DK153157B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 7-alfa-aminoacyl-3-halogen-cephalosporinderivater eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

DK 153157 B

Den foreliggende opfindelse- angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 7-a-aminoacyl-3-halogen-cephalo-sporiner med den i kravets indledning angivne formel I og ikke-toxiske farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilke forbindelser kan anvendes som værdifulde, oralt effektive antibiotika. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Der kendes adskillige 7-a-aminoacyl-cephalosporinantiobiotika med forskellige substituenter i 3-stilling i molekylet. For eksempel kan nævnes det velkendte antibiotikum cephalexin, 7-(D-a-phenyl-glycylamido)-3-methyl-3-cephem-4-car.boxylsyre> der er en desace-toxvcephalosporansyre med en methylgruppe i 3-stillingen, anti-biotiket cephaloglycin, 7-(D-a-phenylglycylamido)-3-acetoxymethvl-

2 DK 153157 B

3- cephem-4-carbo:xylsyre, der er en cephalosporansyre med en acet-oxymethylgruppe i 3-stillingen, οσ endelig a-aminoacylcephalospo-riner, hvori 3-stillingen er substitueret med en thiadiazol-thio-methyl· eller tetrazolthiomethyl-del, og de er alle værdifulde terapeutiske midler.

ligeledes er der beskrevet et antal cephalosporinforbindelser, hvori molekylet er substitueret i 3-stillingen med en 3-halogen-methylgruppe, f.eks. 3-brom-methyl-3-cephem-4-oarboxylsyreestere.

De beskrevne 3-halogenmethylcephalosporinestere er nyttige mellemprodukter til fremstilling af cephalosporinantibiotika.

Halogencephalosporinforbindelseme, der tilvejebringes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er strukturelt enestående forbindelser inden for cephalosporinerne, idet halogenatomet er knyttet direkte til carbonatomet i 3-stillingen i dihydrothiazinringen.

I modsætning hertil har de kendte halogenderivater af eephalo-sporiner, såsom de, der er beskrevet ovenfor, et halogenatom på en methylengruppe knyttet til carbonatomet i 3-stillingen i dihydrothiazinringen. De omhandlede forbindelser har en kombination af karakteristika, der omfatter en 7-a-aminoacyldel knyttet til en cephalosporinkeme, der er substitueret i 3-stillingen med et chlor-eller bromatom. 1 den i kravet angivne almene formel I refererer hydroxyphenyl til mono- og dihydroxyphenylgrupper, såsom 4-hydroxyphenyl, 3-hydroxyphe-nyl, 2-hydroxyphenyl, 3,4-dihydroxyphenyl og 2,4-dihydroxyphenyl. Ha-logenphenyl refererer til mono- og di-halogen-substituerede phenyl-grupper, hvori halogen refererer til fluor, chlor og brom, såsom 4- fluorphenyl, 4-chlorphenyl, 3,4-dichlorphenyl, 3-chlorphenyl, 2-chlorphenyl, 3-bromphenyl og 4-bromphenyl. Methylphenyl refererer til mono- og dimethylerede phenylgrupper, såsom isomere 2-, 3- og 4-methylphenylgrupper og dimethylphenylgrupper, såsom 3,4-dimethylphenyl og 2,4-dimethylphenyl. Betegnelsen methoxy-phenyl refererer til mono- og di-methoxylerede phenylgrupper, såsom 4-methoxyphenyl, 3-methoxyphenyl, 2-metho'xyphenyl, 3}4-dimethoxyphenyl og 2,6-dimethoxyphenyl.

3 DK 153157 B

Estergruppeme repræsenteret af R i ovennævnte formel er alle kendte esterdele, der sædvanligvis anvendes i cephalosporiner for at beskytte C^-carboxylsyregruppen i cephalosporinmolekylet, medens andre reaktioner, der omfatter andre reaktive steder i molekylet, udføres. Fremstillingen af estere med formel I (R1 = andet end bydrogen) udføres ved hjælp af følgende metode, ved hvilken der anvendes samme estergrupper til at beskytte carb-oxylsyregruppen som i andre cephalosporinforbindelser.

Betegnelsen pharmaceutisk acceptable, ikke-toxiske salte refererer både til salte af C^-carboxylsyrefunktionen og syreadditionssalte af a-amino-gruppen af 7-glycylamido-sidekæden. Pharmaceutisk acceptable salte, der omfatter C^-carboxylsyrefunktionen, omfatter salte dannet med uorganiske baser, såsom natrium-, kalium og calciumsalte, der kan fremstilles med natriumbicarbonat, kaliumcarbonat, calciumhydroxid eller natriumhydroxid. Pharmaceutisk acceptable aminsalte kan også fremstilles, f.eks. med organiske aminer, såsom dieyclohexylamin, benzylamin, 2-amino-ethanol, diethanolamin eller diisopropylamin. Syreadditionssalte af α-aminogruppen omfatter salte dannet med mineralsyrer, såsom hydrogenchloridsyre, hydrogenbromidsyre og sulfater og salte dannet med organiske sulfonsyrer, såsom p-toluensulfonat.

Det ses nemt, at når R er hydrogen, kan den amfotere form af forbindelsen eksistere, idet denne form fremkommer via intra-molekylær saltdannelse.

På grund af nærværelsen af det asymmetriske carbonatom i a-amino-acylgruppen omfatter de ovennævnte 3-halogen-cephalosporiner B-, I- og Dl-formeme. B-formen er den foretrukne isomere form.

Eksempler på a-aminoacyl-3-halogen-cephalosporiner repræsenteret ved den i kravet angivne formel er følgende: 7-(B-phenylglycylamido)-3~chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, 7- (B-phenylglycylamido) -3-brom-3-cephem-4-carboxylsyre, 7~(B-3~hydroxyphenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, 7-[B-2-(2-thienyl)glycylamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, 7~[B-2-(2-furyl)glycylamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, 7- (D-4-chlorphenylgly c.ylamido) -3-brom-3-cephem-4-carboxylsyre,

4 DK 153157 B

7- (D- 3-me thylphenylglycylanildo) - 3-oIilor-3- c epiiem-4-carftoxylsyre, 7-(D-2,6-dime tiioxyplienylgly cylamido )-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre og 7-[D-2-(3-thienyl)glycylamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre som amfotere ioner og farmaceutisk acceptable salte deraf.

Forbindelser med den i kravet angivne formel, hvor R1 er hydrogen, eller farmaceutisk acceptable ikke-toxiske salte deraf, er værdifulde antibiotika, der er anvendelige til at bekæmpe infektioner i varmblodede pattedyr, nærmere bestemt infektioner, der er forårsaget af gram-positive og gram-negative mikroorganismer. De er også effektive, når de indgives parenteralt, f.eks. subcutant eller intra-musculært, samt når de indgives oralt.

7-a-aminoacyl-3-halogen-cephalosporiner har et bredt spektrum af antibakteriel virkning som illustreret af in vitro spektret for 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, der ses af følgende tabel:

Tabel I nedenfor angiver den minimale hæmningskoncentration (MIC) i μg pr. ml, der er opnået med denne forbindelse ved standard-agar-fortyndingsforsøg.

Tabel_I

7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre in vitro spektrum.

* MIC

Organisme (ug/ml)

Staphylococcus aureus 3055 1

Staphylococcus aureus 3074 1

Streptococcus faecalis X66 16

Proteus morganii PR15 >128

Salmonella typhisa SA12 <0,5

Klebsiella pneumoniae K114 0,2

Enterobacter aerogenes EB17 8

Serratia marcescens SE3 >128

Escherichia coli EC14 2

Citrobacter freundii CE17 >128

Pseudomonas aeruginosa X239 >128

5 DK 153157B

Tatel_I (forts.)

* MIC

Organisme (pg/ml)

Salmonella typhimurium 1

Pseudomonas solanacearum X185 >128

Erwinia amylovora 1 * lal og/eller "bogstaver efter navnet på organismen refererer til stammen.

Tabel II nedenfor angiver diameter i millimeter af hæmningszonen gældende for den angivne mikroorganisme i standardpladeforsøget opnået med 7-(l>-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxyl-syre.

Tabel_II

Hæmningszone* (mm-diameter)

Mikroorganisme Koncentration (mg/ml) 1,0 0,1 0,01

Staphylococcus aureus 35 28 20

Bacillus subtilis 44 32 21

Sarcina lutea 48 27 27

Mycobacterium avium 24 Tr

Proteus vulgaris 23 Tr —

Salmonella gallinarum 35 26 13

Escherichia coli 30 20 11

Klebsiella pneumoniae 28 20 12

Pseudomonas solanacearcum 32 23 * Tr indicerer spor af en zone

En streg (—) angiver, at der ikke er observeret nogen zone. 1 tabel III nedenfor er vist den minimale hæmningskoncentration opnået med 7-(E-phenylglycylamido)-3-chlor-3--cephem-4-carboxyl~ syre over for et spektrum af gram-positive og gram-negative mikroorganismer ved aqar-fortvndinasforsøa.

f DK 153157 B

Tabel_III

In vitro antibiotisk spektrum af 7-(D-phenylglycylamido)-3~chlor- 3-cephem-4-carboxylsyre # Minimal hæmnings-

Testorganisme koncentration MIC pg/ml

Staphylococcus aureus 3055 1,0

Staphylococcus aureus 3123 1,0

Staphylococcus aureus 3074 2,0

Streptococcus (gruppe D) 9901 64

Enterobaeter cloacae EB9 >128

Enterobacter aerogenes EB17 64

Escherichia coli EC14 1,0

Escherichia coli EC35 2,0

Escherichia coli EC38 1,0

Klebsiella sp. K13 <0,5

Klebsiella sp. KI14 2,0

Klebsiella sp. K125 1,0

Proteus mirabilis PR6 1,0

Proteus morganii PR1 128

Proteus rettgeri PR9 >128

Proteus rettgeri PR2 >128

Salmonella SA12 <0,5

Shigella sp. SH3 2,0 * Tal og/eller bogstaver efter organismens navn henfører til stammen.

I standard-agar-fortyndingsforsøg viste 7-(D-phenylglycylamido)-3“Chlor-3-cephem-4~carboxylsyre aktivitet over for Hemophilus influenzae med en MIC-værdi på 1 - 4 mg/ml over for et antal stammer.

I tabel IY nedenfor er vist den orale absorption af 7-(D-phenyl-giycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre ved hjælp af de blod-

7 DK 153157 B

og urinkoncentrationer, der opnåedes i mus. Ved udførelsen af forsøget blev schweiziske McAllister mus, der vejede fra 11 til 13 gram, fastet natten over og blev indgivet oralt 20 mg/kg af 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre. Blod-og urinprøver blev udtaget ved de anførte intervaller, og koncentrationen af antibiotikum i hver prøve bestemtes ved et mikrobiologisk forsøg under anvendelse af Sarcina lutea i en agar med pH 6,0 ved et pladeforsøg.

Tabel_IV

7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-eephem-4-carboxylsyre Koncentration i blod og urin M Koncentration (pg/ml) ius nr. efter følgende tider (min.) 5 15 50 60 90 120 240 1 29,1 16,2 11,6 3,5 1,2 0,5 0,2 2 23,7 19,2 11,0 5,2 3,2 2,0 0,6 3 17,6 10,1 9,1 5,7 2,1 1,3 0,7 4 23,3 13,6 10,1 4,0 1,6 1,6 1,0

Gennemsnit i blod 23,4 14,8 10,5 4,6 2,0 1,4 0,6

Gennemsnit i gennem- __ -1474 1754 843 305 308 226 snitsprøve af urinen ^ ^

Ben effektive dosis (ED^q) for 7-(B-phenylglycylamido)-3-chlor- 3-cephem-4-carboxylsyre, der er illustrativ for den effektive dosis af forbindelserne ifølge opfindelsen, er 0,74 mg/kg x 2 indgivet oralt og 0,48 mg/kg x 2 s.c. vs. Streptococcus pyogenes og 5,5 mg/kg x 2 oralt over for Escherichia coli og 17,6 mg/kg x 2 oralt over for Diplococcus pneumoniae bestemt i mus.

Tabel V nedenfor angiver den minimale hæmningskoncentration for illustrative 3-halogen-3-cephem-forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen over for repræsentative gram-negative bakterier. Hæmningskoncentrationerne bestemtes ved gradient plade-metoden udført i det væsentlige som beskrevet i Science 116, 45 (1952). I tabel V refererer betegnelsen R til strukturformlen.

8 DK 153157 B

Iabel_T

Antibiotisk virkning af substitueret 7-(phenylglycyl-amido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre over for gramnegative bakterier.

COOH

Minimal hæmningskoncentration Organisme ^g/ml)

R 3-OH 4-OH 4-C1 H

Shigella sp. 1,0 2,0 13,5 6,7

Escherichia coli 1,0 2,0 17,2 5,7

Klebsiella pneumoniae 0,9 1,5 8,0 0,9

Aerobacter aerogenes 0,8 1,0 5,0 0,8

Salmonella heidelberg 0,5 0,8 10,7 0,2

Pseudomonas aeruginosa >200 >200 > 200 >200 1 følgende tabel VI er anført aktiviteten af repræsentative 3-halogen-3-cephem-forbindelser over for adskillige kliniske isolater af penicillin-resistente staphylococci. Aktiviteten er angivet i minimal hæmningskoncentrationer af den omhandlede forbindelse. Pen minimale koncentration bestemtes ved gradient-plade-metoden.

9 DK 153157 B

Tatel_YI

Antibiotisk virkning af substitueret 7-(phenylglycyl-amido-3~chlor-3-cephem-4-carboxylsyrer over for penicillin-resistent Staphylococcus r—v o h // A it »

C S

nh2 i ]

COOH

Minimal hæmningskoncentration

Staphylococcus1 _(ftg/ml)_

Stamme R 3-0Ξ 4-OH 4-01 H

741 3,0/ 5,0/ 10,5/>20 11,5/>20 732 3,5/ 7,0/ 18 />20 17 />20 X400 >20 >20 >20 />20 >20 />20 784 0,5/ 0,6/ 3,0/ >20 2,7/ 15 XI.1 0,4/ 0,6/ 0,4/0,7 0,4/1,0 1/ Bogstav-tal-betegnelsen refererer til stammer af kliniske isolater af penicillin-resistent staphylococcus.

2/ I kolonnerne er værdien ovenfor skråstregen den minimale hæmningskoncentration i fravær af humant serum. Værdien under stregen er, når den er til stede, den minimale hæmningskoncentration i nærværelse af humant serum.

Forbindelserne ifølge opfindelsen fremstilles ved N-acylering af en 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyre eller en ester deraf, f.eks. benzyl, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, diphenyl-methyl, 2,2,2-trichlorethyl, trimethylsilyl eller tert.-butylester, med et aktivt derivat af en phenyl, thienyl eller furyl substitueret glycin med formlen:

10 DK 153157 B

R-CH-COOH

m2 hvor R har samme betydning som i formel I. Ved acyleringen beskyttes aminogruppen i glycinen, f.eks. som et salt, såsom et hy-drochlorid, eller med en af de sædvanligt anvendte aminobeskyt-tende grupper, som f.eks. tert.-butyloxycarbonyl, benzyloxycar-bonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, trichlorethoxycarbonyl eller trithylgruppen, eller enaminer dannet med methylacetoacetat og acetylacetone og lignende grupper. Aktiverede derivater af carb-oxylsyregruppen i den substituerede glycin kan være syrehaloge-nider, såsom syrechlorider, aktiverede estre, såsom de, der dannes med pentachlorphenol, azid eller et blandet anhydrid dannet med glycin Og methylchlorformiat og isobutylchlorformiat. Ligeledes kan den aminobeskyttede glycin anvendes direkte i acyleringen af den ønskede 3-halogenkerneester ved at anvende et kondenseringsmiddel, såsom N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinolin (EEDQ). Eor eksempel omsættes p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat med N-(tert.-butyloxycarbonyl)-D-phenylgly-cin i et tørt inert opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran, til dannelse af p-nitrobenzy1-7-(D-phenylglycylamido)-3-ehlor-3-cephem-4-carboxylat.

Generelt kan man anvende enhver af de kendte amid-koblingsmetoder ved acyleringen af 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyre eller -estere. Når det aktiverede derivat er et syrehalogenid, udføres acyleringen i nærværelse af et hydrogenhalogenidbindende middel, såsom natriumbicarbonat, pyridin, natriumbisulfit eller en alkylenoxid, såsom propylenoxid. Når et blandet anhydrid anvendes ved acyleringen, kan det dannede anhydrid dannes ved hjælp af N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinolin (EEDQ). Når en N-beskyttet phenyl, thienyl eller furylglycin anvendes, kan acyleringen udføres i nærværelse af et kondenseringsmiddel, såsom N,N'-dicyclohexylcarbodiimid.

Som eksempler på substituerede glyciner, der kan anvendes til fremstilling af de omhandlede forbindelser, kan nævnes D-phenylglycyl-chlorid, hydrochlorid, D-4-hydroxyphenylglycyl-chlorid, hydrochlorid, pentachlorphenyl-D-phenyl-N-(tert.-butyloxycarbonyl)glycinat, pentachlorphenyl-D-2-thienyl-N-(2,2,2-trichlorethoxycarbonyl)-

DK 153157 B

glycinat, N-(tert.-butyloxycarbonyl)-D-phenylglycin, N-(1-carbo-methoxy-2-propenyl) -D-phenylglycin, 3-thienylglycylchlorid, hy-drochlorid, N-(tert,-butyloxycarbonyl)-2-thienylglycin eller N-(tert. -butyloxycarbonyl) -2-furylglycin.

Acyleringen udføres i et inert opløsningsmiddel, f.eks. i acetone, acetonitril, dimethylformamid eller methylenchlorid og fortrinsvis ved en temperatur på -20 - +20° C. Por eksempel fremstilles 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre ved at omsætte D-phenylglycylchlorid, hydrochlorid med p-nitro-benzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat i acetonitril i nærværelse af propylenoxid. Estergruppen fjernes dernæst ved hydrogenering.

Illustrative eksempler på 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxyisyrer og -estere, der er udgangsmaterialer ved fremstillingen af de omhandlede forbindelser, er 7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat, diphenyl-methyl-7-amino-3-brom-3-cephem-4-carboxylat eller diphenylmethyl-7-amin o-3-chlor-3-c ephem-4-carboxy lat.

7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyrer og -estere fremstilles på følgende måde: En 7-acylamido-cephalosporansyre eller en ester deraf omdannes til en 7-acylamido-3-exomethylencepham-4-carboxylsyre eller ester. Esteren af 3-exomethylencepham-forbin-delsen oxideres med ozon til dannelse af et mellemprodukt i form af et ozonid, der dekomponeres til opnåelse af 7-acylamido-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylsyreester. Denne chloreres eller bromeres til frembringelse af den tilsvarende 3-halogen-3-cephem-forbindelse. 7-acylgruppen i denne forbindelse fjernes ved velkendt sidekæde-spaltningsreaktion, idet der anvendes phosphor-pentachlorid i pyridin til opnåelse af iminochloridderivatet af sidekæden, der dernæst omsættes med en alkohol, såsom methanol, til opnåelse af iminoetheren, der herefter nemt hydrolyseres til opnåelse af 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyreesteren.

Por eksempel omsættes en 7-acylamido-cephalosporansyre, såsom 7-phenoxyacetamidocephalosporansyre, med en svovlholdig nucleo-phil forbindelse ifølge velkendte metoder til udøvelse af en nu-cleophil substitution af acetoxygruppen i cephalosporansyren og

12 DK 153157 B

til frembringelse af en 3-thio-substitueret 7-acylamido-methyl- 3-cephem-4-carboxylsyre. Denne reduceres dernæst med zink/myre-syre i nærværelse af dime thylformamid eller med Raney-nikkel i nærværelse af hydrogen til opnåelse af en 7-acylamido-3-exomethyl-encepham-4--carboxylsyre. For eksempel omsættes 7-phenoxyacet-amido-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carboxylsyre med kaliumethyl-xanthat til opnåelse af 7-phenoxyacetamido-3-ethoxythionocar-bonylthiomethyl-3-cephem-4-carboxylsyre. Reduktion af sidstnævnte forbindelse med zink og myresyre i nærværelse af dimethylformamid giver 7-pbenoxyacetamido-3-exomethylencepham-4-oarboxylsyre.

På lignende måde kan en lang række 7-acylamido-cephalosporansy-rer omsættes med en lang række svovlholdige nucleophile forbindelser til opnåelse af 3-thio-substituerede methyl-3-cephem-forbin-delser. Por eksempel kan 7-acylamidogruppen være en heterocyc-lisk kæde, f.eks. 2-thienylacetamido eller 2-furylacetamido, eller det kan være en alkanoylsidekæde som eksemplificeret af acetamido eller en lang række andre sidekæder. Ligeledes kan den svovlholdige nucleophile forbindelse være en lang række forbindelser, såsom thiourinstof og substituerede thiourinstoffer, der reagerer med cephalosporansyrer til opnåelse af isothiouroniumsalte, thiobenzoater, mercaptopyridin-N-oxid, 1-methyl-tetrazol-5-thiol, 5-methyl-1,3»4-thiadiazol-2-thiol og andre svovlholdige nucleophile forbindelser. Efter den reduktive substitutionsreaktion beskrevet ovenfor kan den således fremstillede 3-exomethylen-cepham-4-carboxylsyre esterificeres for eksempel med p-nitro-benzylbromid, p-methoxybenzylbromid, diphenyldiazomethan eller 2,2,2-trichlorethylchlorformat eller en anden esterdannende forbindelse, og 3-exomethylencephamesteren omsættes med ozon til opnåelse af 3-hydroxy-3-cephem-esteren. Reaktionen, hvorved man ozono-lyserer en 3-exomethyIencephamester udføres i et inert opløsningsmiddel ved en temperatur på mellem -80 og 0°C og fortrinsvis mellem -80 og -50°C til dannelse af det intermediære ozonid. Dette dekom-poneres in situ i kulden til opnåelse af den tilsvarende 3-hydroxy-3-cephem-ester som illustreret i følgende reaktionsskema:

13 DK 153157 B

0 IT

R-C-N-,-S

tf-CH2 COOR1 °5 Φ [ozonid] v

0 H

R-C-N-*-|^S'^ 0J- COOR1 I ovennævnte formel er R hydrogen eller resten af acylamido-gruppen som beskrevet ovenfor. For eksempel kan R være "benzyl,

’ A

phenoxymethyl, methyl, 2-thienylmethyl eller 2-furylmethyl, og R har samme "betydning som defineret i formel I.

Ozonolysen af 3-exomethylencephamesteren udføres ved at lede ozon gennem en opløsning af esteren i et inert opløsningsmiddel, indtil ozoniddannelsen er tilendebragt. Inerte opløsningsmidler, der kan anvendes, er de opløsningsmidler, hvori 3-exomethylen-cephamestere i det mindste delvis er opløselige, og som ikke reagerer med ozon under de beskrevne betingelser. Sædvanligvis anvendte opløsningsmidler er methanol, ethanol, ethylacetat, methylacetat, isoamylacetat og methylenehlorid.

Ozongassen fremstilles ved hjælp af en ozongenerator af den type, der sædvanligvis anvendes ved syntese og analytisk arbejde. Sådanne generatorer fremstiller ozon ved indvirkning af en elektrisk spænding på oxygen. En sådan ozongenerator sælges af Wells- η DK 153157 Β back Corporation. Ozon frembringes i en strøm af oxygen, der ledes direkte ind i reaktionsbeholderen. Det procentvise indhold af ozon i oxygenstrømmen kan varieres efter ønske, f.eks. ved at variere strømningshastigheden af oxygen igennem ozongeneratoren samt ved at variere intensiteten af den elektriske ladning.

Koncentrationen af 3-exomethylencephamester-udgangsmaterialet i det inerte opløsningsmiddel er ikke kritisk, og det foretrækkes at anvende et opløsningsmiddel-volumen, der er tilstrækkeligt til at danne en fuldstændig opløsning.

Når ozoniddannelsen er tilendebragt, fjernes ethvert overskud af ozon i reaktionsblandingen ved at boble nitrogen, oxygen eller en inert gas, såsom argon, igennem blandingen. Efter fjernelse af ethvert overskud af ozon dekomponeres ozonidet ved at sætte et reduktionsmiddel til reaktionsblandingen, hvilket middel vælges fra gruppen bestående af natriumborsulfit, svovldioxid og trims thylphosph.it til opnåelse af 3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylsyre-esteren. Dekomponeringen udføres ved at sætte et overskud af dekompositionsmidlet til blandingen og omrøre denne, indtil der opnås en negativ kaliumiodid-stivelsesprøve. Et foretrukkent middel til brug ved dekomponeringen er gasformigt svovldioxid.

3-hydroxy-3-cephem-estere udvindes fra reaktionsblandingen ved at afdampe de flygtige opløsningsmidler fra blandingen, hvorved der opnås en reaktionsproduktblanding som remanens, hvorefter der omkrystalliseres. Den således dannede 7-acetamido-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylsyreester halogeneres dernæst til opnåelse af 7-acylamido-3-halogen-3-cephem-4“Carboxylsyreesteren.

Eorbindelser repræsenteret ved formel I, hvori X er chlor eller brom fremstilles ved at omsætte en 7-acylamido~3-hydroxy-3-cephem-ester eller en 3-hydroxy-3-cephem-ester i dimethylformamid med en reaktiv chlor- eller bromforbindelse, der med dimethylformamid danner chlor eller brom-dimethyliminiumchlorid eller bromid med følgende formel:

OH* , H

3+ t -V-— N=C x

CH^ Z

hvor X og X repræsenterer henholdsvis chlor eller brom og chlorid

15 DK 153157 B

eller bromid. Det reaktive halogeniminiumhalogenid med ovennævnte formel dannes in situ og er et meget reaktivt chlorerings- eller bromeringsmiddel. Chlor- og bromforbindelser, der danner ovennævnte iminiumhalogenid, indbefatter sædvanligvis anvendte chlo-reringsmidler, såsom phosgen (carbonylchlorid), oxalylchlorid, thionylchlorid og phosphorchlorider, såsom f.eks. phosphortri-chlorid og phosphoroxychlorid (phosphorylchlorid). Bromerings-midler, der kan anvendes i nærværende opfindelse, omfatter carbo-nylbromid, oxalylbromid, thionylbromid (svovloxybromid) og phos-phorbromider, phosphoroxybromid og phosphortribromid. Phosphor-pentachlorid kan anvendes ved fremstilling af 3-chlor-3-cephem-forbindelser ifølge opfindelsen. Imidlertid reagerer dette middel samtidigt med 7-acylamido-sidekæden i udgangsmaterialet til dannelse af et iminochlorid, der er det reaktive mellemprodukt i den velkendte reaktion til fraspaltning af cephalosporin-sidekæden. Derfor foretrækkes det at anvende et af de andre chloreringsmidler.

Chloreringen og bromeringen udføres ved at sætte halogenerings-midlet til en opløsning af 3-hydroxy-3-cephem-esteren i tør di-methylformamid ved en temperatur på 5 - 15° C og lade reaktionsblandingen stå ved stuetemperatur i 4 - 8 timer eller længere. Reaktionen er til at begynde med exotherm,og derfor køles reaktionsbeholderen først i et is-vandbad og holdes dernæst ved 25° 0 under resten af reaktionen. Dimethylformamidet tørres fortrinsvis over en molekylsi før anvendelsen. Selv om reaktionen kan udføres i dimethylformamid som opløsningsmiddel, kan der sammen med dimethylformamidet anvendes et andet opløsningsmiddel.

Por eksempel kan der anvendes tetrahydrofuran, dioxan, methylen-chlorid, dimethylacetamid eller dimethylsulfoxid som yderligere opløsningsmiddel.

3-chlor- eller 3-brom-3-cephemesterne udvindes fra reaktionsproduktblandingen ved at udhælde denne i en blanding af vand og ethyl-acetat og fraseparere den organiske fase indeholdende produktet. Den organiske fase vaskes, tørres og inddampes til opnåelse af 3-halogen-3-cephemesteren som en amorf remanens. Dette produkt opnås ofte i krystallinsk form ved behandling af remanensen med ether eller med n-hexan. Ved at følge metoden til fremstilling af 7-acylamido-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyreestere som beskrevet ovenfor opnås de respektive 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carb-

16 DK 153157 B

oxylsyreestere ved at udføre den velkendte N-deacylering af 7-acylamido-sidekæden. For eksempel omsættes 7-aeylamido-3-halo-gen-cephalosporinesteren med phosphorpentachlorid i methylenchlorid i nærværelse af pyridin til dannelse af iminochloridet. Dette omsættes med et alkoholisk opløsningsmiddel, såsom methanol eller isobutanol til opnåelse af den tilsvarende iminoether. Denne hydrolyseres til opnåelse af 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-earb-oxylsyre som et hydrogenchloridsalt.

Som tidligere nævnt kan 7-amino-3-halogen-udgangsmaterialet acyleres enten som frie syrer eller som estre deraf. Acyleringen af 7-amino-3-halogen-kernen udføres som tidligere beskrevet.

I en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omsættes 7-phenoxyacetamido-cephalosporansyre med thiourinstof til opnåelse af St isothioroniumsalt ved substitution af acetoxygruppen i 3-stilling i cephalosporansyrens dihydrothiazinring. Iso-thioroniumsaltet omsættes dernæst med zink og overskud af 90 $ myresyre i nærværelse af dimethylformamid ved en temperatur på 25° C til opnåelse af 7-phenoxyacetamido-3-exomethylencepham-4-carboxylsyre. Denne esterificeres med p-nitrobenzylbromid i nærværelse af et hydrogenhalogenidbindende middel til opnåelse af 3-exomethylencepham-4-carboxylsyre-p-nitrobenzylester. Denne ozoniseres i methylenchlorid ved en temperatur på -70° C,og ozonolyseblandingen behandles med svovldioxid for at dekomponere ozonidet til opnåelse af p-nitrobenzyl-7-phenoxyacetamido-3-hydroxy-3-eephem-4-carboxylat. 3-Hydroxy-esteren omsættes dernæst med phosphortrichlorid i tørt dimethylformamid til opnåelse af p-nitrobenzyl-7-phenoxyacetamido-3“Chlor-3-cephem-4-carboxy-lat. 3-chlor-esteren omsættes dernæst i methylenchlorid med phos-phorpentachlorid i nærværelse af pyridin til opnåelse af imino-chlorid-mellemproduktet in situ, der dernæst omsættes med methanol til opnåelse af den tilsvarende iminoether. Ved tilsætning af vand til reaktionsblandingen dekomponeres iminoetheren, hvorved der opnås p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat. 7-Amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyreesteren kan dernæst acyleres som tidligere beskrevet med D-phenylglycylchlorid, hydrochlo-rid eller med et aminobeskyttet D-phenylglycylderivat til opnåelse af 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, p-nitrobenzylester eller et N-beskyttet derivat deraf. Efter

17 DK 153157 B

fjernelse af den α-amino-beskyttende gruppe og C^-carboxylsyre-estergruppen opnås der 7-(I>-phenylglycylainido)-3-chlor-3-cephem- 4-carboxylsyre. Det er klart fra den foregående omtale af fremstillingen af udgangsmaterialerne, at der kan anvendes en lang række kendte 7-acylamidocephalosporansyrer ved fremstilling af 7-amino-3-halogen-3-cephem-4-carboxylsyrer.

En foretrukken gruppe af forbindelser ifølge opfindelsen er de, der er repræsenteret ved formel I, hvor X betegner chlor, R er hydrogen, og R er phenyl, og farmaceutisk acceptable, ikke-toxi-ske salte deraf. Eor eksempel er 7-(D-a-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre en foretrukken forbindelse.

En anden foretrukken gruppe af forbindelser ifølge opfindelsen består af forbindelser med formel I, hvor R er hydroxyphenyl, R·*" er hydrogen, og X er chlor, samt farmaceutisk acceptable, ikke-toxiske salte deraf. Som illustrative eksempler på sådanne forbindelser kan nævnes 7-(Ε-α-4-hydroxyphenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre og 7-(D-α-3-hydroxyphenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre.

Et særligt foretrukkent antibiotikum fremstillet ifølge opfindelsen er 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre.

Eølgende eksempler illustrerer nærmere fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksemgel_2 p-nitrobenzyl-7-amino-3-methylencepham-4-carboxylat1^hydrochlorid

Til en opløsning af 965 mg (2 mmol) p-nitrobenzyl-7-phenoxyacet-amido-3-methylencepham-4-carboxylat i 10 ml methylenchlorid sattes 175 mg tør pyridin og 460 mg phosphorpentachlorid, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 6 timer. 1 ml isobutanol sattes til blandingen, der henstod ved 0° -C natten over. Reaktionsproduktet , p-nitrobenzyl-7-amino-3-methylencepham-4-carb-oxylat, hydrochlorid, der dannedes som et krystallinsk bundfald, 18 DK 153157 S' filtreredes til opnåelse af 430 mg (58 % udbytte) af titelforbindelsen.

Grundstof-analyse for C^H^gN^O^SOl: teoretisk: C 46,69 - H 4,18 - N 10,89.

fundet: 0 46,40 - H 4,20 - N 10,62.

I.R. (Nujol Mull): C ar b onylab sorption ved 5,65 (β-lactam) og 5,75 (ester) γ..

N.M.R. (DMS0 dg):

Signaler ved 6,34 (2d, 2H, 02-H2), 4,98 (d, 1H, Cg-H), 4,7 - 4,4 (m, 6H, C^-H, ester CH2, C^-CH2 og Ογ-Η) og 2,4 - 1,6 (m, 4H, aromatisk H) tau.

Eksempel_2

El^iii2^®S^yizZz2?i22z^I^Z^£25Zr|-ce£liem-4-carbox2;la;ti_liydrocklori:d

En opløsning af 4 g p-nitrobenzyl-7-amino-3-methylencepliam-4-carboxylat, hydrochlorid i 620 ml methanol afkøledes i et tøris-acetone-bad, og ozon bobledes igennem den kolde opløsning i 20 minutter. Reaktionsblandingen befriedes for den tiloversblevne ozon ved at lede nitrogen igennem opløsningen, og der tilsattes 10 g natriumbisulfit.

Reaktionsblandingen omrørtes i en time ved 0° C, hvorefter blandingen gav en negativ kaliumiodid-stivelsesprøve.

Blandingen inddampedes i vakuum til opnåelse af et reaktions-produkt som et amorft gult fast stof. Remanensen omkrystalliseredes i acetone til opnåelse af 3,4 g p-nitrobenzyl-7-amino-3-hydroxy-3-cepbem-4-carbo2ylat, hydrochlorid som et krystallinsk acetonesolvat.

DK 153157 B

I.R. (Nujol Mull):

Carbonyl-absorptionsbånd ved 5,60 (β-lactam) og 6.04 (estercarbonylhydrogen bundet til 3-hydroxy) mp..

N.M.R, (DMSO dg):

Signaler ved 7,92 (s, 3H, 1/2 mol acetone), 6,22 (2d, 2H, Cg-Hg), 5.07 (d, 1H, CgH), 4.8 - 4,5 (m, 3H, ester CHg og ΟγΗ), 2.4 - 1,6 (m, 4H, aromatisk H) tau.

Eksempel 5

En opløsning af 2,5 g p-meth.oxybenzyl-7-ph.enoxyacetamido-3-methylencepham-4-car'bo2ylat i 350 ml ethylacetat afkøledes i et acetone-tøris'bad. Ozon bobledes igennem den kolde opløsning i 8 minutter, og dernæst ledtes oxygen igennem den ozoniserede reaktionsblanding for at fjerne overskud af ozon. Mellemproduktet dekomponeredes ved at sætte 25 g natriumbisulfit til reaktionsblandingen under omrøring ved en temperatur på 0° 0. Reaktionsopløsningen dekanteredes og vaskedes successivt med vand, 5 % saltsyre og en mættet opløsning af natriumchlorid. Vaskeblandingen tørredes og afdampedes til opnåelse af et reaktionsprodukt, nemlig p-meth.oxybenzyl-7-plienoxyacetainido-3-hydroxy- 3-ceph.em-4-carboxylat som et amorft fast stof.

N.M.R. (CDClj):

Signaler ved 6,75 (s, 2H, C2-H2), 6,23 (s, 3H, p-methoxy), 5.53 (d, 1H, CgH), 4,87 (s, 2H, ester CHg), 4,47 (q, 1H, C7H), 3,40 - 2,50 (m, 9H, aromatisk H), 2,33 (d, 1Ξ, amid NH) og 1.53 (bred s, 1H, 3 OH) tau.

20

DK 153157 B

Eksemgel_4 p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-hydro:xy-3-cephem-4-__car^bozylat_________ 5Dil en opløsning af 1,55 g p-nitrobenzyl-7-amino-3-hydro:xy-3-cephem-4-carboxylat, hydrochlorid i 30 ml acetone indeholdende 364 mg (0,5 ml, 3»6 mmol) triethylamin sattes 962 mg urinstof.

Under omrøring ved stuetemperatur tilsattes dråbevis en opløsning af 730 mg (4f4 mmol) 2-thiophenacetylchlorid i 20 ml acetone. Efter 2,5 timer blev reaktionsblandingen filtreret og inddampet. Remanensen opløstes i ethylacetat, og opløsningen vaskedes successivt med vand, en 5 % opløsning af natrium-bicarbonat, 5 % saltsyre og en mættet opløsning af natrium-chlorid. hen vaskede opløsning tørredes og koncentreredes dernæst ved inddampning i vakuum til opnåelse af 1,2 g af reaktionsproduktet som et krystallinsk fast stof. Produktet omkrystalliseredes fra ethylacetat til opnåelse af rent p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carhoxylat, der har følgende spektrale egenskaber: I.R. (Nujol Mull):

Absorptionstoppe ved 3.0 (amid NH), 5,68 (β-lactam-carbonyl) og 6.1 (amid og ester hydrogen bundet til 3 OH) mu.

N.M.R. (ChCl^/hMSO d6):

Signaler ved 6,54 (2d, 2H, C2H2), 6,16 (s, 2H, sidekæde CH2), 4,90 (d, 1H, C6H), 4,60 (d, 2H, ester CH2), 4,43 (g, 1H, C?H), 3.1 - 1,6 (m, 7H, aromatisk H) og 1,30 (d, 1H, amid NH) tau.

21 DK 153157 B

Eksemgel^ £-nitrobenzYl-7-acetamido-3-h2drox2i3-2eE£em-4-carbox2lat

En opløsning af 10 mmol p-nitrobenzyl-7-amino~3-hydroxy-3-cephem- 4-carboxylat, hydrochlorid i en blanding af 325 ml acetone og 125 ml vand afkøledes i et is-vandbad. Under omrøring ledtes en strøm af ketengas igennem opløsningen i 30 minutter. Herefter inddampedes reaktionsblandingen for at fjerne acetonen, og den vandige remanens opslemmedes i ethylacetat. Ethylacetat-fassn frasepareredes og vaskedes med 5 % saltsyre og en mættet opløsning af natriumchlorid. Een vaskede ekstrakt tørredes og inddampedes i vakuum til opnåelse af et reaktionsprodukt som et krystallinsk fast stof. Eette behandledes med diethylether og vakuumtørredes til opnåelse af 3,55 g p-nitro-benzyl-7-acetamido-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat, der smeltede ved 146 - 152° C under dekomponering.

Grundstof-analyse for C^gH^N^OyS: teoretisk: C 48,85 - H 3,84 - N 10,68.

fundet: C 48,97 - H 3,96 - N 10,42.

I.R. (CHC15):

Absorptionsbånd ved 2,9 og 3,0 (amid NH og OH), 5.63 (β-lactam-carbonyl)og 5,95 (bredt amid og estercarbonylhydrogen bundet til 3 OH) ιημ.

N.M.R. (CBOlj):

Signaler ved 7,90 (s, 3H, 7-acetamido-CH^), 6,55 (s, 2H, C2H2), 4,92 (d, 1H, C6H), 4.63 (m, 2H, ester CH2), 4,30 (q, 1H, C7H), 2,81 (d, 1H, amid NH), 2,5 - 1,8 .(m, 4H, aromatisk H) og 2,8 (s, 1H, C3 OH) tau.

22 DK 153157 B

Elektrometrisk titrering (66 fo vandig DMP) pKa 5,9.

Eksempel 6

Diphenyl-7-[ 2-(2-thienyl)acetamidoJ-5-chlor-5-cephem.-4-carboxylat (a) Til en opløsning af 34 g (100 mmol) 7-[2-(2-thienyl)acet-amido ]-3-methylencepham-4-carboxylsyre i 500 ml methylenchlorid sattes 21,4 g (110 mmol) diphenyldiazome than, og den fremkomne blanding omrørtes i 2 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet inddampedes under reduceret tryk, og remanensen opløstes i ethyl-acetat. Ethylacetatopløsningen vaskedes med en 5 opløsning af natriumbicarbonat, dernæst med vand og tørredes over magnesiumsulfat. Den tørrede opløsning koncentreredes til et lille volumen. Yed henstand udfældedes 40 g diphenylmethyl-7-[2-(2-thienyl)-acetamido]-3-methylencepham-4-carboxylat som et krystallinsk fast stof, der smeltede ved 132 - 133° 0.

I.R. (chloroform):

Absorptionstoppe ved 2,9 (amidN-H), 5,65} 5,75 og 5,95 (β-lactam, ester og amidcarbonyl) og 6,62 (amid II) mp., N.M.R. (CDCl^):

Signaler ved 6,72 (ABq., 2H, Og-Hg), 6,21 (s, 2H, a-0H2), 4,83 - 4,65 (m, 4H, O^-H, Cg-H og C3-CH2), 4,39 (cl, 1H, C7-H), 3,4 - 2,65 (m, 15H, Ογ-NH, ester CH og aromatisk H) tau.

(b) Til en opløsning af 8,1 g (16 mmol) af ovennævnte ester i 80 ml methylenchlorid sattes 1,57 g (1,6 ml, 19,6 mmol) tør pyridin og 3,8 g (18,1 mmol) phosphorpentachlorid. Reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer ved stuetemperatur og afkøledes derefter i et is-vandbad. Den kolde blanding behandledes med 8 ml isobutanol under omrøring. Omrøring fortsattes i 2 timer, hvorunder 3 g diphenylmethyl-7-amino-3-methylencepham-4-carb02ylat, hydrochlorid

23 DK 153157 B

dannedes som et krystallinsk bundfald. Produktet filtreredes fra og vaskedes med methylenchlorid og vakuumtørredes.

Grundstof-analyse ($) for C21H21W2°3SC1: teoretisk: C 60,50 - H 5,08 - N 6,72 - Cl 8,50.

fundet: 0 60,70 - H 5,02 - N 6,71 - Cl 8,80.

N.M.R. (DMSO d6):

Signaler ved 6,45 (ABq., 2H, C2-H2), 5.00 (d, 1H, C6-H), 4,68 (d, 1H, Ογ-Ξ), 4.60 (s, 2H, 3-CH2), 4,44 (s, 1H, C4-H), 3,10 (s, 1H, ester CH) og 2.61 (s, 10H, aromatisk H) tau.

(c) Hydrochloridsaltet af 7-amino-3-exomethylencephamester, i alt 2,1 g (5 mmol), opløstes i 200 ml methanol, og opløsningen afkøledes i et acetone-tørisbad. Ozon bobledes igennem den kolde opløsning i 7 minutter til dannelse af ozonidet. Dette dekompo-neredes ved at lede en strøm af svovldioxidgas igennem reaktionsblandingen i 2 minutter. Herefter inddampedes reaktionsblandingen, og remanensen behandledes med diethylether til opnåelse af 1,6 g diphenylmethyl-7-amino-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat, hydrochlorid som et krystallinsk fast stof.

N.M.R. (CDC15):

Signaler ved 6,4 (ABq., 2H, C2—H2), 5.0 - 4,5 (m, 2H, Cg-H og Ογ-Η), 3,2 - 2,4 (m, 11H, ester CH og aromatisk H) tau.

I.R. (chloroform):

Carbonylabsorptionstoppe ved 5,57 og 5,70 (henholdsvis β-lactam og estercarbonyl) ιημ.

U.Y. (pH 7 buffer): X max 275 ιημ, 7550.

u DK 153157 B

Elektrometrisk titrering (60 $ ag. DMP): titrerhare grupper ved 4,5 og 6,5.

(d) Til en opløsning af 840 mg diphenylmethyl-7-amino--3--hydro:xy- 3-cephem-4-carBoxylat i 10 ml vand og 10 ml acetone sattes 1 g natriumhisulfit. Blandingen omrørtes, og 800 mg thiophen-2-acetylchlorid i 10 ml acetone tilsattes dråBevis. Blandingen omrørtes i 4?5 timer ved stuetemperatur og inddampedes dernæst under reduceret tryk. Remanensen opløstes i en Blanding af ethyl-acetat og en vandig 5 $ opløsning af natriumBicarBonat. Ethyl-acetatfasen frasepareredes, vaskedes med vand og tørredes. Den tørrede opløsning inddampedes, og remanensen Behandledes med ether til opnåelse af 500 mg diphenylmethyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]- 3-hydroxy-3-cephem-4-carBoxylat.

N.M.R. (CDClj):

Signaler ved 6,79 (s, 2H, C2-H2), 6,16 (s, 2H, a-CH2), 5,0 (d, 1H, C6-H), 4,32 (cl, 1H, C7-H), 3,05 - 2,46 (m, 15H, Ογ-ΝΗ, ester CH og aromatisk H) tau.

I.R. (chloroform): ABsorptionstoppe ved 2,9 (amid NH), 5,6, 5,73 og 5,95 (henholdsvis β-lactam, ester og amidcarBonyler) og 6,65 (amid II) mp.

(e) Til en opløsning af 4,2 g diphenylmethyl-7-[2-(2-thienyl)-acetamido]-3-hydroxy-3-oephem-4-carBoxylat i 44 ml tør dimethyl-formamid sattes 865 mg phosphortrichlorid. Blandingen omrørtes 1,5 timer ved stuetemperatur og udhældtes i en Blanding af ethyl-acetat og 5 i° vandig saltsyre. Ethylacetatfasen inddampedes, vaskedes med 5 % saltsyre og med vand og tørredes. Den tørrede opløsning koncentreredes i vakuum, hvorved produktet udkrystalliserede. 3-chloresteren filtreredes fra, vaskedes med kold ethylacetat og tørredes til opnåelse af 2,2 g af titelforbindelsen.

25 DK 153157 B :;

Grundstof-analyse {i») for C26H21N2°4^2C1: teoretisk: C 59,48 - H 4,05 - N 5,34 - Cl 6,75.

fundet: C 59,77 - H 4,25 - N 5,40 - Cl 6,91.

N.M.R. (CDOlj):

Signaler ved 6,49 (ABq., 2H, , 6,22 (s, 2H, a-0H2), 5.08 (d, 1H, 06-H), 4,19 (G, 1H, C?-H), 3,13-25, (m, 15H, Ογ-ΝΗ, ester CH og aromatisk H) tau.

I.R. (CHOlj):

Absorptionstoppe ved 2.9 (amid NH), 5,55, 5,72 og 5,90 (β-lactam, ester og amidcarbonyler) og 6,60 (amid II) mu.

U.V. (dioxan): λ max 275 mu, ε=87Ο0.

Eksempel_7 p-nitrobenzyl-7-[ 2-( 2-thienyl)acetamido] -5-chlor-3-cephem-4--carb-__oxylat__iyia_tbionylcblorid2___________________________________

Til en opløsning af 1,9 g (4 mmol) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)-acetamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat i 10 ml dimethylformamid (tørret over en molekylsi) sattes 950 mg (0,58 ml, S mmol) frisk destilleret thionylchlorid. Blandingen omnørtes ved stuetemperatur i 6,5 timer og udhældtes i 100 ml ethylacetat.

Blandingen ekstraheredes tre gange med 50 ml portioner :5 f° hydro-genchloridsyre og med en mættet opløsning af natriumchlorid. Den vaskede ethylacetatopløsning filtreredes fra og inddampedes til tørhed i vakuum. Remanensen behandledes med ether til opnåelse af 1,2 g p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-chlor-3-cephem- 4-carboxylat som et brunt krystallinsk fast stof med et smeltepunkt på 164 - 166° C.

26 DK 153157B

Grundstof-analyse (<fo) for C20H16N306S2C1: teoretisk: C 48,63 - H 3,27 - N 8,51 - 01 7,18.

fundet: C 48,47 - H 3,29 - N 8,78 - Cl 6,96.

I.R. (chloroform):

Absorptionsbånd ved 2,9 (amidNH), 5,59 (β-lactamcarhonyl), 5,75 (estercarhonyl) og 5,92 mp (amidcarbonyl).

U.B, ahsorptionsspektrum (acetonitril) viste maxima ved X max 235 mp, ε 12.100 X max 268 mp, e=15.800.

Massespektret af produktet viste en molekylærion på 493 m/e.

N.M.R. (CDOl^) viste signaler ved 6,39 (ABq., 2H, Cg-Hg), 6,17 (s, 2H, a-CH2), 4,99 (d, 1H, C6-H), 4,64 (s, 2H, ester CH2), 4,19 (q, 1H, C?-H), 3,45 (d, 1H, C7-NH), 3,1 - 1,67 (m, 7H, aromatisk H) tau.

Eksemgel_8 p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-chlor-3-cephem-4-carb-__oxylat (via phosphortrichlorid)_________________________

Til en afkølet opløsning af 439 mg (0,93 mmol) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carhoxylat i 4,4 ml dimethylformamid sattes langsomt 85 mg (0,05 ml, 0,63 mmol) phosphortrichlorid. Reaktionsblandingen henstod 4 timer ved stuetemperatur ,og derefter oparbejdedes reaktionsproduktet ved at følge metoden beskrevet i eksempel 6 til opnåelse af 374 mg p-nitro-

27 DK 153157 B

benzyl-7-[ 2- (2-thienyl) acetamido ] -3-chlor-3-cephem-4-carboxylat. NMR-spektret af produktet stemte overens med det forventede produkt og med forbindelsen i eksempel 7.

Eksempel_9 7-phenoxyacetamido-3~chlor-3-cephem-42carbox2lsyre

Ved at følge chloreringsmetoden i eksempel 6 fremstilledes p-nitrobenzyl-7-phenoxyacetamido-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat med phosphortrichlorid. p-nitrobenzylestergruppen fjernedes ved hydrogenering med hydrogen og 5 i° palladium-på-carbon til opnåelse af 3-chlorcephalosporansyre.

Eksempel 10 p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)aeetamido]-3-chlor-3-cephem-4-carb-__oxylat__iyia^oxalylchlorid)____________________________________

Til en opløsning af 439 mg (0,93 mmol) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-hydroxy-3-cephem-4--carboxylat i 4»4 ml dime'thylformamid afkølet i et isbad sattes dråbevis 118 mg (0,07 ml, 0,93 mmol) oxalylchlorid. Reaktionsblandingen henstod i 4 timer ved stuetemperatur og udhældtes i en blanding af vandig 5 fo hydrogenchloridsyre og ethylacetat. Den organiske fase separeredes fra og vaskedes dernæst sekventielt med 5 % saltsyre, vand og en mættet opløsning af natriumchlorid.

Den vaskede fase tørredes og inddampedes til tørhed, hvorved der opnåedes p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat som et amorft fast stof. Produktet blev opnået i krystallinsk form ved behandling med ether. Udbytte 360 mg. Det infrarøde spektrum og IMR-spektret af det krystallinske produkt stemte med spektret for et autentisk materiale.

Eksempel^! 7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3vbrom-3-cephem-4-garbo^lsyre

Til en opløsning af 19 g (40 mmol) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)-acetamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat i 300 ml tør dimethyl-

28 DK 153157 B

formamid sattes 15 g (56 mmol) phosphortribromid, og reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur natten over. Reaktionsblandingen udhældt es i en blanding af ethylacetat og vand, og den organiske fase frasepareredes og vaskedes derefter gentagne gange med vand og tørredes over magnesiumsulfat. Den tørrede organiske fase inddampedes i vakuum til tørhed. Det rå reaktionsprodukt, der vejede ca. 9 g, oprensedes ved kromatografi over 500 g silicagel under anvendelse af ethylacetat-hexan (55:45 v:v) som elueringsmiddel. Eluatet inddampedes til tørhed under reduceret tryk, og produktet p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-brom-3-cephem-4-carboxylat opnåedes i krystallinsk forir. ved at behandle den tørre remanens med diethylether.

U.V. (ethanol): λ max. 270 mp (£=13.500) λ max. 245 mp (6=12.700).

Grundstof-analyse beregnet for °20H16’BrN306S2: teoretisk: C 44,61 - H 3,00 - N 7,81 - Br 14,84.

fundet: 0 44,78 - H 3,03 - N 7,65 - Br 14,91.

NMR-spektrum (DMS0 dg):

Signaler ved 6,21 (2H, a-CH2), 5,98 (ABq., 2H, C2-H2), 4,72 (d, 1H, C6-H), 4,51 (s, 2H, ester-CH2), 4,20 (q, 1H, C7-H), 3,04 - 1,74 (m, 7H; aromatisk H) og 0,66 (d, 1H, C7-CH) tau.

Ovennævnte 3-bromester deesterificeredes på følgende måde: 545 mg (1,0 mmol) af esteren hydrogeneredes ved stuetemperatur i ethanol i nærværelse af præreduceret 5 procent palladium-på-car-bon katalysator. Katalysatoren filtreredes fra, og filtratet inddampedes under reduceret tryk til tørhed. Remanensen behandledes med diethylether til opnåelse af 180 mg (44 i«) af det krystallinske produkt, 7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-brom-3-cephem-4-' carboxylsyre.

29 DK 153157 B

Elektrometrisk titrering (66 $ vandig dimethylformamid) viste en pKa-værdi på 4*4 og en tilsyneladende molekylvægt på 393.

Beregnet molekylvægt = 405.

Grundstof-analyse for C^H·}-jBrNgO^S^ 1/2 diethyletherat: teoretisk: C 40,91 - H 3*66 - N 6,36 - Br 18,15.

fundet: C 41,29 - H 3,20 - N 6,29 - Br 18,,50.

NMR (CDC13) viste signaler ved 8.8 (t, diethylether-CH^), 6,68 - 5,86 (m, G^-R^, a-CIL, og diethylether-CB^), 4,90 (d, 1H, C6-H), 3,0 - 2,63 (m, 30, aromatisk-H) og 1.9 (d, 1H, amid NH) tau.

Eksempel 12 (a) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-tMenyl)acetamido]-3-metliylsulfonyl- __________________________________

Til en opløsning af 4,75 g (10 mmol) p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)-acetamido]-3-bydroxy-3-cephem-4-carboxylat i 50 ml tør dimethyl-acetamid sattes 2 ml propylenoxid. Til opløsningen sattes under omrøring en ækvivalent mængde methansulfonylchlorid,· og omrøringen fortsattes i 3 timer. Reaktionsblandingen opløstes i ethylaeetat, og opløsningen vaskedes med en mættet opløsning af natriumcblorid.

Den vaskede organiske fase inddampedes i vakuum til tørhed, hvorved der opnåedes en reaktionsproduktblanding som en remanens.

Denne oprensedes ved præparativ tyndtlagskromatografi på silica-gel under anvendelse af 65 $ ethylacetat/hexan som eluerings-middel.

Det oprensede produkt gav følgende procentvise sammensætning ved mikroanalyse:

Beregnet for C^H^N^OgS^: teoretisk: C 45,56 - H 3,46 - N 7,59 - S 17,38.

fundet: C 45.74 - H 3.56 - N 7.30 - S 17.06.

?0 DK 153157 B

NMR-spektret og det infrarøde absorptionsspektrum stemte med strukturen af det dannede produkt.

(b) p-nitrobenzyl-7-[ 2-(2-thienyl)acetamido]-3-fluor-3-ceph.em- ______________________________________________

Til 93 mg dicyclohexyl-18-krone-6-et]ier i 15 ml acetonitril tørret over en molekylsi sattes 25 mg kaliumfluorid, der var tørret i vakuum ved 90° C. Blandingen omrørt es i 10 minutter, og 138 mg p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetamido]-3-methylsulfonyloxy-3-ceph.em-4-carboxylat i 4 ml acetonitril tilsattes. Blandingen om-rørtes i 1 time. Blandingen blev gjort sur ved tilsætning af fortyndet (5 %) saltsyre, og den fremkomne sure blanding eks-traheredes med ethylacetat. Det rene produkt opnåedes fra ethyl-acetatekstrakten ved præparativ tyndtlagskromatografi på silica-gel, idet der som elueringsmiddel anvendtes ethylacetat:benzen (1:1). Der opnåedes 10 mg p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acetami'doJ-3-fluor-3-cephem-4-carboxylat.

I.R.:

Absorptionstoppe ved 1792, 1740 og 1685 cm"1.

NMR (CDC15) viste signaler ved 6,15 (s, 2H, o-CH2), 4,97 (d, IH, J = 4H2, Cg-H), 4,20 (q, 1H, C?-H), 3,52 (d, 1H, Cy-NH), 2,32 - 1,7 (m, 2H, C2-H2) tau.

Pluor NMR — (d, J = 10 Hz).

M.S.: Beregnet — 477.0465

Pundet — 477.0455.

Eksempel 13

EzSiiiH^^^illrSBiSSz^-cb.lor-^-cephem-^-carbox^iat^^^drochlorid

Til en opløsning af 500 mg p-nitrobenzyl-7-[2-(2-thienyl)acet-amido] -3-ch.lor-3-cephem-4-carboxylat i 6 ml methylenchlorid sattes 95 mg tør pyridin og 237 mg phosphorpentachlorid. Reak

51 DK 153157 B

tionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1,5 timer og afkøledes derefter i et is-vandbad til ca. 5° C, og der filsattes 0,6 ml isobutylalkohol. Ved fortsat køling og omrøring udkrystalliseredes reaktionsprodukter, p-nitrobenzyl-7-amino-5-chlor-3-cephem-4-carboxylat, hydrochlorid, fra reaktionsblandingen. Produktet frafiltreredes, vaskedes med koldt methylenchlorid og tørredes til opnåelse af 200 mg af det krystallinske produkt, der smeltede under dekomponering ved ca. 168° C.

Grundstof-analyse for C^H^CIN^O^S.HCI: teoretisk: C 41,39 - H 3,20 - N 10,34 - Cl 1,7,45.

fundet: C 41,14 - H 3,34 - N 10,44 - Cl 17,29.

I.R. (Nujol Mull): viste absorptionsbånd ved 5,55 (β-lactamearbonyl) og 5,78 (estercarbonyl) mu.

U.V. (pH 7 buffer): viste absorptionsmaximum λ max 268 mu (£=13.800).

N.M.R. (DMSO dg):

Signaler ved 5,97 (s, 2H, C2-H2), 4,8 - 4,5 (m, 4H, Cg-H, Ογ-H og ester-CH2) og 2,35 - 1,6 (1, 4H, aromatisk H) tau.

Eksempel_14

IlSSiH2z2l£^i2iz5~cephem-4“earbox2;lsyre

Til en opløsning af 750 mg {1,85 mmol) p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat, hydrochlorid i 20 ml tefrahydrofuran og 40 ml methanol sattes en suspension af 750 mg præreduceret 5 i° palladium-på-carbon katalysator i 20 ml ethanol, og suspensionen hydrogeneredes under et tryk på 50 psi (ca, 3.,5 kg/cm2) ved stuetemperatur i 45 minutter. Katalysatoren filtreredes fra- og vaskedes med tetrahydrofuran og vand. Filtratet og vaskevandet

32 DK 153157B

kombineredes og inddampedes til tørhed. Remanensen opløstes i en vand-ethylacetatblanding, og pH-værdien indstilledes til 3. Det uopløselige produkt filtreredes fra og behandledes med acetone. Produktet tørredes til opnåelse af 115 mg 7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre.

I.R. (Mull):

Absorptionstoppe ved 5,61 (β-lactamcarbonyl) og 6,2 (carboxylsyre).

N.M.R. (D20-NaH003);

Signaler ved 6,25 (ABq., 2H, Og-Hg), 4,88 (d, 1H, Og-H) og 4,54 (d, 1H, C7-H) tau.

U.V. (pH 7 buffer):

Absorptionsmaximum ved λ max 265 mu, e=7550.

Piphgnylmethyl-7-amino~5-ghlor-5-cepliem-4-carboxylat

Til en opløsning af 525 mg diphenylmethyl-7-[2-(thienyl)acet-amido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat i 20 ml methylenchlorid sattes 0,1 ml tør pyridin og 237 mg phosphorpentachlorid. Reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer ved stuetemperatur og afkøledes dernæst i et is-vandbad. Den kolde blanding tilsattes 0,6 ml isobutanoljOg efter 30 minutter inddampedes reaktionsblandingen. Remanensen opløstes i ethylacetat, og opløsningen vaskedes med 5 io natriumbicarbonat og med vand, hvorefter den tørredes. Den tørrede opløsning inddampedes til tørhed, og remanensen behandledes med ether til opnåelse af 190 mg 3-chlor-kemeesteren, diphenyl-methyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat.

I.R. (Mull):

Absorptionstoppe ved 5,7 og 5,9 (β-lactam og estercarbonyl) mu.

33 DK 153157 B

N.M.R. (0Γ013):

Signaler ved 6,35 (ΑΒα, 2H, Cg-Hg), 4.78 (2d, 2H, Gg-H og Ογ-Η), 3,05 (s, 1H, ester-CH) og 2,65 (s, 10H, aromatisk H).

Eksempel 16

Ved at følge reaktionen til fraspaltning af 7-acyl-sidekæden beskrevet i eksempel 13 fremstilledes diphenylmethyl-7-amino-3-brom-3-cephem-4-carboxylat ud fra diphenylmethyl-7-phenoxyacetamido- 3- brom-3-cephem-4-carboxylat.

Eksempel 17 7- (D-a-phenylgl^cyl^ido) -3-ciilor-5-cepliem-4-garbo^ylsyre

Til en suspension af 280 mg (1,2 mmol) 7-amino-3-chlor-3-cephem- 4- carboxylsyxe i 14 ml acetonitril sattes under omrøring ved stuetemperatur 0,5 ml N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid til dannelse af det opløselige disilylmethylderivat. Opløsningen afkøledes til 0° C, og der tilsattes langsomt en opløsning af det blandede anhydrid dannet ved reaktion mellem 408 mg (1,5 mmol) af natriumsaltet af methyl-3-a-carboxybenzylaminocrotonat og 161 mg (1,7 mmol) methylchlorformiat i nærværelse af 2 dråber dimethylbenzylamin i 7 ml acetonitril. Blandingen omrørtes i et isbad i 2 timer, og der sattes 1 ml methanol til blandingen, der dernæst filtreredes for at fjerne uopløselige urenheder. Der sattes 2 ml vand til filtratet, og pH-værdien indstilledes i første omgang til 1,5 for at udvirke fjernelse af enamin-blokeringen og dernæst til 4,5 med triethylamin. Efter omrøring i yderligere 1 time ved isbadtemperatur udfældede reaktionsproduktet, 7-(D-a-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre (zwdtterion) fra reaktionsblandingen som et krystallinsk fast stof.. Produktet filtreredes fra, vaskedes med acetonitril og tørredes i vakuum til opnåelse af et udbytte på 200 mg.

34 DK 153157 B

Produktet havde følgende fysiske egenskaber;

Grundstof-analyse for C^H^N^O^SOl· 1/2 H20: teoretisk; O 47,80 - H 4,01 - N 11,15 - Cl 9,40.

fundet; C 47,55 - H 4,12 - N 10,98 - 01 9,21.

I.R.-spektrum (Mull);

Absorptionstoppe ved 2,9 (amid NH), 5,70 (β-lactarnearbony1), 5,95 (amidcarbonyl) og 6,28 (carboxylat) mp.

NMR-spektrum (D20/I)C1);

Signaler ved 6,5 - 6,7 (ABq, 2H, 02-H2).

4,84 (d, 1H, Og-H), 4,26 (d, 1H, Cy-H) og 2,44 (s, 5H, aromatisk H) tau.

U.V.-spektrum (pH buffer); λ max 265 mp (e=6.800).

Eksempel_18 I il en opløsning af 500 mg (1,85 mmol) af natriumsaltet af methyl-3-a-carboxybenzylaminocrotonat (dannet med phenylglycin og methyl-acetoacetat) i 20 ml acetonitril sattes 4 dråber dimethylbenzyl-amin, og opløsningen afkøledes i et tøris-carbontetrachlorid-bad under omrøring. Til den kolde opløsning sattes langsomt 184 mg (195 mmol) methylchlorformiat til dannelse af det blandede anhydrid. Efter 20 minutter tilsattes en på forhånd afkølet opløsning af 750 mg (1,85 mmol) p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat og 188 mg (1,85 mmol) triethylamin i 40 ml acetone. Tilsætningen forløb over 3 minutter, hvorefter reaktionsblandingen omrørte s i kulden i 30 minutter og dernæst ved stuetemperatur i 2 timer. Reaktionsblandingen filtreredes for at fjerne uopløselige urenheder og inddampedes i vakuum. Reaktionsproduktet opløstes i en blanding af ethylacetat og vand, og opløsningens pH indstilledes til 7. Den organiske fase separe-

35 DK 153157 B

redes fra og vaskedes med vand. Efter tørring over magnesium-sulfat koncentreredes den organiske fase under vakuum til et lille volumen. Efter tilsætning af n-hexan til koncentratet udfældede 620 mg p-nitrobenzyl-7“[N-(l~carbomethoxy-2-propenyl)-D-a-ph.enylglycylamido] -3-dilor-3-cep]iem-4-carTDoxylat .‘fra reak-tionshlandingen.

Produktet gav følgende grundstof-analyse og NMR-spektrum: G-rundstof-analyse for C^H^U^OgSCl: teoretisk: C 53,87 - H 4,35 - N 9,31.

fundet: C 54,05 - H 4,13 - N 9,36.

NMR (EMSO dg):

Signaler ved 8,20 (s, 3H, enamin CH^), 6,60 (ABq, 2H, C2-H2), 6,45 (s, 3H, ester-CH^), 5,48 (s, 1H, enamin-viny1-H), 4,90 - 4,1 (m, 5H, Cg-H, C^-H, α-CH og ester-CH2) og 3,10 - 1,5 (m, 9H, aromatisk H) tau.

540 mg (0,9 mmol) af produktet opløstes i 40 ml acetonitril indeholdende 20 ml vand, og opløsningen blev først afkølet i isvand og dernæst gjort sur til pH 1,5, hvorefter pH indstilledes til 2,5. Blandingen inddampedes, og remanensen opløstes i 40 ml tetrahydrofuran og 80 ml methanol.

Til opløsningen sattes 540 mg 5 % palladium-på-carbon .katalysator (præreduceret i 20 ml ethanol i 45 minutter under et hydrogentryk „ 2 pa ca. 3,5 kg/cm ved stuetemperatur), og opløsningen-hydrogeneredes ved stuetemperatur i 2,5 timer under et hydrogentryk på 50 psi (ca.

2 3,5 kg/cm ). Katalysatoren filtreredes fra og vaskedes på filteret med methanol, tetrahydrofuran og vand. Filtratet og vaskevandet kombineredes og inddampedes til tørhed i vakuum. Reaktionsproduktet opløstes i en blanding af vand og ethylacetat, og pH i opløsningen indstilledes til 4,5. Den vandige fase separeredes fra, vaskedes med ethylacetat og inddampedes til et lille volumen på ca. 2 ml. Ved afkøling udfældede 65 mg af produktet, 7-(D-a-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, som et krystallinsk fast stof fra det kolde

36 DK 153157 B

koncentrat.

Eksem-gel_19 fil en suspension af 3,0 g (8,1 mmol) p-nitrobenzyl-7-amno-3-chlor-3-ceph.em-4-*carboxylat i 200 ml tetrahydrofuran (tørret med molekylsi) sattes 2,1 g (8,3 mmol) N-(t-butyloxycarbonyl)-D-a-pbenylglycin og 2,0 g (8,3 mmol) N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy- 1,2-dihydroguinolin (EEDQ). Reaktionsblandingen omrørtes natten over ved stuetemperatur, og opløsningsmidlet afdampedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i en blanding af etbylacetat og vand, og den organiske fase frasepareredes. Denne fase afkøledes og vaskedes successivt med en kold 5 i° vandig opløsning af natriumbicarbonat, kold 5 % saltsyre og vand. Den vaskede opløsning tørredes over magnesiumsulfat, filtreredes og koncentreredes ved inddampning under reduceret tryk til et volumen på ca. 50 ml. Fra koncentratet opnåedes 3,7 g (83 % udbytte) af reaktionsproduktet, p-nitrobenzyl-7-[D-2-(t-butyloxy-carbamido)-2-phenylacetamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat, som et krystallinsk produkt. Et andet udbytte af produktet på i alt 2 gram opnåedes ved yderligere at koncentrere filtratet.

Grundstof-analyse beregnet for ^yHgyCIN^OgS: teoretisk: C 53,78 - H 4,51 - N9,29.

fundet: C 52,66 - H 4,36 - N 8,88.

U.Y. (acetonitril) viste et maximum ved 268 ιημ (£=17.100).

I.R.:

Ami-d NH absorptionstop ved 3,05 ιημ og carbonylabsorptionstop ved 5,59, 5,75 og 6,0 ιημ.

NMR (CDC13):

Signaler ved 8,60 (s, 9H, t-BOC), 6,45 (ABcl, 2H, C2-H2), 5,03 (d, 1H, C6-H), 4,67 (s, 3H, α-CH og ester-CH2), 4,12 (m, 3H, Cy-H og amid NH) og 2,72 - 1,74 (m, 10H, aromatisk H og amid NH) tau.

37 DK 153157 B

Til en opløsning af 3,0 g (5,0 mmol) af produktet i 15 ml tør tetra-hydrofuran tørret med molekylsi og 185 ml methanol sattes 3 g præ-reduceret 5 procent palladiua-på-carbon. Katalysatoren præreducere-des i ethanol i 30 minutter ved stuetemperatur under et hydrogentryk på 50 psi (ca. 3,5 kg/cm ). Efter tilsætning af den præreducerede katalysator hydrogeneredes produktet ved stuetemperatur 1 time under et hydrogentryk på 50 psi (ca- 3,5 kg/cm ). Katalysatoren filtreredes fra og vaskedes på filteret med tetrahydrofuran og methanol. Filtratet og vaskevandet kombineredes og inddampedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i ethylacetat, og der tilsattes vand. Blandingens pH-værdi indstilledes til 7 ved tilsætning af :1N natriumhydroxid. Den vandige fase separeredes og vaskedes med ethylacetat. Den vandige fase behandledes dernæst med ethylacetat og filtreredes til pH 2,5 med IN saltsyre. Den organiske fase separeredes fra den vandige fase, vaskedes med vand og tørredes over magnesiumsulfat. Den tørrede organiske fase inddampedes under reduceret tryk til tørhed, hvorved der opnåedes et reduktie^sprodukt, 7-(D-2-(t-butyloxycarbamido-2-phenylacetamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, som et tørt fast stof. Produktet krystalliseredes fra 70 ml ether indeholdende 20 ml petroleumsether til opnåelse af 1,75 g (75 %) krystallinsk produkt.

Grundstof-analyse beregnet for C20H22C1N3°6S: teoretisk: C 51,34 - H 4,74 - N 8,98 - Cl 7,58.

fundet: C 51,02 - H 4,96 - N 8,75 - Cl 7,30.

U.V. (acetonitril) maximum ved 268 mp (£=7400).

KMR (CDClc): Signaler ved 8,55 (s, 9H, t-BOC), 6,48 (ABq, 2H, C2-H2), 5,0 (d, IH, Cg-H), 4,63 (d, IH, cc-CH), 4,25 (q, IH, C?-H), 3,90 (d, IH, amid NH), 2,59 (s, 5H, aromatisk H) tau.

Til en opløsning af 420 mg (2,2 mmol) p-toluensulfonsyre i 5 ml acetonitril sattes 468 mg (1 mmol) krystallinsk hydrogeneringsprodukt. Opløsningen henstod ved stuetemperatur i 16 timer og fortyn-

38 DK 153157 B

4,8, hvorefter 320 mg (87 %) af det krystallinske produkt, 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, udfældede fra opløsningen. Produktet opsamledes ved filtrering og tørredes.

Grundstof-analyse beregnet for C15Hi4C1N304S.1/2 H20: teoretisk: C 47,80 - H 4,01 - N 11,15 - Cl 9,40.

fundet: C 48,04 - H 3,82 - N 11,18 - Cl 9,70.

Eksempel_20

Den antibiotiske forbindelse 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre fremstilledes ud fra p-nitrobenzyl-7-(D-2-(t-butyloxycarbamido)-2-phenylacetamido)-3-chlor-3-cephem-4-carb-oxylat ved en deblokeringsmetode alternativ til den i det foregående eksempel beskrevne. Ved denne metode fjernes den aminobeskyt-tende t-butyloxycarbonyl-gruppe først, og derefter fraspaltedes p-nitro-benzylestergruppen med zink og saltsyre i dimethylformamid. Denne alternative fremstilling er beskrevet i de følgende afsnit.

Til en opløsning af 2,4 g (12,6 mmol) p-toluensulfonsyre i 60 ml acetonitril sattes 3,6 g (6 mmol) p-nitrobenzyl-7-(D-2-(t-butyloxycarbamido )-2-phenylacetamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 15 timer, hvorunder det aminodeblokerede produkt, p-nitrobenzyl-7-(D-phenylgly-cylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat, dannedes som et krystallinsk bundfald i form af p-toluensulfonsyresaltet.

Produktet frafiltreredes, vaskedes med acetonitril og vakuumtørre des. Udbytte 3,1 g ( 81 96).

Grundstof-analyse for C2^H2yClN40gS2: teoretisk: C 51,58 - H 4,06 - N 8,29 - Cl 5,25.

fundet: C 51,51 - H 4,14 - N 8,12 - Cl 5,60.

IR-spektrum (chloroform):

Carbonylabsorptionstoppe ved 5,61, 5,80 og 5,95. Tosylatsaltabsorptionstop ved 6,29 mp.

39 DK 153157B

NMR-spektrum (DMSO dg):

Signaler ved 7,70 (s, 3H, p-toluensulfonsyre-salt-CH^), 6,61 (s, 3H, sidekæde NH^), 6,20 (ABq, 2H, C2~H2), 4,51 (s, 2H, ester CH2), 4,08 (q, IH, C?-H), 2,95 - 1,62 (m, 14H, aromatisk hydrogen og amid NH), 0,32 (d, IH, amid NH).

Det aminodeblokerede p-toluensulfonsyresalt, der opnåedes som beskrevet ovenfor, deesterificeredes til opnåelse af følgende antibiotiske forbindelse: En opløsning af 1,5 g (2,2 mmol) af p-tolu- ensulfonsyresaltet i 10 ml tørt dimethylformamid (tørret med mole-kylsi) afkøledes i et is-alkoholbad. Den kolde opløsning tilsattes 2 ml koncentreret saltsyre. 400 mg (6,1 mmol) zinkstøv sattes til den kolde opløsning i løbet af 15 minutter. Reaktionsblandingen omrørtes i kulden i 30 minutter og opvarmedes dernæst ved stuetemperatur under stadig omrøring.

Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time og filtreredes dernæst. Filtratets pH-værdi indstilledes til 6,8 med tri-ethylamin. Produktet, 7-(D-phenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre som bis-dimethylformamidsolvatet af den amfotere ion, dannedes som et hvidt krystallinsk bundfald. Produktet frafiltrere-des, vaskedes med 10 ml koldt dimethylformamid og dernæst med 6 ml diethylether. Det vaskede produkt vakuumtørredes til opnåelse af et udbytte på 800 mg (71 %).

Grundstof-analyse for C^H^ClN^OgS.2DMF: teoretisk: C 49,07 - H 5,49 - N 14,63 - Cl 6,90.

fundet: C 48,84 - H 5,53 - N 13,48 - Cl 7,18.

U.V. spektrum (acetonitril): maximum ved 265 πιμ (£=6.000).

Elektrometrisk titrering (66 % vandig DMF): pKa ved 4,55 og 7,2.

40 DK 153157 B

MR-spektrum (D20/DC1):

Signaler ved 6,34 (2s, 6H, DMF-CH3), 6.33 (ABq, 2H, C2-H2), 4,85 (d, IH, Cg-H), 4,64 (s, IH, a-CH), 4,27 (d, IH, C7-H), 2,41 (s, 5H, aromatisk H) og 1,84 (s, 2H, DMF-CH) tau.

Eksempel_21

ZiiDl2z4ydrox^henYlglYCYlamido)=322^l2rr3i2§Bhem-4-carboxYlsYre 2,9 g (11 mmol) N-(t-butyloxycarbonyl) -D-3-hydroxyphenylglycin omsattes med 3»7 g (10 mmol) p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-ce-phem-4-carboxylat og 2,6 g (10,5 mmol) af koblingsreagenset EEDQ. Produktet isoleredes ved at følge metoden beskrevet i eksempel 18. Produktet opnåedes som et amorft fast stof efter behandling med ether i et udbytte på 2,8 g (46 %).

Grundstof-analyse for C27H27C*N409S: teoretisk: C 52,39 - H 4,40 - N 9>05.

fundet: C 52,16 - H 4,59 - N 8,79.

U.V. spektrum (acetonitril): maximum ved 270 πμ (£=17.200).

MR-spektrum (CDCl^) :

Signaler ved 8,59 (s, 9H, t-BOC), 6,50 (ABq, 2H, C2-H2) 5,06 (d, IH, Cg-H), 4,66 (s, IH, a-CH), 4,09 (m, 2H, C?-H), 3.34 - 1,70 (m, 9H, aromatisk H og amid NH) tau.

41 DK 153157 B

3,5 g (5,6 mmol) af produktet, p-nitrobenzyl-7-(D-2-(.t-butyloxy-carbamido)-2- (3-hydroxy)phenylacetamido)-3-chlor-3-cephem-4-carb-oxylat, hydrogeneredes i ethanol i nærværelse af præreduceret 5 % palladium-på-carbon ved at følge deesterificeringsmetoden beskrevet i eksempel 18. Produktet, 7-(D-2-(t-butyloxycarbamido) - 2-(3~hydroxy)phenylacetamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, opnåedes krystallinsk ved behandling af det amorfe stof med en opløsning af hexan i diethylether. Udbytte 1,5 g (55 %)· U.V. spektrum (acetonitril: maximum ved 272 mp (£=8.280).

Elektrometrisk titrering (66 % vandig DMF): pKa på 4,5.

1,3 g (2,7 mmol) af ovennævnte produkt omsattes med 1,1 g (5,9 mmol) p-toluensulfonsyre i 28 ml acetonitril for at fjerne den tert.-butyloxycarbonylbeskyttende gruppe. Metoden udførtes som beskrevet i eksempel 18.

Produktet, 7-(D-3-hydooxyphenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre, krystalliseredes fra reaktionsblandingen, filtreredes fra og vakuumtørredes. Udbytte 700 mg (64 %).

Grundstof-analyse for C15H14C1N3°5S*1H20: teoretisk: C 44,83 - H 4,01 - N 10,46.

fundet: C 45,12 - H 4,06 - N 10,31.

Ultraviolet absorptionsspektrum (pH buffer): maximum ved 268 mp (£=9.750).

NMR-spektrum (D20/DC1):

Signaler ved 6,31 (ÅBq, 2H, C2-H2), 4,81 (d, IH, Cg-H), 4,52 (s, IH, a-CH), 4,26 (d, IH, Cy-H) og 3,1 - 2,5 (m, 4H, aromatisk H)tau.

42 DK 153157 B

Eksempel_22

Ved at følge metoden beskrevet i eksempel 18 acyleredes 850 mg (2,3 mmol) p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat med 700 mg (2,5 mmol) N-t-butyloxycarbonyl-D-4-chlorphenylglycin og 567 mg (2,3 mmol) EEDQ til opnåelse af 1,2 g p-nitrobenzyl-7-(D- 2-(t-butyloxycarbamido)-2-(4-chlorphenylacetamido)-3-chlor-3-ce-phem-4-carboxy1at.

1,2 g (1,9 mmol) af produktet hydrogeneredes ved stuetemperatur i nærværelse af præreduceret 5 % palladium-på-carbon for at fjerne p-nitrobenzylestergruppen og til frembringelse af 450 mg 7-(D-2-(t-butyloxycarbamido)-2-(4-chlorphenylacetamido))-3-chlor-3-cephem~ 4-carboxylsyre som et krystallinsk produkt. Produktet opnåedes i krystallinsk form ved at behandle den amorfe remanens med diethylether.

Grundst of-analyse for ^20^21^2^3^6^1 teoretisk: C 47,82 - H 4,21 - N 8,36 - Cl 14,11.

fundet: C 47,75 - H 4,43 - N 8,11 - Cl 14,15.

Elektrometrisk titrering (66 % vandig DMF): pKa ved 4,4; tilsyneladende molekylvægt = 508; beregnet MW = 502.

450 mg (0,9 mmol) af deesterificeringsproduktet omsattes med p-toluensulfonsyren i acetonitril ved at følge metoden beskrevet i de tidligere eksempler for at fjerne den beskyttende tert.-butyl-oxycarbonyl-gruppe og til opnåelse af 160 mg (44 %) af det krystallinske 7- (D-4-chlorphenylglycylamido) -3-chlor-3-cephem-4-carboxyl-syre i form af den amf ot er e ion.

Grundstof-analyse for C-^H-^C^N^O^S. lH^O: teoretisk: C 42,86 - H 3,59 - N 9,99 - Cl 16,87.

fundet: C 43,07 - H 3,63 - N 9,69 - Cl 16,75.

U.V. spektrum (pH buffer): maxima ved 265 ωμ (2=8.100) og 2,25 mp (6=13.900).

DK 153157B

Elektrometrisk titrering (66 % vandig DMF): pKa = 4,15 og 6,8; tilsyneladende molvægt = 407, beregnet molvægt = 403.

Eksempel_23 7;(D-4-hydro^ghenylglycylamido)-3ichlor-3-cephem-42carboxylsyre N-(t-butyloxycarbonyl)-D-4-hydroxyphenylglycin (2,9 g, 11 mmol) omsattes med 3,7 g (10 mmol) p-nitrobenzyl-7-amino-3-chlor-3-cephem- 4-carboxylat og 2,6 g (10,5 mmol) af koblingsreagenset EEDQ i tør tetrahydrofuran. Produktet isoleredes ved at følge metoden beskrevet i eksempel 22. Produktet, i alt 3,7 g (60 %) udbytte), opnåedes i krystallinsk form fra koldt diethylether.

Produktet, p-nitrobenzyl-7(D-2-(t-butyloxycarbamido)-2-(4-hydroxy)-phenylacetamido)-3-cblor-3-cepbem-4-carboxylat gav følgende procentvise grundstof-analyse og NMR-spektrum:

Grundstof-analyse for C^H^N^OgSCl: teoretisk: C 52,39 - H 4,40 - H 9,05.

fundet: C 52,12 - H 4,26 - N 8,91.

NMR-spektrum (DMSO dg):

Signaler ved 8,62 (s, 9H, t-BOC-CH^), 6,16 (ABq, 2H, C2-H2), 4,81 (d, IH, C6-H), 4,75 (d, IH, a-CH), 4,53 (s, 2H, ester-CH2), 4,18 (q, IH, C?-H), 7,04 og 2,0 (2q, 8H, aromatisk H), 0,76 (d, IH, C?-NH) og 0,58 (s, IH, p-OH), tau.

2,2 g (3,5 mmol) af produktet hydrogeneredes i ethanol i nærværelse af præreduceret 5 % palladium-på-carbon katalysator for at udvirke fjernelse af p-nitrobenzylgruppen. Det deesterificerede. produkt, 7-(D-2-(t-butyl-oxycarbamido)-2-(4-hydroxy)phenyl-acetamido)-3-chlor-^-cenham-h-nar’bnyv! svrs. ormåedes i krvstallinsk form fra en bian-

44 DK 153157 B

ding af diethylether og hexan. Der opnåedes 1 gram af produktet svarende til et udbytte på 59 %.

Grundstof-analyse for ^20^22^^3^7^ teoretisk: C 49,64 - H 4,58 - N 8,08.

fundet: C 48,92 - H 4,40 - N 8,24.

NMR-spektrum (DMSO dg):

Signaler ved: 8,61 (s, 9H, t-BOC-CKj), 6.26 (ABq, 2H, C2H2), 4,89 (d, IH, Cg-H), 4.78 (d, IH, a-CH), 4,28 (q, IH, C?-H), 3,06 (q, 4H, aromatisk-H) og 1,20 (d, IH, C?-NH) tau.

Den beskyttende tert-30C-gruppe fjernedes fra deesterificerings-produktet ved at omsætte dette i acetonitril med p-toluensulfon-syre. Fra 1 g af produktet opnåedes 330 mg (40 %) af slutproduktet, 7-(D-4-hydroxyphenylglycylamido)-3-chlor-3-cephem-4-carboxylsyre med følgende grundstof-analyse og NMR-spektrum:

Grundstof-analyse beregnet for C15Hl4C1N3°5S*1H20i teoretisk: C 44,83 - H 4,01 - N 10,46.

fundet: C 44,92 - H 3,45 - N 10,63.

Elektrometrisk titrering i 66 % vandig DMG gav v dier på 4,2, 7,7 og 12,4. Den tilsyneladende molvægt = 384; den beregnede molvægt = 383,8.

NMR-spektrum (D20/DC1) viste signaler ved 6,32 (ABq, 2H, C2-H2), 4,84 (d, IH, Cg-H), 4.27 (d, IH, C7-H) og 2.79 (q, 4H, aromatisk-H) tau.

45 DK 153157B

Eksemgel_24 A. p-Nitrobenzyl-7-[N-(t-butyloxycarbonyl)-oc-D-(2-thienyl)-glycyiamido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat.

N-t-butyloxycarbonyl-2-thienyl-D-glycin (3,2 g, 12,5 mM) opløstes i 300 ml tørt tetrahydrofuran. Der tilsættes p-nitrobenzyl-7-amino- 3-chlor-3-cephem-4-carboxylat (4,6 g, 12,5 mM) og EEDQ (3,4 g, 13,8 mM), og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur natten over. Opløsningsmidlet blev fjernet i vacuum, og remanensen opløst i ethylacetat. Ethylacetatopløsningen blev vasket med syre og base og inddampet til tørhed. Produktet krystalliserede ved udrivning med ether.

Udbytte 5,7 g (78%) I.R. (CHC13)

Carbonylbånd ved 5,59 pm (β-lactam), 5,72 pm (ester), 5,89 pm (bred) og 6,55 pm (amid) U.V. (MeCN) X max = 269 nm, £ =17 769

Analyse for 025^5^0^8201: beregnet: C 50,63; - H 4,25 - N 9,45 - Cl 5,98 fundet : C 50,42 - H.4,39 - N 9,22 - Cl 6,10.

B. 7- [N- (t-butyloxycarbonyl) -oc-D- (2-thienyl) -glycyiamido ]-3-chlor-3-cephem*-4-carboxylsyre.

p-Nitrobenzyl-7- [N-(t-butyloxycarbonyl) - oc-D- (2-thienyl) -glycyl-amido]-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat (6,0 g, 10,2 mM) blev hydrogenolyseret ved konventionelle metoder under anvendelse af en lige så stor vægtmængde forreduceret palladium-på-kul. Pro-

DK 153157 B

duktet krystalliserede ved udrivning med en blanding af ether og hexan i volumenforholdet 1:1.

Udbytte 2,9 g (64%) U.V. (MeCN) X max = 270 nm = 7500

Analyse for O-j^E^qN^O^^CI *1/2 mol ether beregnet: C 47,01 - H 4,93 - N 8,22 - Cl 6,94 fundet : C 46,58 - H 4,85 - N 8,19 - Cl 7,13- C. 7-D-2-thienylglycylamido-3“Chlor-3-cephem-4-carboxylsyre 7- [N- (t-butyloxycarbonyl) -oc-D- (2-thienyl)-glycylamido ]-3-chlor- 3-cephem-4-carboxylsyre (2,7 g, 5,3 mM) opløstes i 150 ml aceto-nitril og behandledes med p-toluensulfonsyre (2,2 g, 11,5 mM). Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur natten over, fortyndet med 15 ml vand, og pH-værdien indstillet til 5,7 med koncentreret ammoniumhydrogencarbonatopløsning. Produktet udfældedes i krystal-form.

Udbytte 1,7 g (86%).

I.R. (Nuøol-suspension)

Carbonylbånd ved 5,65 jum (β-lactam) og 5,91 pm (amid) U.V. (pH 6 puffer) Ά max = 265 nm, 8 = 9800

Analyse for C-^H-j^N^O^S^CI j beregnet: C 41,77 - H 3,24 - N 11,24 - Cl 9,48 fundet : C 42,01 - H 3,02 - N 11,24 - Cl 9,34.

47 DK 153157 B

Eksemgel_25 p-Nitrobenzyl-7-ohenylglycylamido-3-chlor-3-cephem-4-carboxylat p-Nitrobenzyl-7-[N-(t-butyloxycarbonyl)-D-a-phenylglycylamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat (3,9 g, 6,7 mM) opløstes i 40 ml tørt dimethylformamid. Der tilsattes phosphortrichlorid (7 ml, 7 mM), og reaktionsblandingen blev omrørt i 3 timer ved stuetemperatur. Den hældtes derpå ud i en blanding af ethylacetat og vand. Ethylacetatlaget blev skilt fra, vasket flere gange med vand, tørret over magnesiumsulfat og inddampet til tørhed i vacuum.

%

Udbytte 1,95 g (58%)

Analyse for C22H19N4°6SC1 beregnet: C 52,54 - H 3,81 - N 11,14 - Cl 7,05 fundet: C 52,52 - H 4,29 - N 10,73 - Cl 7,55*

Eksempel_26 p-Nitrobenzyl-7-(D-a-phenylglycylamido)-3-brom-3-cephem-4-carboxylat p-Nitrobenzyl-7-[N-(t-butyloxycarbonyl)-D-a-phenylglycylamido]-3-hydroxy-3-cephem-4-carboxylat (2,3 g, 4 mM) blev opløst i 25 ml dimethylformamid og behandlet med 3 ml phosphorpentabromid. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur natten over. Tyndtlagschro-matografi over silicagel, udviklet med ethylacetat/benzen 7:3, viste næsten fuldstændig omsætning af udgangsmaterialet til produktet. Reaktionsblandingen blev dispergeret i vand/ethylacetat.

Det organiske lag blev skilt fra, vasket med saltvand, tørret over magnesiumsulfat og inddampet til tørhed i vacuum. Den amorfe remanens blev chromatograferet over silicagel til opnåelse af det ovennævnte produkt.

N.M.R. (CDCl-j): 6,24 (Abq, 2H, C2-H2), 4,80 (d, IH, C6-H),

Claims (1)

1. 49 DK 153157 B 2 hvor R har den ovennævnte betydning, og R er t-butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, trichlorethoxycarbonyl eller trityl, eller enaminer dannet med methylacetoacetat og acetylacetone eller et anhydrid, et syrehalogenid eller en aktiv ester deraf, hvorefter den carboxylsyrebeskyttende, esterdannende gruppe eller den amino-beskyttende gruppe fjernes til opnåelse af den tilsvarende 7-(α-amino)acylamido-3-halogen-3-cephem-4-carboxyl-syre, som om ønsket overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt.