DK142852B - Analogifremgangsmåde til fremstilling af fusida-13(17)-en-21-carboxylsyrederivater. - Google Patents

Description

(w) \£5/ (11) FREMUEGGELSESSKRIFT 142852 C 07 J 13/00 DANMARK («mim. ci.3 c 07 J 31/00 UMΠΜΜΠΙ\ C 07 J 41/00 C 07 J 43/00 §(21) Ansøgning nr. 5594/76 J22) Indleveret dsn 1 · dec. ^976 (24) Lebedeg 1· dec. 1976 (44) Ansøgningen fremlagt og . η fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 9* yol

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet begæret fre den

3. dec. 1975s 49714/75, GB

20. apr. 197 6, 16015/76, GB

(71) LEO PHARMACEUTICAL PRODUCTS LTD. A/s (LØVENS KEMISKE FABRIK PRO-T5UKTI0NSAKTIESELSKAB), Industriparken 55, 2750 Ballerup, DK.

(72) Opfinder: Welf von Daehne, Frihedsvej 4, 2960 Rungsted Kyst, DK:

Poul Rødbroe Rasmussen, Bjarkesvej 21, 3600 Frederikssund, DK.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling: (64) Analogifremgangs måde til fremstilling af fusida-1 3(1 7)-en-21 -carboxy 1= syrederivater.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af en serie hidtil ukendte fusidinsyrederivater eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne. De hidtil ukendte fusidinsyrederivater har den almene formel I

142852 2 γ ]25 : 24 Γ * γ20 τ HQ. 17 1

'/yyA-R

ί ή hvor Α betyder oxygen eller svovl, og R^ betyder en lige eller forgrenet alkylgruppe med fra 1 til 12 C-atomer, såsom en methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, eller tert-butylgruppe, de kendte isomerer af pentyl-, hexyl-, heptyl-, octyl- og dodecylgrupper, idet de omhandlede alkylgrupper om ønsket kan være mono-, di- eller trisubstitueret med halogenatomer eller med hydroxy-, alkoxy-, aralk-oxy-, aryloxy-, alkanoyloxy-, aralkanoyloxy-, aroyloxy-, sulfhydryl-, alkylthio-, aralkylthio-, arylthio-, alkanoylthio-, aroylthio-, azido-, nitro-, cyano-, thiocyano-, hydroxycarbonyl-, alkoxycarbonyl-, aryl-oxycarbonyl-, amino-, alkylamino-, dialkylamino-, arylamino-, alkano-ylamino- og aroylaminogrupper, i hvilke substituenter alkyldelen kan indeholde 1 til k C-atomer og aryldelen 6 til 10 C-atomer, idet R yderligere kan være en alkenyl— eller alkynylgruppe med fra 3 til 6 C-atomer, såsom en allyl-, crotyl eller propargylgruppe, en cyclo-alkylgruppe med fra 3 til 7 C-atomer i den alicykliske ring, såsom en cyclopropyl-, cyclobutyl-, cyclopentyl-, cyclohexyl- eller cycloheptyl-gruppe eller de mono- eller disubstituerede analoger, der er substituerede med halogenatomer, C^-C^-alkyl, C^-C^-alkoxy eller hydroxy, og hvor R·*" yderligere kan betyde en phenyl-, naphthyl-, phenyl-C^-C^-alkyl- eller naphthyl-C^-C^-alkylgruppe, eventuelt mono-, di- eller trisubstitueret med halogen, C^-C^—alkyl-, hydroxy— eller C^-C^-alk-oxygrupper, en furfury1gruppe, en heterocyklisk gruppe indeholdende 5 eller 6 ringatomer, hvoraf op til 4 kan være nitrogen og/eller 1 kan være oxygen eller svovl, hvilke heterocykliske ringe kan være substitueret med en methylgruppe, fx 2- eller 3-pyrrolyl-, 2- eller 3-furyl-, 2- eller 3-thienyl-, 2-, 3- eller 4-pyridyl, 2-, k- eller 142852 5-pyrimidinyl- eller en 2- eller 3-pyrazolylgruppe, eller en imidazol- ylgruppe, fx l-methyl-2-imidazolyl-, en triazolylgruppe, fx 5-methyl- -1,2,^-triazol-3-ylgruppe, en tetrazolylgruppe, fx 1-methyl-lH-tetr- azol-5-ylgruppe, en thiazolylgruppe, en thiadiazolylgruppe, fx en 5- . h methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylgruppe, og R betyder hydrogen eller en C^-Cg-alkanoyloxy-C^-C^-alkyl, phenyl-C^-Cg-alkanoyloxy-C^-C^-alkyl-, benzoyloxy-C^-C^-alkyl, C^-C^-alkoxycarbonyloxy-C^-C^-alkyl-, C^-C^--laktonyl eller di-C^-Cg-alkylamino-C^-C^-alkylgruppe.

I formel I indicerer den punkterede linie mellem C-2k og C-25» at de pågældende C-atomer er forbundet med en dobbeltbinding eller en enkeltbinding, og stjernen ved C-20 indicerer, at forbindelserne eksisterer i to diastereomere former. Opfindelsen omfatter fremstillingen af de rene diastereomerer såvel som af blandinger af disse.

Hvor ikke andet er anført betegner udtrykket alkyl i de ovenfor nævnte grupper en C^-C^- alkylgruppe.

Forbindelserne af formel I kan benyttes som sådan eller i form af salte eller let hydrolyserbare estere. Saltene af de omhandlede forbindelser er farmaceutisk acceptable, ugiftige salte , såsom alkalimetalsalte og jordalkalimetalsalte, fx natrium-, kalium-, magnium- eller calciumsalte, såvel som salte med ammoniak eller med egnede ugiftige aminer, fx lavere alkyl-aminer, herunder triethylamin, hydroxy-lavere alkylaminer, herunder 2-hydroxyethylamin, bis-(2-hydroxyethyl)-amin eller tri-(2-hydroxyethyl)-amin, cycloalkylaminer, fx dicyclohexylamin, eller benzylaminer fx N,N’-dibenzyl-ethylendiamin eller dibenzylamin.

Til visse formål kan også sølvsaltene af de omhandlede forbindelser anvendes, navnlig til topisk applikation.

De let hydrolyserbare estre kan fx være C^-Cg-alkanoyloxy--C^-C^-alkyl-, phenyl-C^-Cg-alkanoyloxy-C^-C^-alkyl- og benzoyloxy--C^-C^-alkylestre, såsom acetoxymethyl-, pivaloyloxymethyl-, benzo-yloxymethyl-, 1 *-acetoxyethyl-, 1'-pivaloyloxyethyl- og l'-benzoyl-oxyethylestre, eller C^-Cg-alkoxycarbonyloxy-C^-C^-alkylestre, såsom methoxycarbonyloxymethyl-, ethoxycarbonyloxymethyl-, 1-methoxycarb-onyloxyethyl- og 11-ethoxycarbonyloxyethylestre, eller C^-C^-lacton-ylestre, såsom phthalidylestre, eller di-C^-Cg-alkylamino-C^-C^--alkylestre, såsom diethylaminoethylestre.

De antibakterielle egenskaber af fusidinsyre samt nogle nyere fusidinsyrederivater overfor et antal grampositive bakterier er velkendte (j.Med.Chem. £, 15 (1966) og dansk patentansøgning nr. 2857/76).

4 142852

Endvidere er det kendt, at en anden type fusidinsyrederivater udviser en mere baktericid effekt end de ovennævnte, men overfor et mere begrænset antal bakterier (dansk patent nr. 1169^-0).

Det har imidlertid vist sig, at de ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede forbindelser besidder antibakterielle egenskaber, som kombinerer den baktericide effekt af den sidstnævnte type derivater med det bredere antibakterielle spektrum af den førstnævnte type derivater, og de her omhandlede forbindelser viser endvidere interessante antimikrobielle og pharmacokinetiske egenskaber både in vivo og in vitro. Således kan de foreliggende forbindelser anvendes i den systemiske og topiske behandling af bakterielle infektioner hos mennesker og dyr.

In vitro undersøgelser har fx vist, at forbindelserne er yderst virksomme overfor et antal bakterier, fx Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Bacteroides sp. og Bacillus subtilis. I tabel A nedenfor er anført in vitro-aktiviteten af nogle af de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser overfor et antal pathogene organismer. Det fremgår af tabellen, at de foreliggende forbindelser har samme stærke aktivitet overfor en fusidinsyreresistent stamme af Staph, aureus som overfor en fu-sidinsyrefølsom variant af samme stamme. Dette viser klart, at der ikke er nogen krydsresistens mellem fusidinsyre og forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse. Omend de foreliggende forbindelser er mindre aktive overfor fusidinsyre-følsomme stafylokokker end fusidinsyren selv, har forbindelserne i sammenligning med fusidinsyre en lignende eller bedre aktivitet overfor streptokokker, Bacteroides fragilis og Corynebacterium aenes.

5 142852 nB *" O Η Ο O CM M3 o m o o o o cn

• · · i—( i—I '—I

OHO a Λ -------- no o vo o M3 O \ pq h m o m no · · n- . . . CM Η H ft- m o o o æ

o-------- CM

in M3 o -3- O Η O O M3 H <J O H O O · Ch

-—- · · · i—i -ft H C

O O O A

tn W

oRj I C

s c Λ ft ·Η 0) o ft t m

•h > cn CM M3 CM

bo tn Φ NO M3 O CM M3·· -n

S 0 · · · cn HHO

•H fe O H O 4-1 C________ Φ S > S · cn on φ id tn o no r-~ m3 M3 o no t 3d H · · · · · · 3«! -¾¾. fe m o O η h m h to o Φ m------ ft h · cn cn SE tnoinM3M3 no o cn no φ \ ,ϋ h · · · · · · ·

3d ilO ft Η O O Η H -ft NO O

H i________ •ri cn > H · cn M3 id inr^NOONø m3 o

id CM · · · · · O O

ft ft O Η H H -ft H

0)---------- > tn no m m no m3 om cd 3d cm ··· · cm · k O ft O O Η H O -/'" “•i H ---------f

P · I

td tn m cn c3n i m

t ^ CM NO M3 NO M3 Ον Γτ HO

p a · · no m o

c O Η Η Η Γτ H O C H

¢) --------1— I Η O O Cm ·Η S tn J· CM H H h o 3d h cn no no no o no ft 3 p

w H . · · -P tn I

ΟΗΗ H m -ft Η Η H - _____ ;>, φ In φ cm . ft ti ft ti ·> nr tn olnpfe-

3d H NO M3 M3 M3 ON m ti tn H O CM

1¾ · . . . .CM · ftSftfd- O ’—I H h O 0 *H O *H ^ _________ tn ft tn ft cm . -Η -Η ·Η ·Η ^ Φ CO NO NO Γ' CM CM I to I to I Ih njh· · · · · cm CM cft0cft3cn.f>i hhhhcm cn cn no fe no ft vo ® ________Η O Η O H £ . O I ti I £ I ‘jj tn m m m o no in ft inft in Ό ϋ oo · · · η · * fe Η In Η η Η Ο Ο CM CM AH Ο ft Ο ft Ο « ________-P ·Η -PH -P 0 . cn φ o' to xi ® ft tncMmcn ocnvo 01010-7- i<cM· · · o o h · cd m cd m a) in ft Ο ΟΝΟ Η H O' φ CM ® CM Φ t! ________. p ·> p * π 2 . i -ft i -cl· i Λ tn mM3 no no cm o m no cm no cm M3 p id H · · · · · CM · Η I Η I H ®

__ft O__H__H__H__cn__O

o · m O i c-Htn < m o fe ft 00 Φ 3 Φ W) Φ fttn !-~ ft h ft <d 3 tn h - ft ti o tn tn sotn-HP tn ft cd 003 ο O 3 tn 3 3 cm Φ o ft ο ο Φ3Φ Φ tn < *

Eo o ootiftp t φ ft p tn oo ο ο φ 3·^ tn 3 ft C3 .. -Η ο φ ο 0 ft tti h cd η 0 cct <1 C O ft O CM H CMtnr— ο Φ ft tdP p ο tn · X φ φ · t ft Φ h MfetnafeiftOftootgftin® fife m t φ φ Φ ft Φ ftC^ Φ g ftft- P - in η o ted to tdti tdHtitd tdH o tn to X ΡΦΡΦΡΟΡΟίηΡΡΗ (tin O ® ^ w tø w ft w cd cootntn wo ffl h oft 142852 6

In vitro undersøgelser har endvidere vist, at den antibak-terielle virkning af forbindelserne er kraftigt baktericid, selv under betingelser hvor fusidinsyrens virkning udelukkende er bak-teriostatisk. Endvidere har det vist sig, at kombinationer bestående af én eller flere af de omhandlede forbindelser og fu-sidinsyre eller andre fusidinsyrederivater, såsom dihydrofusidin-syre og forbindelserne fremstillet ifølge dansk patentansøgning nr. 2857/76, udviser en effekt, som overstiger den additive effekt af de enkelte komponenter. Ved at benytte en sådan kombination hindrer man ligeledes udvikling af resistens overfor de enkelte komponenter.

De foreliggende forbindelser er endvidere kemisk mere stabile end fusidinsyre, hvilket er af praktisk betydning, fx ved fremstillingen af præparater til topisk anvendelse. Ligesom fusidinsyre absorberes de effektivt fra mave-tarmkanalen og er praktisk talt ugiftige.

Forbindelserne af formel I fremstilles ud fra et mellemprodukt af den almene formel IX

v

J

l .C00R1 2 Ϊ 1 11

Q1^ I

formel XI betyder hydrogen eller en alkanoyl-, en aralkan- oyl- eller en aroylgruppe, medens R , A, og den punkterede linie 2 mellem C-24 og C-25 har den tidligere definerede betydning, og R betyder en benzylgruppe eller en substitueret benzylgruppe, såsom en p-nitrobenzyl— eller p-methoxybenzylgruppe.

Forbindelserne af formel II kan fx fremstilles i henhold til en af de følgende metoder: 7 142852 A. En forbindelse af den almene formel III omsættes med en forbindelse af den almene formel IV til dannelse af en forbindelse af den almene formel II:

Y

i

l -COOX

HO.. _ .K—^ r2y Q10"'

j III IV

11 2 I disse formler har Q , R , A, R og den punkterede linie mellem C-24 og C-25 den ovenfor definerede betydning, X be- + + + tyder hydrogen eller en kation, såsom Na , K , Ag , en ammonium-eller trialkylammoniumjon, og Y er et chlor-, brom- eller jodatom. Reaktionen udføres i et inert organisk opløsningsmiddel, fx di-methylformamid, ved stuetemperatur eller ved lidt forhøjet temperatur.

B. En forbindelse af den almene formel V omsættes med en forbindelse af den almene formel VI til dannelse af en forbindelse af den almene formel II:

Y

Y

X

HQ·' AA

l [ _l R1AH

Q1<r i v vi i 12 1 I disse formler har Q , R , Y, R , A og den punkterede linie mellem C~Zh og C-25 den tidligere nævnte betydning.

8 142352

Hvis A i formlerne XI og VI repræsenterer oxygen, kan udgangsstofferne af formel VI fortrinsvis anvendes som opløsningsmiddel, og reaktionen gennemføres i nærværelse af et sølv- eller kviksølvsalt, fx sølvkarbonat, sølvtrifluoracetat eller mercuriacetat, eller en base, fx kaliumkarbonat, natriumkarbonat eller natrium-alkoholat, ved stuetemperatur eller ved lidt forbøjet temperatur.

Hvis A i formel II og formel VI betyder svovl, gennemføres reaktionen i et inert organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis ethanol, dimethylsulfoxid eller dimethylformamid, i nærværelse af en base, fx natrium- eller kaliumhydroxid eller natriumhydrid, og ved eller under stuetemperatur eller ved lidt forhøjet temperatur.

C. Forbindelser af den almene formel II, i hvilken A betyder svovl og R·*- er aryl eller en aromatisk heterocyklisk gruppe, kan fremstilles ved at omsætte en forbindelse af den almene formel V, i hvilken Y betyder en hydroxylgruppe, med en phosphin, fx tri-butylphosphin eller triphenylphosphin, og en forbindelse af den almene formel R^SSR·*". Denne reaktion udføres enten uden opløsningsmiddel eller i et inert organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis dimethylformamid eller pyridin, ved eller under stuetemperatur.

Fremstillingen af udgangsstofferne af formlerne III og V er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 2857/76, hvor der ligeledes er anført metoder til fremstilling af mellemprodukterne af formel II.

I et sluttrin omdannes forbindelserne af formel II til forbindelserne af formel I eller salte deraf ved omsætning med en base, såsom vandig natrium- eller kaliumhydroxid, natriumhydrid eller kalium-tert-butylat, i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel .

Hvis dette opløsningsmiddel er dimethylsulfoxid, forløber reaktionen særlig hurtigt og giver udmærkede udbytter af de rene forbindelser. Dette skyldes formentlig dannelsen af carbanjonen ØCH_icH , når dette opløsningsmiddel bringes i kontakt med en base.

^ J

Denne jon, der virker som en særlig mild base, katalyserer iso-meriseringen af dobbeltbindingen og giver således anledning til dannelsen af forbindelser af formel I (med en dobbeltbinding mellem C-13 og C-I7) i stedet for forbindelser af formel III (med en dobbeltbinding mellem C-17 og C-20), der er hovedprodukterne, når der anvendes andre opløsningsmidler, således som det er beskrevet i dansk patentansøgning nr, 2857/76.

9 142852

De let hydrolyserbare estre af forbindelserne ifølge formel I kan fremstilles på kendt måde ved de i litteraturen beskrevne metoder.

De foreliggende forbindelser, som er fremstillet i henhold til de beskrevne metoder, består af blandinger af de to mulige C-20-isomerer. Disse blandinger kan skilles i de to rene isomerer ved konventionelle metoder, fx fraktioneret krystallisation eller ved kromatografiske metoder.

Med de foreliggende forbindelser er det muligt at tilvejebringe farmaceutiske præparater, som anvendes ved behandlingen af infektionssygdomme i den humane og veterinære praksis.

Sådanne præparater indeholder som aktiv bestanddel mindst én forbindelse af formel I eller salte deraf med ugiftige, farmaceutiske acceptable baser eller med let hydrolyserbare estre deraf sammen med faste eller flydende farmaceutiske bærere og/eller hjælpestoffer.

I de nævnte præparater kan forholdet mellem terapeutisk aktivt stof og bærerstof variere mellem 1 og 95 vægt-$. Præparaterne kan oparbejdes til forskellige farmaceutiske indgivelsesformer, såsom granulater, tabletter, piller, drageer, suppositorier, kapsler, tabletter med forsinket afgivelse, suspensioner, injektionspræparater, eller de kan fyldes på flasker eller tuber eller lignende beholdere. Farmaceutiske organiske eller uorganiske, faste eller flydende bærere og/eller hjælpestoffer, som er egnet til oral, enteral, parenteral eller topisk anvendelse, kan benyttes ved fremstillingen af præparater indeholdende de foreliggende forbindelser. Vand, gelatine, lactose, stivelse, magniumstearat, talkum, vegetabilske og animalske olier og fedtstoffer, benzylalkohol, gummiarter, polyalkylenglykol, vaselin, kakaosmør, lanolin eller andre kendte bærerstoffer for medicinske præparater er alle anvendelige, og præparaterne kan yderligere som hjælpestoffer indeholde stabiliserende midler, befugtende og emulgerende stoffer, salte til at variere det osmotiske tryk eller puffere for at sikre en passende pH-værdi af præparatet.

Endvidere kan præparatet indeholde andre farmaceutisk aktive forbindelser, der med fordel kan indgives sammen med de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser ved behandlingen af infektionssygdomme, såsom andre egnede antibiotika, navnlig sådanne antibiotika, som kan forøge aktiviteten og/eller forhindre resistensdannelse. Sådanne antibiotika er fx fusidinsyre 10 U2852 og andre fusidinsyrederivater, β-lactam-antibiotika, tetracykliner, rifamyciner, erythromycin, lincomycin og clindamycin. Andre forbindelser, som med fordel kan kombineres med de foreliggende forbindelser, navnlig ved topisk anvendelse, er fx corticosteroider, såsom hydrocortison, triamcinolon eller fluocinolon.

Granulater, tabletter, kapsler eller drageer indeholder fortrinsvis fra 25% til 95c/° af den ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse, og i orale suspensioner er den tilsvarende mængde fortrinsvis fra 2fo til 25Β/ό.

Ved parenteral anvendelse indgives de foreliggende forbindelser fortrinsvis ved injektion af farmaceutiske præparater indeholdende fra 1 °/o til 20^ af den aktive bestanddel.

Når forbindelserne af formel X indgives i fonn af salte med farmaceutisk acceptable, ugiftige baser, er de foretrukne salte fx natriumsaltene eller diethanolaminealtene, men andre farmaceutisk acceptable og ugiftige salte kan anvendes.

Som angivet ovenfor kan forbindelserne af formel X og disses salte og let hydrolyserbare estere oparbejdes på forskellige farmaceutiske indgivelsesformer, herunder suspensioner, pulvere, salver og cremer. Et farmaceutisk præparat til oral brug kan også være i form af en suspension indeholdende en forbindelse af formel I eller et kun lidt opløseligt salt deraf med en farmaceutisk acceptabel base eller en let hydrolyserbar ester deraf i en mængde på fra 20 til 100 mg pr. ml bærer. Et farmaceutisk præparat til topisk anvendelse kan i form af et pulver, en salve eller en creme indeholde de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser i en mængde på fra 0,5 til 10 g pr. 100 g præparat.

De foreliggende forbindelser indgives i sådanne doser, at den ønskede virkning opnås uden samtidige bivirkninger. Til human brug indgives de foreliggende forbindelser fx (til voksne) i dosisenheder indeholdende ikke mindre end 50 mg og op til 1000 mg, fortrinsvis fra 250 mg til 750 mg, beregnet som en forbindelse af formel I.

Med betegnelsen dosisenhed forstås en enkeltdosis, dvs. en dosisenhed, som kan indgives til en patient, og som let kan håndteres og emballeres, og som forbliver fysisk stabil, bestående af enten det aktive stof som sådant eller af en blanding af dette med faste eller flydende farmaceutiske bærere og/eller hjælpestoffer.

I form af en dosisenhed kan forbindelsen indgives én eller 11 142852 flere gange dagligt med passende intervaller, alt afhængigt af patientens tilstand og i overensstemmelse med den behandlende læges forskrifter.

Ved den systemiske behandling vil en daglig dosis være fra 0,25 til k g pr, dag, fortrinsvis en mængde på fra 0,5 til 3 g, beregnet som en forbindelse af formel I eller en ækvivalent mængde af et salt eller en ester, som defineret ovenfor, af en forbindelse af formel I.

Ved betegnelsen dosisenhed skal der i forbindelse med topisk anvendelse forstås en enhedsdosis, dvs. en enkelt dosis, som påføres pr. kvadratcentimeter af det inficerede areal i en mængde på fra 0,1 mg til 10 mg, fortrinsvis fra 0,2 mg til 1 mg, af den omhandlede forbindelse.

Hvis forbindelsen skal injiceres, kan man anvende en forseglet ampul, et hætteglas eller tilsvarende beholder, som indeholder en parenteralt acceptabel vandig eller olieagtig injicerbar opløsning eller dispersion af det aktive stof som dosisenhed.

De parenterale præparater er navnlig anvendelige ved behandlingen af tilstande, ved hvilke en hurtig virkning af behandlingen er ønskelig. Ved den kontinuerlige behandling af patienter, som lider af infektionssygdomme, kan tabletter eller kapsler være den bedst anvendelige farmaceutiske indgivelsesform som følge af den forlængede virkning, der opnås, når forbindelsen gives oralt, navnlig i form af tabletter med forsinket afgivelse.

Ved behandlingen af infektionssygdomme kan sådanne tabletter som nævnt ovenfor med fordel indeholde andre aktive komponenter.

Opfindelsen skal i det følgende beskrives nærmere ved hjælp af nogle eksempler.

Eksempel 1 30C, lla-Dihydroxy-l63-phenylthiofusida-13( 17). 24-dien-21-carboxylsyre. natriumsalt

Til en isafkølet opløsning af 15 g 3-acetyl-l6-epideacetyl-fusidinsyrebenzylester (25 mmol) og 13»5 g diphenyldisulfid (62 mmol) i 100 ml tør pyridin blev der sat 30 nil tributylphosphin (126 mmol), og blandingen fik lov at henstå ved 5°C. Efter 3 dages forløb blev der tilsat yderligere mængder diphenyldisulfid (3»^ S» l6 mmol) og tributylphosphin(7»5 ml, 31»5 mmol), og efter at have henstået i alt 5 dage ved 5°C blev der tilsat en blanding af 100 ml 12 142852 dimethylsulfoxid og· 50 ml 30$ vandig natriumhydroxid, og den resulterende suspension blev opvarmet til 70°C i 3 timer. Efter afkøling til 20°C blev der under omrøring tilsat 1 liter diethyl-ether, 3 liter vand og 100 ml mættet vandig natriumklorid, hvorved det ønskede produkt udfældedes som farveløse krystaller.

Efter en times omrøring blev den organiske fase indeholdende krystallerne filtreret, og krystallerne blev vasket med 100 ml vand og 200 ml diethylether og tørret, hvorved man fik 3ct,llct-dihydroxy-l6β-phenylthiofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre, natriumsalt som en blanding af de to C-20-isomerer; smeltepunkt 243-247°C. Analyse: C^H^NaO^S, ^H^O

Beregnet: C 63,59 H 8,69 S 4,85 HgO 10,9$

Fundet: C 63,65 H 8,62 S 4,84 HgO 10,4$

Eksempel 2

Natriumsalt af 3a, lla-dihydroxy-l68-(41 -bromphenylthio) fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre

Ved at følge den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet man erstattede diphenyldisulfid med di-(4-bromphenyl)-disulfid fik man natriumsaltet af lla-dihydroxy-16β-(4·-bromphenylthio)-fusida-13(l7)j24-dien-21-carboxylsyre, som en blanding af de to C-20-isomerer med smeltepunkt 231-239°C.

Analyse: C^H^gNaBrO^S, E^O

Beregnet: C 6l,30 H 7,35 S 4,68 Br 11,66$

Fundet: C 61,67 H 7,63 S 4,83 Br 11,24$

Eksempel 3

Natriumsalt af 3a,11α-άϊ]χνάηοχν-ΐ6β-(21,51-dichlorphenylthio)-fusida-13(17).24-dien—21—carboxylsyre

Ved at følge den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet man erstattede diphenyldisulfid med di(2,5-dichlorphenyl)disulfid fik man natriumsaltet af 3a, llα:-dihydroxy-l6β-(2 ' , 5 1-dichlorphenyl-thio)fusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre, som et krystallinsk produkt uden noget veldefineret smeltepunkt. (produktet er en blanding af de to C-20 isomerer).

13 142852

Eksempel 4

Natriumsalt af 3cc* lla-dihydroxy-l6P-phenylthiofusida-13(l7 ),24-dien-21-carboxylsyre 3 g 16-Epideacetylfusidinsyrebenzylester (5,3 mmol) og 4,9 g diphenyldisulfid (23 mmol) blev opløst i 20 ml pyridin, opløsningen blev afkølet til 0°C, og der tilsattes 5,5 ml tributylphosphin (23 mmol). Efter henstand ved 20°C i 3 dage blev opløsningen fortyndet med 100 ml diethylether, vasket med 2 x 25 ml 4 N saltsyre, med 2 x 25 ml 2 N natriumhydroxid og med 2 x 50 ml vand, tørret og inddampet i vakuum, hvorved man fik rå l6-deacetoxy-l6β-phenyl-thiofusidinsyrebenzylester som en olie. Denne remanens blev opløst i en blanding af 200 ml dimethylsulfoxid og 50 ml 2 N vandig natriumhydroxid. Efter opvarmning i 3 timer til 70°C blev der langsomt sat 100 ml diethylether og 200 ml vand til reaktionsblandingen til udfældning af det ønskede produkt som farveløse krystaller. Etherfasen indholdende krystallerne blev filtreret, og krystallerne blev vasket med vand og diethylether og tørret, hvorved man fik natriumsaltet af 3a,lla-dihydroxy-l6P-phenylthio-fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre i form af en blanding af de to C-20-isomerer med et smeltepunkt på 243-247°C.

Eksempel 5-7

Ved at følge den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde, idet man erstattede diphenyldisulfid med de i tabel I anførte disulfider fik man ΐ6β-ΐ1ιϊοθΐ1ΐθΓηΘ af natriumsaltet af 3^, lla-dihydroxyfusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre, som blandinger af de to C-20 iso-merer.

Tabel I: r - *

royXsB

ΓτΤ' /*\A/ HCf ! 14 142852 __Resulterende forbindelse

Eksempel Disulfid R smeltepunkt (°c) 5 Di(o—methylphenyl) o—CH^ 222-238 6 Di(m~methylphenyl) 226-234 .7 Di (p-me thylphenyl) p-CH^C^Hj^ 199-213

__L.___I

Eksempel 8

Natriumsalt af 3a.lla-dih.ydroxy-l68-phenylthiofusida-13(l7)-en-21-carboxyl syre

Til en isafkølet blanding af 6,2 g l6-epideacetyl-24,25-di-hydrofusidinsyrebenzylester (il mmol) og 6,3 S diphenyldisulfid (29 mmol) blev der sat l4 ml tributylphosphin (59 mmol), og blandingen fik lov at henstå ved 20°C i 48 timer. Der tilsattes derefter 40 ml dimethylsulfoxid og 20 ml 30°/° vandig natriumhydroxid, og den resulterende suspension opvarmedes til 70°C i to timer.

Efter afkøling til 20°C blev der tilsat 200 ml diethylether og 600 ml vand. Efter nogle timers forløb udfældede det ønskede produkt som farveløse krystaller. Efter 24 timer ved stuetemperatur blev den organiske fase indeholdende krystallerne filtreret, og krystallerne blev vasket med 100 ml vand og 100 ml diethylether og tørret, hvorved man fik natriumsaltet af 3α,11α-dihydroxy-l63-phenylthiofusida-13(l7)-en-21-carboxylsyre, som en blanding af de to C-20 isomerer. Dette råprodukt blev omkrystalliseret af methanol-vand, hvorved man fik den analytisk rene forbindelse med et smeltepunkt på 235-24l°C.

Eksempel 9

Natriumsalt af 3a. Ila-dihydroxy-l66-isopropylthiofusida-13(l7), 24-dien-21-carboxylsyre

Til en opløsning af 10 g kaliumhydroxid (150 mmol) og 30 ml isopropylmercaptan (320 mmol) i 750 ml ren ethanol blev der sat 24 g 3-acetyl-l6-deacetoxy-l6a-bromfusidinsyrebenzylester (36 mmol), og den resulterende opløsning fik lov at henstå ved stuetemperatur i 3 dage. Derefter blev hovedparten af ethanolen fjernet i vakuum, og der blev til remanensen sat 200 ml ethylacetat og 100 ml vand.

142852 15

Den organiske fase blev fraskilt og vasket to gange med vand, tørret og inddampet i vakuum, hvorved man fik rå 3-acetyl-l6-deacetoxy-l6β-isopropylthiofusidinsyrebenzylester som en olieagtig remanens.

Denne remanens blev opløst i en blanding af 40 ml 30% vandig natriumhydroxid og 200 ml dimethylsulfoxid. Efter opvarmning i 3 timer ved 70°C blev der under omrøring tilsat 1000 ml vand og 200 ml diethylether. Efter 1 times forløb blev den organiske fase indeholdende det ønskede produkt som farveløse krystaller fraskilt, krystallerne frafiltreredes, vaskedes med vand og diethylether og tørredes, hvorved man fik natriumsaltet af 3tt,Hct- dihydroxy-l6P-isopropylthiofusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyren som en blanding af de to C-20 isomerer.

Omkrystallisation af methanol-vand gav en analytisk prøve med smeltepunkt 220-228°C.

Analyse: C^^H^^O^SNa, tøgO

Beregnet: C 61,31 H 9,^9 S 5,12%

Pundet: C 61,68 H 9,32 S 5,lb%

Eksempel 10-24 l6j3-Thioethere af 3ct,lla-dihydroxyfusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre, natriumsalt

Ved at følge den i eksempel 5 beskrevne fremgangsmåde, idet man erstattede isopropylmercaptan med de i tabel II nedenfor anførte mercaptaner, blev de l6P-thioethere af 3&>llCc-dihydroxy-fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre, natriumsalt, som anført i tabel II fremstillet som blandinger af de to C-20 isomerer.

Tabel II;

X

l .cocf Na+ H0' i 16 142852

Resulterende forbindelse

Eksempel Mercaptan R Smeltepunkt 10 methylmercap^an CH^ 252-262 .11 ethylme.rcaptan CH^CH^ 201-210 12 n-butylmercaptaji (CH^) ^-CH^ 136-145 13 tert-butylmercaptan CiCH^ 222-235 · 14 allylmercaptan CHgCHsCHg 175-200 15 cyclohexylmercaptan cyclohexyl * 250 16 n-heptylmercaptan (CHgJg-CH^ 196-210 17 n-dodecylmercaptan ('CH^J^-CH^ 116-136 18 thiophenol 243-247 19 benzylmercaptan CH^CgH^ 210-222 20 2-phenylethyl- CH-CH-CgH.. 234-242 mercaptan 3 2Ϊ 4-tert-butyl-thio- 4-C-H. C(CH-) - 215-225 phenol 04 J ·* 22 thio-2-naphthol 2-naphthyl 145-165 23 furfurylnereap^an 2-furfuryl 216-221 24 2-pyrxdylmercaptan 2-pyridyl 216-221

Eksempel 25 3a,lla-Dihvdroxy-l68-lsopropylthiofusxda-13(l7).24-dxen-21- carboxylsyre.natriumsalt

Til en opløsning af 33»5 g 3-°“acetyl-l6-deacetoxy-l6a-bromfusidinsyrebenzylester (50 mmol) i 75 ml dimethylsulfoxid blev der sat en opløsning af 2,4 g natriumhydroxid (60 mmol) og 7 ml isopropylmercaptan (75 mmol) i 25 ml ethanol. Efter omrøring ved stuetemperatur i 2 timer blev der tilsat 25 ml 30$ vandig natriumhydroxid, og den resulterende blanding blev opvarmet til 70°C i 2 timer. Efter afkøling til 20°C blev der tilsat 500 ml vand, 500 ml 4-methyl-2-pentanon og 400 ml 4 N saltsyre.

Den organiske fase blev opsamlet, vasket med vand og filtreret.

Den resulterende opløsning blev omrørt, idet der langsomt blev tilsat 100 ml 2 N vandig natriumhydroxid, hvilket fik det ønskede produkt til at udfælde som farveløse krystaller. Efter afkøling til 5°C i 2 timer blev krystallerne frafiltreret og vasket med 17 142852 2 x 10 ml vand og 2 x 10 ml 4-methyl-2-pentanon og tørret, hvorved man fik analytisk rent natriumsalt af 3a> lloc-dihydroxy-l63-isopropylthiofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre som en blanding af de to C-20 isomerer; smeltepunkt 243-248°C.

Eksempel 26 3a,llg-Dihydroxy-l6P-isopropylthiofusida-13(17)-en-21-carboxy1syre, natriumsalt

Ved at følge den i eksempel 25 beskrevne fremgangsmåde, idet man anvendte 3-0-acetyl-l6-deacetoxy-24,25-dihydro-l6a-bromfusidin-syrebenzylester i stedet for den tilsvarende 24,25-umættede forbindelse, fik man 3a, ll<X-dihydroxy-l6β-isopropylthiofusida-13(l7)-en-21-carboxylsyre som et krystallinsk natriumsalt} smeltepunkt 215-24o°C (sønderdeling).

Eksempel 27 3a,lla-Dihydroxy-l68-isopropylthiofusida-13(17), 24-dien-21-carboxylsyre 10 g natriumsalt af 3a,llα-dihydroxy-l6β-isoρroρyl-thio-fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre, fremstillet som beskrevet 1 eksempel 25, blev opløst i 150 ml methanol, og der tilsattes 17,5 ml 1 N saltsyre. Den resulterende opløsning blev omrørt ved 20°C samtidig med, at der langsomt blev tilsat 22,5 ml vand, hvilket fik det ønskede produkt til at udkrystallisere. Efter omrøring i 2 timer blev krystallerne frafiltreret, vasket med methanol/vand (4/1), og tørret, hvorved man fik 7»0 g af en blanding af de to C-20 isomerer af 3CC, lla-dihydroxy-l6P-isopropylthiofusida-13( 17), 24-dien-21-carboxylsyre, smeltepunkt 130-134°C} [a]^= -92.9° (C=l, chloroform). Til moderluden blev der sat 10 ml vand, hvilket fik en yderligere mængde af kun den ene af de to isomerer til at udfælde som farveløse krystaller, der blev opsamlet og omkrystalliseret af methanol/vand, hvorved man fik den ene af de to C-20-isomere syrer (360 mg) i ren form, smeltepunkt 109-113°C. [a]^= -37,8° (C=l, chloroform). (Dette produkt er identisk med det ifølge eksempel 31 C fremstillede).

Eksempel 28 3a,lla-Dihydroxy-l6p-(21-aminoethylthio)fusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre 18 142852 A. 3-Acetyl-l6-deacetoxy-l68-( 2»-aminoethylthio) fusidinsyre-benzylester 2,68 g 3-Acetyl-l6-deacetoxy-l6a-bromfusidinsyrebenzylester (4 mmol) blev sat til en opløsning af 8,64 g kaliumhydroxid (13O mmol) og 9,0 g af hydrochloridet af cysteinamin (80 mmol) i 150 ml ren ethanol. Efter omrøring i 16 timer ved stuetemperatur blev der langsomt tilsat 200 ml vand, hvorved den ønskede forbindelse udkrystalliserede.

Krystallerne blev frafiltreret, vasket med en blanding af IO ml vand og 10 ml ethanol og tørret, hvorved man fik 2,49 g 3-acetyl-l6-deacetoxy-ΐόβ-(21-aminoethylthio)fusidinsyrebenzyl-ester.

Omkrystallisation af methanol/vand gav en analytisk prøve med smeltepunkt 184-186°C.

Analyse: C40H59°5NS

Beregnet: C 72,15 H 8,93 S 4,81 N 2,10$

Fundet: C 71,6l H 8,92 S 4,81 N 2,04$ B. 3k,lla-Dihydroxy-166-(21-aminoethylthio)fusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre 600 mg af den i trin A fremstillede benzylester blev opløst i en blanding af 50 ml dimethylsulfoxid og 10 ml 2 N vandig natriumhydroxid. Efter opvarmning til 70°C i 1,5 timer blev der tilsat 250 ml vand. Indstilling af pH-værdien til 6,0 ved tilsætning af 4 N saltsyre fik et amorft produkt til at udkrystallisere.

Dette råprodukt blev frafiltreret, tørret og opløst i 150 ml kogende ethylacetat. Når denne opløsning fik lov at afkøle i stuetemperatur under omrøring, dannedes der et amorft bundfald. Den således fremkomne 3a, llct-dihydroxy-l6p-(2 1-aminoethylthio )fusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre blev frafiltreret og tørret, hvorved man fik en blanding af de to C-20 isomerer.

Analyse: Co.,H_,N0i.S

jl 51 4·

Beregnet: C 65,34 H 9,73 S 5,63 N 2,46$

Fundet: C 65,80 H 9,54 S 5,59 N 2,40$ NMR-spektret (CD^OD) udviser signaler ved S =0,96 (d, JH), l,0l(a, 3H), 1,21 (bs, 6H), 1,59 og 1,65 (2 bs, 6h), 2,5-3,4 (m, 4Hj -SCH2CH2NH3), 3,61 (m, IH; CH-3), 3,78 (m, IH; CH-20), 4,31 (m, IH; CH-ll) og 5,13 (m, IH; CH-24) ppm. Tetramethylsilan blev anvendt som intern reference.

19 142852

Eksempel 29 'tø. lloc-Dihydroxy-l66-( 21 -hydroxyethylthio ) fuslda-13( 17 ), 24-dien-21-carboxylsyre A. 3-Acetyl-l6-deacetoxy-l6g-(21-hydroxyethylthio)fusidinsyre-benzylester 1,34 g 3-Acetyl-l6-deacetoxy-l6a-bromfusidinsyrebenzylester (2 mmol) blev sat til en opløsning af 1,68 g kaliumhydroxid (25 mmol) og 2,1 ml 2-hydroxyethylmercaptan (30 mmol) i 150 ml ren ethanol. Efter omrøring i 16 timer ved stuetemperatur blev der langsomt tilsat 100 ml vand til udkrystallisation af den ønskede forbindelse. Krystallerne blev frafiltreret, vasket med en blanding af 5 ml vand og 5 ml methanol og tørret, hvorved man fik 1,18 g 3-acetyl-l6-deacetoxy-l6β-(2'-hydroxyethylthio)fusidinsyrebenzylester med smeltepunkt l67-176°C.

Omkrystallisation af methanol/vand hævede smeltepunktet til 175-178°C.

B. 3CX. lla-Dihydroxv-l6B-(2 1 -hydroxyethylthio )fusida-13( 17 ) ♦ 24-dien-21-carboxylsyre 700 mg af den i trin A fremstillede benzylester blev opløst i en blanding af 50 ml dimethylsulfoxid og 10 ml 2 N vandig natriumhydroxid. Efter opvarmning til 70°C i 1,5 timer blev blandingen gjort sur med 4 N saltsyre (pH=2), og der tilsattes 100 ml vand og 100 ml diethylether. Den organiske fase blev fraskilt, vasket med 5 x 50 ml vand, tørret og inddampet i vakuum, hvorved man fik en olieagtig remanens, der indeholdt de to isomerer af det ønskede produkt. Denne remanens blev adskilt i to fraktioner ved tør kolonnekromatografi på silikagel (cyklohexan:chloroform: eddikesyre, 10:80:10).

Den mest polære af disse fraktioner indeholdt én af de to C-20 isomerer af 3a,lla-dihydroxy-l6p-(2'-hydroxyethylthio)fusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre (290 mg), og den mindst polære indeholdt 50 mg af den anden isomer.

NMR spektret (CDCl^) af den mest polære C-20 isomer udviste signaler ved l,00(s, 3H), 1,21 (bs, 3H), 1,25 (s, 3H), l,6l og 1,69 (2 bs, 6h), 2,75 (m, 2H, CHgS), 3,5-3,9 (m, 5H, CH-3, CH-16, CH-20 og CH20H), 4,40 (m, 1H,CH-Il) og 5,06 (m, IH, CH-24) ppm. Tetramethylsilan blev anvendt som intern reference.

NMR spektret (CD^OD) af den mindst polære C—20 isomer udviste signaler ved 0,86 (d, J=7, 3H), 0,97 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,20 20 142852 (s, 3H), 1,56 og 1,61 (2bs, 6H), 2,62 (m, 2H, SCHg), 3,5-3,8 (m, 5H, CH-3, CH-I6, CH-20 og CH20H), 4,27 (m, CH-ll) og 5,15 (m, IH, CH-24) ppm. Tetramethylsilan blev anvendt som intern reference.

Eksempel 30

Adskillelse af de to C-20 isomerer af 30C. 110C-dihydroxy-l63-phenylthiofusida-13(l7).24-dien-21-carboxvlsyre

En suspension af natriumsaltet af 3a,Ha-c^:*-fry’(iroxy-l63— phenylth.iofusida-13(l7) »24-dien-21-carboxylsyre (l g af den i eksempel 1 fremstillede blanding af isomerer)i en blanding af 50 ml diethylether og 10 ml 1 N saltsyre blev omrystet, indtil krystallerne var forsvundet. Den organiske fase blev fraskilt, vasket to gange med vand, tørret og inddampet i vakuum. Remanensen blev opløst i 5 ml kogende cyclohexan. Ved afkøling til stuetemperatur udskiltes et krystallinsk produkt, der blev frafiltreret og vasket med 1 ml cyclohexan og tørret. Omkrystallisation af 5 ml cyclohexan gav én af de to C-20 isomerer i ren form med smeltepunkt 96-98°C·

Moderluden blev inddampet i vakuum og remanensen omkrystalliseret af diethylether-petroleumsether, hvorved man fik 210 mg af den anden C-20 isomer, som blev renset ved omkrystallisation af diethylether-petroleumsether og derved fik et smeltepunkt på 94-99°C. I henhold til tyndtlagskromatografi (opløsningsmiddelsystem: chloroform:cyclohexan:methanol:eddike syre, 80:10:2,5:10; forstøvningsreagens: svovlsyre) var sidstnævnte produkt den mindste polære af de to isomerer.

Eksempel 31

Adskillelse af de to C-20 isomerer af 30C. ll(X-dihydroxy-l63- isopropylthiofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre A. En C-20 isomer af 30C-O-formyl-llq-hydroxy—l6[3-isopropyl- thiofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyreacetoxymethylester 1,5 g natriumsalt af Ja,lla-dihydroxy-l6p-isopropylthio-fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre (2,5 mmol), fremstillet ifølge eksempel 25, blev opløst i 15 ml dimethylformamid, og der blev tilsat 0,3 ml chlormethylacetat (3,3 mmol). Efter henstand i 16 timer ved 20°C blev reaktionsblandingen afkølet til 0°C og omrørt, medens man langsomt tilsatte 1 ml thionylchlorid (l3,7 mmol). Efter omrøring i 1 time ved 20°C blev der tilsat 21 142852 100 ml diethylether, og den resulterende blanding blev vasket med 4 x 50 ml vand, tørret og inddampet, hvorved man fik 1,4 g af en blanding af de to C-20 isomere estere. Denne remanens blev opløst i 15 ml petroleumsether, og ved skrabning udkrystalliserede den ene af de to isomerer i ren form. Krystallerne blev frafiltreret, vasket med petroleumsether og tørret, hvorved man fik den ønskede forbindelse med et smeltepunkt på 126-128°C, B. Den anden isomer af 3a-0-formyl-llg-hydroxy-l6P-isopropyl-thiofusida-13(17).24-dien-21-carboxylsyreacetoxymethylester Moderluden fra krystallisationen af forbindelsen ifølge afsnit A i dette eksempel blev inddampet i vakuum, og remanensen blev renset ved kromatografi på silikagel (cyclohexan:ethylacetat, 8:2), hvorved man fik den ønskede forbindelse som en olieagtig remanens.

C. En C-20 isomer af 30C. lla-dihydroxv-l63-isopropylthiofusida-13(17).24-dien-21-carboxylsyre 300 mg af den ifølge afsnit A i dette eksempel fremstillede forbindelse blev opløst i 15 ml methanol, der tilsattes 300 mg kaliumcarbonat, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i en time. Reaktionsblandingen blev derefter inddampet i vakuum, og der tilsattes 50 ml diethylether og 25 ml 1 N saltsyre. Den organiske fase blev fraskilt, vasket to gange med vand og inddampet, hvorved man fik det rå produkt, der blev krystalliseret af methanol/vand til dannelse af én isomer af 3tt»Ha-dihydroxy-l63-isopropylthiofusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre, med et smeltepunkt på 110-112°Cj [a]^° = -37,8° (C=l i chloroform).

D. Den anden C-20 isomer af 3a,lla-dihydroxy-lég-isopropyl-thiofusida-13(17),24-dien-21-carboxylsyre

Ved at følge den i dette eksempel, afsnit C beskrevne frem^ gangsmåde, idet man i stedet for produktet fremstillet i henhold til afsnit A i dette eksempel anvendte produktet fremstillet i henhold til afsnit B ifølge dette eksempel, blev den anden isomer af 3a,lla-dihydroxy-l6p-isopropylthiofusida-13(17), 24-dien-21-carboxylsyre fremstillet som farveløse krystaller med et smeltepunkt på l44-l49°Cj [a]^ = -158,7° (C=l i chloroform).

22 142852

Eksempel 32 3a.lla-DihvdroxY-l6g-phenvlthiofusida-13(l7).24-dien-21-carboxyl- syreacetoxvmethylester 330 mg natriumsalt af 3a,lloc-dihydroxy-l6P-ph.enylthiofusida~ 13(l7)»24-dien-21-carboxylsyre (0,5 mmol af den mest polære af de to isomerer, som udfældede ved den i eksempel 26 beskrevne fremgangsmåde) blev opløst i 2 ml dimethylformamid, og der tilsattes 50 μΐ chlormethylacetat (0,55 mmol). Efter henstand ved stuetemperatur i 16 timer blev der tilsat 50 ml diethylether, og den resulterende blanding blev vasket med 4 x 50 ml vand, tørret og inddampet til dannelse af Ja, lla-dihydroxy-l6p— phenylthio— fusida-13(l7)»24-dien-21-carboxylsyreacetoxymethylester (én af de to mulige C-20 isomerer) som et farveløst skum (l80 mg). NMR-spektret (CDCl^) udviser signaler ved tf = 0,88 (d, J=6, 3H), 0,97 (s, 3H), 1,16 (bs, 6h), 1,59 og 1,67 (2 bs, 6h), 2,02 (s, 3H, 9 0-C-CH ), 3,52 (m, CH-20), 3,63 (m, CH-3), 4,16 (bd, CH-16), 4,29 J 0 0 (m, CH-11), 5,12 (m, CH-24), 5,67 og 5,81 (2d, J=6, C-0CH2-0-<5) og 7,1-7,5 (5H; aromatisk CH) ppm. Tetramethylsilan blev anvendt som intern reference. .

Eksempel 33

Ja,lla-Dihvdroxy-l63-phenylthiofusida-13(17). 24-dien-21-carboxyl- syre-fusidyloxymethylester

Ved at følge den i eksempel 32 beskrevne fremgangsmåde, idet man i stedet for chlormethylacetat anvender fusidinsyrechlorme-thylester, fik man Ja,lla-dihydroxy-l6P-phenylthiofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre-fusidyloxymethylester som et farveløst skum.

Eksempel 34 3tX,lloc-Dihydroxy-l68-methoxyfusida-13(l7).24-dien-21-carboxylsyre, natriumsalt A. l6-Deacetoxy-l68-methoxyfusidinsvrebenzvlester

En opløsning af 1,71 S l6-deacetoxy-l6p-methoxyfusidinsyre (3,5 mmol) i 50 ml methanol blev titreret med 2 N methanolisk natriumhydroxid under anvendelse af phenolphthalein som indikator. Efter inddampning til tørhed i vakuum blev det således fremstillede amorfe natriumsalt opløst i 10 ml dimethylformamid, der tilsattes 0,54 ml benzylbromid (4,5 mmol), og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer. Ved dråbevise tilsætninger af 30 ml 23 142852 methanol:vand (l:l) til den omrørte reaktionsblanding fandt der en udfældning sted af et farveløst krystallinsk produkt. Krystallerne blev frafiltreret, vasket med methanol;vand (1 s 1) og tørret til dannelse af den ønskede forbindelse med smeltepunkt 179-182°C.

B. 3ct, llg-Dihydroxy-l68-methoxyfusida-13( 17 )« 24-dien-21-carboxylsyre, natriumsalt

Til en opløsning af 500 mg l6-deacetoxy-l6p-methoxyfusidin-syrebenzylester (0,86 mmol) i 25 ml dimethylsulphoxid blev der sat 5 ml 2 N vandig natriumhydroxid, og blandingen blev omrørt ved 70°C i 1,5 timer. Efter afkøling til stuetemperatur blev der dråbevis tilsat 25 ml vand til den omrørte reaktionsblanding, hvorved der udfældedes et krystallinsk produkt. Krystallerne blev frafiltreret, vasket med methanol:vand (l:l) og tørret, hvorved man fik natriumsaltet af 3<l,llCC-dihydroxy-l6P-methoxyfusida-13“ (l7),24-dien-21-carboxylsyre (blanding af C-20 isomerer) med et smeltepunkt på 224-228°C (sønderdeling).

Analyse: C^H^O^Na, 1,5 HgO

Beregnet: C 67,01 H 9,37$

Fundet: C 66,82 H 9,33$

Eksempel 35-37

Yderligere natriumsalte af 3cc,llct-dihydroxy-l66-alkvloxyfusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre

Ved i eksempel Jk at erstatte l6-deacetoxy-l6p-methoxyfusidinsyre med henholdsvis l6-deacetoxy-l6β-ethoxyfusidinsyre, 16-deacetoxy-l63-(2,-fluorethoxy)fusidinsyre og l6-deacetoxy-l6p-(21,2',2’-tri-fluorethoxy)fusidinsyre fik man natriumsaltene af de i tabel III anførte 3&, H0C-dihydroxy-l6P-alkyloxyfusida-13( 17) , 24-dien-21-carboxylsyrer (blandinger af C-20 isomerer).

Tabel III: S

I .COO~Na+

H0''v/\/V°*"R

f 2b 142852

Eksempel R Smeltepunkt (°C) 35 CH2CH3 216-220 (sønderdeling) 36 CH2CH2F 170-178 (sønderdeling) 37 CHgCF^ ikke bestemt

Eksempel 38 3α,lla-Dihydroxy-l6S-(21,21,2,-trif‘luorethoxy)f‘usida-13(l7) .24-dien-21-carbo3cyls~yre

Til en suspension af bbo mg natriumsalt af 3<X, lla-dihydroxy-ΐ6β-(21,2*,2 *-trifluorethoxy)fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre i 15 ml vand blev der sat 15 ml diethylether, og den omrørte blanding blev gjort sur med fortyndet saltsyre. Den organiske fase blev fraskilt, den vandige fase ekstraheret med 10 ml diethylether og de kombinerede etherekstrakter vasket to gange med vand, tørret og inddampet i vakuum, hvorved man fik den ønskede forbindelse (blanding af C-20-isomerer i det omtrentlige forhold lsl) som et farveløst skum. Den ovennævnte remanens blev krystalliseret af ether, krystallerne blev frafiltreret og omkrystalliseret to gange fra samme opløsningsmiddel, hvorved man fik én af de to C-20-isomere syrer i ren tilstand med smeltepunkt 173-17^°C· I henhold til tyndtlagskromatografi (opløsningsmiddelsystem: chloroform:cyclo-hexan:methanol:eddikesyre 80:10:2,5:10; forstøvningsreagens: svovlsyre) var den krystallinske forbindelse den mest polære C-20-isomer.

Analyse: C^H^F^O,-

Beregnet: C 66,89 H 8,51 °/o

Fundet: C 66,7b H 8,56$ 25 142852

Eksempel 59-41

Yderligere rene C-20 isomerer af 3ct, lla-dihydroxy-l63-alkyloxv-fusida-13(17)< 24-dien-21-carboxylsyrer

Ved at følge den i eksempel 38 beskrevne fremgangsmåde, idet man erstatter natriumsaltet af Ja,lla-dihydroxy-l63-(2',2',2'-trifluorethoxy)fusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre med henholdsvis natriumsaltet af Ja,Ha-dihydroxy-l6p-methoxyfusida-13(l7),-24-dien-21-carboxylsyre og natriumsaltene af de tilsvarende l6p-ethoxy- og ΐ6β-(Z1-fluorethoxy)-derivater, fik man en af de rene C-20 isomerer af de i tabel IV anførte 3&» HÆ-dihydroxy-l6β-alkyloxyfusida-13(17)>24-dien-21-carboxylsyrer.

Tabel IV;

Y

) ,^*000Η Η0\γ^γ-* ηο/Ντ'·' i

Eksempel R Smeltepunkt ( c) 39 CH^ 163-16^ 40 CH2CH3 175-177 41 ch2ch2f 172-173

Eksempel 42

In vitro baktericid effekt af 3(X«ll0C-dihvdroxv-l68-phenylthlofusida-13(l7),24-dien-21-carboxylsyre sammenlignet med fusidinsyrens effekt Til to reagensglas indeholdende NIH bouillon blev der sat! +) se definition næste side , 142852 26 a) natriumsaltet af 30c, lla-d±hydroxy-l6p-phenylt:h.xofusida--13(l7)»24-dien-21-carboxylsyre (lO μ£/πιΐ) b) natriumsaltet af fusidinsyre (lO μg/ml)

Reagensglassene blev podet med Streptococcus pyogenes /j, o til 9,2 x 10 organismer pr. ml, blev dyrket ved 37 C, og kxm-tallet blev bestemt med mellemrum som antallet af kolonidannende enheder.

Et tredje reagensglas blev behandlet på tilsvarende måde uden tilsætning af antibiotika og blev benyttet som kontrol: ^_ Kimtal efter

Glas- 0 timer 1,5 timer 4 timer 7 timer a 9.2χΐο^ 1.4x10^ 5·7χΐο2 5^10 b 9.2x10** 1.2x10"* 1.5xl05 1.3xl05 kontrol 9.2X10^ 6.8x10^ 2.4x10^ I.7XIO8 +) NIH-bouillon:

Yeast Extract, DXFCO.......................... 0,5$

Kasein hydrolysat (enzymatisk nedbrudt) ....... 1,5$

Natriumchlorid................................0,2 5$

Dextrose ...................................... 0,1$ L-cystin...................................... 0,005$ i destilleret vand, pH 7,1 efter autoklavering.

Eksempel 43

In vitro virkning af kombinationen af fusidinsyre og 3<X.ll0t:-dihydroxy-l6|3-isopropylthiofusida-13(l7).24-dien-21-carboxylsyre Til tre reagensglas indeholdende NIH-bouillon blev der sat: a) natriumsaltet af fusidinsyre (l μg/ml) b) natriumsaltet af 30c, lla-dihydroxy-l6P-isopropylthiofusida-13(l7)j24-dien-21-carboxylsyre (3 μg/ml).

c) En blanding af natrdumsaltene af fusidinsyre (l μg/ml) og 3ce, Ha-dihydroxy-l6p-isopropylthiofusida-13(l7) , 24-dien-21-carboxylsyre (3 μg/ml).

Reagensglassene blev podet med Staphylococcus aureus til 1,4 x 10 organismer pr. ml, blev dyrket ved 37°C i 24 timer, og kimtallet blev bestemt som antallet af kolonidannende enheder.

27 142852

Et fjerde reagensglas blev behandlet på tilsvarende måde uden tilsætning af antibiotika og blev benyttet som kontrol:

Glas Kimtal a 1.8 x 108 b 1.5 x 106 c 7.3 x 10° kontrol 6.2 x 108

De overlevende organismer i reagensglas a) er resistente overfor fusidinsyre, og de i reagensglas b) er resistente overfor 3a,Ha-dihydroxy-l6P-isopropylthiofusida-13(l7), 24-dien-21-carboxylsyre, medens kombinationen af de to forbindelser i reagensglas c) forhindrer resistensudvikling.

Eksempel kk

In vitro virkning af kombinationen af dihydrofusidinsyre og 3a,llq-dihydroxy-l66-phenylthiofusida-13(l7),24-dlen-21-carboxylsyre

Til tre reagensglas indeholdende NIH-bouillon blev der satj a) natriumsaltet af dihydrofusidinsyre (10 μg/ml) b) natriumsaltet af 3<X,lla-dihydroxy-l63—phenylthiofusida— 13(17)>24-dien-21-carboxylsyre (10 μg/ml).

c) En blanding af natriumsalte af dihydrofusidinsyre (5 μg/ml) og 3a, Ha-dihydroxy-l6|3-phenylthiofusida-.13(l7), 24-dien-21~ carboxylsyre (5 μg/ml).

Reagensglassene blev podet med Staphylococcus aureus til 5,2 x 10^ organismer pr. ml, blev dyrket ved 37°C i 96 timer, og kimtallet blev bestemt som antallet af kolonidannende enheder.

Et fjerde reagensglas blev behandlet på tilsvarende vis uden tilsætning af nogen af de nævnte antibiotika og blev benyttet som kontrol: 142852 28

Kimtal efter ' O- 2 6 l/2~ 24 96 timer „Kontrol 5.2 x 105 1.3 x 106 Ux 107 4.3 x 108 fuld V{Bkst a 4.1 x 105 3.1 x 105 6.3 x 106 · " b 5.2 x 10* 1.1 x 10* 3.1 x 106 " «· c 1.5 x 105 4.1 x 10* CIO <10

De overlevende organismer i reagensglas a) er resistente overfor dihydrofusidinsyre, og de i reagensglas b) er resistente overfor 3a, Ha-dihydroxy-l63-phenylthiofusida-13(l7) ,24-dien-21-carboxylsyre, medens kombinationen af de to forbindelser i reagensglas c) forhindrer resistensudvikling.

Eksempel 45

Forhindring af resistensudvikling overfor fusidinsyre som resultat af behandling af Staph.aureus med natriumsaltet af 30C.11(X-dihydroxv-l63-isopropylthiofusida-13f17).24-dien-21-carboxvlsyre Efter en 48 timers forudgående behandling af en fusidinsyre-følsom stamme af Staph.aureus (Leo CC178B) med subhæmmende koncentrationer af fusidinsyre eller af forbindelsen ifølge eksempel 9 blev de forbehandlede kulturers følsomhed samt den originale stammes følsomhed overfor de to forbindelser bestemt. Følsom-hedsbestemmelserne blev foretaget ved seriefortyndinger i NIH-bouillon, der blev podet til 2 x 10^ organismer/ml, og IC^ blev bestemt efter 18 og 48 timer. Resultaterne fremgår af tabel B:

Tabel B: _ i IC5Q (μβ/ml)

Xsolater fra 18 timer 48 timer

Fusidin- Forbindel- Fusidin- Forbindel- syre se iflg. syre se iflg.

Eks. 9 Eks. 9

Kontrolkultur 0,016 21 5

Kultur forbehandlet med Fusidinsyre 7,9 1,6 50 5

Kultur forbehandlet med forbindelse ifølge eks. 9 0,0l6 5 0,020 16 29 142852

Kontrolkulturens resistensudvikling overfor fusidinsyre ses af de forøgede IC ^-værdier efter 48 timer, og den forøges yderligere ved forbehandling med fusidinsyre.

Der ses kun en svag formindskelse af følsomheden overfor forbindelsen fremstillet ifølge eksempel 9· Forbehandling med fusidinsyre påvirker ikke resultaterne.

Forbehandling af kulturen med forbindelsen fremstillet ifølge eksempel 9 hindrer fuldstændig resistensudvikling overfor fusidinsyre.

Eksempel 46

In vitro aktivitet af 3QC.ll0C-dihydroxy-l66-ethylthiofusida-13(17).24-dien-21-carboxylsyre overfor Staph,aureus før og efter et antal passager i substrat indeholdende stoffet.

Seriefortyndinger af den ovennævnte forbindelse blev foretaget i flydende NIH-medium. Fortyndingsrækken blev podet kraftigt med en fusidinsyrefølsom stamme af Staph.aureus (Leo CC178B) eller med en fusidinsyreresistent variant af samme stamme (Leo CC178A).

Fortyndingsrækkerne blev dyrket i 72-96 timer ved hver passage. Inoculum til næste passage blev taget fra det reagensglas, som indeholdt størst mængde af den afprøvede forbindelse og som samtidig viste fuld vækst. Tabellen nedenfor viser bakteriens følsomhed aflæst efter ca. 18 timers dyrkning.

Tabel C: IC50 (pg/ml)

Staph.

aureus før og efter et vist antal passager 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Leo CC178B

(Fusidinsyre- 2,7 2,0 7,4 7,4 13,5 10,0 32 følsom) ' 1

Leo CC178A i (Fusidinsyre- 2,7 2,3 3,8 4,3 4,2 4,0 4,0 j

resistent I

------i--i

Claims (1)

1. 30 142852 Det ses af tabellen, at den fusidinsyrefølsomme stamme er 12 gange mindre følsom overfor den omhandlede forbindelse efter den sjette passage, medens den fusidinsyreresistente stammes følsomhed næppe ændres. Dette er et meget uventet fænomen. Analogifremgangsmåde til fremstilling af fusida-13(l7)-en-21--carboxylsyrederivater af den almene formel I H^C CH3 '^25 !l24 s*/CO OR2* ipo I H(k^ A-R1 c4 ÆJT I H ®3 h/V^ ! H CH3 hvilken bindingen mellem C-24 og C-25 er enkelt eller dobbelt, og stjernen ved C—20 angiver, at forbindelserne eksisterer i to dia-stereomere former, og i hvilken formel A betyder oxygen eller svovl, R1 står for en lige eller forgrenet alkylgruppe med fra 1 til 12 carbonatomer, hvilke alkylgrupper kan være mono-, di- eller trisubsti— tueret med halogenatomer eller med hydroxy-, alkoxy-, aralkoxy-, aryl-oxy-, alkanoyloxy-, aralkanoyloxy-, aroyloxy-, sulfhydryl-, alkylthio-, aralkylthio-, arylthio-, alkanoylthio-, aroylthio-, azido-, nitro-, cyano-, thiocyano-, hydroxykarbony1-, alkoxykarbonyl-, aryloxykarbon-yl-, amino-, alkylamino-, dialkylamino-, arylamino-, alkanoylamino-, eller aroylaminogrupper, i hvilke substituenter alkyldelen kan inde-holde 1 til 4 C-atomer og aryldelen 6—10 C—atomer, idet R endvidere kan betyde en alkenyl- eller alkynylgruppe med fra 3 til 6 carbonatomer, en cykloalkylgruppe med fra 3 til 7 carbonatomer i den ali-cykliske ring, der eventuelt kan være mono-eller disubstitueret med halogenatomer, C^-C^-alkyl, C^-C^-alkoxy- eller hydroxygrupper, og hvor Η"*" yderligere kan betyde en phenyl-, naphthyl, phenyl-C^-C^--alkyl- eller naphthyl-C^-C^-alkylgruppe, eventuelt mono-, di- eller