FI70044C - Foerfarande och reagens foer aktivering av kolesterinesteras - Google Patents
Foerfarande och reagens foer aktivering av kolesterinesteras Download PDFInfo
- Publication number
- FI70044C FI70044C FI800743A FI800743A FI70044C FI 70044 C FI70044 C FI 70044C FI 800743 A FI800743 A FI 800743A FI 800743 A FI800743 A FI 800743A FI 70044 C FI70044 C FI 70044C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- addition
- ext
- surfactant
- alcohol
- cholesterol esterase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
ΓΒΐ /ιι\ ^ u u L UTU SJ U L K AIS U *70044 ä§F$ ^ (11* UTLÄGGNINGSSKRIFT / U U 4 4 C ,,,, Patentti myönnetty
Potent me Mel-1 12 CO 1336 ^ ^ ' (51) Kv.lk//lnt.CI/ C 12 N 9/18 (21) Patenttihakemus — Patentansftkning 800743 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 1 1 .03.80 (F») (23) Alkupäivä — Glltighetsdag 11 .03.80 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvit often tl ig 23.09 .80
Patentti- ja rekisterihallitus Njhtäviksipanon Ja kuul.julkaisun pvm.— 31 _ o 1.86
Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansftkan utlagd och utl.skrlften publlcerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prloritet 22.03.79 Saksan 1i i ttotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2911284.3 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, 6800 Mannheim--Waldhof, Saksan 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Sigmar Klose, Berg, Herbert Buschek, Starnberg, Helmut Sch1umberger, Polling, Saksan 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (74) Berggren Oy Ab (54) Menetelmä ja reagenssi kolesteriiniesteraasin aktivoimiseksi -Förfarande och reagens för aktivering av kolesterinesteras
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ja välinettä koleste-riiniesteraasin aktivoimiseksi erikoisesti estereiden entsy-maattisen reaktion aikana reaktioseoksessa. Tällaisia reak-tioseoksia käytetään mm. kliiniskemiallisessa analytiikassa ja elintarvikekemiallisessa analytiikassa.
Tunnettuja probleemeja kolesteriiniesterikokeita suunniteltaessa ovat kalliin entsyymin säästäminen, suuremman reaktionopeuden aikaansaaminen ja mahdollisimman vapaa pinta-aktiivisten aineiden ja puskureiden laadun ja pitoisuuden valintamahdollisuus edellä esitetyt seikat huomioonottaen.
Puskuroidussa väliaineessa, joka ei sisällä muita aineosia, on kolesteriiniesteraasilla substraatteihinsa nähden erittäin vähäinen tai ei minkäänlaista aktiivisuutta. Tämän johdosta on tarpeellista löytää entsyymiä aktivoivia lisäaineita, jonka johdosta estereiden lohkeaminen kasvaa. Tällaisina aktivoivina aineina tunnetaan eräitä pinta-aktiivisia aineita (US-patent-ti 3 884 764, DE-OS 24 09 696, DE-OS 25 12 605, DE-OS 25 12 585, 70044 2 DE-PS 2 506 712, Biochim. Biophys Acta 270 (1972) s. 156-166, esimerkiksi sappihapot, Triton X-100, Thesit).
Suurempi väliaineen suolapitoisuus lisää sen aktivoivaa vaikutusta. Kaikki puskurijärjestelmät eivät kuitenkaan ole samalla tavoin sopivia. Samoin on asianlaita pinta-aktiivisten aineiden suhteen. Tällöin määrätyissä olosuhteissa esiintyy sellaisia, joilla on parempi tai huonompi vaikutus aina sellaisiin saakka, joilla ei ole minkäänlaista vaikutusta. Minkälainen pinta-aktiivinen aine on tässä suhteessa sopiva, on vaikeata ennakolta tietää.
Aktivoiduille pinta-aktiivisille aineille on yhteistä, että ne kehittävät esitetyssä väliaineessa määrätyllä väkevyysalueel-la optimiaktiivisuuden. Optimiarvot voivat olla liian korkeilla väkevyysalueilla. Optimiarvojen ulkopuolella ei suhteellisen kalliin entsyymin suurempi lisätty määrä reagoi optimaalisesti suurella reaktionopeudella.
Sitä paitsi aikaansaadaan aktiviteetin lisäys optimoimalla pinta-aktiivisen aineen pitoisuus ja nostamalla ioniväkevyyttä ainoastaan suhteellisen ahtaissa rajoissa.
Koska kysymykseen tulevat reaktioseokset sisältävät säännöllisesti myös muita myöhempien ja indikaattorireaktioiden entsyymejä ja substraatteja, ei valittaessa puskureita ja pesuaineita sekä optimoitaessa kulloinkin lisättyjä määriä voida käyttää vapaata valintaa.
Reaktio-olosuhteita määrättäessä on päin vastoin otettava huomioon kaikkien reaktioon osaaottavien aineiden vuorovaikutus, erikoisesti muiden entsyymien mahdollinen estyminen tai haitallinen vaikutus stabiilisuuteen pinta-aktiivisista aineista ja/ tai suuresta ioniväkevyydestä johtuen.
Edelleen on koejärjestelmiä suunniteltaessa otettava huomioon galeeniset liukoisuusrajat ja probleemat.
Viimemainitussa tapauksessa voidaan juoksevista vahamaisiin pinta-aktiivisia aineita lisätä harvoin aktivoimiseen tarpeel- 3 '· *·’ ‘ .....
70044 lisissä määrissä kiinteiden aineiden seoksiin, joiden tulee olla kuivia ja valumiskykyisiä. Tällä on erikoisesti merkitystä lisäysreagensseista puheenollen.
Lopuksi on otettava huomioon, että useimmiten kysymykseen tulevat pinta-aktiiviset aineet eivät ole määrättyjä yhdisteitä vaan yhdisteseoksia. Tämän johdosta niissä esiintyy laatueroja, jotka ilmenevät myös aktivoivassa vaikutuksessa. Tämän johdosta voi olla erittäin haitallista jos aktivointi on pelkästään riippuvainen pinta-aktiivisesta aineesta.
Tämän johdosta on olemassa huomattava tarve kolesteriini-esteraasin aktivoimiseksi käyttäen muita ja parempia menetelmiä ja aineita.
Esillä olevan keksinnön tehtävänä on välttää edellä mainitut haitat ja aikaansaada mainitunlainen menetelmä ja väline, joiden avulla kolesteriiniesteraasia voidaan säästää, voidaan aikaansaada määrätyissä olosuhteissa suurempi reaktionopeus, voidaan työskennellä käyttäen pienempää ioniväkevyyttä, on tarpeellista käyttää pinta-aktiivisia aineita ainoastaan erittäin pienissä väkevyyksissä, ja voidaan käyttää myös sellaisia pinta-aktiivisia aineita, joilla sellaisinaan on ainoastaan huono aktivoiva vaikutus tai ei tätä ollenkaan.
Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmän avulla kolesteriiniesteraasin aktivoimiseksi ionipitoisissa liuoksissa lisäämällä ainakin yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka perustuu polyetoksieetteriin tai -esteriin ja/tai sappihappoyhdisteeseen ja/tai sellaisten rasvahappojen suolaan, joissa on 6-10 hiiliatomia, ja keksinnölle on tunnusomaista, että pinta-aktiivista ainetta lisätään yhdessä ainakin yhden synergistisesti vaikuttavan alkoholin kanssa, joka on suoraketjuinen, haarautunut tai syklinen alifaattinen alkoholi, jossa on 5-12 hiiliatomia, mahdollisesti halogeenisubstituoitu aromaattinen alkoholi tai useammilla halogeeniatomeilla substituoitu alifaattinen alkoholi, jossa on 1-3 hiiliatomia.
70044 4
Keksintö perustuu sen seikan yllättävään toteamiseen, että mainitut alkoholit, joilla sinänsä ei ole minkäänlaista aktivoivaa vaikutusta kolesteriiniesteraasiin, vahvistavat huomattavasti synergistisesti määrättyjen pinta-aktiivisten aineiden sinänsä tunnettua aktivoivaa vaikutusta, ja käytettäessä niitä yhdessä sinänsä ei-aktivoivien pinta-aktiivisten aineiden kanssa, aikaansaavat niiden aktivoitumisen.
Tämä aiheuttaa sen, että tällaisia ei-aktivoituja, yleisesti kaupan olevia pinta-aktiivisia aineita voidaan käyttää. Samalla tavoin tulevat käyttökelpoisiksi määrätyn molekyylirakenteen-sa ja kiinteän konsistenssinsa johdosta halutut, mutta huonompien aktivoivien ominaisuuksiensa johdosta tähän asti sopimattomat ioniset pinta-aktiiviset aineet. Edelleen voidaan säästää entsyymiä, korottaa saavutettavissa olevaa maksimaalista reaktionopeutta, alentaa tarpeellista ioniväkevyyttä ja lopuksi erilaisten kombinaatiomahdollisuuksien johdosta sopeuttaa esteraasi-aktivoimisjärjestelmä reaktioseoksen muiden aineosien määräämiin olosuhteisiin.
Esimerkkejä keksintöön sopivista polyetoksieettereistä ovat rasva-alkoholi-polyglykolieetteri, kuten polyoksietyleeni, lau-ryylieetteri ja hydroksipolyetoksidodekaani, alkyyliaryylieet-teri ja aryylialkyylieetteri, kuten polyoksietyleeninonyylifenyy-lieetteri ja polyoksietyleeni-oktyylifenyylieetteri, rasvahappo-esterit, kuten polyoksietyleenisorbitaani-monolauraatti yms. Sappihappoyhdisteistä ovat edullisia koolihappo, desoksikooli-happo ja näiden alkalisuolat. Rasvahapposuoloista ovat alkali-suolat, aivan erikoisesti natriumsuolat, edullisia.
Tyypillisiä esimerkkejä keksinnön toteuttamiseen sopivista suoraketjuisista, haarautuneista tai syklisistä alifaattisista alkoholeista ovat pentanoli, tert-amyylialkoholi, metyylipen-tanoli, heksanoli, sykloheksanoli, oktanoli, iso-oktanoli, dekanoli ja dodekanoli. Esimerkkejä sopivista aromaattisista alkoholeista ovat fenoli ja dihydroksinaftoli. Edullisia ovat halogeenisubstituoidut fenolit ja naftolit, kuten mono-, di- ja trikloorifenoli. Useamman kerran halogeenisubstituoi-duista alifaattisista alkoholeista voidaan käyttää esimerkiksi dikloorietanolia, trikloorietanolia, dikloorimetanolia, 5 70044 trikloorimetanolia, triklooripropanolia, tetraklooripropanolia yms. Halogeenisubstituenteista tulevat kysymykseen aromaattisissa ja alifaattisissa alkoholeissa kloori, bromi ja fluori, edullisesti kloori. Aromaattisissa alkoholeissa voi olla myös yksi tai kaksi alkyyliryhmää, joissa on 1-2 C-atomia.
Mikä näistä alkoholeista (nimitetään seuraavassa lisäaineiksi) soveltuu erikoisesti määrätyssä tapauksessa käytettäväksi, voidaan määrätä helposti esikokeiden avulla. Tavallisesti määräävät olosuhteet, kuten puskurijärjestelmän laatu ja voimakkuus, pinta-aktiivisen aineen laadun ja väkevyyden, sekä reaktio-seoksen säilytvsmuodon säilyvyyden ja halutun konsistenssin.
Nämä olosuhteet voidaan aikaansaada valitsemalla sopivasti lisäaineet ja käyttämällä niitä sopivia määriä. Yleensä on todettu, että väkevyydet 1-300 mM lisäainetta/1 aikaansaavat hyvän tuloksen .
Alkoholeja lisätään edullisesti määrässä välillä 0,01 ja 5 %, jolloin juoksevista alkoholeista kysymyksen ollessa käytetään tilavuus-% ja kiinteistä alkoholeista kysymyksen ollen paino-%. Erittäin edullista on käyttää 0,05-3 % määriä.
Polyetoksijohdannaisissa sisältävät alkyyliryhmät yleensä 8-22 C-atomia ja aralkyyli- ja alkyyliaryyliryhmät edullisesti fe-nyylijäännöksen. Näiden pinta-aktiivisten aineiden glykolijään-nöksessä on yleensä 3-25 oksietyleeniryhmää.
Pinta-aktiivisia aineita lisätään tarkoituksen mukaisesti määrässä välillä 0,05-5 tilavuus-%, vast, paino-% kiinteiden aineiden kysymyksessä ollessa. Edullisin käyttöalue on 0,1-3 %.
Keksinnön toisena tarkoituksena on aikaansaada väline koleste-riiniesteraasin aktivoimiseksi ionipitoisessa liuoksessa, joka sisältää vähintään yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka perustuu polyetoksieetteriin tai -esteriin ja/tai sappihappoyhdisteeseen ja/tai sellaisten rasvahappojen suolaan, joissa on 6-10 hiili-atomia, jolle on tunnusomaista se, että se sisältää synergistisesti vaikuttavaa alkoholia, joka on suoraketjuinen, haarautunut tai syklinen alifaattinen 6 7 C O 4 4 alkoholista, jossa on 5-12 hiiliatomia, mahdollisesti halogeeni-substituoitu aromaattinen alkoholi tai halogecnisubstituoitu alifaattinen alkoholi, jossa on 1-3 hiiliatomia.
Keksintö on käyttökelpoinen kaikkien sellaisten mittausten ja reaktioiden yhteydessä, joissa kolesteriiniesteraasia käytetään reaktioseoksessa. Tällaiset reaktioseokset ovat asiantuntijalle yleisesti tunnettuja ja niitä on kuvattu, mikäli niitä käytetään analyyttisissä tarkoituksissa, esimerkiksi H.U. Bergmeyer'in kirjassa "Methoden der enzymatischen Analyse",
Verlag Chemie Weinheim, Bergstrasse. Tällaisten reaktioseosten lähempi selittäminen on tämän johdosta jätetty pois tässä yhteydessä. Keksinnön avulla tulee mahdolliseksi säästää entsyymiä, aikaansaada esitetyissä olosuhteissa suurempi reaktionopeus, lisätä pienemmän ionivahvuuden omaavaa puskuria, käyttää pinta-aktiivisia aineita pienemmässä väkevyydessä ja käyttää myös sellaisia pinta-aktiivisia aineita, joilla on ainoastaan riittämätön aktivoiva vaikutus tai ei tätä ollenkaan. Keksintö soveltuu käytettäväksi käsiteltäessä sellaisia kolesteriiniesteraa-seja, jotka ovat peräisin mikro-organismeista tai muista lähteistä kuten haimasta tai maksasta.
Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä edelleen oheen liitettyyn piirustukseen viitaten. Tässä piirustuksessa esittävät:
Kuvio 1 kaaviollisesti käytettyä laitteistoa kolesteriini-esteraasiaktiviteetin määräämiseksi, kuvio 2 graafisesti käytetyssä menetelmässä esiintyvää ekstink-tiomuutosta aikayksikössä, jota käytettiin esterin lohkaisu-nopeuden ilmoittamiseksi.
Seuraavassa taulukossa on esitetty tavaramerkeillä tunnistettujen pinta-aktiivisten aineiden koostumus: 7 70044 "Brij 35" Polyoksietyleeni-lauryylieetteri "Genapol OX-lOO" Rasva-alkoholi-polyglykolieetteri "Tergitol NPX" Polyoksietyleeninonyyli-fenyyli- eetteri (noin 10,5 oksietyleeniryhmää) "Thesit" Hydroksipolyetoksidodekaani "Triton X-lOO" Polyetoksioktyylifenyylieetteri (9-10 oksietyleeniryhmää) "Tween 20" Polyoksietyleeni-sorbitaanimono- lauraatti.
Keksinnön mukaisen tutkittavan synergistisen yhdistelmän aktivoivan vaikutuksen tutkimiseksi kolesteriiniesteraasiin käytettiin kuviossa 1 esitettyä laitteistoa.
Hehkutusta kestävästä reaktioastiasta 1 (25°C), jossa esterin lohkeaminen tapahtuu, poistetaan letkupumpun 2 avulla poistoletkun 3 kautta, jolla on määrätty poikkileikkaus, jatkuvasti 0,32 ml seosta minuutissa. Saman pumpun avulla johdetaan toisen letkun 4 kautta varastoastiasta 5 myös jatkuvasti 1,0 ml indikaat-toriliuosta minuutissa, pumpun 2 jälkeen suoritetaan yhdistäminen ilmavirran 6 kanssa, jonka vakionopeus on 0,6 ml ilmaa/ minuutti, ja täten suoritetaan sedimentointi, ja tämän jälkeen se yhdistetään edellä mainitun reaktioseosvirran kanssa. Yhdistetty virta kulkee sitten kahden lasiputken 7 kautta, jolloin aikaansaadaan nesteiden sekoittuminen ja indikaattori-reaktion tarpeellinen reaktioaika loppupisteeseen saakka. Poistamalla 1,2 ml/minuutti suuruinen virtaus välittömästi ennen maljaa letkun 8 kautta pystysuoraan ylöspäin, poistetaan ilmakuplat uudelleen. Sedimentoitu jätevirta johdetaan foto-metriseen mittaukseen (546 nm) läpivirtausmaljaan (1 cm:n paksuinen kerros) ja mittausarvot rekisteröidään kirjoittimen 10 avulla.
Vakio-olosuhteiden johdosta, mitä tulee indikaattorireaktioon, riippuvat mittaussignaalien korkeudet ja niiden kulku pelkästään reaktioastian tapahtumista. Mikäli tällöin tapahtuu esterin lohkeaminen, vaikuttaa sen kineettinen tapahtuminen mittaussignaalin kasvuun, joka rekisteröidään kirjoittimessa 10 positiivisena kasvuna. Kasvun jyrkkyys on reaktionopeuden mittapuu ja myös reaktioseoksessa olevan kolesteriiniesteraasiak-tiivisuuden mittapuu.
70044 8
Johtuen esterin lohkeamisen ja indikaattorireaktion erillisestä tapahtumisesta, eivät ne voi vaikuttaa toisiinsa. Luonnollisesti voidaan käyttää myös muita indikaattorijärjestelmiä, kuten happielektrodeja.
Indikaattoriliuos: 0,1 m kaliumfosfaattipuskuri, pH 7,0 1,5 mM/1 4-amino-antipyriini 5 mM/1 fenoli 3 % hydroksipolyetoksidodekaani 8 U/ml peroksidaasi 1 U/ml kolesteriinioksidaasi
Indikaattoriliuos muuttaa ensin vapaan kolesteriinin kolesteno-niksi ja H20:ksi. Muodostunut H20 saatetaan reagoimaan fenolin ja 4-amino-antipyriinin kanssa punaiseksi väriaineeksi, jonka absorptio mitataan fotometrisesti. Syntyneen väriaineen väkevyys on suhteessa vapaan kolesteriinin määrään. Vapaan kolesteriinin väkevyys riippuu substraatissa jo olemassa olevasta koles-teriinimäärästä sekä esteraasin vapauttaman kolesteriinin määrästä .
Reaktioastian sisältö: 0,5 ml substraattia (vertailuseerumi 360 mg kolesteriiniä kaikkiaan/dl)
Pinta-aktiivista ainetta, kokeesta riippuen Lisäaineita, kokeesta riippuen Puskuri, 5 ml:n määrään saakka.
Alussa käytetään 50 ^ul esteraasi-perusliuosta, jonka jälkeen esteraasin määrä on 0,003 U/ml. Aktiviteettikokeessa vaihdeltiin tätä määrää.
Kokeen alkamisen ja sekoittamisen jälkeen upotetaan pumpun 2 toimiessa siirtoletku 3 reaktioastiassa 1 olevaan liuokseen noin 10 minuutin ajaksi. Tämän jälkeen imetään signaalien paremman erottamisen aikaansaamiseksi kulloinkin noin 10 segmentistä vuorotellen ilmaa ja kahdesti tislattua vettä. Tämän jälkeen voi tapahtua seuraava rnääritys.
9 70044
Alla olevissa esimerkeissä on esitetty keksinnön avulla mahdollistunut entsyymin säästö (a), suurempien reaktionopeuksien aikaansaaminen määrätyissä olosuhteissa (b), pienemmän ioni-vahvuuden omaavan puskurin käyttö (c), pinta-aktiivisten aineiden lisäys pienemmässä väkevyydessä (d), ja myös sellaisten pinta-aktiivisten aineiden käyttö, joille määrätyissä olosuhteissa on ainoastaan riittämätön aktivoiva vaikutus tai joilla ei ole tällaista vaikutusta ollenkaan (e).
a) Kolesteriini-esteraasin säästäminen.
Kolesteriini-esteraasin säästämismahdollisuus esitetään seu-raavalla tavalla:
Ensin suoritetaan entsyymiaktiviteetin porrastus ilman että lisäaineita on läsnä. Vertailumittaukset tapahtuvat sitten lisäämällä lisäaineita kolesteriini-esteraasi-lisäyksen ollessa 0,003 U/ml. Aikaansaadun aktiivisuuden ja tämän seurauksena olevan nopeuden välisen suhteen perusteella ilmoitetaan sitten saavutettu aktiviteetin lisäys.
Esimerkki 1 0,1 M tris/viinihappo-puskuri, pH 8,0 5 % "Triton X-100"
Lisätty aktiivisuus Aikaansaatu nopeus 0 U/ml 0 ekst/10 min 0,0012 0,012 0,0030 0,032 0,0045 0,052 0,0060 0,058 0,0089 0,094 1.1 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholia
Lisätty aktiivisuus 0,0030 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,046 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0044 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 147 % 70044 10 1.2 Lisäys 0,4 tilavuus-% 4-raetyylipentanoii-(2)
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,065 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0063 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 210 % 1.3 Lisäys 1 tilavuus-% sykloheksanolia
Lisätty aktiivisuus 0,0030 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,077 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0075 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 250 %
Esimerkki 2 0,1 M kaliumfosfaattipuskuri, pH 7,0 1,5 % "Tergitol NPX"
Lisätty aktiivisuus Aikaansaatu nopeus 0,0012 U/ml 0,019 ekst./10 min 0,0030 U/ml 0,030 ekst./10 min 0,0060 U/ml 0,055 ekst./10 min 0,0090 U/ml 0,091 ekst./10 min 0,0120 U/ml 0,120 ekst./10 min 2.1 Lisäys 0,4 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,046 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0046 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 153 % 2.2 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholi
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,053 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0053 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 177 % 11 70044 2.3 Lisäys 1,4 tilavuus-% 4-metyylipentanoli-(2)
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,059 ekst./lo min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0059 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 197 % 2.4 Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,114 ekst./lO min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0114 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 380 %
Esimerkki 3 0,3 M kaliumfosfaattipuskuri, pH 7,0 5 % "Genapol 0X-100"/5 % Na-kaprylaattia
Lisätty aktiivisuus Aikaansaatu nopeus 0,0012 U/ml 0,01 ekst./10 min 0,0030 U/ml 0,023 ekst./10 min 0,0060 U/ml 0,038 ekst./lO min 0,0090 U/ml 0,055 ekst./lO min 0,0150 U/ml 0,093 ekst./10 min 0,0240 U/ml 0,138 ekst./lO min 3.1 Lisäys 4 mM/1 3,4-dikloorifenolia (0,065 paino-%)
Lisätty aktiivisuus 0,0030 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,058 ekst./lo min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0093 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 310 % 3.2 Lisäys 10 mM/1 (noin 0,09 paino-%) fenolia
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,064 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0104 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 347 % 70044 12 3.3 Lisäys 1 tilavuus-% 4-metyylipentanolia-(2)
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,069 ekst./10 min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0112 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 373 % 3.4 Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,080 ekst./lO min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0129 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 430 % 3.5 Lisäys 0,3 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia
Lisätty aktiivisuus 0,003 U/ml
Aikaansaatu nopeus 0,089 ekst./lO min
Tarpeellinen entsyyminlisäys tämän nopeuden saavuttamiseksi ilman lisäaineita 0,0144 U/ml
Aikaansaatu aktiivisuus 480 % b) Suuremman reaktionopeuden aikaansaaminen esitetyissä olosuhteissa.
Useissa tapauksissa ovat määrätyt olosuhteet, kuten puskuri ja ioniväkevyys sekä reaktioseoksessa olevan pinta-aktiivisen aineen laatu, ennakolta määrättyjä edellä esitettyjen syiden johdosta. Tällaisia syitä voivat olla esimerkiksi toisen vielä seoksessa tarvittavan entsyymin suurempi herkkyys. Näissä tapauksissa on kolesteriiniesteraasin vakiolisäystä käytettäessä mahdollinen esterilohkaisun maksiminopeus rajoitettu johtuen esteraasiaktivoitumisen riippuvuudesta pinta-aktiivisen aineen laadusta ja sen väkevyydestä. Tällä riippuvuudella on yleensä optimiarvo pinta-aktiivisen aineen alemmalla väkevyysalueella. Tässä vaiheessa saavutettu nopeus ei ole ylitettävissä edellä esitetyissä olosuhteissa ja asettaa tässä suhteessa järjestelmälle määrätyt rajat.
13 70044
Seuraavissa esimerkeissä kuvatuilla keksinnön mukaisten yhdisteiden avulla on tarkoituksena ylittää nämä rajat.
Esimerkki 4
Seoksen aineosat: 0,1 M tris/viinihappo-puskuri, pH 8,0 "Triton X-100" 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia % "Triton X-IOO" seoksessa Aikaansaatu nopeus 0 % 0 ekst./10 min 1 % 0,003 ekst./10 min 3 % 0,028 ekst./10 min 5 % 0,037 ekst./10 min 7 % 0,037 ekst./lO min 10 % 0,037 ekst./10 min 15 % 0,029 ekst./10 min
Optimi Järjestelmän rajat 5 % 0,037 ekst./10 min
Lisäaineiden lisäys tapahtuu arvossa 5 % "Triton X-100".
4.1 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholia
Aikaansaatu nopeus 0,046 ekst/10 min
Nousu arvoon 124 % 4.2 Lisäys 0,4 tilavuus-% 4-metyylipentanoli-(2)
Aikaansaatu nopeus 0,065 ekst./10 min
Nousu arvoon 176 % 4.3 Lisäys 1 tilavuus-% sykloheksanolia
Aikaansaatu nopeus 0,077 ekst./lO min
Nousu arvoon 208 %
Esimerkki 5 Käytetty seos: 0,3 M kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0 "Tergitol NPX" 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 700 4 4 % "Tergitol NPX" seoksessa Aikaansaatu nopeus O % O ekst./ΙΟ min 2 % O ekst./10 min 5 % 0,029 ekst./10 min 10 % 0,042 ekst./10 min 15 % 0,049 ekst./10 min 20 % 0,039 ekst./lO min
Optimi Järjestelmän rajat 15 % 0,049 ekst./10 min
Lisäaineiden lisäys tapahtuu käyttäen 15 % "Tergitol NPX" 5.1 Lisäys, jossa 2 mM/1 3,4-dikloorifenolia ja 1 tilavuus-% sykloheksanolia
Aikaansaatu nopeus 0,058 ekst./10 min
Nousu arvoon 118 % 5.2 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholia
Aikaansaatu nopeus 0,066 ekst./10 min
Nousu arvoon 135 % 5.3 Lisäys 1,4 tilavuus-% sykloheksanolia
Aikaansaatu nopeus 0,118 ekst./10 min
Nousu arvoon 241 % c) Pienemmän ionivahvuuden omaavan puskurin käyttö Kuten jo mainittiin, lisää suuremman ionivahvuuden omaava puskuri pinta-aktiivisten aineiden aktivoivaa vaikutusta koles-teriiniesteraasiin nähden. Käytettyjen mahdollisimman vapaiden olosuhteiden valintamahdollisuuksien puitteissa on kuitenkin toivottavaa, ettei liuoksessa esiinny liian suuria suolapitoisuuksia. Seuraava esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaisesti voidaan suolapitoisuuksia pienentää huomattavasti.
Toisiinsa vertaillaan: 0,3 M kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0 70044 15
Lisäämällä sopivia lisäaineita 0,1 m puskurijärjestelmään voidaan nopeuksien antaa nousta siten, että ne saavuttavat 0,3 M puskurijärjestelmän korkeamman vertailuarvon ilman lisäaineita ja osaksi vieläpä ylittävät sen selvästi.
Esimerkki 6 15 % "Tergitol NPX" 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 6.1 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholia Järjestelmä Nopeus 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,030 ekst./10 min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,049 ekst./10 min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,053 ekst./10 min
Vertailuarvo ylitetään.
6.2 Lisäys 1,4 tilavuus-% 4-metyylipentanoli-(2) 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,030 ekst./10 min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,049 ekst./10 min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,059 ekst./10 min
Vertailuarvo ylitetään.
6.3 Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,030 ekst./10 min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,049 ekst./10 min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,114 ekst./lO min
Vertailuarvo ylitetään selvästi.
Esimerkki 7 10 % "Genapol 0X-100"/10 % Na-kaprylaattia 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 7.1 Lisäys 40 mM (noin 0,35 paino-%) fenolia 70044 Järjestelmä Nopeus 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,017 ekst./10 min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,053 ekst./lO min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,053 ekst./10 min
Vertailuarvo saavutetaan.
7.2 Lisäys 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,017 ekst./10 min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,053 ekst./10 min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,063 ekst./lO min
Vertailuarvot ylitetään.
7.3 Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia 0,1 m puskuri ilman lisäystä 0,017 ekst./lO min 0,3 m puskuri ilman lisäystä 0,053 ekst./lO min 0,1 m puskuri lisäyksen kera 0,072 ekts./10 min
Vertailuarvo ylitetään.
d) Pinta-aktiivisten aineiden käyttö pienemmissä väkevyyksissä Mikäli pinta-aktiivinen aine kykenee aktivoimaan kolesteriini-esteraasin, tulee sen esiintyä reaktioseoksessa tämän ominaisuuden täydellisen tehon hyväksikäyttämiseksi määrätyssä väkevyydessä. Tämä pinta-aktiivisen aineen optimi riippuu huomattavasti pinta-aktiivisen aineen laadusta ja se voi olla useissa tapauksissa epäsuotuisan korkealla väkevyysalueella. Tämän johdosta voivat muut jatkoreaktioissa tarpeelliset entsyymit aiheuttaa estyrnisreaktion ja vaikeuksia voi syntyä myös liukoisuuden ja galeenisten ilmiöiden johdosta. Pesuaineoptimin alapuolella voidaan saavuttaa vain epätyydyttävä aktivoiminen. Olosuhteiden mahdollisimman vapaan valinnan kannalta on kuitenkin toivottavaa voida käyttää mahdollisimman useita erilaisia pinta-aktiivisia aineita, myös sellaisia, joiden väkevyysoptimi on suuri.
Alla oleva esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaisesti on mahdollista käyttämällä pienempää pinta-aktiivisen aineen määrää saavuttaa väkevyysoptimin reaktionopeus ja vieläpä ylittää se, jolloin voidaan säästää pinta-aktiivisen aineen määrää.
Esimerkki 8 0,3 m kaliumfosfaattipuskuri, pH 7,0 "Tergitol NPX" 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 17 70044 % "Tergitol NPX" seoksessa Aikaansaatu nopeus O % 0 ekst./lO min 2 % O ekst./10 min 5 % 0,029 ekst./10 min 10 % 0,042 ekst./lO min 15 % 0,049 ekst./10 min 20 % 0,039 ekst./lO min
Optimi Vertailuarvo 15 % 0,049 ekst./lO min 8.1 Lisäys 0,1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus 15 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,049 ekst./10 min 5 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,029 ekst./lO min 5 % "Tergitol" lisäyksen kera 0,059 ekst./lO min
Vertailuarvo ylitetään.
8.2 Lisäys 2 tilavuus-% tert.-amyylialkoholia 15 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,049 ekst./lO min 5 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,029 ekst./lO min 5 % "Tergitol" lisäyksen kera 0,075 ekst./lO min
Vertailuarvo ylitetään selvästi.
8.3 Lisäys 1 tilavuus-% sykloheksanolia Järjestelmä Nopeus 15 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,049 ekst./lO min 5 % "Tergitol" ilman lisäystä 0,029 ekst./lO min 5 % "Tergitol" lisäyksen kera 0,124 ekst./lO min
Vertailuarvo ylitetään selvästi.
70044 18
Esimerkki 9 0,3 m kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0 "Genapol 0X-100"/natriumkaprylaatti 0,003 U/ml kolesteriini-esteraasia % "Genapol OX-lOO"/Na-kaprylaatti Nopeus 0 % 0 ekst./10 min 5 % 0,020 ekst./10 min 10 % 0,053 ekst./lO niin 15 % 0,062 ekst./10 min 20 % 0,066 ekst./lO min 30 % 0,068 ekst./lO min 40 % 0,068 ekst./lO min
Optimi Vertailuarvo 30 % 0,068 ekst./lO min 9.1 Lisäys 1 tilavuus-% 4-metyylipentanoli-(2) Järjestelmä Nopeus 30 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,068 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,020 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti lisäyksen kera 0,069 ekst./lO min
Vertailuarvo saavutetaan.
9.2 Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia Järjestelmä Nooeus 30 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,068 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,020 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti lisäyksen kera 0,080 ekst./10 min
Vertailuarvo ylitetään.
9.3 Lisäys 0,3 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus 30 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,068 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti ilman lisäystä 0,020 ekst./10 min 5 % "Genapol"/kaprylaatti lisäyksen kera 0,089 ekst./lO min 19 70044
Vertailuarvo ylitetään selvästi.
e) Sellaisten pinta-aktiivisten aineiden käyttö, joilla määrätyissä olosuhteissa ei ole minkäänlaista aktivoivaa vaikutusta tai on ainoastaan riittämätön tällainen vaikutus.
Useista mahdollisista pinta-aktiivisista aineista vain muutamat kykenevät aktivoimaan kolesteriiniesteraasin riittävässä määrässä. Muiden reaktioon osaaottavien aineiden reaktion estäminen, reaktioseoksen stabiilisuus, konsistenssi, liukoisuus ja yhdisteen vast, preparaatin tasalaatuisuus, tukevat edellä esitettyjä syitä, että on toivottavaa voida valita pinta-aktiiviset aineet mahdollisimman vapaasti. Alla oleva esimerkki osoittaa, että myös sellaiset pinta-aktiiviset aineet, joilla vallitsevissa olosuhteissa on vain vähäinen aktivoiva vaikutus tai ei tällaista ollenkaan, ovat keksinnön mukaisesti käyttökelpoisia.
Esimerkki 10 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0, 0,003 U/ml kolesteriinieste- raasia
Pinta-aktiivinen aine 6 % "Thesit"
Lisäys 1 tilavuus-% n-amyylialkoholia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,003 ekst./10 min Lisäys 0 ekst./l0 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,029 ekst./10 min
Esimerkki 11 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine 6 % "Thesit"
Lisäys 10 mM/1 (noin 0,16 paino-%) 1,7-di- hydroksinaftaliinia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,003 ekst./10 min Lisäys 0,005 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,024 ekst./lO min 20
Esimerkki 12 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 700 44
Pinta-aktiivinen aine: 12 % "Thesit"
Lisäys 2 tilavuus-% sykloheksanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,010 ekst./10 min
Lisäys 0,003 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,105 ekst./l° min
Esimerkki 13 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasi
Pinta-aktiiviset aineet: 12 % "Thesit"
Lisäys: 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,010 ekst./10 min
Lisäys O ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,081 ekst./10 min
Esimerkki 14 0,1 m tris/viinihappopuskuri, pH 8,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiiviset aineet: 2 tilavuus-% "Thesit"/2-tilavuus-% "Tween 20"
Lisäys: 0,4 tilavuus-% heksanoli-1 Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,018 ekst./10 min
Lisäys 0 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,028 ekst./lO min
Esimerkki 15 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 21 70044
Pinta-aktiiviset aineet: 5 tilavuus-% "Thesit"/5 tilavuus-% "Tween 20"
Lisäys: 8 mM/1 3,5-dikloorifenolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,005 ekst./lO min
Lisäys O ekst./lO min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,033 ekst./2.C> min
Esimerkki 16 0,3 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiiviset aineet: 5 tilavuus-% "Genapol 0X-100"/5 paino- % Na-kaprylaattia
Lisäys: 10 mM/1 fenolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,020 ekst./10 min
Lisäys 0 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,064 ekst./lO min
Esimerkki 17 0,3 m fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiiviset aineet: 5 tilavuus-% "Genapol 0X-100"/5 paino- % Na-kaprylaattia
Lisäys: 4 mM/1 (noin 0,065 paino-%) 3,4-dikloo- rifenolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,020 ekst./lO min
Lisäys 0 ekst./lO min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,058 ekst./lO min
Esimerkki 18 0,1 m fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 22 70044
Pinta-aktiivinen aine: 10 tilavuus-% "Brij 35" (30 %:nen liuos) Lisäys: 4 mM/1 3,4-dikloorifenolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä O ekst./10 min
Lisäys 0 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,010 ekst./lO min
Esimerkki 19 0,1 m fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 10 tilavuus-% "Brij 35" (30 %:nen liuos) Lisäys: 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./10 min
Lisäys O ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,018 ekst./10 min
Esimerkki 20 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 2 tilavuus-% "Brij 35" (30 %:nen liuos) Lisäys: 2 tilavuus-% sykloheksanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./lO min Lisäys 0,003 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,027 ekst./lO min
Esimerkki 21 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia 23 7 0 0 4 4
Pinta-aktiivinen aine: 6 paino-% koolihappoa
Lisäys: 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä O ekst./10 min
Lisäys O ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,029 ekst./10 min
Esimerkki 22 0,1 m fosfaattipuskuri a,pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 6 paino-% koolihappoa
Lisäys: 16 mM/1 3,5-dikloorifenolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./10 min
Lisäys 0 ekst./l0 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,036 ekst./10 min
Esimerkki 23 0,1 m fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 1 paino-% koolihappoa
Lisäys: 4 mM/1 3,5-dikloorifenolia, 1 tilavuus- % sykloheksanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./10 min
Lisäys 0,010 ekst./l0 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,103 ekst./10 min
Esimerkki 24 0,1 m tris/viinihappopuskuria, pH 8,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 3 paino-% natriumdesoksikolaattia Lisäys: 0,2 tilavuus-% heksanoli-1 70044 24 Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä O ekst./10 min
Lisäys O ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,056 ekst./10 min
Esimerkki 25 0,1 m tris/viinihappopuskuri, pH 8,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 3 paino-% natriumdesoksikolaattia Lisäys: 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./10 min
Lisäys 0 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,069 ekst./10 min
Esimerkki 26 0,1 m fosfaattipuskuria, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 6 tilavuus-% "Genapol 0X-100”
Lisäys: 0,4 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0 ekst./l° niin
Lisäys 0 ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,059 ekst./lO min
Esimerkki 27 0,1 m fosfaattipuskuri, pH 7,0 0,003 U/ml kolesteriiniesteraasia
Pinta-aktiivinen aine: 20 tilavuus-% "Tween 20"
Lisäys: 1 tilavuus-% 2,2,2-trikloorietanolia 70044 25 Järjestelmä Nopeus
Pinta-aktiivinen aine ilman lisäystä 0,005 ekst./10 min
Lisäys O ekst./10 min
Pinta-aktiivinen aine lisäyksen kera 0,067 ekst./lO min Käyttömuoto Esimerkki 28
Reagenssi kolesteriinin määräämiseksi seerumissa
Koostumus: 4,5 g/1 viinihappoa 7,5 g/1 tris 8,7 g/1 natriumsulfaattia 200 mg/ml 4-amino-antipyriiniä 282 mg/1 fenolia 5000 U/l peroksidaasia 430 U/l kolesteriiniesteraasia 310 U/l kolesteriinioksidaasia
Aktivoimisaine: 2,2 g/1 "Thesit" 1,3 g/1 natriumdesoksikolaattia 0,815 g/1 3,4-dikloorifenolia
Edellä esitetty lisäaineiden valinta mahdollistaa kolesteriini-esteraasin aktivoimisen muiden entsyymien ominaisuuksien aikaansaamissa olosuhteissa. Samanaikaisesti on mahdollista muodostaa reaktioseoksen säilytysmuoto kiinteässä muodossa olevaksi lisäysreagenssiksi.
Claims (10)
1. Menetelmä kolesteriiniesteraasin aktivoimiseksi ionipi-toisessa liuoksessa lisäämällä ainakin yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka perustuu polyetoksieetteriin tai -esteriin ja/tai sappihappoyhdisteeseen ja/tai sellaisten rasvahappojen suolaan, joissa on 6-10 hiiliatomia, tunnettu siitä, että pinta-aktiivista ainetta lisätään yhdessä ainakin yhden synergistisesti vaikuttavan alkoholin kanssa, joka on suoraketjuinen, haarautunut tai syklinen alifaattinen alkoholi, jossa on 5-12 hiiliatomia, mahdollisesti halogeeni-substituoitu aromaattinen alkoholi, tai useammilla halogeeni-atomeilla substituoitu alifaattinen alkoholi, jossa on 1-3 hiiliatomia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sappihappoyhdisteenä käytetään koolihappoa, des-oksikoolihappoa tai näiden alkalisuolaa.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rasvahapposuolana käytetään alkalisuolaa.
4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 0,05-5 % pinta-aktiivista ainetta.
5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 0,01-5 % alkoholia.
6. Väline kolesteriiniesteraasin aktivoimiseksi ionipitoises-sa liuoksessa, joka sisältää vähintään yhtä pinta-aktiivista ainetta, joka perustuu polyetoksieetteriin tai -esteriin ja/tai sappihappoyhdisteeseen ja/tai sellaisten rasvahappojen suolaan, joissa on 6-10 hiiliatomia, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin yhtä synergistisesti vaikuttavaa alkoholia, joka on suoraketjuinen haarautunut tai syklinen alifaattinen alkoholi, jossa on 5-12 hiiliatomia, mahdollisesti halogeenisubstituoitu aromaattinen alkoholi tai halogeenisubstituoitu alifaattinen alkoholi, jossa on 1-3 hiiliatomia. 27 70044
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen väline, tunnettu siitä, että se sisältää pinta-aktiivista ainetta 0,05-5 % entsyymiliuoksesta laskettuna.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen väline, tunnettu siitä, että se sisältää 0,1-3 % pinta-aktiivista ainetta.
9. Patenttivaatimu en 6-8 mukainen väline, tunnettu siitä, että se sisältää 0,01-5 % alkoholia.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen väline, tunnettu siitä, että se sisältää 0,05-3 % alkoholia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2911284A DE2911284C2 (de) | 1979-03-22 | 1979-03-22 | Verfahren und Reagenz zur Aktivierung der Cholesterinesterase |
| DE2911284 | 1979-03-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI800743A FI800743A (fi) | 1980-09-23 |
| FI70044B FI70044B (fi) | 1986-01-31 |
| FI70044C true FI70044C (fi) | 1986-09-12 |
Family
ID=6066139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI800743A FI70044C (fi) | 1979-03-22 | 1980-03-11 | Foerfarande och reagens foer aktivering av kolesterinesteras |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0016946A1 (fi) |
| JP (1) | JPS55127987A (fi) |
| AR (1) | AR220448A1 (fi) |
| AU (1) | AU520246B2 (fi) |
| CA (1) | CA1131110A (fi) |
| DD (1) | DD150222A5 (fi) |
| DE (1) | DE2911284C2 (fi) |
| DK (1) | DK148658C (fi) |
| FI (1) | FI70044C (fi) |
| HU (1) | HU183078B (fi) |
| IL (1) | IL59571A0 (fi) |
| ZA (1) | ZA801653B (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3046241A1 (de) * | 1980-12-08 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
| DE3200274A1 (de) * | 1982-01-07 | 1983-07-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
| GB2154735B (en) * | 1984-01-27 | 1987-07-15 | Menarini Sas | Reagent for determining blood glucose content |
| EP0259521A1 (en) * | 1986-09-10 | 1988-03-16 | Akzo N.V. | Test reagent for amylase determination |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1479994A (en) * | 1974-03-04 | 1977-07-13 | Abbott Lab | Single reagent for the enzymatic determination of cholesterol and method therefor |
| DE2612725C3 (de) * | 1976-03-25 | 1979-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin |
| DE2816229C2 (de) * | 1978-04-14 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Mittel zur Beseitigung von Trübungen |
-
1979
- 1979-03-22 DE DE2911284A patent/DE2911284C2/de not_active Expired
-
1980
- 1980-02-20 EP EP80100840A patent/EP0016946A1/de not_active Withdrawn
- 1980-02-22 CA CA346,298A patent/CA1131110A/en not_active Expired
- 1980-03-05 AR AR280186A patent/AR220448A1/es active
- 1980-03-11 IL IL59571A patent/IL59571A0/xx unknown
- 1980-03-11 FI FI800743A patent/FI70044C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-03-11 AU AU56334/80A patent/AU520246B2/en not_active Expired
- 1980-03-19 DD DD80219760A patent/DD150222A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-03-20 DK DK120380A patent/DK148658C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-03-21 HU HU80681A patent/HU183078B/hu not_active IP Right Cessation
- 1980-03-21 JP JP3481580A patent/JPS55127987A/ja active Granted
- 1980-03-21 ZA ZA00801653A patent/ZA801653B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS55127987A (en) | 1980-10-03 |
| DE2911284B1 (de) | 1980-10-02 |
| DE2911284C2 (de) | 1982-01-28 |
| JPS5645586B2 (fi) | 1981-10-27 |
| FI800743A (fi) | 1980-09-23 |
| FI70044B (fi) | 1986-01-31 |
| ZA801653B (en) | 1981-04-29 |
| HU183078B (en) | 1984-04-28 |
| DK148658C (da) | 1986-01-27 |
| IL59571A0 (en) | 1980-06-30 |
| AU520246B2 (en) | 1982-01-21 |
| AR220448A1 (es) | 1980-10-31 |
| AU5633480A (en) | 1980-09-25 |
| DD150222A5 (de) | 1981-08-19 |
| EP0016946A1 (de) | 1980-10-15 |
| DK148658B (da) | 1985-08-26 |
| DK120380A (da) | 1980-09-23 |
| CA1131110A (en) | 1982-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI69929B (fi) | Foerfarande och anordning foer avlaegsnande av grumlighet | |
| US4517287A (en) | Method and reagent for the enzymatic determination of enzyme substrates | |
| US4378429A (en) | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum | |
| US4098574A (en) | Glucose detection system free from fluoride-ion interference | |
| US4212938A (en) | Reagent and method for the determination of cholesterol | |
| FI57782B (fi) | Foerfarande och reagens foer enzymkinetisk koncentrationsbestaemning hos ett substrat | |
| US5250418A (en) | Process and reagent for determining the activity of chymotrypsin and trypsin in feces | |
| JPS6036754B2 (ja) | グリセリンの測定法 | |
| US4116635A (en) | General purpose in vitro anticoagulant | |
| EP0024578B1 (en) | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor | |
| US4066508A (en) | Process and reagent for determining triglycerides | |
| FI70044C (fi) | Foerfarande och reagens foer aktivering av kolesterinesteras | |
| Heinonen et al. | A method for the concentration and for the colorimetric determination of nanomoles of inorganic pyrophosphate | |
| US4409326A (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| EP0044432B1 (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| Keltch et al. | Oxidative phosphorylation by a cell-free particulate system from unfertilized Arbacia eggs | |
| US6114134A (en) | Method for assaying biological specimens for substances contained in the components thereof and reagent to be used in this method | |
| EP0103628A1 (en) | Stabilization of diazonium salt solutions | |
| JP2619222B2 (ja) | 血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法 | |
| ATE25464T1 (de) | Zeitstabile fluessige zusammensetzung fuer den cholesterinnachweis. | |
| US4206280A (en) | Determination of acid phosphatase | |
| Kobayashi et al. | The application of chemiluminescence of a Cypridina luciferin analog to immobilized enzyme sensors | |
| Kovar et al. | Determination of cholesterol in sera | |
| Bloch et al. | Fluorescence assay for picomole quantities of uric acid: A new enzyme—Coupled approach | |
| US4731331A (en) | Rate method for the determination of inorganic phosphorus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |