DK148658B - Fremgangsmaade og middel til aktivering af kolesterinesterase - Google Patents

Description

i 148658

Opfindelsen angår en fremgangsmåde og et middel til aktivering af kolesterinesterase ved den enzymatiske omsætning af estere i reaktionsblandinger. Sådanne reaktionsblandinger anvendes blandt andet i den klinisk-kemiske ana-lytik og i den levnedsmiddelkemiske analytik.

Ved udarbejdelsen af kolesterinesterafhangige tests er det ønskeligt at spare dyrt enzym, opnå høje reaktionshastigheder og størst mulig valgfrihed med hensyn til art og indhold af detergenter og puffere efter overordnede synspunkter.

I et pufret medium, som ikke indeholder yderligere komponenter, udvikler kolesterinesterasen overfor sine substrater slet ingen eller kun en meget ringe aktivitet. Det er derfor nødvendigt at finde aktiverende tilsætninger til enzymet, hvorved esterspaltningen bliver forøget. Som sådanne aktiverende tilsætninger kendes nogle detergenter (US patentskrift nr, 3.884.753, DE offentliggørelsesskrift nr.

24 09 695, DE offentliggørelsesskrift nr. 25 12 605, DE offentliggørelsesskrift nr. 25 12 585, DE patentskrift nr. 2 506 712, Biochim. Biophys. Acta, 270 (19721 156-166, f.eks. galdesyrer, Triton X-100, Thesitl.

Et højere saltindhold i mediet understøtter den aktiverende yirkning heraf, Ikke alle puffersystemer er dog lige velegnede, Det samme gælder for detergenterne, Man finder her under bestemte betingelser sådanne med god eller mindre god virkning lige til sådanne, som overhovedet ikke viser nogen aktiverende virkning. Hvilke detergenter, der er egnede i denne henseende, kan for det meste ikke forudsiges.

Det er fælles for aktiverende detergenter, at de i et foreliggende medium i en bestemt koncentration giver deres optimale aktiverende virkning. Dette optimum kan ligge i ugunstigt høje koncentrationsområder. Udenfor dette opti- 148658 2 mum bliver en større mængde af det forholdsvis dyre enzym ikke på optimal måde omsat med høje reaktionshastigheder.

Aktivitetsforøgelser ved optimering af detergentindhold og forøgelse af ionstyrken kan desuden kun opnås indenfor forholdsvis snævre rammer.

Da reaktionsblandingerne, som kommer i betragtning, i reglen desuden indeholder yderligere enzymer og substrater for følge-og indikatorreaktioner,er der ved valget af puffere og detergent samt ved optimeringen af de mængder, der skal tilsættes, ikke nogen valgfrihed.

Ved fastlæggelsen af reaktionsbetingelserne skal der desuden altid tages hensyn til vekselvirkningerne af alle reaktionskomponenterne på hinanden, specielt mulige hæmninger eller uheldige stabilitetspåvirkninger af andre enzymer ved hjælp af detergenter og/eller høje ionstyrker.

Ved udviklingen af et testsystem skal man desuden tage hensyn til opløselighedsgrænser og galenikproblemer.

I sidstnævnte tilfælde kan de hyppigt flydende til voks-agtige detergenter sjældent indføres i den til aktiveringen nødvendige mængde i faststofblandinger, som jo skal være tørre og risledygtige. Dette er særligt at betydning ved blandingsreagenser.

Endelig må der tages hensyn til, at de fleste detergenter, der kommer på tale, ikke foreligger som definerede forbindelser men som stofblandinger. Følgelig optræder der forskelle fra portion til portion, som også viser sig ved den aktiverende virkning. Det kan derfor være meget uheldigt, når aktiveringen alene er afhængig af et detergent.

Som følge heraf er der et stort behov for et bedre middel samt fremgangsmåde til aktivering af kole- 148658 3 sterinesterase.

Formålet med opfindelsen er at fjerne de ovennævnte ulemper og tilvejebringe en fremgangsmåde og et middel af den nævnte art, hvor der spares kolesterinesterase, under bestemte betingelser kan opnås højere reaktionshastigheder, kan arbejdes med ringere ionstyrke, detergenter kun kræves i såvidt mulig minimal koncentration, og der også kan anvende sådanne detergenter,som alene kun viser en ringe om overhovedet nogen aktiverende virkning.

Fra fransk fremlæggelsesskrift nr. 2.263.516 kendes midler omfattende kolesterinesterase, overfladeaktivt middel og phenol. Det fremgår imidlertid ikke heraf, hvorledes man kan aktivere enzymet kolesterinesterase. Phenol i usubstitueret form nævnes udelukkende som bestanddel af et farvereagens.

Fra tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.612.725 kendes ligeledes midler, omfattende kolesterinesterase, overfladeaktivt middel og phenol. Det kan dog heller ikke her udledes, hvordan man kan aktivere kolesterinesterase. Som i det ovennævnte franske fremlæggelsesskrift anvendes phenol udelukkende til opnåelse af en farvereaktion. Desuden indeholder de i DE fremlæggelsesskrift nr. 2.612.725 nævnte reagenser lavere alkanoler,der imidlertid kun har til formål at forhindre uklarheder i serum.

Formålet opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til aktivering af kolesterinesterase i ionholdige opløsninger ved tilsætning af mindst ét overfladeaktivt middel, kendetegnet ved, at man a) som overfladeaktivt middel tilsætter en polyethoxyether eller -ester og/eller en galdesyreforbindelse og/eller salte af fedtsyrer med 6-10 carbonatomer i kombination med b) en synergistisk virkende alkohol, som er valgt blandt de ligekædede, forgrenede eller cykliske alifatiske alkoho- 148658 4 ler med 5-12 carbonatomer, halogensubstituerede, aromatiske alkoholer og de med flere halogenatomer substituerede, alifatiske alkoholer med 1-3 carbonatomer.

Opfindelsen beror på den overraskende konstatering, at de nævnte alkoholer, som i sig selv alene ikke udviser nogen, aktiverende virkning på kolesterinesterase, syner-gistisk tydeligt forstærker den i og for sig kendte aktiverende virkning af bestemte detergenter,og ved bestemte i sig selv alene ikke aktiverende detergenter bevirker en aktivering.

Dette fører til, at sådanne ikke aktiverende,i handelen vidt udbredte detergenter kan anvendes. På samme måde kan på grund af deres definerede molekylstruktur og faste konsistens anvendes Ønskede,men på grund af dårligt aktiverende egenskaber hidtil uegnede ioniske detergenter. Yderligere kan der spares enzym, den maksimalt opnåelige reak-. tionshastighed forøges, den nødvendige ionstyrke formind-skes, og endelig ved de mange kombinationsmuligheder.det ésteraseaktiverende system tilpasses til de af yderligere komponenter i reaktionsblandingen dikterede betingelser.

Eksempler på egnede polyethoxyethere er fedtalkohol-polygly-colethere såsom polyoxyethylenlaurylether og hydroxypolyethoxy-dodecan, alkylarylethere og arylalkylethere såsom polyoxy-éthylennonylphenylether dg polyoxyethylen-octylphenylether, fedtsyreestere såsom polyoxyethylensorbitanmonolaurat og lignende. Ved galdesyreforbindelserne foretrækkes cholsyre, des-oxycholsyre og deres alkalisalte. Ligeledes foretrækkes blandt fedtsyresaltene alkalimetalsaltene, specielt natriumsaltene.

Typiske eksempler på egnede ligekædede, forgrenede eller cykliske alifatiske alkoholer er pentanol, tert-amylalkohol, methylpentanol, hexanol, cyklohexanol, octanol, isooctanol, decanol og dodecanol. Eksempler på egnede halogensubstitu- 148658 5 erede, aromatiske alkoholer er de halogensubstituerede phe-noler og naphtholer såsom mono-, di- og trichlorphenolerne.

Som polyhalogensubstituerede, alifatiske alkoholer kan f.eks. anvendes dichiorethanol, trichlorethanol, dichlormethanol, trichlormethanol, trichlorpropanol, tetrachlorpropanol osv.

Som halogensubstituenter kommer ved de aromatiske og alifatiske alkoholer chlor, brom og fluor i betragtning. Chlor foretrækkes. De aromatiske alkoholer kan også have en eller to alkylgrupper med 1-2 carbonatomer.

Hvilke af disse alkoholer (i det følgende omtalt som adjuvant} , der er særligt egnede i bestemte tilfælde,kan let bestemmes ved forudgående forsøg. Por det meste er betingelserne såsom art og styrke af puffersystemer, art og koncentration af detergentet samt holdbarheden og den ønskede konsistens af opbevaringsformen af reaktionsblandingen givet forud. Disse betingelser kan så opfyldes ved valg af egnet adjuvant og tilpasning af den tilsatte mængde. I almindelighed viste det sig, at koncentrationer mellem 1 og 300 mm adjuvant/1 giver gode resultater.

Alkoholerne anvendes fortrinsvis i mængder mellem 0,01 og 5%, volumenprocent ved flydende alkoholer, vægt% ved faste alkoholer. 0,05-3% foretrækkes specielt.

I polyethoxyderivaterne indeholder alkylgrupperne i almindelighed 8-22 carbonatomer. Aralkyl- og alkarylgrupperne indeholder fortrinsvis en phenylrest. Glycolresten af disse detergenter har i almindelighed 3-25 oxyethylengrupper.

Detergenterne anvendes hensigtsmæssigt i en mængde mellem Q,05 og 5 volumen%, henholdsvis vægt% ved faste stoffer.

0,1-3% foretrækkes.

148658 6

Opfindelsen angår yderligere et middel til udøvelse af ovennævnte fremgangsmåde indeholdende i det mindste ét overfladeaktivt middel på basis af en polyethoxyether eller -ester og/eller en galdesyreforbindelse og/eller salte af fedtsyrer med 6-10 carbonatomer, kendetegnet ved et indhold af en syn-ergistisk virkende alkohol valgt blandt ligekædede, forgrenede eller cykliske, alifatiske alkoholer med 5-12 carbonatomer, halogensubstituerede, aromatiske alkoholer og halogensubstituerede alifatiske alkoholer med 1-3 carbonatomer.

Opfindelsen kan anvendes i sammenhæng med alle arter af målinger og reaktioner, hvor kolesterinesterase anvendes i reaktionsblandinger. Sådanne reaktionsblandinger kendes allerede cif fagfolk og beskrives for såvidt de er bestemt til analytiske formål, f.eks. i "Methoden der enzymatischen Analyse", H.U. Bergmeyer, Verlag Chemie Weinheim, Bergstrasse. En nærmere beskrivelse af sådanne reaktionsblandinger er derfor ikke nødvendig her. Opfindelsen egner sig til kolesterinesterase fra mikroorganismer eller af anden oprindelse, såsom af pankreas eller lever.

De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere i forbindelse med den efterfølgende tegning. På tegningen er fig. 1 en skematisk fremstilling af det anvendte apparatur til bestemmelsen af kolesterinesteraseaktiviteten, fig. 2 en grafisk fremstilling af den ved den anvendte metode forekommende ekstinktionsændring pr. tidsenhed, som blev anvendt til bestemmelse af esterspaltningshastigheden.

Følgende tabel viser den kemiske sammensætning, der er angivet ved hjælp af handelsnavne: 148658 7

Brij 35 Polyoxyethylenlaurylether

Genapol OX-IOQ Fedtalkoholpolyglycolether

Tergitol NPX Polyoxyethylennonylphenylether (ca. 1Q,5 oxyethylengrupperl

Th.es it Hy droxypropyle thoxydodecan

Triton X-100 Polyethoxyoctylphenylether (9-10 oxyethylen= grupper}

Tween 2Q Polyoxyethylensorbitanmonolaurat.

Til påvisningen af den aktiverende virkning af den synergistiske kombination ifølge opfindelsen, som skal undersøges på kolesterinesterase, blev det i fig. 1 viste apparatur anvendt .

I en tempererbar reaktionsbeholder 1 (25°C), hvori esterspaltningen foregår, udtages der via en slangepumpe 2 gennem en fødeslange 3 af defineret tværsnit kontinuerligt 0,32 ml blanding pr. min. Via den samme pumpe ledes der gennem en anden slange 4 fra en forrådsbeholder 5 ligeledes kontinuerligt 1,0 ml indikatoropløsning pr. min. bag pumpen 2 sammenført med en luftstrøm 6 af konstant 0,6 ml luft pr. min. og segmenteres dermed og forenes så med den før beskrevne reaktionsblandingsstrøm. Ben samlede strøm passerer derpå 2 glasslanger 7, hvorved der sikres en gennem-blanding af væskerne og den nødvendige reaktionstid for indikatorreaktionen indtil slutpunktet. Ved udtagelse af en strøm på 1,2 ml/min. umiddelbart før beholderen gennem slangeledning 8 lodret opad fjernes luftblærerne igen. Den ikke segmenterede reststrøm ledes til fotometrisk måling (ved 546 nm) i en gennemstrømsbeholder (1 cm lagtykkelse),og måleværdierne registreres af skriveren 10.

På grund af de uændrede betingelser med hensyn til indikatorreaktionen er ændringer i højde og forløbet af målesignalet alene afhængig af forløbet i reaktionsbeholderen.

Sker der her en esterspaltninger,bevirker det kinetiske forløb en forøgelse af målesignalet, hvilket bliver regi- 148553 8 streret som en positiv stigning med skriveren 10. Stejlheden af stigningen er et mål for reaktionshastigheden og dermed for kolesterinesteraseaktiviteten i reaktionsblandingen.

På grund af det adskilte forløb af esterspaltningen og indikatorreaktionen er en gensidig påvirkning udelukket. Naturligvis kunne der også anvendes andre indikatorsystemer inklusive oxygenelektroden.

Indikatoropløsning: 0,1 m kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 1,5 itM/1 4-amino-antipyrin 5 nM/1 phenol 3 %o Hydroxypolyethoxydodecan 8 U/ml Peroxidase 1 ϋ/ml kolesterinoxidase.

Indikatoropløsningen omsætter først frit kolesterin til kolesteron og ' H2®2 * Det dannede omsættes med phenol og 4-amino-antipyrin til et rødt farvestof, hvis absorption måles fotometrisk. Mængden af det dannede farvestof er proportional med koncentrationen af frit kolesterin. Koncentrationen af frit kolesterin består af den allerede i substratet tilstedeværende mængde frit kolesterin samt af det ved esterasen frigjorte kolesterin.

Sammensætningen i reaktionsbeholderen: Q,5 ml substrat (kontrolserum; 360 mg kolesterin ialt/dl) Detergent, alt efter forsøg Adjuvant, alt efter forsøg Puffer til 5 ml.

Start med 5Q μΐ af en esterase-stamopløsning, hvorhos der i blandingen foreligger 0,0Q3 U/ml-esterase. Ved aktivitetsændringer blev denne mængde varieret.

9 1Λ 8 6 5 8

Efter start og gennemblanding bliver fødeslangen 3 ved kørende pumpe 2 dyppet i opløsningen i reaktionsbeholderen 1 i ca. 10 min. Til bedre adskillelse af signalerne bliver derpå skiftevis luft og bidestil. vand tilsuget i hver ca.

10 segmenter. Derpå kan den næste.bestemmelse finde sted.

De efterfølgende eksempler viser den ved opfindelsen mulig-gjorte besparelse af enzym (a), opnåelsen af højere reaktionshastigheder under givne betingelser (bl^anvendelsen af puffere af ringere ionstyrke (c); tilsætningen af detergenter i ringere koncentration (dl og anvendelsen også af sådanne detergenter, som under bestemte betingelser kun giver en utilstrækkelig eller slet ingen aktiverende virkning (e) .

a) Kolesterinesterasebesparelse.

Muligheden for kolesterinesterasebesparelsen påvises på følgende måde: Først foretages der en trinvis enzyraaktivitetsændring i fraværelse af adjuvanter. Sammenligningsmålingerne sker så under tilsætning af adjuvanter ved en kolesterinesterase-tilsætning på 0,0.03 U/ml. På basis af den viste sammenhæng mellem ansat aktivitet og resulterende hastighed bestemmes så den opnåede aktivitetsforøgelse.

Eksempel 1 0,1 M tris/vinsyre-puffer, pH 8,0 5% o Triton X-1Q0

Startaktivitet Resulterende hastighed 0 U/ml 0 Ext/10 minutter 0,0012 0,012 0,0030 0,032 0,0045 0,052 0,0060 Q,058 0,0089 0,094 148658 10 1.1 Tilsætning af 2 volumen% tertiær-amylalkohol

Startaktivitet Q,Q030 U/ml

Opnået hastighed 0,046 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0044 U/ml

Opnået aktivitet 147% 1.2 Tilsætning af 0,4 volumen% 4-methylpentanol-(21

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,065 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0063 U/ml

Opnået aktivitet 210% 1.3 Tilsætning af 1 volumen% cyklohexanol

Startaktivitet 0,0030 U/ml

Opnået hastighed 0,077 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0075

Opnået aktivitet 250%

Eksempel 2

I 0,1 M kaliumphosphat-puffer, pH 7,0 1,5% Tergitol NPX

Startaktivitet Resulterende hastighed 0,0012 U/ml 0,019 Ext/10 min.

0,0030U/ml 0,030 Ext/10 min.

0,0060 U/ml 0,055 Ext/10 min.

0,0090 U/ml 0,091 Ext/10 min.

Q,012Q U/ml 0,120 Ext/10 min.

148658 11 2.1 Tilsætning af 0,4 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,046 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,046 Ext/10 min.

Opnået aktivitet 153% 2.2 Tilsætning af 2 volumen% tert-amylalkohol

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,053 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden ad j uvant 0,0053 U/ml

Opnået aktivitet 177% 2.3 Tilsætning af 1,4 volumen% 4-methylpentanol-(2)

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,059 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0059 U/ml

Opnået aktivitet 197% 2.4 Tilsætning af 2 volumen% cyklohexanol

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,114 Ect/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,114 U/ml

Opnået aktivitet 380%

Eksempel 3 I 0,3 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 5% o Genapol OX-100/5 %o Natriumcaprylat 12 U8658

Startaktivitet Resulterende hastighed 0,0012 -U/ral 0,01 Ext/10 min.

0,00.30 U/ml 0,023 Ext/10 min.

0,0060 U/ml 0,038 Ext/IQ min.

0,0Q90 U/ml 0,055 Ext/10 min.

0,0150 U/ml Q,Q93 Ext/10 min.

0,0240 U/ml 0,138 Ext/10 min.

3.1 Tilsætning af 4 mM/1 3,4-dichlorphenol (0,065 vægt%l

Startaktivitet 0,0030 U/ml

Opnået hastighed 0,058 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0093 U/ml

Opnået aktivitet 310% 3.2 Tilsætning af 1 volumen% 4-methylpentanol-(2)

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,069 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0112 U/ml

Opnået aktivitet 373% 3.3 Tilsætning af 2 volumen% cyklohexanol

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,080 Ext/10 min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0129 U/ml

Opnået aktivitet 430% 3.4 Tilsætning af 0,3 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

Startaktivitet 0,003 U/ml

Opnået hastighed 0,089 Ext/10. min.

Nødvendig enzymtilsætning til denne hastighed uden adjuvant 0,0144 U/ml

Opnået aktivitet 480% 148658 13 bl Opnåelse af højere reaktionshastigheder under givne betingelser, I mange tilfælde er der på forhånd givet bestemte betingelser som f.eks, puffer og ionstyrke samt art af detergent i reaktionsblandinger på grund af overordnende synspunkter. Sådanne grunde kan f.eks. være givet på grund af større følsomhed af et andet i blandingen nødvendigt enzym. I dette tilfælde er den ved konstant kolesterinesterasetil-sætning opnåelige, maksimale hastighed af esterspaltningen kendetegnet og begrænset ved afhængighed af esterase-aktiveringen af arten af detergent --og detergentkoncentrationen. Denne afhængighed viser i almindelighed et optimum i det nedre koncentrationsområde af detergent.

Den på dette punkt opnåede hastighed kan ikke overgås ifølge de ovenfor anførte betingelser og udgør i denne henseende en grænse for systemet.

De i det følgende eksempel beskrevne kombinationer ifølge opfindelsen er egnet til at overskride sådanne grænser.

Eksempel 4

Givet på forhånd: 0,1 M tris/vinsyre-puffer, pH 8,0 Triton X-1Q0, Q,Q03 U/ml kolesterinesterase %o Triton X-100 i blandingen Resulterende hastighed 0 %o Q Ext/10 min.

1 %o 0,003 Ext/1Q min.

3 %o 0,028 Ext/10 min.

5 %o 0,037 Ext/10 min.

7 %o 0,037 Ext/10 min.

10 %o 0,037 Ext/10 min.

15 %o Q,029 Ext/10 min.

Optimum Grænse for systemet 5 %o 0,037 Ext/10 min.

148658 14

Adjuvanttilsætningen sker ved 5 %o Triton X-10Q.

4-1 Tilsætning af 2 volumen% tert-amylalkohol

Opnået hastighed 0 ,Q46 Ext/10 min.

Stigning til 124% 4.2 Tilsætning af Q,4volumen% 4-methylpentanol-(2)

Opnået hastighed . 0,065 Ext/10 min.

Stigning til 176% 4.3 Tilsætning af 1 volumen% cyklohexanol

Opnået hastighed 0,077 Ext/10 min.

Stigning til 208%

Eksempel 5

Givet på forhånd: 0,3 M kaliumphosphat-puffe.r, pH 7,0

Tergitol NPX, 0.,0Q3 U/ml kolesterinesterase %o Tergitol NPX i blandingen Resulterende hastighed 0 %o 0 Ext/10 min.

2 %o 0 Ekt/10 min.

5 %o 0,029 Ext/10 min.

10 %o 0,042 Ext/10 min.

15 %o 0,049 Ext/10 min.

20 %o 0,039 Ext/10 min.

Optimum Grænse for systemet 15 %o 0,049 Ext/10 min

Tilsætning af adjuvanter sker ved 15 %o Tergitol NPX.

5.1 Tilsætning af 2 itM/1 3,4-dichlorphenol og 1 volumen% cyklohexanon

Opnået hastighed 0,058 Ext/10 min.

Stigning til 118% 15 148650 5.2 Tilsætning af 2 volumen% tert-amylalkohol

Opnået hastighed 0,066 Ext/10 min.

Stigning til 135% 5.3 Tilsætning af 1,4 volumen% cyklohexanol

Opnået hastighed 0,118 Ext/1Q min.

Stigning til . 241% c) Anvendelse af puffere af ringere ionstyrke.

Som allerede nævnt understøtter puffere af højere ionstyrke aktiveringen af detergenters virkning på kolesterineste-rase. Indenfor rammerne af den krævede størst mulige valgfrihed af betingelserne er det dog ønskeligt ikke at være tvunget til for høje saltindhold i opløsningen. Det følgende eksempel viser, at saltindholdet ifølge opfindelsen kan reduceres væsentligt.

Der sammenlignes: 0,3 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0

Ved tilsætning af egnede adjuvanter til 0,1 m puffersystemet kan hastighederne forøges således, at den højere sammenligningsværdi af 0,3 M puffersysternet uden adjuvant kan opnås og delvis tydeligt kan overgås.

148658

Eksempel 6 16 15% %o Tergitol NPX, 0,QQ3 ϋ/ml kolesterinesterase 6.1 Tilsætning af 2 volumen% tert-amylalkohol

System Hastighed 0,1 m puffer uden tilsætning 0,030 Ext/10. min.

0,3 m puffer " " Q,049 Ext/10 min.

0,1 m puffer med tilsætning 0,053 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås.

6.2 Tilsætning af 1,4 volumen% 4-methylpentanol-(2) 0,1 m puffer uden tilsætning 0,030 Ext/10 min.

0,3 m puffer " " 0,049 Ext/10 min.

0,1 m puffer med tilsætning 0,059 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås.

6.3 Tilsætning af 2 volumen% cyklohexanol 0,1 m puffer uden tilsætning 0,030 Ext/10 min.

0,3 m puffer " " 0,049 Ext/10 min.

0,1 m puffer med tilsætning 0,114 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås tydeligt.

Eksempel 7 10 %o Genapol OX-10Q / 10 %o Na-caprylat 0,003 U/ml kolesterinesterase 148658 17 7.1 Tilsætning af 1 volumen% 2,2,2-trichlorethanol 0,1 m puffer uden tilsætning 0,017 Ext/1Q min.

0,3 m puffer " " Q,053 Ext/1Q min.

0,1 m puffer med tilsætning 0,063 Ext/10 min,

Sammenligningsværdien overgås.

7.2 Tilsætning af 2 volumen% cyklohexanol 0,1 m puffer uden tilsætning 0,017 Ext/10 min.

0,3 m puffer " " 0,053 Ext/10 min.

0,1 m puffer med tilsætning 0,072 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås.

d) Anvendelsen af detergenter i ringere koncentration.

Såfremt et detergent er i stand til at aktivere kolesterin-esterasen,skal det for fuldt at kunne udnytte denne egenskab foreligge i reaktionsblandingen i en bestemt koncentration. Dette detergentoptimum er i væsentlig grad afhængig af arten af detergentet og kan i mange tilfælde ligge i et ugunstigt højt koncentrationsområde. Derved kan der blandt andet ske hæmninger af enzymer, der er nødvendige til følgereaktioner,og også opstå vanskeligheder på grund af opløseligheden og galenikken. Under detergentoptimet konstateres der kun en utilstrækkelig aktivering. For at få en så stor valgfrihed af betingelserne som mulig er det dog ønskeligt at kunne anvende så mange forskellige detergenter som muligt,herunder sådanne, som har et højere-liggende koncentrationsoptimum.

Det efterfølgende eksempel viser, at det ifølge opfindelsen er muligt med mindre detergent at opnå og overstige koncentrationsoptimets reaktionshastigheder, hvorved der spares detergent.

148658

Eksempel 8 18 0.,3 m kaliumphosphat-puffer, pH 7,0 Tergitol NPX, Q,0Q3 U/ml kolesterinesterase

So Tergitol NPX i blandingen Resulterende hastighed 0 %o 0 Ext/10 min.

« 2 %o 0 Ext/10 min.

5 %o 0,029 Ext/10 min.

10 %o 0,042 Ext/10 min.

15 %o 0,049 Ext/10 min.

20 %o 0,039 Ext/10 min.

Optimum Sammenligningsværdi 15 %o 0,049 Ext/10 min.

8.1 Tilsætning af 0,1 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed 15 %o Tergitol uden tilsætning >. 0,049 Ext/10 min.

5 %o Tergitol " " 0,029 Ext/10 min.

5 %o Tergitol med tilsætning 0,059 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås ,· 8.2 Tilsætning af 2 volumens tert-amylalkohol 15 %o Tergitol uden tilsætning 0,049 Ext/10 min.

5 %o Tergitol " " 0,029 Ext/10 min.

5 So Tergitol med tilsætning 0,075 Ext/1Q min.

Sammenligningsværdien overstiges tydeligt.

8.3 Tilsætning af 1 volumens cyklohexanol

System Hastighed 15 So Tergitol uden tilsætning 0,049 Ext/10 min.

5 So Tergitol " " 0,029 Ext/10 min.

5 So Tergitol med tilsætning 0,124 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien overgås tydeligt.

Eksempel· 9 148658 19 0,3 m kaliumphosphat-puffer, pH 7,0 puffer

Genapol OX-IOO / Natriumcaprylat, Q,QQ3 U/ml kolesterinesterase.

%o Genapol CK-100/Na-caprylat Hastighed 0 %o 0 Ext/10 min.

5 So 0,020 Ext/10 min.

10 %o 0,053 Ext/10 min.

15 %o 0,062 Ext/10 min.

20 %o 0,066 Ext/10 min.

30 %o 0,068 Ext/10 min, 40 %o 0,068 Ext/10 min.

Optimum Sammenligningsvaerdi 30 %o 0,068 Ext/10 min.

9.1 Tilsætning af 1 volumen% 4-methylpentanol-(2)

System Hastighed 30 %o Genapol/caprylat uden tilsætning 0,068 Ext/10 min.

5 %o Genapol/caprylat uden tilsætning 0,020 Ext/10 min.

5 So Genapol/caprylat med tilsætning 0,069 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien opnås.

9.2 Tilsætning, af 2 volumen% cyklohexanol

System Hastighed 30 %o Genapol/caprylat uden tilsætning 0,068 Ext/10 min.

5 %o Genapol/caprylat uden tilsætning 0,020 Ext/10 min.

5 So Genapol/caprylat med tilsætning 0,080 Ext/1Q min.

Sammenligningsværdien overgås.

148658 20 9.3 Tilsætning af 0,3 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed 30 %o Genapol/caprylat uden tilsætning 0,068_Ext/10 min.

. 5 %o Genapol/caprylat uden tilsætning Q,020 Ext/10 min.

5 %o Genapol/caprylat med tilsætning 0,089 Ext/10 min.

Sammenligningsværdien øvergås tydeligt.

e). Anvendelse af detergenter, som under bestemte betingelser ikke har nogen eller kun har en utilstrækkelig aktiverende virkning.

Blandt det store antal detergenter, der er tilrådighed, har det vist sig, at kun nogle få er i stand til at aktivere kolesterinesterase i tilstrækkelig grad. Hæmningen af andre reaktionskomponenter, stabiliteten af reaktionsblandingen, konsistens, opløselighed og entydighed af forbindelsen eller præparatet hører til de overordnede grunde til, at der ønskes den størst mulige valgfrihed for detergenterne. Det efterfølgende eksempel viser, at også detergenter, som under de givne betingelser , kun har en ringe eller slet ingen aktiverende virkning kan anvendes ifølge opfindelsen.

Eksempel 10 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0, 0,003 U/ml kolesterinesterase.

Detergent: 6 %o Thesit

Tilsætning: 1 volumen% n-amylalkohol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0,003 Ext/10 min.

Tilsætning 0. Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,029 Ext/1Q min.

148658

Eksempel 11 21 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 12 %o Thesit

Tilsætning: 2 volumen% cyklohexanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0,010 Ext/10 min.

Tilsætning 0,003 Ext/10 min.

Detergent med tilsætning Q,1Q5 Ext/10 min.

Eksempel 12 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 12 %o Thesit

Tilsætning: 1 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0,010 Ext/1Q min.

Tilsætning 0 Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,081 Ext/10 min.

Eksempel 13 0,1 tris/vinsyre-puffer, pH 8,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergenter: 2 volumen% o Thesit/2 volumen% o Tween 20

Tilsætning: 0,4 volumen% hexanol-1

System Hastighed

Detergenter uden tilsætning Q,Q18 Ext/10 min.

Tilsætning 0 Ext/10 min.

Detergenter med tilsætning Q,Q28 Ext/10 min.

Eksempel 14 148650 22 0,1 m phosphate-puffer, pH 7,Q 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergenter; 5 volumen% o Thesit/5 volumen% o Tween 20 Tilsætning; 8 mM/1 3,5-dichlorphenol

System Hastighed

Detergenter uden tilsætning 0,0Q5 Ext/1Q min.

Tilsætning Q Ext/1Q min.

Dertergenter med tilsætning Q,033 Ext/10 min.

Eksempel 15 0,3m phosphat-puffer, pH 7,0 0,Q03 U/ml kolester inesterase

Detergenter: 5 volumen% o Genapol OX-1Q0./5 vægt% o natriumcaprylat

Tilsætning: 4 mM/1 (ca. 0,06.5 vægt%) 3,4-dichlorphenol

System Hastighed

Detergenter uden tilsætning 0,020 Ext/10 min.

Tilsætning Q Ext/10 min.

Detergenter med tilsætning 0,Q58 Ext/10 min.

Eksempel 16 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 10 volumen% o Brij 35 (30 %'ig opløsning)

Tilsætning: 4 mM/1 3,4-dichlorphenol 148658 23

System Hastighed

Detergenter uden tilsætning Q Ext/1Q min.

Tilsætning Q Ext/IQ min.

Detergenter med tilsætning Q,Q1Q Ext/IQ min.

Eksempel 17 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,00.3 U/ml koiesterinesterase

Detergent; 10 volumen* o Brij 35 (30 %’ig opløsning!.. Tilsætning; 1 volumen% 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0 Ext/IQ min.

Tilsætning 0 Éxt/10 min.

Detergent med tilsætning 0,018 Ext/IQ min.

Eksempel 18 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml koiesterinesterase

Detergent: 2 volumen* o Brij 35 (30 %'ig opløsning)

Tilsætning: 2 volumen* cyklohexanol

System Hastighed

Detergent.uden tilsætning 0 Ext/10 min.

Tilsætning 0,003 Ext/IQ min.

Detergent med tilsætning 0,027 Ext/IQ min.

Eksempel 19 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml koiesterinesterase

Detergent: 6 vægts o cholsyre

Tilsætning: 1 volumen* 2,2,2-trichlorethanol 148658 24

System Hastighed

Detergent uden tilsætning O Ext/1Q min.

Tilsætning Q Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,029 Ext/1Q min.

Eksempel2O

0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 6 vægt% o cholsyre

Tilsætning: 16 rtM/1 3,5 dichlorphenol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0 Ext/1Q min.

Tilsætning Q Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,036/10 min.

Eksempel 21 Q,i m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 1 vægt% o cholsyre

Tilsætning: 4 mM/1 3,5-dichlorphenol, 1 volumen! cyklohexanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætninger 0 Ext/10 min.

Tilsætninger 0,010 Ext/10 min.

Detergent med tilsætninger 0,103 Ext/10 min.

Eksempel 22 0,1 m tris/vinsyre-puffer, pH 8,0 Q,003 U/ml kolesterinesterase 148658 25

Detergent: 3 vægt% o natriumdesoxycholat

Tilsætning: 0,2 volumen% hexanol-1

System Hastighed

Detergent uden tilsætning Q Ext/10 min.

Tilsætning 0 Ext/1Q min.

Detergent med tilsætning 0,056 Ext/10 min.

Eksempel 23 0,1 m tris/vinsyre-puffer, pH 8,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 3 vægti o natriumdesoxycholat

Tilsætning: 1 volumen! 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0 Ext/10 min.

Tilsætning 0 Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,069 Ext/10 min.

Eksempel 24 0,1 m phosphat-puffer, pH 7,0 0,003 D/ml kolesterinesterase

Detergent: 6 volumen! o Genapol OX-100

Tilsætning: 0,4 volumen! 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning 0 Ext/10 min.

Tilsætning Q Ext/10 min.

Detergent med tilsætning 0,059 Ext/10 min.

Eksempel 25 148658 26 0,1 m phosphat-puff er, pH 7,0 0,003 U/ml kolesterinesterase

Detergent: 20 volumen% o Tween 20

Tilsætning: l volumen% 2,2,2-trichlorethanol

System Hastighed

Detergent uden tilsætning Q.,0Q5 Ext/1Q min.

Tilsætning Q Ext/1Q min.

Detergent med tilsætning Q,067 Ext/1Q min.

Anvendelsesform Eksempel 26

Reagens til bestemmelse af kolesterin i serum

Recept: 4,5 g/1 vinsyre 7,5 g/1 tris 8,7 g/1 natriumsulfat 2Q0 mg/fnl 4-amino-antipyrin 282 mg/1 phenol 5000 ϋ/1 peroxidase 430 U/l kolesterinesterase 310 U/l kolesterinoxidase

Aktiveringsmiddel: 2,2 g/1 Thesit 1,3 g/1 natriumdesoxycholat 0,815 g/1 3,4-di.chlorphenol

Det ovenfor trufne valg af tilsætninger muliggør aktiveringen af kolesterinesterase under de af de andre enzymers egenskaber stillede betingelser. Samtidigt er det muligt at virkeliggøre opvarelsesformen af reaktionsblandingen som blandingsreagens i fast form.

Claims (6)

148658

1. Fremgangsmåde til aktivering af kolesterinesterase i ionholdig opløsning ved tilsætning af mindst ét overflade-aktivt middel, kendetegnet ved, at man al som overfladeaktivt middel tilsætter en polyethoxyether eller -ester og/eller en galdesyreforbindelse og/eller salte af fedtsyrer med 6-10. carbonatomer i kombination med b) en synergistisk virkende alkohol, der er valgt blandt de ligekædede, forgrenede eller cykliske alifatiske alkoholer med 5-12 carbonatomer, halogensubstituerede aromatiske alkoholer og de med flere halogenatomer substituerede alifatiske alkoholer med 1-3 carbonatomer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som galdesyreforbindelse anvendes cholsyre, desoxy= cholsyre eller et alkalimetalsalt heraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som fedtsyresalt anvendes et alkalimetalsalt.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes 0,05-5% overfladeaktivt middel.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes 0,01-^5% alkohol.

6. Middel til udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1 indeholdende mindst ét overfladeaktivt middel på basis af en polyethoxyether eller -ester og/eller en galdesyreforbindelse og/eller salte af fedtsyrer med 6-10 carbonatomer, kendetegnet ved et indhold af en synergistisk virkende alkohol, der er valgt blandt de lige-