DK150204B

DK150204B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af dipeptidyl-agmatiner eller deres hydrochlorider

Info

Publication number: DK150204B
Application number: DK23981A
Authority: DK
Inventors: Sandor Bajusz; Erzsebet Szell; Eva Barabas; Daniel Bagdy; Zsuzsanna Mohai
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1979-06-12
Filing date: 1981-01-20
Publication date: 1987-01-05
Also published as: IT8120107A0; SE452326B; NL8100391A; CH649561A5; FR2491463B1; CA1158641A; DK23981A; SU1178322A3; ATA43681A; AU535688B2; DE3108810A1; SE8100302L; US4346078A; IL62018A; GB2085444A; BE887224A; FR2491463A1; AT384228B; GB2085444B; AU6672581A

Description

i 150204 o

Den foreliggende opfindelse angår en analogi-fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte dipep-tidyl-agmatiner eller deres hydrochlorider med den almene formel I, 5 X-Pro-Agm, (HCl)n (I) hvori X betyder en a-aminosyrerest af D-konfiguration med en sidekæde valgt blandt phenyl, phenyl-(C2_2-alkyl) el-10 ler phenyl-(heteroatomholdigt C2~alkyl),

Pro betyder en L-prolinrest, ifølge litteraturen (dvs.

Biochem. J. 126, 773 (1972)),

Agm står for en agmatingruppe, og n betyder 0, 1 eller 2.

15 Det er kendt, at de simple acylderivater af agma- tin (l-amino-4-guanidino-butan), som f.eks. tosyl-agmatin (1-(p-toluen-sulfonylamido)-4-guanidino-butan) har evnen til at undertrykke de proteolytiske reaktioner af både trypsin og thrombin (Lorand og Rule: Nature, 190, 722 20 (1961) ; Rule og Lorand: Biochim. Biophys. Acta, 81, 130 (1964)).

Ifølge de ovennævnte forfattere forsinker tosyl--agmatin størkningen af blodplasma og formodes også at undertrykke fibrinogenthrombin-reaktionen. I egne eksperimen-

QC

ter er fibrinogenthrombin-reaktionen imidlertid påvirket af tosyl-agmatin i en ubetydelig grad: der kræves 0,7 mg tosyl-agmatin for at fordoble (fra 15 til 30 sekunder) thrombin-tiden af 1 ml af en opløsning indeholdende 1,25 mg fibrinogen og 1,25 NIH-enheder thrombin (standardenhe-30 der ifølge National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA, jfr. Method of Enzymology, bind XLV, Proteolytic Enzymes, del B, Academic Press, New York - San Franci sco - London (1976), især side 156, "Minimum Requirements of Dried Thrombin").

35 Det er formålet med den foreliggende opfindelse at fremstille hidtil ukendte agmatinderivater, der udviser forøget antikoagulantaktivitet.

150204 2

O

Det har vist sig, at hidtil ukendte dipeptidyl--agmatinderivater med den almene formel I, hvori X, Pro,

Agm og n er som defineret ovenfor, udviser signifikant antikoagulantstyrke. Det er især gunstigt, hvis sidekæden 5 på den N-endestillede D-a-aminosyredel af dipeptidyl-agmati-net er eh phenyl-(Cj^-alkyl)-gruppe. Således har D-phenyl-alanyl-L-prolin-agmatin en særdeles høj aktivitet.

Tabel I viser virkningen af de hidtil ukendte agmatinderivater med den almene formel I fremstillet ifølge 10 opfindelsen og af det kendte tosyl-agmatin på fibrinogen-thrombin-reaktionen. Stoffernes styrke er defineret ved den mængde af forbindelsen, der kræves for at fordoble fibrinogens thrombintid. Endvidere er også angivet den relative styrke af de hidtil ukendte agmatinderivater i 15 sammenligning med tosyl-agmatin (aktiviteten af den sidstnævnte droge er sat til 1).

Styrken af forbindelserne er afprøvet i det følgende system: 0,2 ml af 0,5%'s oksefibrinogen i 0,9%'s NaCl-opløsning, 20 0,1 ml af en tris-(hydroxymethyl)-methylamin-hydrochlorid--pufferopløsning (pH-værdi = 7,4) indeholdende agmatinderi-vatet, og 0,1 ml US Standard Human Thrombin 5 NIH enheder/ml.

Thrombintiden for systemet, som er frit for 25 agmatinderivat, er 15 sekunder.

0 3 150204

Tabel I

Mængde af agmatinderivat, der kræves for at fordoble fibrinogens thrombintid.

5 x)

Derivat ;ug/reaktions- Relativ 'blanding aktivitet H-D-Phg-Pro-Agm 1,4 200 10 H-D-Ser(Bzl)-Pro-Agm 0,7 400 H-D-Phe-Pro-Agm 0,12 2333

Tosyl-agmatin 280 1 15 x) De forkortelser, der anvendes for aminosyrerester og peptidderivater i tabellen og i det følgende er i overensstemmelse med litteraturen (Biochem. J., 126, 773 (1972)), endvidere betyder Phg phenylglycin, Agm betyder agmatin, og Bzl, Z og Boc står for benzyl-, benzyloxycarbonyl- og tert.-20 -butyloxycarbonylgrupper. -D-Ser (Bzl)-gruppen betyder en O-benzyl-D-serin-rest.

Det har yderligere vist sig, at den antikoagulerende virkning af de hidtil ukendte dipeptidyl-agmatinderivater med den almene formel I forøges ved hjælp af gængs heparin, 25 der anvendes til terapeutiske formål, hvilket kan bekræftes ved både in vitro og in vivo eksperimenter.

Ved in vitro-forsøg iagttages virkningen af D-Phe-Pro- -Agm-2 HC1 (i den almene formel I står X for en D-phenyl- alanindel, og n = 2) og heparin i et isoleret system i en 30 fibrinogen-thrombin-reaktionsblanding (A) og i citrats-plasma fra mennesker (B): A: 0,2 ml 0,5%'s oksefibrinogen i 0,9%'s saltopløsning, 0,1 ml af en tris-(hydroxymethyl)-aoethylamin-hydrochlorid- -pufferopløsning (pH-værdi = 7,4) indeholdende agma-35 4 150204

O

tinderivatet og/eller heparin (132,2 E/mg U.S. Pharmacopoeia (U.S.P.) XVII), og 0,1 ml OS Standard Human Thrombin 10 NIH enheder/ml.

Thrombintiden for systemet, som er frit for inhi-5 bitor, er 15 sekunder.

B: 0,2 ml citratplasma fra mennesker 0,1 ml af en tris-(hydroxymethyl)-methylamin-hydro-chlorid-pufferopløsning (pH-værdi = 7,4) indeholdende agmatinderivatet og/eller heparin (132,2 E/mg U.S.P.

J.Q XVII) , og 0,1 ml US Standard Himan Thrombin 10 NIH enheder/ml. Thrombintiden for systemet, som er frit for inhibitor, er 15 sekunder.

Resultaterne er opsummeret i tabel II, som viser, 15 hvordan thrombintiden forlænges ved hver droge alene og ved en kombination af dem henholdsvis i system A og B, og som viser thrombintiden, beregnet på basis af de individuelle styrker (thrombintiden uden inhibitor er 1).

Den daglige dosis af forbindelserne med den almene 20 formel I andrager for voksne 50 til 100 mg/time, når den indgives i intravenøse infusioner i 6 til 12 timer/dag.

Den daglige dosis af forbindelserne med den almene formel I i kombination med heparin andrager for voksne 50-60 mg peptid sammen med 3500-4500 E heparin, når 25 den indgives 3 eller 4 gange om dagen.

150204 _ 5 e

S

o “ ® a s to M o o o in o o o (N m co o ft s ^ ^ s S ^ ^ ^ ^ ^ 4J fj id ffl b η m "i d m t' fi

<D -Η ·ο Η ni H

M Mg Φ (d > H Dj 0 0)

m M

5 -H + ffl s

Cn •H rij +1 10) C! O β VOOlOHinO N N O Ί ^ H M&> *·*»»·».*.». “ M pi i ΐΝΠΠ'3<'3<ιη <m ro in ro

id I M

Dl Φ Φ 1ft Φ Λ Λ

10 A A

Ή ~ Q

(d ffl

D

Φ M

tr> φ Q. X M m Ο Φ ti m _ H-l pj -H HinOHinO oocooo 15 H 0) (d ΗΗΓΗΗΗΟΙ ΗΜΓΟί-Πηΐ

Ug A

ffi Ό Φ

td Η K

cm M +) Φ

1 m C G

Hg -Η Φ

H cn Πί Λ H

Cg g >4 (d Η I in O g Φ O id Μ ' σ» λ μ h a e 20 <d A A -P I -

E-i I 4-> O

(D<d > m inininooo n n cn ^ A M -ha (i, 4j 4j i μ n m <f >j cMc-icsmcn 1 -H id Φ

Q ϋ H A

Φ A 4H H «1 nj a

Cn O

25 -S

G tn

X G

M G -H

•η -h *d moomoo inooino h

> MC OrHCNOHCN O r-H CN Ο H U

edid *.*.-»>«»» * * * * * ffi (D AH oooooo ooooo t! ^

G K in L

Φ G Ά MO Cn 30 φ »— η e

JU H >4 +> I

2 & X 0

tji Cn id M

id e Φ A

O lM oooooo ininmoo l ,¾ O HHHMCNM'OOOHH Φ •H Ml H ~ ^ ~ ^ - * - - - ' X!

4J Ag OOOOOO ooooo A

C i V* 1 <3 φ o5 a A 3" oc a a — 35 Ο) I n a a ei mi 6 0 150204

Ved in vivo-forsøg indgives subcutanfc til grå kaniner (2 til 3 kg) : a. 5 mg/kg heparin (132,2 E/mg U.S.P. XVII), b. 10 mg/kg D-Phe-Pro-Agm-2 HC1, eller 5 c. ' 5 mg/kg heparin og 10 mg/kg D-Phe-Pro-Agm-2 HC1.

Efter indgivelse af drogerne udtages blodprøver fra kaninernes ørevene hvert 30. minut, og thrombintiden for helblodet bestemmes i en thromboelastograf (Hartert, Ή.: Zschr. f. clin. Med. 153, 423 (1955). Under eksperimen-10 terne blev det tydeligt, at både heparin og agamatinderi-vatet alene kun udviser lille aktivitet ved de indgivne doser (a og b); thrombintiden for helblodet forlænges med kun 1,5 gange (relativ thrombintid er i bedste fald 1,2 til 1,5), blodets prothrombin-aktivitet er i praksis også 15 uændret. Hvis agmatinderivatet indgives sammen med heparin i samme doser (c), régistreres der en forøget antikoa-gulerende virkning i forsøgsdyrene, den relative thrombintid 4- til 5-dobles i 3 til 4 timer i selvkontroleksperimenterne. På samme tid formindskes prothrombin-aktiviteten 20 i de blodprøver, der tages med forskellige intervaller, og som er afprøvet ifølge Quick (Quick, A.J.: J. Biol. Chem.

109, 73 (1935)) fra 100%'s niveauet, forud for behandling, til 20-30%. Denne værdi skal ifølge litteraturen betragtes som en antikoagulerende virkning af terapeutisk værdi.

25 Baseret på ovennævnte angår den foreliggende opfin

delse en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil u-kendte dipeptidyl-agmatinderivater med den almene formel I, hvori X, Pro, Agni og n er som defineret ovenfor, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret ved, at et 1,4-diamino-bu-30 tanderivat med den almene formel II

a-hn-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2, (HCl)n (II) hvori A betyder H2N-C(NH), Y-HN-C(NH) eller Q, Y og Q står 35 for amino-beskyttende grupper, der er almindeligt anvendt i peptidkemien, og n betyder 0, 1 eller 2, kondenseres

O

7 150204 enten først med L-prolin, som er blokeret på sin aroino-gruppe, og derefter med en N-beskyttet aminosyre X-OH eller med et N-beskyttet dipeptid X-L-Pro-OH ved hjælp af metoder, som er kendte i peptid-kemienj Q-beskyttelsesgruppen spal-5 tes om nødvendigt fra 1,4-diamino-butandelen i den fremstillede forbindelse, og den derved frigjorte aminogruppe omdannes til en guanidinogruppe ved hjælp af kendte metoder, hvorefter der fra det resulterende dipeptidyl-agmatin fjernes både den N-terminale aminobeskyttelsesgruppe og en .

10 eventuel Y-blokeringsgruppe i guanidinodelen, og det fri dipeptidyl-agmatin eller et hydrochlorid deraf isoleres.

Forbindelser med den almene formel I, hvor X står for en D-phenylalaninrest, fremstilles fortrinsvis ved dannelse af et blandet anhydrid ud fra Z-D-Phe-Pro-OH (Niko-15 laides et al.: J. Med. Chem. 11, 74 (1968)) og chlormyre-. syre-alkylester, og dette bringes til at reagere med agma-tin-hydrochlorid (i formel II betyder A H2N-C(NH), og n = 1), eller med et agmatin med en benzyloxycarbonylgruppe (Z) på sin guanidinogruppe (i formel II betyder A Y-HN-C(NH), 20 Y betyder en Z-gruppe, og n = 0), Z-beskyttelsesgruppen eller -grupperne spaltes fra det dannede dipeptidyl-agmatin, og D-Phe-Pro-Agm isoleres i form af et dihydrochlorid.

De følgende eksempler er illustrative for opfindelsen .

25 R^-værdierne bestemmes ved silicagel-tyndtlagschro- matografi (Kieselgel G, REANAL, Budapest) i de følgende opløsningsmiddelsystemer: . 1. chloroform-methanol - 9:1 2. ethylacetat-pyridin-eddikesyre-vand - 240:20:6:11 30 3. ethylacetat-pyridin-eddikesyre-vand - 60:20:6:11 4. ethylacetat-pyridin-eddikesyre-vand - 30:20:6:11

Eksempel 1 D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (i formel I 35 står X for en D-phenylalaninrest, og n = 2) 150204

O

8

Trin 1 N-Benzyloxycarbonyl-S-methyl-isothiourinstof.

13,9 g (0,1 mol) S-methyl-isothiourinstof opløses i 50 ml vand, afkøles til en temperatur mellem 0 og 5°C, 5 og ved denne temperatur og under konstant omrøring tilsættes 15 ml (0,1 mol) chlormyresyre-benzylester og 50 ml 4 N natriumhydroxid i løbet af ca. 20 minutter. Det dannede bundfald filtreres fra, vaskes 3 gange med 50 ml koldt vand, derefter 3 gange med 50 ml n-hexan, og ende-10 · lig tørres det over phosphorpentoxid i vakuum. Udbytte: 15,7 g (70%) af den tilsigtede forbindelse. Smp.: 74-75°Cj Rf1)= 0,70-0,75.

C10H12°2N2S (224,27) 15 Beregnet: C: 53,55%, H: 5,39%, N: 12,49%, S: 14,3%

Fundet: C: 53,59%, H: 5,69%, N: 12,23%, S: 14,27%.

Trin 2

- Q

N-Tert.-butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-agmatin 20 6,7 g (30 mol) 1-(tert.-butyloxycarbonyl)-l,4-diamino- '-butan-hydrochlorid (Geiger: Liebigs Ann. Chem., 750, 165 (1971)) og 6,7 g (30 mmol) isothiourinstofderivat (eks. 1, trin 1) opløses i 15 ml ethanol, 4,2 ml (30 mmol) triethyl-amin tilsættes, og opløsningen holdes i 3 timer på et damp-25 bad. Reaktionsblandingen inddampes, remanensen opløses i en blanding af 150 ml benzen og 50 ml 1 N eddikesyre, benzenlaget vaskes med 10 ml vand og inddampes ved formindsket tryk. Den krystallinske remanens suspenderes i 30-50 ml benzen nedkølet til ca. 10°C, filtreres og vaskes med 10 30 ml koldt benzen, derefter med n-hexan. Udbytte: 7,9 g (60%)' af den tilsigtede forbindelse. Smp.: 99-101°Cj R^1}= 0,60-0,64.

C18H28°4N4f C.H3C00H' 2/3H20 (436,5) 35 Beregnet: C: 55,03%, H: 7,69%, N: 12,84%

Fundet: C: 55,1%, H: 7,8%, N: 12,65%.

0 150204 9

Trin 3 Λ N -Benzyloxycarbonyl-agmatin-dihydrochlorid (i formel II står A for Y-HN-C(NH), Y for en benzyloxycarbonylgruppe, og n = 2).

5 5,5 g (15 mmol) beskyttet agmatin (eks. 1, trin 2) suspenderes i 10 ml ethylacetat, derefter tilsættes 20 ml ethylacetat indeholdende 11-15% saltsyre under omrøring og isafkøling. Omrøring fortsættes i 30 minutter, derefter fortyndes suspensionen med 10 ml ethylacetat, 10 filtreres, vaskes med ethylacetat og tørres over kaliumhydroxid ved stuetemperatur og formindsket tryk. Udbytte: 4,3 g (83%) af den tilsigtede forbindelse. Smp.: 150-153°C; R^4)= 0,49-0,59.

c13H2o°2N4> 2HC1, 1/3H20 (343,3) 15

Beregnet: C: 45,48%, H: 6,65%, N: 16,32%. Cl: 20,65%

Fundet: C: 45,5%, H: 6,5%, N: 16,3%, Cl: 20,3%.

Trin 4

Q

20 Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-N -benzyloxy-carbonyl-agmatin.

2 g (6 mmol) blokeret agmatin-hydrochlorid (eks.

I, trin 3) suspenderes i 10 ml dimethylformamid, 1,5 ml vand tilsættes, derefter indstilles opløsningens pH-vær- 25 di på 8-9 med triethylamin (ca. 1,5 ml). Opløsningen afkøles til -15°C og hældes i det på følgende måde fremstillede, blandede anhydrid: 2,4 g (6 mmol) benzyloxycarbonyl--D-phenylalanyl-L-prolin (Nikolaides et al.: J. Med. Chem., II, 74 (1968)) opløses i 12 ml dimethylformamid, afkølet 30 til -15°C, og ved denne temperatur og under omrøring tilsættes 0,66 ml (6 mmol) N-methyl-morpholin og 0,8 ml (6 mmol) chlormyresyre-isobutylester. Efter omrøring i 10 minutter hældes den ovennævnte dimethylformamidopløs-ning i. Om nødvendigt indstilles reaktionsblandingens pH-35 -værdi på 8-9 med triethylamin, og omrøringen fortsættes i 1 time ved -15°C og i 1 time ved 0°C, derefter inddam- 15020Λ ίο o pes reaktionsblandingen. Remanensen opløses i en blanding af 60 ml af en 4:1-benzen-ethylacetatopløsning og 20 ml vandr det organiske lag vaskes to gange med 20 ml vand indeholdende 1% morpholin, to gange med 20 ml 0,1 N 5 saltsyre og endeligt to gange med 20 ml vand, tørres over natriumsulfat og inddampes ved formindsket tryk.

Udbytte: 3,1 g (80%) af titelforbindelsen. R^2^ = 0,30--0,35.

to Trin 5 D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid.

3,1 g (4,8 mmol) beskyttet dipeptidyl-agmatin (eks. 1, trin 4) opløses i 40 ml methanol, 4,8 ml 2 N saltsyre tilsættes, og blandingen hydrogeneres over pal-15 ladium-trækul. Når reaktionen er tilendebragt, frafil- treres katalysatoren, vaskes med vand, og filtratet inddampes ved formindsket tryk. Remanensen opløses i 5 ml methanol og fortyndes med 30-40 ml acetone. De dannede krystaller frafiltreres, vaskes med acetone og lufttør-20 res. Udbytte: 2,05 g (95%) af titelforbindelsen. Smp.: 216-219°C; Rf(4)= 0,5-0,6; [a]20 _ -125,5°C (c = 1, o,l N eddikesyre).

C19H30°2N6; 2hc1; 1/3H20 (453'4^ 25

Beregnet: C: 50,32%, H: 7,26%, N: 18,53%, Cl: 15,64%.

Fundet: C: 50,8%, H: 7,5%, N: 18,3%, Cl: 15,6%,

Eksempel 2 30 D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (i formel I står X for en D-phenylalaninrest, og n = 2).

Trin 1

Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-hydro-chlorid.

35 4 g (10 mmol) benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L- -prolin (Nikolaides et al.: J. Med. Cheiri. 11, 74 (1968)) 11 150206 o opløses i 20 ml dimethylformamid, afkøles til -15°C, og ved denne temperatur og under konstant omrøring tilsættes 1,11 ml (10 mmol) N-methyl-morpholin og 1,32 ml (10 mmol) chlormy-resyre-isobutylester. Omrøring fortsættes i 10 minutter, 5 hvorefter den på følgende måde fremstillede opløsning hældes deri: 2,05 g (10 mmol) agmatin-dihydrochlorid (i formel II står A for en H2N-C(NH)-rest, og n = 2) suspenderes i 15 ml dimethylformamid, 2 ml vand og derefter 1,4 ml (10 mmol) triethylamin tilsættes, og der afkøles til -15°C. Reaktions-10 blandingen omrøres i 2 timer ved -15°C, i 1 time uden afkøling, derefter inddampes den ved formindsket tryk. Inddamp-ningsremanensen opløses i 100 ml 0,2 N saltsyre og ekstrahe-res 3 gange med 20 ml ethylacetat. Det vandige lags pH-værdi indstilles på 8,0-8,5 med fast natriumhydrogencarbonat og 15 ekstraheres fem gange med 20 ml chloroform. De kombinerede chloroforming vaskes to gange med 10 ml vand og inddampes ved formindsket tryk. Remanensen oparbejdes med diethyl-ether, filtreres, vaskes med diethylether og lufttørres.

Udbytte: 4,1 g (75%) af den tilsigtede forbindelse.

20 R^3) = 0,5-0,6.

Trin 2 D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid.

3,8 g (7 mmol) blokeret dipeptidyl-agmatin (eks.

25 2, trin 1) opløses i 60 ml methanol, 3,5 ml 2 N saltsyre tilsættes, og blandingen hydrogeneres over palladium--trækul. Når reaktionen er fuldstændig, frafiltreres katalysatoren, vaskes med vand, og filtratet inddampes ved formindsket tryk. Remanensen opløses i 10 ml methanol og 30 fortyndes med 40-60 ml acetone. De dannede krystaller frafiltreres, vaskes med acetone og lufttørres. Udbytte: 2,95 g (95%) af det tilsigtede produkt. Smp.: 216-219°C;

Rf4)= 0,5-0,6} [a]^° - -125,5°C. (c = 1, 0,1 N eddikesyre).

35 12 150204

O

Eksempel 3 O-Benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (i formel I står X for en O-benzyl-D-serin-rest, og n = 2).

5 Trin 1 L-Proly1-agmatin-dihydrochlorid.

3f7 g (10 mmol) benzyloxycarbonyl-L-prolyl-p-ni-trophenylester (Goodman & Stueben: J. Am. Chem. Soc. 81, 3980 (1959)) opløses i en blanding af 10 ml dimethylform-10 amid og 5 ml pyridin, 2,03 g (10 mmol) agmatin-dihydro-chlorid (i formel II står A for en I^N-CiNH)-rest, og n = 2) og 1,4 ml (10 mmol) triethylamin tilsættes og omrøres i 16-20 timer. Reaktionsblandingen inddampes ved formindsket tryk. Remanensen opløses i en blanding af 50 ml 0,1 N 15 saltsyre og 20 ml ethylacetat, det vandige lag ekstrahe-res to gange med 20 ml diethylether, neutraliseres med fast natriumhydrogencarbonat og ekstraheres derefter fem gange med 20 ml chloroform. De kombinerede chloroformlag vaskes to gange med vand og inddampes ved formindsket 20 tryk. Inddampningsremanensen, benzyloxycarbonyl-L-prolyl- (3) -agmatin-hydrochlorid (R^ - 0,32-0,42), opløses i 40 ml methanol, 10 ml 1 N saltsyre tilsættes, og blandingen hydrogeneres i nærværelse af palladium-trækul. Når reaktionen er fuldstændig, frafiltreres katalysatoren, vaskes 25 med vand, og filtratet inddampes ved formindsket tryk. Inddampningsremanensen oparbejdes med diethylether, frafiltreres, vaskes med diethylether og tørres over kaliumhydroxid ved formindsket tryk. Udbytte: 2,1 g (70%) af den tilsigtede forbindelse. Smp.: 186-189°C; R^^= 0,15-30 -0,25* [aj20 = -33,25°C (c = 1, methanol).

C10H21ON5f 2HC1 (300'2)

Beregnet: C: 40,00%, H: 7,72%, N: 23,32%, Cl: 23,62%

Fundet: C: 40,00%, H: 7,7%, N: 23,0%, Cl: 23,3%.

35

O

13 150204

Trin 2 O-Benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid.

1/5 g (5 mmol) L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (eks. 3/ trin 1) suspenderes i 5 ml dimethylformamid, 5 0,5 ml vand og 0,7 ml (5 mmol) triethylamin tilsættes, ' blandingen afkøles til -15°C og hældes i det på følgende måde fremstillede, blandede anhydrid: 1,5 g (5 mmol) tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-serin (Otsuka et al.: Bull.

Chem. Soc. Japan, 39, 1171 (1966)) opløses i 10 ml dime-10 thylformamid, afkøles til -15°C, og ved denne temperatur og under omrøring tilsættes 0,6 ml (5 mmol) N-methyl-mor-pholin og 0,7 ml (5 mmol) chlormyresyre-isobutylester. Omrøring fortsættes i 10 minutter, derefter hældes ovennævnte dimethylformamidopløsning deri. Reaktionsblandingen om-•(5 røres i 1 time ved -15°C, derefter i yderligere 1 time ved 0°C og inddampes til sidst ved formindsket tryk. Remanensen opløses i en blanding af 10 ml vand og 50 ml chloroform, chloroformlaget vaskes to gange med 10 ml vand og to gange med 10 ml af en 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning, tør-20 res over natriumsulfat og inddampes ved formindsket tryk. Remanensen oparbejdes med diethylether, frafiltreres, vaskes med diethylether og lufttørres. Det resulterende tert.- butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-hydro- (3) chlorid (R^ = 0,4-0,5) suspenderes i 5 ml ethylacetat, 25 og ved konstant omrøring og isafkøling tilsættes 10 ml 11-15%'s saltsyre indeholdende ethylacetat.

Efter omrøring i 30 minutter filtreres suspensionen, vaskes med ethylacetat og tørres over kaliumhydroxid ved formindsket tryk. Produktet opløses i 20 ml vand og frysetørres.

30 Udbytte: 1,62 g (65%) af titelproduktet. Smp.: 110-115°Ci R^4* = 0,56-0,66; [a]20 =-47°C (c = 1, 0,1 N eddikesyre).

C20H32°3N6j2HC1 H2° i495'45) 35 Beregnet: C: 48,48%, H: 7,32%, N: 16,96%, Cl: 14,31%

Fundet: C: 48,4%, H: 7,4%, N: 16,85%, Cl: 14,3%.