HU183078B - Process and reagent for the activation of cholesterol esterase - Google Patents

Process and reagent for the activation of cholesterol esterase Download PDF

Info

Publication number
HU183078B
HU183078B HU80681A HU68180A HU183078B HU 183078 B HU183078 B HU 183078B HU 80681 A HU80681 A HU 80681A HU 68180 A HU68180 A HU 68180A HU 183078 B HU183078 B HU 183078B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ext
additive
units
cholesterol esterase
detergent
Prior art date
Application number
HU80681A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sigmar Klose
Herbert Buschek
Helmut Schlumberger
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU183078B publication Critical patent/HU183078B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás és reagens koleszterinészteráz aktiválására, különösen észterek reakcióelegyekben való enzimes reagáltatásánál. Ilyen reakcióelegyeket többek között a klinikai-kémiai analitikában és az élelmiszerkémiai analitikában használnak.
Koleszterin-észteráztól függő tesztek tervezésénél ismert probléma a drága enzim megtakarítása, nagyobb reakciósebesség elérése és az előírt szempontoktól függően a detergensek és pufferok fajtáinak és mennyiségének lehetőleg szabad megválasztása.
Olyan pufferolt közegben, amely további komponenseket nem tartalmaz, a koleszterin-észteráz szubsztrátjaival szemben semmilyen vagy csak nagyon csekély aktivitást fejt ki. Ezért szükséges, hogy az enzim részére olyan aktiváló adalékokat találjunk, amelyekkel az észterhasítás gyorsítható. Ilyen aktiváló adalékokként ismeretes néhány detergens, például epesavak, Triton X-100, Thesit. [Lásd 3 884 764 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 24 09 696, 25 12 602, 25 12 585 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat; 2 505 712 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás; Biochim. Biophys. Acta 2 70, 156-166 (172)].
A közeg magasabb sótartalma elnyomja ennek aktiváló hatását. Tehát nem minden pufferrendszer felel meg azonos módon. Ugyanez áll fenn a detergensekre. Találunk bizonyos körülmények között jó és kevésbé jó hatásúaktól kezdve olyanokat is, amelyek egyáltalán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak. Többnyire nem mondható meg előre, hogy ebből a szempontból melyik detergens megfelelő.
Az aktiváló detergensek közös tulajdonsága, hogy egy adott közegben, adott koncentrációtartományban fejtik ki. optimális aktiváló hatásukat. Az optimumok kedvezőtlenül magas koncentrációtartományokban is lehetnek. Az optimumokon kívül a viszonylag drága enzim nagyobb mennyiségben való hozzáadása nem eredményez optimális módon magasabb reakciósebességeket.
Ezenkívül aktivitásnövelések a detergens-tartalom optimálásával és az ionerősség növelésével csak viszonylag szűk határok között érhetők el.
Mivel a számításba jövő reakcióelegyek rendszerint még további enzimeket és szubsztrátokat tartalmaznak a további és az indikátorreakciókhoz, a puffer és a detergens kiválasztásánál, valamint a mindenkori hozzáadandó mennyiségek optimalizálásánál semmilyen szabad választási lehetőség nincs adva.
A reakciókörülmények megállapításánál továbbá mindig tekintetbe kell venni az összes reakciópartner egymásközti kölcsönhatását, különösen más enzimek esetleges gátlását vagy hátrányos stabilitásbefolyását detergensek és/vagy nagy ionerősségek miatt.
Egy tesztrendszer tervezésénél továbbá oldhatósági határokra és a galenusi gyógyszerészet problémáira is ügyelni kell.
Az utóbbi esetben a főként folyékonytól viaszosig változó állagú detergensek ritkán adhatók hozzá az aktiváláshoz szükséges mennyiségekben szilárd anyagkeverékekhez, amelyeknek száraznak és szórhatóknak kell lennie. Ennek különösen cseppreagenseknél van jelentősége.
Végül tekintetbe kell még venni, hogy a legtöbb számításba jövő detergens nem jól definiált vegyületként, hanem anyagkeverékként fordul elő. Következésképpen sarzseltérések lehetségesek, amelyek az aktiváló hatásnál is észrevehetők. Ezért nagyon hátrányosan hathat, ha az aktiválás egyedül egy detergenstó'l függ.
Ennek következtében áll fenn jelentős igény további reagensekre és eljárásokra a koleszterin-észteráz aktiválására.
A találmány feladata, hogy a fentemlített hátrányokat elhárítsa, és a fenti célra olyan eljárást és reagenst biztosítson, amelynél koleszterin-észterázt takarítunk meg, meghatározott körülmények között nagyobb reakciósebességek érhetők el, kisebb ionerősségeknél dolgozhatunk, detergensek csak minimális koncentrációban szükségesek, és olyan detergensek is alkalmazhatók, amelyek egyedül csak nagyon gyenge vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak.
Ezt a feladatot a találmány szerint koleszterinészteráznak iontartalmú oldatokban, detergensek hozzáadásával való aktiválására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy felületaktív szerként egy (3—25 etoxi-csoportot tartalmaz) polietoxi-(6—11 szénatomos) alkil-fenil-étert, vagy (3-25 etoxi-csoportot tartalmazó) polietoxi-(8—18 szénatomos)-alkil-étert, vagy 1-3-(3-25 etoxicsoportot tartalmazó)-polietoxicsoporttal szubsztituált cukoralkoholok 8-18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy egy epesavszármazékot és/vagy 6-10 szénatomos zsírsavak alkálifémsóit használjuk egy szinergetikus hatású olyan alkohollal kombinálva, amelyet 5-8 szénatomos egyenesláncú vagy elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholok, adott esetben 1-3 halogénatommal szubsztituált fenol, 1—2 hidroxicsoporttal szubsztituált naftalin vagy 1-4 halogénatommal szubsztituált, 1—3 szénatomos alifás alkoholok közül választhatunk ki.
A találmány annak a meglepő ténynek a felismerésén alapul, hogy az említett alkoholok, amelyek önmagukban egyedül semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak a koleszterint-észterázra, bizonyos detergensek önmagukban ismert aktiváló hatását szinergikusan jelentősen erősítik, és bizonyos, önmagukban nem aktiváló detergenseknek aktiváló hatást biztosítanak.
Ez azt jelenti, hogy ilyenfajta nem aktiváló, de a kereskedelemben széles körben elterjedt detergensek is használhatók. Ugyanígy, definiált molekulasúlyuk és szilárd állaguk miatt kedvező, de rossz aktiváló tulajdonságaik miatt eddig alkalmatlan ionos detergensek is használhatók. Továbbá enzim takarítható meg, növelhető a maximálisan elérhető reakciósebesség, csökkenthető a szükséges ionerősség és végül a sokféle kombinációs lehetőség folytán az észterázaktiváló rendszer hozzáilleszthető a reakcióelegy további komponensei által megkövetelt feltételekhez.
A találmány keretein belül felhasználható polietoxiéterek példái a políetoxi-zsiralkohol-éterek, így polietoxi-lauri-éter és hidroxi-polietoxi-dodekán-éter, alkilfenil-éterek, így polietoxi-nonil-fenil-éter és polietoxioktil-fenil-éter, zsírsav-észterek, így polietoxi-szorbitánmonolauráí és hasonlók. Az epesav-származékok közül kólsav, dezoxi-kólsav és ezek alkálifém-sói előnyösek. A zsírsav-alkálifémsók közül különösen a nátriumsók előnyösek.
A találmány keretein belül alkalmazható egyenesláncú, elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholokra példaként a pentanol, terc-amilalkohol, metil-pentanol, hexanol, ciklohexanol, oktanol és izookatanol, említhetők. Alkalmas alkohol továbbá a fenol és dihidroxinaftol. Előnyösek a halogénszubsztituált fenolok,
183 078 például a mono-, di- és triklór-fenol. A halogénatommal többszörösen szubsztituált alifás alkoholok közül például diklór-etanol, triklóretanol, diklór-metanol, triklór-metanol, triklór-propanol, tetraklór-propanol stb. használható. Halogén-szubsztituensekként az aromás és 5 alifás alkoholok esetében a klór-, bróm és fluoratom jön számításba, előnyösen a klóratom.
Előkísérletekkel könnyen eldönthető, hogy ezek közül az alkoholok (a továbbiakban adjuvánsok) közül egy bizonyos esetben melyek különösen alkalmasak. 10 A körülmények, így a pufferrendszer fajtája és erőssége, a detergens fajtája és koncentrációja, valamint a reakcióelegy tárolhatósága és a tárolható forma kívánt konzisztenciája többnyire előre megadottak. Ezekhez a feltételekekhez igazodhatunk azután az alkalmas adjuváns 15 kiválasztásával és a hozzáadandó mennyiség egyeztetésével. Általában azt észleltük, hogy literenként 1 és 300 mmól közti adjuváns mennyiség esetében kapunk jó eredményeket.
Folyékony alkoholok esetében előnyösen 0,01 és 5 20 térfogat% közötti, szilárd alkoholok esetében 0,01 és 5 súly% közötti mennyiségeket adagolunk. Különösen előnyös 0,05-tól 3 %-ig terjedő mennyiség.
A polietoxi-származékokban az alkilcsoportok általában 8-18 szénatomot, az alkil-fenil-csoportok eló'nyö- 25 sen egy fenilcsoportot tartalmaznak. A detergensekben a glikol-maradék általában 3—25 etoxi-csoportot tartalmaz.
A detergenseket célszerűn 0,05 és 5 térfogat%, illetve szilárd anyagok esetében súly% mennyiségben alkalmaz- 30 zuk. Előnyös 0,1-ől 3 %-ig terjedő mennyiség.
A találmány tárgya továbbá a koleszterin-észteráznak iontartalmú oldatokban való aktiválására szolgáló reagens, amelyre az jellemző, hogy legalább egy (3-25 etoxi-csoportot tartalmazó)-polietoxi-(6—11 szénatomos) 35 alkil-fenil-étert, vagy (3—25 etoxi-csoportot tartalmazó)polietoxi-(8—18 szénatomos ) alkil-étert, vagy 1-3-(325-etoxicsoportot tartalmazó)-polietoxicsoporttal szubsztituált cukoralkoholok 8—18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy epesav-származék és/ 40 va® 6-10 szénatomos zsírsav-alkálifémsó típusú felületaktív szert tartalmaz, valamint e® szinergikus hatású alkoholt, amelyet az 5—8 szénatomos e®enesfácú vagy elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholok, adott esetben 1—3 halogénnel szubsztituált fenol, 1—2 hidroxil- 45 csoporttal szubsztituált naftalin vagy 1-3 szénatomos, 1-4 halogénnel szubsztituált alifás alkoholok közül választunk ki.
A találmány alkalmazható mindenféle olyan méréssel és reakcióval kapcsolatban, amelynél koleszterin- 50 észterázt használunk a reakcióele®ekben. Ilyenféle reakcióelegyeket a szakemberek általában ismernek, és — amennyiben analitikai célokat, szolgálnak — például H. U. Bergmeyer: Methoder dér enzymatischen Analyse (Verlag Chemie Weinheim, Bergstrasse) c. könyvében 55 írnak le ilyeneket. Ezért ilyenfajta reakcióele®ek közelebbi taglalása itt felesleges. A találmány alkalmazásával lehetővé válik, ho® enzimet takarítsunk meg, adott körülmények között na®obb reakciósebességeket éljünk el, kisebb ionerősségű pufferokat használjunk, 60 detergenseket kisebb koncentrációban alkalmazzunk, és olyan detergensek is alkalmazhatók, amelyek egyedül nem kielégítő vagy e®általán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak. A találmány alkalmazható mikroorganizmusokból származó vagy más eredetű, például hasnyál- 65 mirigyből va® májból származó koleszterin-észteráz használata esetén is.
A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik a mellékelt rajzok segítségével. Ezek a következőket ábrázolják:
1. ábra: A koleszterin-észteráz aktivitásának meghatározására használt berendezés vázlatos ábrázolása.
2. ábra: Az alkalmazott módszernél fellépő időegységenkénti extinkcióváltozás grafikus ábrázolása, amelyet az észterhasítás sebességének meghatározására használunk.
A következő táblázat a kereskedelmi néven említett detergensek kémiai összetételét közli:
Brij 35
Genapol OX-100 Tergitol NPX
Thesit
Triton X-100
Tween 20 polietoxi-lauril-éter; poiietoxi-zsíraikohol-éter; polietoxi-nonil-fenil-éter (körülbelül 10,5 etoxi-csoport); hidroxi-polietoxi-dodekán-éter; polietoxi-oktil-fenil-éter (9—10 etoxi-csoport); polietoxi-szorbitán-monolaurát.
A találmány szerinti vizsgálandó szinergikus kombinációk koleszterin-észterázra gyakorolt aktiváló hatásnak mérésére az 1. ábrán bemutatott berendezést használjuk.
E® 25 C-on temperált (1) reakcióedényből, amelyben az észterhasítás végbeme®, egy (2) csöves szivattyúval és meghatározott keresztmetszetű (3) szállítócsövön át percenként folyamatosan 0,32 ml elegyet veszünk el. Ugyanezzel a szivattyúval egy (4) második csövön át egy (5) tárolóedényből szintén folyamatosan percenként 1,0 ml indikátoroldatot továbbítunk, a (2) szivattyú után 0,6 ml/perc állandó (6) légáramot vezetünk hozzá, megkeverjük, és utána az előbbi reakcióeleggyel egyesítjük. Az együttes áramot utána átvezetjük két (7) üvegcsövön, miáltal elérjük a folyadékok alapos átkeverését, és az indikátorreakció végbemeneteléhez szükséges reakcióidő eltelik. Közvetlenül a küvetta előtt a (8) csővezetéken 1,2 ml/perc áram elvételével a légbuborékokat ismét eltávolítjuk. A maradék áramot fotometriás mérésre (546 nm-nél) egy 1 cm rétegvastagságú átfolyó küvettába vezetjük, és a mérési eredményeket a (10) írószerkezettel rögzítjük.
Az indikátorreakció állandósított feltételei miatt a mérőjel nagyságában és lefutásában fellépő változások e®edül a reakcióedényben végbemenő folyamatoktól függenek. Ha ott észterhasítás megy végbe, úgy ennek kinetikus lefutása a mérőjel növekedését eredményezi, amelyet a (10) írószerkezet pozitív növekedésként je®ez fel. A növekedés meredeksége a reakciósebesség mértéke, és így mérték a koleszterin-észteráz aktivitására a reakcióelegyben.
Az észterhasítás és az indikátorreakció elkülönített lefolyása miatt ellenkező befolyásolás ki van zárva. Természetesen más indikátorrendszerek is alkalmazhatók lennének, beleértve az oxigénelektródot is.
Indikátoroldat:
0,1 mól kálium-foszfát puffer; pH = 7,0; l,5mmól/lit. 4-amino-antipirin;
mmól/lit. fenol;
%0 hidroxi-polietoxi-dodekán;
egység/ml peroxidáz;
I egység/ml koleszterin-oxidáz.
-3183 078
Az indikátoroldat először szabad koleszterint kolesztenonná és hidrogén-peroxiddá alakít. A keletkezett hidrogén-peroxid fenollal és 4-amino-antipirinnel vörös színezékké reagál, amelynek abszorpcióját fotometriásan méqük. A keletkezett színezék mennyisége a szabad koleszterin koncentrációjával arányos. A szabad koleszterin-részből valamint az észteráz által szabaddá tett koleszterinből tevődik össze.
A rekcióedényben levő elegy:
0,5 ml szubsztrát (kontroll-szárum; 360 mg/dl összkoleszterin);
detergens, kísérlet szerint; adjuváns, kísérlet szerint; puffer, 5 ml-re.
Indulás 50 μΐ észteráz-törzsoldattal, amikor 0,003 egység/ml észteráz van a reakcióelegyben. Aktivitássorozatoknál ezt a mennyiséget változtatjuk.
Sikeres indulás és összekeverés után a (2) szivattyú járatása közben a (3) szállítócsövet körülbelül 10 percre az (1) reakcióedényben levő oldatba mártjuk. Végül a jelek jobb elválasztása céljából körülbelül 10 részletben felváltva levegőt és kétszer desztillált vizet szívatunk be. Ezután következhet az újabb meghatározás.
A következő példák az enzim találmány szerint lehetséges megtakarítását (a), megadott körülmények között nagyobb reakciósebességek elérését (b), kisebb ionerősségű pufferok alkalmazását (c), detergensek kisebb koncentrációban való alkalmazását (d) és olyan detergensek alkalmazását szemléltetik, amelyek meghatározott körülmények között csak elégtelen vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatást sem mutatnak (e).
a) Koleszterin-észteráz megtakarítása.
ezen sebességhez szükséges 0,0044 egység/ml enzimmennyiség adjuváns nélkül, elért aktivitás
1.2. 0,4 térf% 4-metil-:
Bevitt aktivitás elért sebesség ezen sebességhez θ szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül
Elért aktivitás
147 %.
:-pentanol hozzáadása.
0,003 egység/ml;
0,065 extinkció/10 perc;
0,0063 egység/ml, 210%.
1.3. 1 térf% ciklohexanol hozzáadása.
Bevitt aktivitás elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül
Elért aktivitás
0,0030 egység/ml;
0,077 extinkció/10 perc;
0,0075 egység/ml, 250%.
2. példa
1,5 % Tergitol NPX 0,1 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát pufferban.
Bevitt aktivitás
0,0012 egység/ml 0,0030 egység/ml 0,0060 egység/ml
0,0090 egység/ml
0,0120 egység/ml
Elért sebesség
0,019 extinkció/10 perc 0,030 extinkció/10 perc 0,055 extinkció/10 perc 0,091 extinkció/10 perc 0,0120 extinkció/10 perc
A koleszterin-észteráz megtakarításának lehetőségét a következőképp mutatjuk be:
Először enzimaktivitas sorozatmeghatározást végzünk adjuvánsok nélkül. Az összehasonlító mérések után a meghatározások adjuvánsok hozzáadása közben 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz jelenlétében történnek.
A bevitt aktivitás és az eredményezett sebesség között kimutatott összefüggés alapján határozzuk meg azután 45 az elért aktivitásnövekedést.
2.1. 0,4 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül
Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,046 extinkció/10 perc
0,0046 egység/ml 153%.
2.2. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
1. példa
0,1 mólos trisz/borkősav puffer, pH 8,0; 5 %0 Triton X-100.
Bevitt aktivitás 0 egység/ml
0,0012
0,0030
0,0045
0,0060
0,0089 elért reakciósebesség 0 extinkció/10 perc
0,012
0,032
0,052
0,058
0,094
Bevitt aktivitás 5θ Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül
Elért aktivitás
2.3.
Bevitt aktivitás 60 Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül
Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,053 extinkció/10 perc
0,0053 egység/ml 177%.
1,4 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása.
1.1. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
Bevitt aktivitás elért sebesség
0,0030 egység/ml; 0,046 ext./ΙΟ perc;
0,003 egység/ml 0,059 extinkció/10 perc
0,0059 egység/ml 197%.
183 078
2.4. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása.
3.5. 0,3 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,114 extinkció/10 perc
0,0114 egység/ml 380 %.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,089 extinkció/10 perc
0,0144 egység/ml 480 %.
3. példa %0 Genapol OX-100/5 %0 nátrium-kaprilát 0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát pufferban.
Bevitt aktivitás
0,0012 egység/ml 0,0030 egység/ml 0,0060 egység/ml 0,0090 egység/ml 0,0150 egység/ml 0,0240 egység/ml
Elért sebesség
0,01 extinkció/10 perc 0,023 extinkció/10 perc 0,038 extinkció/10 perc 0,055 extinkció/10 perc 0,093 extinkció/10 perc 0,138 extinkció/10 perc
3.1. 4 mmól/liter (0,065 súly%) 3,4-diklór-fenol hozzáadása.
b) Nagyobb reakciósebességek elérése előre megadott feltételek mellett.
Sok esetben bizonyos feltételek, így például puffer és ionerősség, valamint a detergens fajtája a reakcióe'egyben fontosabb szempontok miatt már előre megadottak. Ilyen ok lehet például az elegyben jelenlevő valamilyen más enzim nagyobb érzékenysége. Ilyen esetekben az észterhasítás konstans koleszterin-észteráz hozzáadással elérhető maximális sebessége az észterázaktiválásnak a detergens fajtája és a detergenskoncentráció által való befolyásától függ, és ezek korlátozzák. Ez a függőség általában kis detergenskoncentrációknál mutat optimumot. Az ennél a pontnál elért sebesség a fent felsorolt körülmények között nem haladható meg, és ebből a szempontból a rendszer határát jelenti.
A példákban alább leírt találmány szerinti kombinációk alkalmasak arra, hogy az ilyen határokat átlépjük.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
0,0030 egység/ml 0,058 extinkció/10 perc
0,0093 egység/ml 310%.
3.2. 10 mmól/liter (kb. 0,09 súly%) fenol hozzáadása.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,064 extinkció/10 perc
0,0104 egység/ml 347 %.
3.3. 1 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
0,003 egység/ml 0,080 extinkció/10 perc
0,0112 egység/ml 373 %.
3.4. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása.
Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez adjuváns nélkül szükséges enzimmennyiség Elért aktivitás
4. példa
Előre megadott feltételek:
0,1 mólos 8,0 pH-jú trisz/borkősav puffer, Triton X-100,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
0,003 egység/ml
0,080 extinkció/10 perc
0,0129 egység/ml 430 %.
%o Triton X-100 az elegyben elért sebesség extinkció/10 perc 0,003 ext./ΙΟ perc 0,028 ext./ΙΟ perc 0,037 ext./ΙΟ perc 0,037 ext./ΙΟ perc 0,037 ext./ΙΟ perc 0,029 ext./ΙΟ perc
Optimum A rendszer határa %0 0,037 extinkció/10 perc
Az adjuvánsok hozzáadása 5 %0 Triton Χ-100-nál.
4.1. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
Elért sebesség 0,046 ext./ΙΟ perc
Emelkedés 124%-ra.
4.2. 0,4 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása.
Elért sebesség 0,065 «ít./10 perc
Emelkedés 176 %-ra.
4.3. 1 térf% ciklohexanol hozzáadása.
Elért sebesség Emelkedés
0,077 ext,/10 perc 208 %-ra.
-5183 078
5. példa
Előre megadott feltételek:
0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffer, Tergitol NPX,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
, Tergitol NPX Elért
az elegyben sebesség
0 0 extinkció/10 perc
2 0 ext./ΙΟ perc
5 0,029 ext./ΙΟ perc
10 0,042 ext./ΙΟ perc
15 0,049 ext./ΙΟ perc
20 0,039 ext./ΙΟ perc
Optimum A rendszer határa
%0 0,049 extinkció/10 perc
Az adjuvánsok hozzáadása 15 %0 Tergitol NPX-nél.
5.1. 2 mmól/liter 3,4-diklór-fenol és 1 térf% ciklohexa non hozzáadása.
Elért sebesség 0,058 extinkció/10 perc
Emelkedés 118 %-ra.
5.2. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
Elért sebesség 0,066 extinkció/10 perc
Emié kedés 135 %-ra.
5.3. 1,4 térf% ciklohexanol hozzáadása.
Elért sebesség 0,118 extinkció/10 perc
Emelkedés 241 %-ra.
c) Kisebb ionerősségű pufferok alkalmazása.
Amint már említettük, nagyobb ionerősségű pufferok a detergensek koleszterin-észterázra gyakorolt aktiváló hatását elnyomják. A feltételek igényekhez képest lehető legszabadabb megválasztásának keretei között kívánatos, hogy az oldatban ne legyen nagy sótartalom. A következő példa mutatja, hogy a találmány szerint a sótartalom lényegesen csökkenthető.
összehasonlítjuk a:
0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffért és a
0,1 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffért.
Alkalmas adjuvánsoknak a 0,1 mólos pufferendszerhez való hozzáadásával a sebességek annyira növelhetők, hogy elérik az adjuváns nélküli 0,3 mólos pufferrendszer magasabb összehasonlítási értékeit, és részben jelentősen meg is haladhatják azokat.
6. példa %0 Tergitol NPX,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
6.1. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
Rendszer Sebesség
0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 extinkció/10 perc
0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,053 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket meghaladja.
6.2. 1,4 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása.
0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 ext./ΙΟ perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,059 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket meghaladja.
6.3. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása.
0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 ext./ΙΟ perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,114 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket jelentősen meghaladja.
7. példa %0 Genapol OX-100/10 %0 nátrium-kaprilát, 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz. 7.1. 40 mmól (kb. 0,35 súly%) fenol hozzáadása.
Rendszer Sebesség
0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,017 extinkció/10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,053 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket eléri.
7.2. 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása.
0,1 mólos puffer adalél nélkül 0,017 ext./ΙΟ perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,063 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket meghaladja.
7.3. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása.
0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,017 ext./ΙΟ perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./ΙΟ perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,072 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket meghaladja.
d) Detergensek alkalmazása kis koncentrációban.
Ha egy detergens képes arra, hogy a koleszterinészterázt aktiválja, akkor ennek ezen tulajdonság teljes kifejtéséhez bizonyos koncentrációban jelen kell lennie a reakcióelegyben. Ez a detergens-optimum lényegesen függ a detergens fajtájától, és sok esetben kedvezőtlenül magas koncentrációtartományba eshet. Ezért más, további reakciókhoz szükséges enzimek esetében gátlások, és oldhatósági és egyéb okokból nehézségek léphetnek fel. A detergens-optimum alatt csaknem kielégítő aktiválás észlelhető. A feltételek lehető legszabadabb megválasztása érdekében azonban kívánatos, hogy lehetőleg sok különböző detergenst — magasabb koncentráció-optimummal rendelkezőket is — alkalmazhassunk.
Az alábbi példák mutatják, hogy a találmány szerint lehetséges a koncentráció-optimum reakciósebességét kevesebb detergenssel is elérni és túllépni, miáltal detergenst takarítunk meg.
183 078
8. példa.
Rendszer Sebesség
0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffer, Tergitol NPX,
0,003 egység/ml koleszterín-észteráz.
%o Tergitol NPX az elegyben
IS
Elért sebesség extinkció/10 perc 0 ext./ΙΟ perc 0,029 ext./ΙΟ perc 0,042 ext./ΙΟ perc 0,049 ext./ΙΟ perc 0,039 ext./ΙΟ perc.
% o Genapol/kaprilát adalék nélkül %0 Genapol/kaprilát adalék nélkül %0 Genapol/kaprilát
0,068 ext./ΙΟ perc 0,020 ext./ΙΟ perc adalékkal 0,069 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket eléri.
1θ 9.2. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása.
Optimum 15 %0
Összehasonlítási érték 0,049 ext./ΙΟ perc. 8.1. 0,1 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása.
Rendszer Sebesség %o Genapol/kaprilát adalék nélkül
5 %0 Genapol/kaprilát adalék nélkül 5 °/00 Genapol/kaprilát adalékkal
Az összehasonlítási értéket meghaladja.
9.3. 0,3 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása.
0,068 ext./ΙΟ perc 0,020 ext./ΙΟ perc
0,080 ext./ΙΟ nerc.
Rendszer %0 Tergitol adalék nélkül %0 Tergitol adalék nélkül 5 %0 Tergitol adalékkal
Sebesség
0,049 ext./ΙΟ perc. 0,029 ext./ΙΟ perc. 0,059 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket meghaladja. 8.2. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása.
%0 Tergitol adalék nélkül %0 Tergitol adalék nélkül 5 %o Tergitol adalékkal Az összehasonlítási értéket jelentősen meghaladja.
8.3. 1 térf% ciklohexanol hozzáadása.
0,049 ext./ΙΟ perc 0,029 ext./ΙΟ perc 0,075 ext./ΙΟ perc.
Rendszer %0 Genapol/kaprilát adalék nélkül %0 Genapol/kaprilát adalék nélkül %0 Genapol/kaprilát adalékkal
Sebesség
0,068 ext./ΙΟ perc 0,020 ext./ΙΟ perc 0,089 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket jelentősen meghaladja.
Rendszer
Tergitol adalék nélkül 5 %0 Tergitol adalék nélkül 5 %0 Tergitol adalékkal
Sebesség
0,049 ext./ΙΟ perc 0,029 ext./ΙΟ perc 0,124 ext./ΙΟ perc.
Az összehasonlítási értéket jelentősen meghaladja.
9. példa
0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffer, Genapol OX-lOO/nátrium-kaprilát,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
e) Bizonyos körülmények között semmilyen vagy csaknem kielégítő aktiváló hatással rendelkező detergen35 sek alkalmazása.
A rendelkezésre álló detergensek közül csak kevés bizonyul alkalmasnak arra, hogy a koleszterin-észterázt kielégítő mértékben aktiválja. Más reakciópartnerek gátlása, a reakcióelegy stabilitása, a vegyület, illetve ké40 szítmény állaga, oldhatósága és egyértelműsége számítanak azon okoknak, amelyek a detergensek lehetséges szabad kiválasztását meghatározzák. Az alábbi példák mutatják, hogy az adott feltételek mellett csak csekély vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatással nem rendel45 kező detergensek is alkalmazhatók a találmány szerint.
10. példa %0 Genapol
ΟΧ-100/nátrium-kaprilát
Optimum 30 %0
Sebesség extinkció/10 perc 0,020 ext./ΙΟ perc 0,053 ext./lOperc 0,062 ext./ΙΟ perc 0,066 ext./ΙΟ perc 0,068 ext./ΙΟ perc 0,068 ext./ΙΟ perc.
Összehasonlítási érték 0,068 ext./ΙΟ perc
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 6 %0 Thesit,
Adalék: 1 térf% n-amilalkohol
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0,003 extinkció/10 perc
Adalék 0 extinkció/10 perc
Detergens adalékkal 0,029 extinkció/10 perc
9.1 1 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása.
11. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer, 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 6 %0 Thesit
-7183 078
Adalék: 10 mmól/liter (kb. 0,16 súly%)
1,7-dihidroxi-naftalin.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0,003 extinkció/10 perc
Adalék 0,005 extinkció/10 perc
Detergens adalékkal 0,024 extinkció/10 perc.
12. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 12 %0 Thesit,
Adalék: 2 térf% ciklohexanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0,010 extinkció/10 perc
Adalék 0,003 extinkció/10 perc
Detergens adalékkal 0,105 extinkció/10 perc.
13. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 12 %0 Thesit,
Adalék: 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0,010 extinkció/10 perc
Adalék 0 extinkció/10 perc
Detergens adalékkal 0,081 extinkció/10 perc
14. példa
0,1 mólos 8,0 pH-jú trisz/borkősav puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergensek: 2 térf%0 Thesit/2 térf%0 Tween 20. Adalék: 0,4 térf% 1-hexanol.
Rendszer Sebesség
Detergensek adalék nélkül 0,018 ext./ΙΟ perc Adalék 0 ext ./10 perc
Detergensek adalékkal 0,028 ext./10 perc.
15. példa.
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergensek: 5 térf%0 Thesit/5 térf%o Tween 20. Adalék: 8 mmól/liter 3,5-diklór-fepol.
Rendszer Sebesség
Detergensek adalék nélkül 0,005 ext./10 perc
Adalék 0 ext./10 perc
Detergensek adalékkal 0,033 ext./10 perc.
16. példa
0,3 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer. 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergensek: 5 térf%0 Genapol OX-100/5 súly%0 nátrium-kaprilát.
Adalék: 10 mmól/liter fenol.
Rendszer Sebesség
Detergensek adalék nélkül 0,020 ext./10 perc
Adalék 0 ext./10 perc
Detergensek adalékkal 0,064 ext./ΙΟ perc.
17. példa
0,3 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer, 1 g 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergensek: 5 téf%0 Genapol OX-100/5 térf%0 nátrium-kaprilát.
Adalék: 4 mmól/liter (kb. 0,065 súly%)
3,4-diklór-fenol.
Rendszer Sebesség
Detergensek adalék nélkül 0,020 ext./ΙΟ perc
Adalék 0 ext./10 perc
Detergensek adalékkal 0,058 ext./ΙΟ perc.
18. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
3Q 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 10 térf%0 Brij 35 (30 %-os oldat), Adalék: 4 mmól/liter 3,4-diklór-fenol.
Rendszer Sebesség
Detergensek adalék nélkül 0 ext./10 perc
Adalék 0 ext./10 perc
Detergensek adalékkal 0,010 ext./10 perc.
4Q 19. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 10 térf%0 Brij 35 (30 %-os oldat).
Adalék: 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens dalék nélkül 0 ext./10 perc
Adalék 0 ext./10 perc
Detergens adalékkal 0,018 ext./10 perc.
20. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 2 térf%0 Brij 35 (30 %-os oldat). Adalék: 2 térf% ciklohexanol.
θθ Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0 ext./10 perc
Adalék 0,003 ext./10 perc
Detergens adalékkal 0,027 ext./ΙΟ perc.
21. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 6 súly%0 kólsav.
Adalék: 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0 ext./ΙΟ perc
Adalék Oext./lOperc
Detergens adalékkal 0,029 ext./10 perc.
183 078 2
26. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 6 térf%0 Genapol OX-100.
Adalék: .0,4 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0 ext.j 10 perc
IQ Adalék Oext./lOperc
Detergens adalékkal 0,059 ext./ΙΟ perc.
22. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz. Detergens: 6 súly%0 kólsav.
Adalék: 16 mmól/liter 3,5-diklór-fenol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül Adalék Detergens adalékkal Oext./lO perc 0 ext.j 10 perc 0,036 ext./ΙΟ perc
27. példa
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 20 térf%0 Tween 20.
Adalék: 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0,005 ext./ΙΟ perc
Adalék Oext./lOperc
Detergens adalékkal 0,067 ext./ΙΟ perc
23. példa
Alkalmazási forma:
0,1 mólos 7,0 pH-jú foszfát-puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 1 súly%0 kólsav.
Adalékok: 4 mmól/liter 3,5-diklór-fenol, 1 térf% ciklohexanol.
Rendszer
Detergens adalékok nélkül Adalékok
Detergens adalékokkal
Sebesség 0 ext./ΙΟ perc 0,010 ext./ΙΟ perc 0,103 ext /10 perc.
24. példa
0,1 mólos 8,0 pH-jú trisz/borkősav puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 3 súly%0 nátrium-dezoxikolát. Adalék: 0,2 térf% 1-hexánok
Rednszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0 ext./10 perc
Adalék Oext./lOperc
Detergens adalékkal 0,056 ext./10 perc.
25. példa
0,1 mólos 8,0 pH-jú trisz/borkősav puffer,
0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.
Detergens: 3 súly%0 nátrium-dezoxikolát.
Adalék: 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol.
Rendszer Sebesség
Detergens adalék nélkül 0 ext./10 perc
Adalék Oext./lOperc
Detergens adalékkal 0,069 ext./10 perc.
28. példa
Reagens koleszterin meghatározására szérumban.
Receptúra:
4,5 g/liter borkősav,
7,5 g/liter trisz,
8,7 g/liter nátrium-szulfát,
200 mg/ml 4-amino-antipirin,
282 mg/liter fenol,
5000 egység/liter peroxidáz,
430 egység/liter koleszterin-észteráz,
310 egység/liter koleszterin-oxidáz.
Aktiválószer:
2.2 g/liter Thesit,
1.3 g/liter nátrium-dezoxikolát,
0,815 g/liter 3,4-diklór-fenol.
Az adalékok fenti összeállítása lehetó'vé teszi ákolesz50 terin-észteráz aktiválását a más enzimek tulajdonságai által megkívánt körülmények között. Egyidejűleg az is lehetséges, hogy a reakcióelegy tárolási formáját szilárd formában valósítsuk meg.

Claims (5)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás a koleszterin-észteráz aktiválására legalább egy felületatktív szert tartalmazó, iontartalmú oldatban,
    60 azzal jellemezve, hogy felületaktív szerként az enzimoldatra vonatkoztatva 0,05-5 % mennyiségben egy (3—25 etoxicsoportot tartalmazó) polietoxi-(6—11 szénatomos) alkil-fenil-étert, vagy (3—25 etoxicsoportot tartalmazó) polietoxi-(8-18 szénatomos) alkil-észtert
    65 vagy 1-3-(3-25 etoxicsoportot tartalmazó)-polietoxi9
    -9183 078 csoporttal szubsztituált cukoralkoholok 8—18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy valamilyen epesav-vegyületet és/vagy 6—10 szénatomos zsírsav alkálifémsóit, ezenkívül az enzimoldatra vonatkoztatva 0,01-5 % mennyiségben egy szinergikus hatású alkoholt - amely 5-8 szénatomos egyeneslácú, elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkohol, vagy adott esetben 1—3 halogénatommal szubsztituált fenol, vagy 1-2 hidroxilcsoporttal szubsztituált naftalin vagy 1 4 halogénatommal szubsztituált 1-3 szénatomos alifás alkohol lehet — adunk a koleszterinészterázt tartalmazó elegyhez.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy epesav-vegyületként kólsavat, dezoxikólsavat vagy ezek valamilyen alkálifémsóját használjuk.
  3. 3. Koleszterin-észteráz iontartalmú oldatokban való aktiválására szolgáló szer, azzal jellemezve, hogy felületaktív szerként az enzimoldatra vonatkoztatva 0,055_ % mennyiségben legalább egy (3-25 etoxicsoportot tartalmazó) polietoxi-(6-ll szénatomos) alkil-fenilétert, vagy (3-25 etoxicsoportot tartalmazó) polietoxi(8-18 szénatomos) alkil-étert vagy 1-3-(3-25 etoxicsoportot tartalmazó) polietoxicsoporttal szubsztituált
    5 cukoralkoholok 8-18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy valamilyen epesav-vegyületet és/vagy 610 szénatomos zsírsav alkálifém-sót, ezen kívül az enzimoldatra vonatkoztatva 0,01-5 % mennyiségben egy szinergikus hatású alkoholt - amely 5-8 szénatomos 1Q egyenesláncú, elágazóláncú vagy ciklikus alifás alkohol, vagy adott esetben 1-3 halogénatommal szubsztituált fenol, vagy 1-2 hidroxilcsoporttal szubsztituált naftalin vagy 1—4 halogénatommal szubsztituált 1—3 szénatomos alifás alkohol lehet - tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,1-3 % felületaktív szert tartalmaz.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,03-3 % alkoholt tartalmaz.
HU80681A 1979-03-22 1980-03-21 Process and reagent for the activation of cholesterol esterase HU183078B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2911284A DE2911284C2 (de) 1979-03-22 1979-03-22 Verfahren und Reagenz zur Aktivierung der Cholesterinesterase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU183078B true HU183078B (en) 1984-04-28

Family

ID=6066139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU80681A HU183078B (en) 1979-03-22 1980-03-21 Process and reagent for the activation of cholesterol esterase

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0016946A1 (hu)
JP (1) JPS55127987A (hu)
AR (1) AR220448A1 (hu)
AU (1) AU520246B2 (hu)
CA (1) CA1131110A (hu)
DD (1) DD150222A5 (hu)
DE (1) DE2911284C2 (hu)
DK (1) DK148658C (hu)
FI (1) FI70044C (hu)
HU (1) HU183078B (hu)
IL (1) IL59571A0 (hu)
ZA (1) ZA801653B (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3046241A1 (de) * 1980-12-08 1982-07-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin
DE3200274A1 (de) * 1982-01-07 1983-07-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden
GB2154735B (en) * 1984-01-27 1987-07-15 Menarini Sas Reagent for determining blood glucose content
EP0259521A1 (en) * 1986-09-10 1988-03-16 Akzo N.V. Test reagent for amylase determination

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1479994A (en) * 1974-03-04 1977-07-13 Abbott Lab Single reagent for the enzymatic determination of cholesterol and method therefor
DE2612725C3 (de) * 1976-03-25 1979-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin
DE2816229C2 (de) * 1978-04-14 1983-11-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Mittel zur Beseitigung von Trübungen

Also Published As

Publication number Publication date
JPS55127987A (en) 1980-10-03
DK148658C (da) 1986-01-27
AU5633480A (en) 1980-09-25
FI70044B (fi) 1986-01-31
DE2911284B1 (de) 1980-10-02
IL59571A0 (en) 1980-06-30
FI70044C (fi) 1986-09-12
DK148658B (da) 1985-08-26
CA1131110A (en) 1982-09-07
FI800743A (fi) 1980-09-23
EP0016946A1 (de) 1980-10-15
AU520246B2 (en) 1982-01-21
DD150222A5 (de) 1981-08-19
DK120380A (da) 1980-09-23
JPS5645586B2 (hu) 1981-10-27
AR220448A1 (es) 1980-10-31
ZA801653B (en) 1981-04-29
DE2911284C2 (de) 1982-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4378429A (en) Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum
US4282001A (en) Compositions and method for reducing turbidity in samples
EP1813680B1 (en) Compositions for lipase activity determination and method of determining activity
KR20010075176A (ko) 리포단백질 중의 콜레스테롤의 분별 정량 방법 및 정량용시약
EP0024578B1 (en) Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor
US3721607A (en) Reagent composition and process for the determination of glucose
EP0030718A1 (de) Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden
JPS60259185A (ja) グリセリンオキシダ−ゼの取得法
HU183078B (en) Process and reagent for the activation of cholesterol esterase
US4409326A (en) Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum
EP0044432B1 (en) Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum
EP0463755A1 (en) Stable aqueous NADH reagent and kit
EP1477570B1 (en) Method of quantifying cholesterol in high density lipoprotein and reagent compositions
JP2619222B2 (ja) 血液試料または血液由来の試料中のフルクトサミン含量を測定するための試薬と方法
CA2570660A1 (en) Stabilized cholinesterase subtrate solution
JPH03228699A (ja) ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物
EP0418940B1 (en) Stabilization of glucose oxidase enzyme in liquid reagent
JP2534859B2 (ja) 生体物質のエンザイムアツセイ
CN1621522B (zh) 胆固醇脱氢酶的稳定方法、含胆固醇脱氢酶的组合物以及胆固醇检测试剂
JP4035776B2 (ja) 防腐剤耐性を有する生体成分測定方法およびその試薬
EP0297387B1 (en) An improved turbidimetric method for the determination of serum lipase
RU2056049C1 (ru) Набор реагентов для определения холестерина в сыворотке крови
JPH0117110B2 (hu)
CN117625735A (zh) 一种用于检测β-羟丁酸的试剂及试剂盒
JP2007185196A (ja) 防腐剤耐性を有する生体成分測定方法およびその試薬

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee