DK144856B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider - Google Patents

Description

i

14485G

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 2452/73 kendes en fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider i en vandholdig væske ved hjælp af enzymatisk forsæbning ved hjælp af lipase fra Rhizopus arrhizus samt måling af ^ den frigjorte glycerol, hvilken fremgangsmåde er karakteristisk ved, at forsæbningen foretages i nærværelse af såvel lipase som carboxylesterase og et alkalimetal- eller jordalkalimetalalkylsulfat med 10 til 15 carbonatomer i alkylgruppen.

10 En ulempe ved denne kendte fremgangsmåde består i, at der i mange tilfælde, især i tilfælde af stærkt lipæmiske sera, optræder uklarheder, som skyldes frigjorte fedtsyrer og kraftigt forstyrrer den optiske bestemmelse. Principielt er det ganske vist muligt ved hjælp af tilsætning af deter-15 genter at holde fedtsyrer i opløsning, men ved de hertil nødvendige detergentmængder hæmmer disse til gengæld enzymerne. Undersøgelse af et meget stort antal materialer med overfladeaktiv virkning gav til resultat, at ingen af disse materialer på tilfredsstillende måde var i stand til at op-2o fylde begge fordringer, d.v.s. hindring af uklarheder og ingen forstyrrelse af enzymaktiviteterne.

Den foreliggende opfindelse tager derfor sigte på at angive en fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider, som muliggør den fuldenzymatiske forsæbning og bestemmelse, 25 hindrer uklarheder, som fremkaldes ved hjælp af frigjorte fedtsyrer, og ikke på uheldig måde påvirker enzymaktiviteten.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art, som er ejen-30 dommelig ved, at forsæbningen foretages i nærværelse af yderligere en forbindelse med den almene formel RO(Cl^-CH90) H, hvori R betyder en alkyl- eller alkenylgruppe med 14 til 20 carbonatomer, og n betyder et tal fra 7 til 20.

2 144858

Fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.327.894 kendes allerede en fremgangsmåde til forhindring af uklarhed i blodprøver eller serum, hvilken uklarhed fremkaldes af trigly= cerider og altså ikke af forsæbningsprodukter deraf. Ifølge 5 denne fremgangsmåde tilsættes prøven en polyoxyethyleret laurinsyreforbindelse med 9 til 20 mol ethylenoxid. Forsøg viste, at med dette middel kunne de ved den enzymatiske spaltning af triglyceriderne optrædende uklarheder ikke forhindres, og endvidere, at der skete en hæmning af lipo= ]_q lysen. Den nævnte forbindelse er derfor uegnet til løsning af det til grund for opfindelsen liggende problem.

Til fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis en lipase fra Rhizopus arrhizus. Der kan imidlertid også anvendes andre lipaser, uden at reaktionsvarigheden og reak-tionstemperaturen behøver at blive forøget. Brugbarheden af en lipase ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmes delvis også ved hjælp af carboxylesterasen. Som carboxyl= esterase anvendes fortrinsvis en kendt esterase fra mikroorganismer* Den ved fremgangsmåden omhandlet i nævnte be-2ø skrivelse til ansøgning nr. 2452/73 opnåede aktivering af lipasen ved hjælp af alkylsulfat bliver derved ikke blot opnået, men det lykkes endog yderligere at formindske varigheden og reaktionstemperaturen i forhold til varigheden og reaktionstemperaturen ved den kendte fremgangsmåde.

25 Ifølge opfindelsen foretrækkes anvendelsen af forbindelser med den i krav 1 angivne almene formel, hvori n betyder et tal fra 9 til 15. Især foretrækkes forbindelser, hvori n er lig med 12.

Forbindelserne med den i krav 1 angivne almene formel an-3Q vendes hensigtsmæssigt i mængder fra 0,015 til 0,3 mg pr. ml måleopløsning.

U4856 3

Kobolt- og/eller magnesiumioner kan tilsættes til yderligere reaktionsfremskyndelse, da disse ioner har en vis aktiverende virkning på lipasen eller esterasen.

Ved tilsætning af serumalbumin undgås en uklarhed som følge 5 af udfældede sæber pålideligt, så at sådanne sæber ikke behøver at blive fraskilt, f.eks. ved hjælp af centrifugering. Serumalbumin tilsættes hensigtsmæssigt i en mængde på mellem 0,1 og 2,0 mg pr. ml måleopløsning.

En tilsætning af serumalbumin, især kvægserumalbumin, fore-10 trækkes, når prøven ikke indeholder fra protein associerede triglycerider.

Som puffere kan anvendes alle puffere, der er virksomme indenfor pH-området 6-9, fortrinsvis mellem 7 og 8,5. Eksempler på egnede puffere er triethanolaminpuffer, trispuf-15 fer, imidazolpuffer, veronalpuffer, glycinpuffer samt, mindre foretrukket, amediolpuffer, boratpuffer og collidin-puffer.

Til forskel fra fremgangsmåden ifølge ansøgning nr. 2452/73 egner imidlertid også phosphatpuffere sig ved den forelig-20 gende fremgangsmåde og er endog foretrukne. Som særligt egnet viste sig en 0,02-0,1 M phosphatpuffer med pH fra 6,5 til 8,0.

Opfindelsen angår endvidere et reagens til anvendelse ved den omhandlede fremgansmåde.

25 Reagenset til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge op- 4 144356 findelsen, som indeholder lipase, især fra Rhizopus arrhizus, carboxylesterase, alkalimetal- eller jordalkalimetalalkyl= sulfat med 10 til 15 carbonatomer i alkylgruppen, puffer og et system til påvisning af glycerol, er ejendommeligt 5 ved et indhold af yderligere en forbindelse med den almene formel RO(CH2CH20)nH, hvori R betyder en alkyl- eller alkenyl= gruppe med 14 til 20 carbonatomer, og n betyder et tal fra 7 til 20.

Ligesom ved fremgangsmåden ifølge ansøgning nr. 2452/73 kan 10 der ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse principielt anvendes ethvert system til påvisning af glv= cerol, idet der dog foretrækkes et påvisningssystem, som består af NADH, ATP, PEP, LDH, PK, GK samt magnesiumioner og puffer.

15 Et særlig egnet reagens indeholder pr. ml måleopløsning 0,1 til 10,0 mg lipase fra Rhizopus arrhizus, 0,01 til 20,0 mg carboxylesterase fra mikroorganismer, 0,01 til 0,2 mg natriumdodecylsulfat, 0,015 til 0,3 mg af en blanding af cetyl- og stearyl= 20 polyglycolether med 12 mol ethylenoxid, 1 til 20 mmol nicotinamid-adenin-dinucleotid i reduceret form (NADH), 10 til 100 mmol adenosintriphosphat (ATP), 2 til 20 mmol phosphoenolpyruvat (PEP), 25 0,05 til 5 mg lactatdehydrogenase (LDH), 0,2 til 5 mg phosphoenolkinase (PK), 0,05 til 10 mg glycerolkinase (GK), 0,1 til 2,0 mg serumalbumin, 3 til 30 mmol magnesiumioner, og 30 0,012 til 0,3 molær pufferopløsning, pH 6 til 9.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forøger præcisionen ved bestemmelsen yderligere. Endvidere er det muligt at for- U4856 5 mindske den samlede tid til gennemførelse af en bestemmelse til 10 minutter og derved at arbejde ved stuetemperatur.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

EKSEMPEL· 1 5 Et reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles ud fra 1. Pufferopløsning: 0,05 mol natriirniphosphatpuffer pH 7,0 inde holdende 4 rrrtol magnesiumsulfat, 0,01% natriumdodecylsulfat, 10 0 ,015% blanding af ætyl- og stearylalkohol= polyglycolether med 12 mol ethylenoxid.

2. Coenzymbianding: 10 mmol NADH

22 mmol ATP-natriumsalt 18 mmol PEP-cyklohexylammoniumsalt.

15 3. Enzymblanding: 400 E/ml lipase (Rhizopus arrhizus) 50 E/ml carboxylesterase (mikroorganismer) 50 E/ml PK (kaninmuskel) 300 E/ml LDH (svinehjerte) som sus-2Q pension i ammoniumsulfatopløsning.

4. 150 E/ml glycerolkinase,suspenderet i ammoniumsulfat opløsning.

Blandingerne 1 til 4 er ved +4°C holdbare i mindst 1 år.

Blanding 2 er efter opløsning ved denne temperatur holdbar 25 i ca. 2 uger.

Af reagenserne 1 til 3 fremstilles en reaktionsblanding, som i kølet tilstand er holdbar i ca. 2 dage. Blanding 2 144856 6 opløses dertil forinden i destilleret vand. Til opnåelse af den færdige reaktionsblanding blandes derpå opløsningerne 1 og 2 samt suspensionen 3 i volumenforholdet 50:1,0:1,0.

Bestemmelsen kan gennemføres med eller uden blindværdi.

5 Gennemførelse af bestemmelsen med prøveblindværdi: 5,0 ml reaktionsblanding af 1, 2 og 3 blandes med 0,1 ml serum. Deraf udtages 2,0 til 2,5 ml og blandes med 0,01 ml suspension 4 (prøve). Resten tjener som prøveblindværdi.

Begge opløsninger lades henstå i ca. 10 minutter ved ca.

10 20 til 25°C, og prøvens ekstinktion i forhold til prøve- blindværdien måles. Den fundne værdi anvendes til beregningen.

Bestemmelse uden prøveblindværdi: 2,5 ml af reaktionsblandingen af 1, 2 og 3 blandes med 0,05 15 ml serum, lades henstå i ca. 10 minutter ved ca. 20 til 25°C, og ekstinktionen af denne opløsning aflæses. Derpå iblandes 0,01 ml suspension 4, og efter 10 minutter aflæses ekstinktionen atter. Forskellen mellem de to målinger anvendes til beregningen. Målingen foregår i et fotometer ved 365 nm, 20 340 nm eller'334 nm.

Beregningen foregår alt efter målebølgelængden ved multiplikation af ekstinktionsforskellen med 15,5 (365 nm) eller 8,23 (340 nm) eller 8,53 (334 nm), idet resultatet opnås i mmol triglycerid pr. liter prøve, 25 Gentagelse af bestemmelsen med forskellige mængder triglycerid i serum resulterer i en ret linie. Proportionaliteten r (korrelationskoefficienten) er lig med 0,997.

7 U6856 EKSEMPEL 2

Til sammenligning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen og det dertil benyttede reagens med henholdsvis fremgangsmåden og reagenset ifølge ansøgning nr. 2452/73 blev der gennemført 5 følgende forsøg:

Forsøg 1 og 2.

4,9 ml af komponent 1 i eksempel 1 ifølge ansøgning nr.

2452/73, 0,2 ml af komponent 2 i eksempel 1 ifølge ansøgning nr.

10 2452/73, 0,1 ml af komponent 3 + 4 i eksempel 1 ifølge ansøgning nr. 2452/73, og 0,1 ml serum (ca. 500 mg% triglycerid) blev blandet. Af denne opløsning blev 2,5 ml anbragt i cu-15 vette 1, medens resten blev bragt i cuvette 2.

Forsøg 3 og 4.

5 ml af pufferopløsning 1 ifølge eksempel 1, 0,1 ml coenzymblanding 2 ifølge eksempel 1, 0. 1 ml enzymblanding 3 ifølge eksempel 1, og 20 0,1 ml serum (som ved forsøg 1 og 2) blev blandet. Af den opnåede opløsning anbringes 2,5 ml i cuvette 3, medens resten anbringes i cuvette 4.

Efter ca. 20 minutter afpipetteres 0,01 ml GK-suspension i hver af cuvetterne 1 og 3. Cuvetterne 2 og 4 anvendes som 25 prøveblindværdi.

Resultater: 1. Genfindelse efter vurdering med prøveblindværdi:

Claims (6)

144856 Cuvette 1/2 517 mg triglycerid/100 ml serum ] 1Q Cuvette 3/4 508 mg triglycerid/100 ml serum ) Genfindelse efter vurdering uden prøveblindværdi: Cuvette 1 477 mg triglycerid/100 ml serum j efter 10 minutter 5 Cuvette 3 513 mg triglycerid/100 ml serum ) Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen måles praktisk taget identiske værdier uden og med hensyntagen til en prøveblindværdi. Ved fremgangsmåden ifølge ansøgning nr. 2452/73 opnås afvigende resultater (forårsaget af optrædende uklarheder), 10 og forskellen andrager i det foreliggende eksempel ca. 8%.

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider i en 20 vandholdig væske, såsom serum,ved hjælp af enzymatisk forsæbning med lipaser, især fra Rhizopus arrhizus, i nærværelse af såvel lipase som en carboxylesterase og et alkalimetal- eller jordalkalimetalalkylsulfat med 10 til 15 car= bonatomer i alkylgruppen og måling af den frigjorte glyce= 25 rol, kendetegnet ved, at forsæbningen foretages i nærværelse af yderligere en forbindelse med den almene formel R0(CH2CH20)nH (i), hvori R betyder en alkyl- eller al= kenylgruppe med 14 til 20 carbonatomer, og n betyder et tal fra 7 til 20. 1U856

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en forbindelse med den almene formel (1), hvori n er et helt tal fra 9 til 15.

2. Uklarhed. Umiddelbart efter prøvetilsætningerne var alle forsøgsmængder næsten klare. I cuvette 1 og 2 indtræder efter 5 minutter en tydelig uklarhed. I cuvette 3 og 4 indtræder -|_5 efter 1/2 minut en klaring. Efter 55 minutter var opløsningen i cuvette 4 endnu klar, medens opløsningen i cuvette 2 var meget uklar. Patentkrav.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2,kendetegnet 5 ved, at der anvendes en forbindelse med den almene formel (l), hvori n betyder tallet 12.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at der anvendes 0,015 til 0,3 mg af forbindelsen med den almene formel (l) pr. ml måleopløs-10 ning.

5. Reagens til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 tilk og indeholdende lipase, især fra Rhizopus arrhizus, carboxylesterase, alkalimetal- eller jordalkalimetalalkylsulfat med 10 til 15 carbonatomer i 15 alkylgruppen, puffer og et system til påvisning af glyce= rol, kendetegnet ved et indhold af yderligere en forbindelse med den almene formel R0(CH2CH20)nH (l), hvori R betyder en alkyl- eller alkenvlgruppe med 14 til 20 car= bonatomer, og n betyder et tal fra 7 til 20.

6. Reagens ifølge krav 5, som pr. ml måleopløsning inde holder 0,1 til 10 mg lipase fra Rhizopus arrhizus, 0,01 til 20,0 mg carboxylesterase fra mikrooganismer, 0,01 til 0,2 mg natriumdodecylsulfat, 25. til 20 mmol nicotinamid-adenin-dinucleotid i reduceret form, 10 til 100 mmol adenosintriphosphat, 2 til 20 mmol phosphoenylpyruvat, 0,5 til 5 mg lactatdehydrogenase,