolysetrinnet kan imid-lertid formelt set betragtes som et altemativt trin til 25 fjernelse af beskyttelse, ved hvilket den "beskyttede" · (dvs. for ojeblikket fraværende) C-3-substituent sâvel som bâde den cis og trans trienchromophore atter gendannes.

Et foretrukkent middel til fluorering er diethylamino-svovltrifluorid (Mi.ddleton, J. Org. Chem. 40, 574 (1975))· 30 Reaktionen udfores bekvemt i et halogen-carbonhydridop 10s- ningsmiddel som f.eks. methylenchlorid, carbontetrachlorid eller trichlorfluormethan ved lav temperatur f. eks.

DK 156716 B

9 -78 °C. For at ombytte hydroxygrupperne med fluor er korte reaktionstider f.eks. 15 - 45 minutter tilstrækkelige.

Skant reagense't ogsâ angriber ketogrupperne i molekylet, gar det dette betydeligt langsommere, og beskyttelsen af 5 eventuel tilstedeværende ketofunktioner er normalt ikke nadvendig under de betingelser, hvor ombytning af hydroxy-grupper anskes.

Som tidligere nævnt og sorti illustreret i reaktionsskemaer-ne mâ éventuelle hydroxygrupper i udgangsmaterialet, der 10 ikke skal erstattes med fluor ved denne procès, acyleres (f.eks. acetyleres eller benzoyleres). Specielt kræ-ver en hydroxyfunktion ved carbon 3 (sâledes som den al-mindeligvis er til stede i vitamin D forbindelser eller analoge) at blive beskyttet ved acylering, idet som nævnt 15 ovenfor, fluorering i nærværelse af en C-3-hydroxygruppe kan fare til uanskede forbindelser. Acylering af hydroxygrupper er naturligvis en velkendt fremgangsmâde, og den udfares normalt ved at behandle hydroxyforbindelsen med et acylerènde middel (f.eks. eddikesyreanhydrid, benzoyl-20 chlorid) i et passende-Oplasningsmiddel (f.eks. pyridin). Primære og sekundære hydroxygrupper i vitamin D forbin-delserne eller deres analége kan let acyleres under an-vendelse af disse reagenser og oplasningsmidler ved stue-temperatur (eller ved let forhajede temperaturer som f.

25 eks. 50 °C) i labet af 2 - 6 timer. Acylering af tertiære hydroxygrupper kræver naturligvis kraftigere reaktionsbetin-gelser f.eks. forhajede temperaturer (f.eks. 75 - 100 °C) og passende reaktionstider f.eks. 4-24 timer. Det fore-trækkes at udfare reaktionen under en nitrogenatmosfære 30 for at undgâ dekomponering af materialet. Selektiv acylering af særlige kemisk forskellige hydroxylgrupper kan derfor let udfares. Hvor selektiv acylering af kemisk ens hydroxygrupper kræves, kan chromatografisk adskillelse af forbindelserne være nadvendig. Sâledes kan la-hydroxyvita-35 min Dg-3-acetat fremstilles ved at udfare en acetylering »

DK 156716 B

10 ved stuetemperatur og afbryde reaktionen, inden fuldstæn-dig acetylering er sket. Under disse betingelser fâs en blanding af 4 forbindelser: Ια-hydroxyvitamin D^, la-hy-droxyvitamin D^-l-acetat, Ια-hydroxyvitamin D^-B-acetat 5 og la-hydroxyvitamin D^-l,3-diacetat, ud fra hvilken den onskede forbindelse f.eks. Ια-hydroxyvitamin D^-B-acetat (se reaktion 2) fâs ved chromatografi. André delvis acy-lerede forbindelser, der kræves soin udgangsmaterialer for den efterfolgende fluorering (f.eks. eom reaktionen 1) 10 kan fâs pâ analog mâde. Alternativt kan delvis acy~ leréde forbindelser fâs ved forst at acylere aile hydroxy-grupperne og herefter fjerne en eller flere af acylfunk-tionerne ved hydrolyse. Sâledes kan 1,25-dihydroxyvitamin ,25-di-0-acyl forbindelsen fâs ved delvis hydrolyse 15 under basiske betingelser af 1,25-dihydroxyvitamin D^_ 1,3,25-tri-0-acylderivatet. Eksemplerne er givet for at vise, at mange forskellige metoder er kendte og mulige at anvende for at fremstille O-beskyttede vita-min D forbindelser, sâledes som det kræves for den efter-20 folgende fluorering.

Mâr forste fluoret er blevet indfort i molekylet kan aile éventuelle tilstedeværende acylgrupper fjernes ved basisk hydrolyse f.eks. ved behandling af den acylerede fluorana-loge med 5% KOH i MeOH ved en temperatur pâ 25-80 °Ci 25 1-4 timer. De herved fremkomne deacylerede fluorerede forbindelser kan herefter bekvemt yderligere renses ved chromatografi. Anvendelsen af cyclovitamin D forbindelser med formel V giver naturligvis udgangsmaterialer med ind-bygget beskyttelse af C-3-stillingen og den trienchromo-30 phore, og med hensyn til fluoreringen kan den 3,5-cyclo- propano-"beskyttende gruppe" betragtes ved oparbejdningen som værende ækvivalent med 3-0-acylbeskyttelsen, nâr det drejer sig om cis og transvitamin udgangsmaterialerne III og IV, naturligvis bortset fra at eventuel "fjernelse af ' 35 beskyttelsen" fra disse cyclopropanmellemprodukter kræver t

DK 156716B

11 syrekatalyseret solvolyse. Nâr som helst et cyclovitamin-udgangsmateruale baerer hydroxyfunktioner, der ikke skal fluoreres (f.eks. i sidekæden), kan disse hydroxyfunktio-• ner beskyttes ved acylering, idet man anvender fremgangs-5 mâder, der er fuldstændig analoge med de ovenfor beskrevne.

Fluorering af cyclovitamin D forbindelserne med formel V udgor en generel og bekvem metode til fremstilling af bâ-de fluorvitamin D forbindelser og fluor-5,6-transvitamin D forbindelser med formlerne I og II, hvori er valgt 10 blandt hydrogen, hydroxy, 0-acryl eller 0-lavere-alkyl og hvori R, R^, R^, R~* og R^ betegner de tidligere definerede substituenter.

De nodvendige cyclovitamin D udgangsmaterialer kan bekvemt fremstilles ud fra C-3-hydroxyvitamin D forbindelser ved 15 fremgangsmâderne omtalt af Sheves og Mazur (J. Am.Chem.

Soc. 97, 6249 (1975)) og Paaren et al. (Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 75, 2080 (1978)). Ved at anvende fremgangsmâden ifolge opfindelsen fluoreres disse forbindelser let ved carbon 1 og eventuelt ved en vilkârlig af sidekaedestillingerne.

20 Efter indforsel af fluor kan fluorcyclovitaminderivaterne underkastes syrekatalyseret solvolyse sâledes som beskre-vet af Sheves og Mazur og Paaren et al. i de ovenfor an-forte litteraturhenvisninger for at give bâde fluorvitamin D forbindelser og 5,6-trans-fluorvitamin forbindelser.

25 Disse C-l-fluorerede cis og trans reaktionsforbindelser kan let adskilles ved chromatografi pâ dette stadium (sâledes som beskrevet af Paaren et al. i den ovenfor nævnte litteraturhenvisning), og de kan hver for sig herefter underkastes hydrolyse (hvis acylbeskyttelsen skal fjernes) 30 under anvendelse af standardbetingelserne beskrevet tid ligere f.eks. 0,1 Μ KOH i methanol ved 60 °C i 1 - 4 ti-mer. Det skal bemærkes, at fjernelsen af acylgrupperne principielt (under anvendelse af de ovenfor nævnte betin-

DK 156716 B

12 gelser) kan udfores pâ et hvilket soin helst stadium efter indforslen af fluor. Sâledes kan acylgrupperne fjernes ogsâ inden solvolysen eller inden adskillelsen af cis og trans solvolyseprodukteme. Valget mellem disse mulighe-5 der afhænger af praktiske hensyn og/eller det onskede pro-dukt. Sædvanligvis foretrækkes deacyleringen som det sid-ste trin.

Afhængig af de nojagtige solvolysebetingelser fâs 5,6-cis og -transforbindelser med forskellige C-3-substituen-10 ter. Dersom solvolysen udf0res i et medium, der bestâr af vandig dioxan og en katalytisk mængde af p-toluen-sulfonsyre fâr man fluorerede 5,6-cis og -transforbindelser, der indeholder en C-3-hydroxysubstituent. Solvolyse af fluorcyclovitamin D mellemprodukter i sure alkoholiske 15 oplosningsmidler (f. eks.methanol, éthanol, isopropanol) forer til 3-0-.alkyl-5,6-cis og -transforbindelser, hvor alkylgruppen svarer til alkyldelen af det anvendte alkoholiske oplosningsmiddel. Solvolyse af fluorcyclovitamin D forbindelser i varm eddikesyre (f. eks. 50 - 60° C) 20 giver 5,6-cis og -transfluorvitamin D forbindelser inde-holdende en C-3-acetoxysubstituent, og dersom solvolysen af fluorcyclovitaminerne udfores i dioxan/myresyreop-losningsmidler, fâr man de tilsvarende 3-0-formyl-5,6-cis og -transforbindelser. Dersom det onskes, kan de C-25 3-0-acylerede forbindelser let omdannes til de tilsvarende C-3-hydroxyforbindelser ved mild basisk hydrolyse.

Fremstillingen af bàde 5,6-cis og 5,6-trans-l-fluorvita-min D forbindelseme (der let kan adskilles ved chroma-tografi) ud -fra 3r5-cyclovitamin D udgangsmaterialerne 30 er etfordelagtigt træk ved denne fluorering, og C-l-flu-orerede-3,5-cyclovitamin D derivaterne er hidtil ukendte og særdeles værdifulde mellemprodukter.

DK 156716B

13 EKSEMPEL 1 Ια-hydroxyvitamin D^-3-acetat : Ια-hydroxyvitamin (25 mg, 0,063 mmol) og eddikesyre-anhydrid (50 y-ul) i pyridin-benzen (2 ml, 1:1) opvarmes 5 under argon ved 50° C i 4 timer. Reaktionsblandingen af-k0les, vand og ether tilsættes, og faserne adskilles.

Etherlaget vaskes med \aad, 1 N HCl (2 gange), fortyndet NaHCO-j, maettet NaCl og torres (NagSO^). Oplosnings-midlet afdampes, og remanensen chromatograferes pâ en 10 silicagelplade (20 x 20 cm, 0,75 cm tyk), der fremkal- des med ethylacetat/"Skellysolve" B (1:1). Fire bând for R^ 0,20, 0,38, 0,49 og 0,64 er synlige. Bândet ved Rf 0,49 stemmer overens med forbindelsen la-hydroxyvitamin D^-3-acetat, 6,0 mg (22%).

15 Bândene ved R^ 0,64, 0,38 og 0,20 stemmer overens med henholdsv Ια-hydroxyvitamin D^-l,3-diacetat, Ια-hydroxyvitamin D^- 1-acetat og udgangsmaterialet (7,3 mg, 29%). Det uonskede 1-acetat og diacetatet slâs sammen (6,8 mg, 23 - 25%) hydrolyseres (1 ml 0,1 M K0H/Me0H; 1 ml ether, 1,25 timer ved 20 stuetemperatur) og slâs herefter sammen med udgangsmate rialet for at give 14 mg Ια-hydroxyvitamin D^. Denne procès gentages yderligere 2 gange, hvorved man ialt fâr 12 mg (43%) la-hydroxyvitamin D^-3-acetat : UV (95% Et0H) \ max 265,Xmin 228; MR (270 MHz, CDC13) 25 cf 0,54 (s, 18-CH3), 0,87 (d, J = 6,6 Hz, 26,27-(CH3)2), 0,92 (d, J = 6,1 Hz, 21-CH3), 2,03 (s, 3 AcO-), 4,41 m, Ιβ-H), 5,02, 5,34 (19-H* er), 5,34 (3a-H), 6,02, 6,34 (AB kvartet, J = 11,4 Hz, 6 og 7 H'er).

DK 156716B

14 EKSEMPEL 2 1-fluorvitamin D^:

Til 2 mg la-hydroxyvitamin D^-3P-acetat i CH2C12 ml) ved -78° C sættes diethylaminosvovltrifluorid'(12^ul) 5 under kraftig omr0ring. Afkolingsbadet fjernes, og 5 mi-nutter senere bratk0les reaktionen med 5% K2C03, Der til-sættes ether, og faserne adskilles. Den organiske fase vaskes med vand og saltoplosning, og der koncentreres til 0,5 ml. Til den organiske fase sættes 0,1 M KOH/MeOH 10 (.1 ml). Efter 1,5 timer ved stuetemperatur fjernes oplos- ningsmidlet, ether og vand tilsættes, og man adskiller faserne. Etherfasen vaskes med vand og saltopl0sning og filtreres germem Na^SO^. Den opnâede remanens efter afdampning af etheren chromatograferes over en 15 findelt silicagelsojle (5 ^u-partikler, 0,7 x 25 cm), der elueres med 0,5% isopropanol/hexan. Den onskede for-bindelse elueres i 78 ml (0,85 mg): uv λ 265.X · 226 nm,X /λ · 2,1: NMR (benzen-dg) $ 0,65 (s, C-18 methyl), 0,98 (d, J = 6,1 Hz, C-26, 20· 27 methyler), 1,01 (d, J - 6,5 Hz, C-21 methyl), 3,52 (m, 24 Hz, 3«-proton), 4,71 (dublet af multipletter, J = 50 Hz, 20 Hz), 5,23, 5,55 (to s, 19-protoner), 6,38, 6,52 (ABq, J = 11 Hz, 6- og 7-protoner); masse-spektrum m/e (relativ intensifet) 402, 3320 (M+, 0,10, 25 beregnet til C^H^FO, 402,3298), 382 (M+ -HP, 0,40), 364 (M+ -HF-H20, 0,28), 349 (M+ -HF-H20, 0,28), 349 (M+ -HF-BjO-CH^, 0,04), 289 (M+ -sidekæde, 0,05), 269 (M+ -sidekæde-HF, 0,08), 251 (M+ -sidekæde-HF-H20, 0,10), 135 (1,00).

30 EKSEMPEL 5 la. 25-dihydroxvvitamin D^-5-aoetat : la,25-dihydroxyvitamin D^ (25 mg) og eddikesyreanhydrid

DK 156716 B

15 (50 yul) i pyridin-benzen (12 ml, 1:1) opvarmes under argon i 4 timer ved 50° C. Den sædvanlige oparbejdelse giver en blanding af delvis acetylerede' forbindelser (her-under 1-acetatet, 3-acetatet og 1,3-diacetatet) fra 5 hvilke det onskede 3-acetat kan adskilles ved præparativ lagchromatografi pâ silicagel, der fremkaldes med 40% ethyl-acetat i "Skellysolve" B. Recirkulering af det uom-dannede udgangsmateriale og hydrolyse af det uonskede 1,3-diacetat og 1-acetat forbedrer totaludbyttet.

10 EKSEMPEL 4 1,25-difluorvitamln D^: la,25-dihydroxyvitamin D^-3-acetat (3 mg) i hehand- les under argon ved -78° C med diethylaminosvovltrifluo-rid (20 ^ul). Man lader oplosningen opvarme tll stuetem- 15 peratur, og der afkoles med 5% I^CO^. Oparbejdelse af re-aktionsblandingen foregâr sâledes som beskrevet i eksem-pel 2. Chromatografi af det udvundne materiale pâ en sili-cagelplade, der fremkaldes med 25% ethylacetat i "Skellysolve" B, giver rent 1,25-difluorvitamin D^-3-^acetat.

20 Hydrolyse (1 ml 0,1 M KOH/MeOH, 1 ml ether, stuetemperatur, 2 timer) og chromatografi igen over silicagel (ethylacetat/ "Skellysolve" B) giver 1,25-difluorvitamin Dy UV:λ. max 265 nmî NMR £ 0 f 5 3 (3H.s.18~CH3) 0,93 (3H.d.J=6,0 HZ.21-CH3), 1,34 (6H.d.J=22Hz.26- og 27-CH3), 3.98 (lH.m.

25 3-H), 5,02 (1H.d-m.J=52Hz.1-H), 5,12 (lH.m(skarp), 19(Z)- H), 5.41 (1H(skarp).19(E)-H), 6,03 (iH.d.J=ll,0Hz.7-H), 6,44 (lH.d.J=ll,0Hz.6-H)? massespektrum, m/e.420 (M .20), 400 (70), 382 (35), 135 (100).

DK 156716 B

16 EKSEMPEL 5 1.25- dih.ydroxyvitamin D^-25-acetat :

En opl0sning af 10 mg 1,25-dihydroxyvitamin D·^ opvarmes ved 90° C i 16 timer under argon med 0,5 ml eddikesyre-5 anhydrid 1 2 ml pyridln. Den sædvanlige oparbejdning gi-ver en blanding, ud fra hvilken 1,25-dihydroxyvitamin D^-l,3,25-triacetatet (9,5 mg) fraskilles ved hjælp af chromâtografi pâ et præparativt lag af silicagel, der fremkaldes med 25% ethylacetat/"Skellysolve" B, eller ved hoj-10 tryksvæskechromatografi pâ en silicagelsojle, der elueres med en blanding af 0,5% 2-propanol i hexan. Selektiv hydrolyse (0,1 M K0H/Me0H, ether, 1,5 timer, 25° C) af 1- og 3 acetatgrupperne giver 7 mg 1,25-dihydroxyvitamin D^-25-acetat, der renses ved chromatografi pâ silicagel-"TL5 tyndtlagsplader, idet man anvender 50% ethylacetat i "Skellysolve" B som oplosningsmiddel.

EKSEMPEL 6 1.25- dihydroxyvitamin D^-3 , 25-diacetat: 1.25- dihydroxyvitamin D^-25-acetat (7 mg) acetyleres un-20 der anvendelse af de i eksempel 1 beskrevne hetingelser.

Fra blandingen af forbindelser isoleres 1,25-dihydroxyvitamin Dy 3,25-diacetat et (4 mg) ved silicageltyndtlags-chromatografi, idet man anvender ethylacetat/"Skellysolve" B (1:1) som opl0sningsmiddelsystem.

25 EKSEMPEL 7 1.25- difluor-6-methoxy-3,5-cyclovitamin D^:

En oplosning af 1 mg 1,25-dihydroxy-6-methoxy-3,5-cyclovitamin (fremstillet ved fremgangsmâden beskrevet af

DK 156716 B

17

Paaren et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 2080 (1978)) i Ci^C^ ved -78 °C under argon behandles med diethylamino svovltrifluorid (2 mg). Efter 10 minutters forlob lader • man reaktionsblandingens temperatur stige til stuetempe-5 ratur, og der bratkoles med 5% K^CO-^. Efter .den sædvanli-ge oparbejdning (se eksempel 2) isoleres 1,25-difluor-6-methoxy-3,5-cyclovitamin (250^ug) i ren form ved hjælp af hojtryksvæskechromatografi, idet man anvender en sili-cagelsojle, der elueres med 10% tetrahydrofuran/hexan. Al-10 ternativt kan forbindelsen renses ved tyndtlagschromato-grafi pâ silicagel, idet man anvender 20% ethylacetat i "Skellysolve" B som fremkaldningsoplosningsmiddel.

NMR, 0,53 (3H.s.18-CH3), 0,98 (3H.d.J=6,0Hz.21-CH3), 1,34 (6H.d.J=22Hz.26-og-27-CH3), 3,25 (3H.s.6-OCH3), 4,18 (1H.

15 d.J=9,6Hz.6-H), 4,97 (lH.d.J=9,6Hz,7-H), 5,18 (lH.dd.J=58

Hz.l-H), 5,45 (lH.d.J=4,0Hz.19(Z)-H), og 5,51 (lH.d.J=4,0 Hz.19(E)-H); massespektrum: m/e 431 (M, 40), 402 (50), 27® (50), 245 (40), 135 (100).

Biologisk virkning af fluorvitamin D-forbindelseme 28 De omhandlede fluorvitamin D-forbindelser udviser signio fikant vitamin D-lignende biologisk virkning, nâr de af-proves over for vitamin D manglende dyr. Den vitamin D-lignende virkning, som de omhandlede fluorvitamin D-for-bindelser udviser, omfatter stimulering af tarmcalcium-25 transporten, stimulering af calciummobiliseringen fra knogler og kalcifikation af knogler. For at demonstrere disse virkninger er et udmærket forsogsdyr en fravænnet hanrotte holdt pâ en vitamin D-manglende lav calciumdiæt eller en vitamin D-manglende, lav-phosphordiæt sâledes 30 som beskrevet af Suda et al. J. Nutr. 100. 1049 (1970).

For dyr, der er holdt pâ en lav calciumdiæt, kan tarmcal-ciumabsorptionen efterpreves ved hjælp af den udkrænge-de tarmteknik beskrevet af Martin og DeLuca (Am. J.

Physiol. 216, 1351 (1969)) og knoglecalciummobiliseringen 35 kan bestemmes ved forsgelse af serumcalciumet, sâledes

DK 156716 B

18 som det er beskrevet af Blunt et al. Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 61, 1503 (1968); graden af endochondral kalcifika-tion kan efterproves ved ,,liniefors0g,'-metoden, der er beskrevet i U.S. Pharmacopeia (15'. reviderede udgave, 5 p. 889, Mack Publ. Easton, PA (1955)),idet man anvender dyr·, der er holdt pâ en layphosphordiest. Under anvendelse af disse metoder kan den biologiske virkning af de omhand-lede 1-fluorvitamin D eller 1-fluor-5,6-trans-vitamin D-forbindelser let eftervises. Sâledes bevirker 1-fluor-10 vitamin administreret intraperitonealt til rotter, der er holdt pâ en vitamin D manglende lav-phosphordiæt en signifikant kalcifikation af knogler, sâledes som det fremgâr af tabel 1.

TABEL 1

Antirakitis virkning af 1-fluorvitamin a

Daglig dosis Sérum phosphor Linie-forsogs- (ng)ü (mg/100 ml) karakter 1,2-propandiol 3,1 - 0,3 0 vitamin (20) 4,5-0,3 3,6-0,7 1-fluorvitamin D3 (270) 4,0 - 0,2 3,2 ± 0,4 aData som middeltal - SEM af 3 - 5 rotter •u üFors0gsforbindelsen indgivet intraperitonealt i 1,2-propandiol oplo sningsmiddel i 7 dage.

Ligeledes frembringer administrering af 1-fluorvitamin til vitamin D manglende dyr, der er holdt pâ en lav calciumdiæt, signifikant forogelse af serumcalciumni- veauerne, og den stimulerer effektivt tarmcalciumtranspor- ten, sâledes som det er vist ved typiske dosisresponsfor- sog angivet i tabel 2.

DK 156716 B

19 TABEL 2 Θ.

Dosisresponsdata for 1-fluorvitamin

Khoglecalciummobilisering

Serumcalcium Tarmcalcium-

Dosis (ng)b (mg/100 ml) transport

Ethanol (kontrol) 4,6 - 0,1 1,7-0,2

Vitamin (24) 5,2 - 0,2 3,1 - 0,3 1-fluorvitamin (280) 5,1 - 0,02 2,0 ± 0,2 " (700) 5,5 - 0,2 2,7 ± 0,2 » (1260) 5,8 ± o,l 3,8 ± 0,4 n (2450) 6,2 - 0,3 2,8 ± 0,2 aData som middeltal - SEM af 5 - 6 rotter0

*K

DPorbindelser administreret ved intrajugular injektion i 50 yul ethanoloplosningsmiddel.

Claims

1. Fremgangsmâde til fremstilling af 1-fluorvitamin D-for-bindelser eller 1-fluor-5,6-trans-vitamin D-forbindelser eller l-fluor-3,5-cyclovitamin D-forbindelser, kende- t e g n e t ved, at de tilsvarende 1-hydroxylerede vita-5 min D-forbindelser eller 1-hydroxylerede 5,6-trans-vitamin D-forbindelser eller l-hydroxylerede-3,5-cyclovitamin D-forbindelser, everituelt efter beskyttelse -af en eller flere andre hydroxylgrupper heri mod fluorering ved acylering, behand-les med et dialkylaminosvovltrif luorid, hvorved hydroxylgrup-10 pen, der findes i de behandlede forbindelser, erstattes med fluor, og at den tilsvarende 1-fluorerede forbindelse udvin-des, og at forbindelsen, dersom den er en l-fluor-3,5-cyclovitamin D-forbindelse eventuelt underkastes syrekatalyseret solvolyse, hvorved der opnâs en blanding af 1-fluorvitamin-15 d- og 1-fluor-5,6-trans-vitamin p-forbindelser, og at disse udvindes hver for sig, og at eventuelt beskyttende acylgrup-per, efter at fluoreringen er udfort, om onsket fjernes ved hydrolyse under basiske betingelser.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kende t.egnet ved, 20 at man i udgangs- 1-hydroxyvitamin D-forbindelserne eller -l-hydroxy-5,6-trans-vitamin D-forbindelserne kun acylerer en eventuel tilstedeværende C-3-hydroxyfunktion inden behand-lingen med det fluorerende middel.

3. Fremgangsmâde ifolge krav 1-2, kendetegnet 25 ved, at det fluorerende middel er diethylaminosvovltrifluorid. 1 2 Fremgangsmâde ifolge et vilkârligt af de foregâende krav, kendetegnet ved, at den fremstillede for 2 bindelse har en af formlerne: DK 156716B f. Φ Φ |j eller ΛΛ Rr '«·· > R hvori R har formlen l\rrH1 . <V^'r6 og hvori R^· betegner hydrogen, hydroxy, O-acyl eller O-lavere alkyl, og hvor z Λ c R , R og Rv er valgt blandt hydrogen, hydroxy, O-acyl, 0-5 lavere alkyl og fluor, og hvor R^ betegner hydrogen eller lavere alkyl.

5, Fremgangsmâde ifolge krav 4, kendetegnet ved, at * l R^ og R betegner hydrogen, hydroxy eller fluor. Fremgangsmâde ifolge krav 5, kendetegnet ved, 10 at R^ betegner methyl, og at forbindelserne har ergosterolside-kædens stereokemiske konfiguration.